Αφηρημένο

Autophagy διαμόρφωσης αναγνωρίζεται πλέον ως μια πιθανή θεραπευτική προσέγγιση για τον καρκίνο (συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου), αλλά οι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν αυτοφαγία απαντώντας σε κυτταρικό στρες δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Τα microRNAs (miRNAs) έχουν βρεθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο πολλών κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, του μεταβολισμού και αντίδραση στο στρες. Η φυσιολογική σημασία του miRNA-αυτοφαγία διασύνδεσης είναι μόλις τώρα αρχίζουν να διευκρινιστεί. τεχνολογία μικροσυστοιχιών miRNA διευκολύνει την ανάλυση του παγκόσμιου έκφρασης miRNA σε ορισμένες περιπτώσεις. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το προφίλ έκφρασης του miRNAs κατά τη διάρκεια της απόκρισης των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου (HT29s) προς 5-FU θεραπεία και θρεπτικό λιμοκτονία χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA. Η αλλοίωση της εκφράσεως miRNA έδειξε το ίδιο μοτίβο κάτω από αμφότερες τις συνθήκες περαιτέρω μαρτυρείται από qRT-PCR σε τρία καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου κόλον. Επιπλέον, βιοπληροφορική πρόβλεψη των γονιδίων στόχων, την ανάλυση μονοπατιού και ανάλυση του δικτύου γονίδιο έγιναν για την καλύτερη κατανόηση των ρόλων αυτών των miRNAs στη ρύθμιση της αυτοφαγία. Εμείς αναγνωριστεί και να επιλεγεί τέσσερα μειωτικά miRNAs συμπεριλαμβανομένων HSA-miR-302A-3ρ και 27 ρυθμίζεται αυξητικά miRNAs υπό αυτές τις δύο προϋποθέσεις ότι έχουν τη δυνατότητα να στοχεύσει τα γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της αυτοφαγία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Έχουν τη δυνατότητα να ρυθμίζουν την αυτοφαγία στο 5-FU χημειοθεραπεία με βάση το καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Χου Ν, Han J, Li J, Λιου Υ, Τσιν Υ, Ni L, et al. (2014) microRNA Profiling σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου κατά τη διάρκεια της 5-φθοριοουρακίλη-Induced Autophagy. PLoS ONE 9 (12): e114779. doi: 10.1371 /journal.pone.0114779

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31, Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 13 Νοεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 19η Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Hou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (επιχορήγηση Νο 31100969) και το Ίδρυμα Επιστημονικής Έρευνας για την επέστρεψε στο εξωτερικό Κινέζοι μελετητές, μέλος Υπουργείο Παιδείας (2013-09) με το Δρ Χου. Είναι επίσης υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (επιχορήγηση Νο 81172358) με τον Δρ Λι. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικές ενδιαφέρον

Εισαγωγή

5-φθοριοουρακίλη (5-FU) -με βάση χημειοθεραπεία ανοσοενισχυτικό έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως τον κορμό του για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC). Ωστόσο, λόγω της αντίστασης στο 5-FU σε πολλούς ασθενείς, τα νέα θεραπευτικές στρατηγικές που διερευνώνται [1]. Αυτοφαγία είναι μια εξελικτικά συντηρημένη ευκαρυωτικών διαδικασία που διατηρεί ενδοκυτταρική ομοιοστασία με την εξάλειψη των περιττών πρωτεΐνες και κατεστραμμένα ή ηλικίας οργανίδια [2]. Στη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, συσσωρεύοντας στοιχεία έχουν δείξει ότι η αυτοφαγία εκτενώς συνδέεται με τον καρκίνο [3]. Με τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης σε υγιή κύτταρα, αυτοφαγία αποτρέπει καρκινικό μετασχηματισμό. Autophagy είναι επίσης σημαντική για την εξέλιξη του όγκου, επιτρέποντας καρκινικά κύτταρα να επιβιώσουν μεταβολικό στρες ή anoikis, διατηρώντας την προσαρμογή τους στην επαναπρογραμματιστεί μεταβολισμό, την υποστήριξη της ανάπτυξης του όγκου μέσω επαγωγής λήθαργο και τη διατήρηση της επιβίωσης και την αυτο-ανανέωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Επιπλέον, επειδή αυτοφαγία παίζει ουσιαστικό ρόλο στον καθορισμό του τρόπου καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται σε θεραπεία, διαμόρφωση autophagy αναγνωρίζεται ως πιθανή θεραπευτική προσέγγιση στον καρκίνο [4], [5]. Αυτοφαγία φαίνεται να αντιπροσωπεύει έγκυρο μηχανισμό αντίστασης ενάντια ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η αναστολή της autophagy με 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) ή μία μικρή παρεμβολή RNA που στοχεύουν ATG7 (ATG7 siRNA) αύξησε την αποτελεσματικότητα της 5-FU με την ενίσχυση της απόπτωσης σε ανθρώπινα καρκίνου του παχέος εντέρου [6], [7]. Αυτοφαγία είναι εξαιρετικά συντηρημένο και καλά οργανωμένη. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν αυτοφαγία σε απόκριση σε κυτταρικό στρες δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή.

Τα microRNAs (miRNAs), 18-25 νουκλεοτίδια σε μήκος, είναι ενδογενείς μικρά, μη κωδικοποιητική RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων τους με αναστολή της μετάφρασης ή διάσπαση αγγελιαφόρο RNA (mRNA), κυρίως μέσω της αλληλεπίδρασης στο 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (UTRs) των mRNA στόχου [8]. MiRNAs μπορεί ταυτόχρονα να ρυθμίσει ένα πλήθος στόχων και βιολογικών δικτύων. Αντιστρόφως, πολλές διαφορετικές miRNAs μπορεί να συνδέονται και συνεργατικά ελέγχουν ένα ενιαίο στόχο mRNA. Οι miRNAs βρεθεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο πολλών κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, το μεταβολισμό και την απόκριση στρες και παρείχε ένα σαφές πλεονέκτημα από μια κλινική άποψη [9] – [11]. Τα τελευταία χρόνια, έχουν κάποια miRNAs έχουν μελετηθεί ως μεσολαβητές του κανονισμού αυτοφαγία. MiRNA-30α μπορεί να ευαισθητοποιήσει τα κύτταρα ηπατώματος με σισπλατίνη στοχεύοντας Beclin-1-μεσολάβηση αυτοφαγία [12]. MiRNA-101 έχει αποδειχθεί ότι είναι ως ένας ισχυρός αναστολέας του autophagy που προκαλείται από ετοποσίδη ή ραπαμυκίνης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [13]. Jegga et al. Προτείνεται επίσης ότι miRNA-130, miRNA-98, miRNA-124, miRNA-204 και miRNA-142 έχουν τη δυνατότητα ρυθμιστικών καθηκόντων με τη διαδικασία αυτοφαγικά βασίζεται στην υπολογιστική ανάλυση [14]. Η φυσιολογική σημασία του miRNA-αυτοφαγία διασύνδεσης είναι μόλις τώρα αρχίζουν να διευκρινιστεί.

Λόγω του μεγάλου αριθμού των miRNAs, η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών miRNA έχει εφαρμοστεί ευρέως για τον προσδιορισμό της παγκόσμιας έκφραση miRNA σε ορισμένες περιπτώσεις [15]. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το προφίλ έκφρασης του miRNAs στην απόκριση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του κόλου (HT29s) προς θεραπεία 5-FU χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA. Την ιεράρχηση των miRNAs που συσχετίζονται με την αυτοφαγία, αυτοφαγία επίσης προκαλείται από ένα δεύτερο μέσο (θρεπτικό συστατικό πείνα), και η έκφραση των miRNAs παρατηρήθηκε επίσης σε αυτό το πλαίσιο. Η αλλαγμένη έκφραση miRNA έδειξε ένα ίδιο μοτίβο κάτω από αμφότερες τις συνθήκες περαιτέρω μαρτυρείται από qRT-PCR σε τρία καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου κόλον. Επιπλέον, η πρόβλεψη βιοπληροφορικής των γονιδίων στόχων, την ανάλυση μονοπατιού και ανάλυση του δικτύου γονιδίων οντολογίας πραγματοποιήθηκαν επίσης στην καλύτερη κατανόηση του ρόλου αυτών των miRNAs στη ρύθμιση της αυτοφαγία. Εμείς αναγνωριστεί και να επιλεγεί τέσσερα μειωτικά miRNAs και 27 ρυθμίζεται αυξητικά miRNAs κατά την κατεργασία με 5-FU και λιμοκτονία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Αυτά τα 31 miRNAs έχουν τις προβλεπόμενες γονιδίων στόχων του κανονισμού της αυτοφαγία, συμπεριλαμβανομένων των βασικών αυτοφαγία γονίδια και οι ρυθμιστικές αρχές αυτοφαγία και έχουν τη δυνατότητα να ρυθμίζουν την αυτοφαγία στο 5-FU χημειοθεραπεία βασισμένη στο CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

5-FU αγοράστηκε από Sigma (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ). LC3 πολυκλωνικό αντίσωμα αγοράστηκε από MBL (MBL, Ναγκόγια, Ιαπωνία). Τα αντισώματα αντι-Ρ62 και αντι-β-ακτίνης ελήφθησαν από τη Sigma, και το αντίσωμα mTOR ήταν από τη Cell Signaling Technology (Cell τεχνολογία σηματοδότησης, Danvers, ΜΑ).

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

ΗΤ29, HCT116 και DLD1 κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος αγοράστηκαν από την Συλλογή Καλλιεργειών Αμερικανικού τύπου, ευγενώς από τον Καθ Kuwano και καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2/95% αέρα με αλλαγές μέσου κάθε δύο ημέρες. Κύτταρα σε φάση mid-log χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Για τη θεραπεία 5-FU, HT29s υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ του 5-FU επί 24 ώρες. Για θρεπτικό πείνα, HT29s επωάστηκαν σε ρυθμιστικό Krebs-Ringer [16] (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 24 mM NaHCO

3, 5.6 mM γλυκόζη, 2 mM ΟαΟ

2, ρΗ 7,6) στους 37 ° C για 7 ώρες.

Μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και την απόπτωση

κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίσθηκε με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας Kit 8 (CCK-8). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες μικροτίτλου σε μία πυκνότητα 1 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά τη θεραπεία, 10 μΙ του διαλύματος CCK-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C για 1 ώρα. Η απορρόφηση του διαλύματος διαβάστηκε φασματοφωτομετρικά στα 450 nm με αναφορά στα 650 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας μικροτίτλου (ΒΙΟ-ΤΕΚ ELX800). Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίσθηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: βιωσιμότητα κυττάρου (%) = Α450 (δείγμα) /Α450 (έλεγχος) × 100

κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκε με χρήση του κιτ ανίχνευσης απόπτωσης.. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με αννεξίνη V-FITC (αννεξίνη V) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Η απόπτωση ορίζεται από αννεξίνης V

+ /ΡΙ

-. (Πρώιμη απόπτωση) και αννεξίνης V

+ /ΡΙ

+ (τέλη απόπτωση), όπως προσδιορίζεται με FACScan (Becton Dickinson)

Ανάλυση autophagy

Ανάλυση του autophagy διεξήχθη κυρίως με ανοσοφθορισμό και ανοσοκηλίδωση για μικροσωληνίσκους πρωτεΐνη που συνδέεται 1Β-ελαφριάς αλυσίδας 3 (LC3) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7], [16]. Για τον προσδιορισμό της ανοσοφθορισμού της LC3, τα κύτταρα του φορείου θάλαμο μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και κατέστησαν διαπερατά με 0,05% Triton Χ-100. Μετά τον αποκλεισμό, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα αντι-LC3 αντίσωμα (1:500 αραίωση) στους 4 ° C όλη τη νύχτα και, επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 αντίσωμα συζευγμένο με αντι-κουνελιού μετά το πλύσιμο. Διαφάνειες τοποθετήθηκαν και εξετάζονται χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (ECLIPSE TE2000-U, Nikon). Χρώση με 0,1 μg /ml 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό πυρήνα. Για ανοσοκηλίδωση της LC3, 20 μα κυτταρολύματος διαχωρίστηκε επί 5-20% Tris-Tricine Ready Gel SDS-PAGE (Bio-Rad), για κηλίδωση διφθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF). Η κηλιδωμένη μεμβράνη μπλοκαρίστηκε και επωάστηκαν με αντι-LC3 (1:1000 αραίωση). Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με την προηγμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας υπεροξειδάση κοχλιαρίας αντίσωμα συζευγμένο με αντι-κουνελιού (1:5000 αραίωση). Ρ62 και mTOR ανοσοαποτύπωση (1:1000 αραιώσεις και τα δύο) πραγματοποιήθηκαν επίσης να αξιολογήσει την κατάσταση αυτοφαγία.

απομόνωση RNA και miRNA μικροσυστοιχιών

Το συνολικό κυτταρικό RNA συλλέχθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA ) και ένα miRNeasy μίνι κιτ (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Exiqon LNA microRNA Ανθρωπίνων Array, συμπεριλαμβανομένων όλων των ανθρώπινων ώριμη miRNAs (Database 18,0) χρησιμοποιήθηκε στο προφίλ έκφρασης των miRNAs και εκτελούνται από KangCheng Bio-Tech Inc (Shanghai, Κίνα). Κάναμε την υποβολή των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μας να γονιδιακής έκφρασης Omnibus, και ο αριθμός είναι GSE61943. Εν συντομία, τα δείγματα RNA (1 μg) επισημάνθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ σήμανσης miRCURY Hy3 και υβριδοποιήθηκε στο Array miRCURY LNA (v.18.0). Μετά την πλύση, τα πλακίδια σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή μικροσυστοιχιών Axon GenePix 4000B, και η πρώτη ένταση της εικόνας διαβάστηκε και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GenePix pro 6.0 λογισμικό (Αχοη). Τέσσερις αναπαραχθεί κηλίδες κάθε ανιχνευτή στην ίδια αντικειμενοφόρο τέθηκαν στον μέσο όρο. Εξέφρασε δεδομένα miRNA ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το διάμεσο εξομάλυνση. Μετά την κανονικοποίηση, διαφορικά εκφρασμένων miRNAs εντοπίστηκαν μέσω Fold Αλλαγή φίλτρου (& gt? = 2)

Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση qRT-PCR για την έκφραση των miRNAs

Οι ποσοτικοί μεταγραφής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης (qRT-. PCR) διεξήχθη για να επικυρώσει τα στοιχεία array miRNA. Ώριμη miRNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα σε cDNA με μεταγραφή αντίστροφης stem-loop χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT (Takara Bio, Shiga, Japan) και ειδικούς εκκινητές stem-loop όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. qRT-PCR για κάθε miRNAs εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας FastStart Essential DNA Πράσινη Μάστερ (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Γερμανία) σε μία μηχανή lightcycle96 (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στον Πίνακα 1. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs ομαλοποιήθηκαν και ποσοτικά με U6 RNA. Η σχετική ποσοτικοποίηση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το 2

(- ΔΔCt). Μέθοδος

Η

Στόχος της πρόβλεψης και της λειτουργίας ανάλυσης

Τα γονίδια-στόχους των miRNAs έχουν προβλεφθεί χρησιμοποιώντας το σημείο τομής των δύο μεγάλων σε απευθείας σύνδεση miRNA αλγόριθμους πρόβλεψης στόχου, TargetScan (https://www.targetscan.org) [17] και PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de) [18], ή TargetScan και miRDB (http: //mirdb .org) [19], αν δεν υπήρχε δεδομένα για ορισμένες miRNAs σε PicTar.

DIANA-miRPath v2.0 (https://www.microrna.gr/miRPathv2) εφαρμόστηκε για να αναλύσει τις κύριες λειτουργίες του miRNAs [20]. Σε γενικές γραμμές, miRNA και πληροφορίες μονοπατιού που σχετίζονται με ελήφθη από miRBase και την Εγκυκλοπαίδεια του Κιότο γονιδίων και γονιδιωμάτων (KEGG) v58.1, αντίστοιχα. Ένα μονόπλευρο ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει τα εμπλουτισμένα μονοπάτια KEGG με τους στόχους των συγκεκριμένων miRNAs, και το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) υπολογίστηκε για να διορθώσει την τιμή p. Εμπλουτισμός παρέχει ένα μέτρο της σημασίας της λειτουργίας? καθώς αυξάνει ο εμπλουτισμός, η αντίστοιχη λειτουργία είναι πιο σημαντική.

Gene Ontology (GO) ανάλυση δίκτυο χρησιμοποιήθηκε επίσης για να αναλυθεί η κύρια λειτουργία των προβλεπόμενων γονιδίων στόχων και να αποκαλύψει το ρυθμιστικό δίκτυο miRNA-γονίδιο με βάση βιολογικές διαδικασίες και μοριακές λειτουργίες. Το plugin CyTargetLinker σε Cytoscape (https://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker) χρησιμοποιήθηκε για να κατασκευαστεί μια ενοποιητική δίκτυο των αλληλεπιδράσεων miRNA-στόχο για τις έξι miRNAs που προσδιορίζονται στη μελέτη μας [21], [22]. Τα επικυρωμένα στόχους για κάθε miRNA ελήφθησαν από mirTarBase, και οι προβλεπόμενες στόχους ελήφθησαν από Targetscan.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση (SD). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση 17.0 του λογισμικού. ρ & lt?. 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

5-FU μείωσε τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων ΗΤ29 ανθρώπινου κόλον,

Το αποτέλεσμα της κύριας χημειοθεραπείας CRC, 5-FU, σε ΗΤ29 καρκινικά κύτταρα κόλου ανθρώπου επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία CCK-8. 5-FU (0~500 μΜ) παρήγαγε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων που έφθασε 64,20% και 42,20% μετά από 5 μΜ θεραπεία 5-FU για 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα (Εικ. 1). 5-FU μπορεί να έχει πολλές επιδράσεις σε κύτταρα ΗΤ29. Κυτταρομετρία ροής αννεξίνης V και χρώση ΡΙ χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της απόπτωσης σε πείραμα μας. Υπήρξαν λίγα απόπτωσης σε κύτταρα ΗΤ29 με 5 μΜ θεραπεία 5-FU για 24 ώρες (S1 Εικ.).

ΗΤ29 κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις (5 μΜ και 25 μΜ) της 5-FU για 12, 24, και 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με CCK-8 δοκιμασίας. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD.

Η

5-FU προκάλεσε την ενεργοποίηση αυτοφαγία σε ΗΤ29 κύτταρα

Η ενεργοποίηση αυτοφαγία από την 5-FU σε κύτταρα ΗΤ29 ανιχνεύθηκε με LC3 ανοσοφθορισμό . Στα κύτταρα ελέγχου, η κατανομή της LC3 έδειξε ένα διάχυτο πρότυπο (κυτταρόπλασμα, LC3- Ι). θεραπεία 5-FU μεταβληθεί η κατανομή LC3 σε πολλούς χοντρό τελείες και διάστικτη χρώση (Εικ. 2Α), και ως αύξηση του χρόνου, οι κουκίδες έγινε πιο έντονη. Οι LC3 θετικά punctuates (LC3-II) αντιπροσωπεύουν αυτοφαγοσώματα. LC3 ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιήθηκε επίσης για να παρατηρήσουν αυτοφαγία (Σχ. 2C). LC3-ΙΙ (16 kDa) προκλήθηκε με 5 μΜ θεραπεία 5-FU για 24 ώρες. Ως χαρακτηριστικό μηχανισμός πρόκλησης επαγωγής αυτοφαγία, θρεπτικό λιμοκτονία πραγματοποιήθηκε επίσης (Σχ. 2Β). Ο λιμός έκανε η χρώση LC3 πιο έντονη, και σε 7 ώρες, υπήρχε κάποια χρώση στικτή. Επιπλέον, η ένταση της LC3 αυξήθηκε κατά ασιτία επί 7 ώρες. Ως δείκτης της ροής αυτοφαγία, ρ62 μειώθηκε τόσο από 5-FU θεραπεία και την πείνα (Σχ. 2C). Μετά από 5 μΜ θεραπεία 5-FU για 24 ώρες, η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων ΗΤ29 αναστάλθηκε, αυτοφαγία ενεργοποιήθηκε, και δεν υπήρχε σχεδόν καμία απόπτωση. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε παγκόσμια προφίλ έκφρασης με προσδιορισμούς microarray miRNA στις δύο ΗΤ29 κύτταρα λιμοκτονούν επί 7 ώρες και ΗΤ29 κύτταρα επεξεργασμένα με 5 μΜ 5-FU για 24 ώρες.

ΗΤ29 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ του 5-FU ή όχι. Η ενεργοποίηση της αυτοφαγία παρατηρήθηκε από LC3 ανοσοφθορισμό (Α). ΗΤ29 κύτταρα στερήθηκαν τροφής εντός ρυθμιστικού Krebs-Ringer ή όχι. Η ενεργοποίηση της αυτοφαγία παρατηρήθηκε από LC3 ανοσοφθορισμό (Β). χρώση ϋΑΡΙ Διεξήχθη για την ταυτοποίηση πυρήνα. LC3, Ρ62 και mTOR ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των προϊόντων λύσεως των κυττάρων ΗΤ29 αντιμετωπίζονται από 5 μΜ της 5-FU για 24 ώρες είτε όχι, και σε νηστεία επί 7 ώρες ή όχι (C). Τα δεδομένα είναι ο εκπρόσωπος του τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Μπαρ, 20 μm.

Η

Αναγνώριση αλλοιωμένη έκφραση των miRNAs με 5-FU και την πείνα στα κύτταρα ΗΤ29

Μετά τη σάρωση των μικροσυστοιχιών και κανονικοποίηση, 124 από 1900 ώριμου ανθρώπινου miRNAs θεωρήθηκαν ως αυξητικά από ασιτία για 7 ώρες σε κύτταρα ΗΤ29, και 56 miRNAs ρυθμίστηκαν προς τα κάτω. Με 5 αγωγή μΜ 5-FU για 24 ώρες, υπήρχαν 302 ρυθμίζεται αυξητικά miRNAs και 86 μειωτικά miRNAs σε κύτταρα ΗΤ29. Την ιεράρχηση των miRNAs συσχετίζονται με τις αλλαγές στην αυτοφαγία, τα miRNAs που δείχνει το ίδιο μοτίβο μεταβληθεί υπό θεραπεία και την πείνα 5-FU (δεύτερο πρότυπο μέσο επαγωγής αυτοφαγία) θεωρήθηκαν πιο πιθανό να εμπλέκονται στη ρύθμιση της αυτοφαγία. Τα miRNAs που δείχνει το ίδιο μοτίβο μεταβάλλεται κάτω από αυτές τις δύο συνθήκες ήταν 94 ρυθμίζεται προς τα πάνω miRNAs και 22 μειωτικά miRNAs (S1 πίνακα). Η πρόβλεψη των miRNA-ρυθμίζονται στόχους γονίδιο είναι ένα απαραίτητο βήμα για την κατανόηση των λειτουργιών μιας δεδομένης miRNA. Το σημείο τομής των δύο διαφορετικά προγράμματα (αλγόριθμοι) αναφέρθηκε αυξάνοντας την ευαισθησία της πρόβλεψης. TargetScan προσδιορίζει στόχους με συντηρημένες συμπληρωματικότητα των σπόρων (νουκλεοτίδια 2-7) του miRNA [23]. Χρησιμοποιήσαμε τη διασταύρωση των TargetScan και PicTar να προβλέψει τα γονίδια-στόχους των αλλοιωμένων miRNAs. Αν δεν υπήρχε δεδομένων PicTar, miRDB χρησιμοποιήθηκε στη θέση του PicTar. Συνολικά, εντοπίσαμε και επιλεγμένα τέσσερις μειωτικά miRNAs, HSA-miR-302a-3ρ, HSA-miR-548ah-5P, HSA-miR-133b και HSA-miR-323A-3ρ, και 27 ρυθμίζεται προς τα πάνω miRNAs, HSA-miR-203a , HSA-miR-99b-5P, HSA-miR-195-5p, HSA-ας-7c-5P, HSA-miR-320d, HSA-miR-301a-3ρ, vmiR-30e-5P, HSA-miR-374c -5p, HSA-miR-181-5P, HSA-ας-7G-5P, HSA-miR-513b-5P, HSA-miR-30β-5P, HSA-miR-19b-3ρ, HSA-miR-19a-3ρ , HSA-miR-15a-5P, HSA-miR-106b-5P, HSA-miR-330-3p, HSA-miR-582-5p, HSA-miR-16-5p, HSA-miR-30a-5P, HSA -miR-23α-3ρ, HSA-miR-26b-5P, HSA-miR-98-5p, HSA-miR-186-5p, HSA-miR-30D-5P, HSA-miR-93-5p και HSA-miR -320c, καθώς έχει τις προβλεπόμενες γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της αυτοφαγία, οι οποίες περιλαμβάνουν πυρήνα γονίδια αυτοφαγία και τις ρυθμιστικές αρχές αυτοφαγία (Πίνακας 2).

η

Εκκαθάριση δεδομένων μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας qRT-PCR σε ΗΤ29, HCT11 , και τα κύτταρα DLD1

για να επικυρώσετε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών, πραγματοποιήσαμε qRT-PCR σε δύο μειωτικά (HSA-miR-302a-3ρ και έχει-miR-548ah-5P) και τέσσερα απορυθμίζεται miRNAs (HSA-ΜΙΚ 30α-5P, HSA-miR-23a-3ρ, HSA-miR-195-5p και HSA-ας-7c-5P) στο 5-FU θεραπεία ή πέθαναν από κύτταρα ΗΤ29. Επειδή ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ετερογενής, η αλλαγμένη έκφραση αυτών των miRNAs προσδιορίστηκε επίσης σε άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου που προέρχεται από δύο ανθρώπινου κόλου, HCT116 και DLD1. Βρήκαμε ότι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από την ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA η έκφραση αυτών των miRNAs άλλαξε σημαντικά με βάση αναγνώσεις qRT-PCR τους (Σχ. 3).

Τρία είδη ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου, ΗΤ29 (Α ), DLD1 (Β) και HCT116 (C), υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Σχ. 2. qRT-PCR διεξήχθη για να επικυρώσει την τροποποίηση της έκφρασης της HSA-miR-302a-3ρ, HSA-miR-548ah-5P, HSA-miR-30a-5P, HSA-miR-23-3p, HSA-miR -195a-5P και HSA-ας-7c-5P κάτω των 5-FU θεραπεία (5-FU) και την πείνα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD. * P & lt? 0,05. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με επαναλήψιμα αποτελέσματα.

Η

ανάλυση Pathway και GO ανάλυση του δικτύου αποκάλυψε την miRNAs-αυτοφαγία

διασύνδεση

Για να αποκτήσουν εικόνα για τις λειτουργίες αυτών των miRNAs, DIANA-miRPath ήταν χρησιμοποιείται για να αναλύσει οδούς KEGG επηρεάζεται από αυτές τις 31 miRNAs (Εικ. 4). Ως αποτέλεσμα, οι υψηλές σημαντικές οδούς εμπλουτισμό των τεσσάρων μειωτικά miRNAs περιελάμβανε την οδό ΜΑΡΚ σηματοδότησης, η οποία έχει αναφερθεί ότι συμμετέχουν θετικά στη ρύθμιση της autophagy [24] (Σχ. 4Α). Ακόμη πιο ενδιαφέρον, μεταξύ των υψηλών σημαντικές οδούς εμπλουτισμό των 27 ρυθμίζεται προς τα πάνω miRNAs, το μονοπάτι σηματοδότησης mTOR σημαντικά προσδιορίζονται από αυτά τα miRNAs (Σχ. 4Β, 4C και 4D). Σταθερά, το επίπεδο πρωτεΐνης mTOR μειώθηκε κάτω από αυτές τις δύο συνθήκες (Σχ. 2C). Επιπλέον, miRNA-mRNA ανάλυση του δικτύου γονίδιο ολοκληρωμένο αυτά τα miRNAs και ΚΟ με την περιγραφή των αλληλεπιδράσεων των miRNA και GO-σχετικών γονιδίων χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cytoscape (Εικ. 5).

DIANA-miRPath v2.0 εφαρμόστηκε για την ανάλυση της κύριες λειτουργίες των επιλεγμένων 31 miRNAs (Α, οι τέσσερις μειωτικά miRNAs? Β, miRNAs υπερεκφράζεται περισσότερο από τέσσερις φορές υπό θεραπεία και την πείνα 5-FU? C, miRNAs ρυθμίζεται προς τα πάνω μεταξύ δύο και τέσσερις φορές κάτω από δύο προϋποθέσεις? D, miRNAs υπερεκφράζεται περισσότερο από τέσσερις φορές και μεταξύ δύο και τέσσερις φορές). Ο κάθετος άξονας είναι η κατηγορία οδού KEGG, και ο οριζόντιος άξονας είναι ο αρνητικός λογάριθμος της

σ

αξίας (-Log

σ

), η οποία εκπροσωπεί τη σημασία των οδών.

Οι ενοποιητική δίκτυα δημιουργήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Cytoscape. Κάθε δίκτυο περιλαμβάνει δύο τύπους κόμβων, μεμονωμένες miRNAs (κόκκινοι κύκλοι) και την προβλεπόμενη στόχους mRNA τους (ροζ εξάγωνο), που προέρχονται από δύο διαφορετικές δημόσιες βάσεις δεδομένων (miRTarBase και Targetscan). Το γράφημα δείχνει ότι οι στόχοι του mRNA εμφανίζονται σε δύο βάσεις δεδομένων, οι οποίες προσδιορίζονται από το χρώμα των βελών που συνδέουν, miRTarBase (κόκκινο) και Targetscan (μαύρο).

Η

Συζήτηση

5 -FU βασίζεται σε χημειοθεραπεία είναι η επικρατούσα τάση του επικουρική θεραπεία της CRC. διαμόρφωσης αυτοφαγία έχει θεωρηθεί ως μια πιθανή στρατηγική για την εφαρμογή της χημειοθεραπείας στη θεραπεία των όγκων [4]. MiRNAs παίζουν σημαντικούς ρόλους στον έλεγχο κυτταρικών λειτουργιών και έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται στην ρύθμιση της αυτοφαγία κατά τα τελευταία έτη [25]. Στο πείραμά μας, η επαγωγή της αυτοφαγία επιβεβαιώθηκε σε ΗΤ29 κύτταρα τόσο από θεραπεία 5-FU και θρεπτικό λιμοκτονία. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση miRNA μικροσυστοιχιών, qRT-PCR, και βιοπληροφορική, εντοπίσαμε και επέλεξε τέσσερις μειωτικά miRNAs συμπεριλαμβανομένων HSA-miR-302a-3ρ και 27 υπερεκφράζεται miRNAs συμπεριλαμβανομένων HSA-miR-30a-5P, HSA-miR-23a-3ρ, HSA- miR-195A-5P, HSA-miR-99b-5P και HSA-ας-7c-5P κάτω από αυτές τις δύο προϋποθέσεις που έχουν τη δυνατότητα να στοχεύσετε γονίδια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της αυτοφαγία (Πίνακας 2). Περαιτέρω λειτουργικές αναλύσεις αυτών των miRNAs πρέπει να εκτελεστεί.

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η αυτοφαγία παίζει σημαντικό ρόλο στη θεραπεία ογκογένεση και όγκων [3]. Μπορεί είτε να αναστέλλουν ή να προωθούν την ογκογένεση ανάλογα με το στάδιο του όγκου. Όσον αφορά τη θεραπεία των όγκων, αυτοφαγία φαίνεται να μεσολαβεί στην επίδραση του αντικαρκινικών παραγόντων καθώς η αναστολή της autophagy καταστέλλει θεραπευτικής αποτελεσματικότητας τους. Autophagy μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί ως απάντηση προ-επιβίωσης για την προώθηση της θεραπευτικής αντίσταση στην κυτταροτοξική θεραπεία. Και η αναστολή της autophagy ενισχύει ναρκωτικά ή που προκαλείται από ακτινοβολία κυτταρικό θάνατο, όπως έχουμε αναφερθεί [6], [7]. Μόρια που εμπλέκονται στη ρύθμιση της αυτοφαγικά διαδικασίας έχουν αναδειχθεί ως υποσχόμενους στόχους για τις καινοτόμες αντικαρκινικών θεραπειών [4].

Autophagy (κυρίως μακροαυτοφαγία) είναι μια καλά οργανωμένη, συντηρημένα καταβολική διαδικασία. Μετά την επαγωγή, τα μέρη του κυτταροπλάσματος απορροφάται σε χαρακτηριστικό κυστίδια διπλή μεμβράνη γνωστή ως αυτοφαγοσώματα (κύστη φύτρων, επιμήκυνση κύστη και ανάκτηση). Στη συνέχεια, αυτοφαγοσώματα ενώνονται με αργά ενδοσώματα ή λυσοσώματα, σχηματίζουν την autolysosome (σύντηξη). Η έκθεση του εσωτερικού διαμερίσματος να λυσοσωμιακό υδρολάσες προκαλεί αποικοδόμηση του κυτταροπλασματικής φορτίου, και τα προκύπτοντα προϊόντα αποικοδόμησης στη συνέχεια απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα για ανακύκλωση. Αυστηρό έλεγχο της αυτοφαγία είναι απαραίτητη για την ομοιόσταση των κυττάρων και την απόκριση σε κυτταρικό στρες. Μια μεγάλη οικογένεια του πυρήνα ρυθμιστικές αυτοφαγία, η αυτοφαγία (ATG)-σχετικών γονιδίων, χρησιμεύει για τη ρύθμιση συντονισμένα τη σταδιακή εξέλιξη της αυτοφαγία από την επαγωγή αυτοφαγία στην κύστη φύτρων, επιμήκυνση κύστη, την ανάκτηση και την σύντηξη [26]. Επιπλέον, ένα ποικίλο και περίπλοκο δίκτυο μονοπατιών ανάντη σηματοδότησης συμβάλλει στην ρύθμιση autophagy συμπεριλαμβανομένης της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ), RAS-πρωτο-ογκογονίδιο και AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) μονοπάτια, πολλά από τα οποία συγκλίνουν στο στόχο θηλαστικών ραπαμυκίνη συγκρότημα 1 (mTORC1), ένας βασικός αρνητικός ρυθμιστής της αυτοφαγία σηματοδότησης [27].

στο πείραμά μας, 27 miRNAs που ενδεχομένως να στοχεύουν τα γονίδια που ρυθμίζουν αυτοφαγία βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά από θεραπεία 5-FU ή πείνα. ανάλυση μονοπάτι πρότεινε ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι του mTOR σημαντικά προσδιορίζονται από αυτά τα miRNAs. Είχε προηγουμένως αποδειχθεί σε κύτταρα καρκίνου του μαστού λόγω θρεπτικό συστατικό αποτελέσματα ασιτία σε αύξηση autophagy μέσω αναστολής του mTOR [28]. Τα αποτελέσματά μας επίσης υποστήριξε ένθερμα αυτό το αποτέλεσμα κατά τη διάρκεια της 5-FU που προκαλείται από αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Μεταξύ αυτών των miRNAs, οι προβλεπόμενες γονιδίων στόχων του HSA-miR-99b-5P περιλαμβάνονται mTOR. Και η αύξηση αυτού του miRNA σε δύο τύπους επαγωγής αυτοφαγία (θεραπεία 5-FU και ασιτία) ήταν σημαντική, 5.624 και 6.243 φορές υψηλότερη από τον έλεγχο. εντάλματα HSA-miR-99b-5P περαιτέρω έρευνα στη ρύθμιση της αυτοφαγία στη θεραπεία 5-FU σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Εκτός από το δίκτυο mTOR, ο beclin1 δίκτυο αναφέρθηκε επίσης για τη ρύθμιση αυτοφαγία στον καρκίνο του μαστού [29]. Η Bcl2 οικογένεια μπλοκ πείνας που προκαλείται από αυτοφαγία αλληλεπιδρώντας με την περιοχή ΒΗ3 των Beclin1 και είναι αρνητικοί ρυθμιστές της αυτοφαγία. Στο πείραμά μας, HSA-ας-7c-5P, HSA-miR-195-5p, HSA-miR-23a-3ρ, HSA-miR-15a-5P, HSA-miR-98-5p, και HSA-miR-181 -5p προβλέπεται να στοχεύσετε γονίδια στην οικογένεια Bcl2 και επίσης να δικαιολογεί περαιτέρω διερεύνηση. Αν και αυτά τα 27 miRNAs έδειξε υπερέκφραση κάτω από αυτές τις δύο μεθόδους επαγωγές αυτοφαγία, που προβλέπεται να στοχεύσετε πυρήνα αυτοφαγία γονίδια? HSA-miR-30a-5P στόχευση των BECN1 και ATG5 έχει αποδειχθεί σε προηγούμενες εκθέσεις [30]. Η λειτουργία αυτών των miRNAs πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Επιπλέον, υπήρχαν μόνο τέσσερις μειωτικά miRNAs με προβλεπόμενη στόχους που εμπλέκονται στη ρύθμιση αυτοφαγία, μικρότερη από την ποσότητα της απορυθμίζεται miRNAs. Κατέδειξε επίσης τη σημασία του μονοπατιού σηματοδότησης mTOR στη ρύθμιση της αυτοφαγία. Επιπλέον, προέβλεψε γονιδίων στόχων που περιλαμβάνονται πυρήνα αυτοφαγία γονίδια? HSA-miR-302a-3ρ στόχους ULK1 και HSA-miR-548ah-5P στοχεύει ATG16L1, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι τέσσερις miRNAs συμμετέχουν στη διαδικασία αυτοφαγία στο 5-FU θεραπεία και έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί για να χειραγωγήσουν αυτοφαγία στο 5-FU με βάση χημειοθεραπείας σε CRC.

Οι ρόλοι της αυτοφαγία στον καρκίνο εξαρτώνται από τον τύπο του καρκίνου, το πλαίσιο και την τοποθεσία [4]. Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρώθηκε σε 5-FU που προκαλείται αυτοφαγία σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου που βασίζονται σε άλλες προηγούμενες εκθέσεις μας και. είχε Υπάρχουν 4 κάτω-ρυθμίζονται miRNAs συμπεριλαμβανομένων HSA-miR-302a-3ρ και HSA-miR-548ah-5P? και 27 επάνω ρυθμισμένη miRNAs συμπεριλαμβανομένων HSA-ας-7c-5P και HSA-miR-30a-5P κατά την κατεργασία με 5-FU και λιμοκτονία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Αυτά τα 31 miRNAs έχουν τις προβλεπόμενες γονιδίων στόχων του κανονισμού της αυτοφαγία, συμπεριλαμβανομένων των βασικών γονιδίων αυτοφαγία και τις ρυθμιστικές αρχές αυτοφαγία και πολλά υποσχόμενη στόχοι για τη διαφοροποίηση αυτοφαγία στο 5-FU χημειοθεραπεία με βάση το CRC. Τα στοιχεία αυτά θα μπορούσαν επίσης να ρίξει φως στο miRNAs-αυτοφαγία αλληλεπιδράσεων σε άλλους τύπους καρκίνου, καθώς και να παρέχει ένα μηχανισμό για δυνητικά ρυθμίζουν αυτοφαγία στην κλινική πράξη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ.

5-FU προκαλεί λίγη απόπτωση σε κύτταρα ΗΤ29. ΗΤ29 κύτταρα επωάστηκαν με 5-FU για 24 ώρες. Κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V και ΡΙ διεξήχθη για την ανίχνευση της απόπτωσης στο πείραμά μας. Υπήρξε μικρή απόπτωση των κυττάρων ΗΤ29 μετά τη θεραπεία 5-FU για 24 ώρες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0114779.s001

(ΔΕΘ)

S1 πίνακα. έκφραση

Διαφορικές miRNA στην πείνα (Starv) έναντι του ελέγχου (Ctrl) και 5-FU έναντι του ελέγχου (DMSO) σε ΗΤ29

doi:. 10.1371 /journal.pone.0114779.s002

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Καθ Kuwano H και Καθ Torii S (απόφοιτος της ιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Γκούνμα, Μαεμπάσι, Ιαπωνία) για την ευγενική βοήθειά τους. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω Aiying Wang και Lin Yu για την τεχνική υποστήριξή τους.