Αφηρημένο

Ιστορικό

Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι η πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στις δυτικές χώρες. Η ανάπτυξη αποτελεσματικότερων θεραπευτικών NSCLC θα απαιτήσει τη διαλεύκανση των γενετικών και βιοχημικών βάσεις για αυτή την ασθένεια. Βρογχιοκυψελιδικό βλαστοκύτταρα (BASCs) αποτελούν ένα υποθετικό κυτταρικό πληθυσμό καρκινικά βλαστικά σε μοντέλα ποντικών του ογκογόνου

K-ras

επαγόμενη αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, μια ιστολογική υπότυπο του NSCLC. Τα σήματα που ενεργοποιούνται από ογκογόνο Κ-ras που μεσολαβούν επέκταση BASC δεν έχουν πλήρως οριστεί.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Χρησιμοποιήσαμε γενετικές και φαρμακολογικές προσεγγίσεις για την διαμόρφωση της δραστικότητας της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης ( ΡΙ3Κ), κύριος μεσολαβητής των ογκογόνων

K-ras,

σε δύο γενετικά μοντέλα ποντικών του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Οι ογκογόνοι

K-ras

επαγόμενη συσσώρευση και ανάπτυξη του όγκου BASC αποκλείστηκαν με επεξεργασία με ένα μικρό μόριο αναστολέα ΡΙ3Κ και ενισχυμένη με αδρανοποίηση του

φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγραφεί από το χρωμόσωμα 10

, ένας αρνητικός ρυθμιστής της PI3K

Συμπεράσματα /Σημασία

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι PI3K είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής της επέκτασης BASC, υποστηρίζοντας στρατηγικές θεραπείας για να στοχεύσουν PI3K σε ασθενείς με NSCLC

Παράθεση:.. Yang Υ , Iwanaga Κ, Ράσο MG, Wislez Μ, Hanna ΑΕ, Wieder ΕΔ, et al. (2008) κινάσης φωσφατιδυλινοσιτόλης-3 Μεσολαβεί βρογχιοκυψελιδικό εκτατό στέλεχος κυττάρων σε μοντέλα ποντικών ογκογόνων

K-ras

Επαγόμενου καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 3 (5): e2220. doi: 10.1371 /journal.pone.0002220

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27η Δεκεμβρίου 2007? Αποδεκτές: 14, Απρ, 2008? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2008

Copyright: © 2008 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. R01 CA117965 , R01 CA105155, U01 CA105352

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι ο κορυφαίος. αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στις δυτικές χώρες και η συχνότητά του αυξάνεται στην Ασία. Μόλις έχει κάνει μετάσταση, δεν υπάρχουν θεραπευτικές θεραπείες για NSCLC. Μια καλύτερη κατανόηση των παραγόντων παθογένεση και τον κίνδυνο για την ασθένεια αυτή θα συμβάλλει όχι μόνο στη βελτίωση έγκαιρη ανίχνευση και την πρόληψη αλλά και για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών για αυτήν.

Περίπου το 10% των δειγμάτων NSCLC φέρουν μεταλλάξεις ενεργοποίησης στο

K-ras

[1]. Η ιστολογική υπότυπος του NSCLC που πολύ συχνά έχει

K-ras

μεταλλάξεις είναι αδενοκαρκίνωμα? Το 30% των αδενοκαρκινωμάτων έχουν αυτές τις μεταλλάξεις.

K-ras

μεταλλάξεις έχουν επίσης εντοπιστεί σε άτυπη αδενωματώδης υπερπλασία (AAH) βλάβες, οι οποίες πιστεύεται ότι προηγείται η ανάπτυξη αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [2]. Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι

K-ras

μεταλλάξεις είναι σημαντικές στην έναρξη της ανάπτυξης αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Οι μοντέλα ποντικών έχουν αναπτυχθεί που εκφράζουν μεταλλαγμένο

K-ras

υπό όρους, σωματικά ή επαγόμενα [3] – [7]. Αυτά τα ποντίκια αναπτύσσουν βλάβες AAH γρήγορα και με μεγάλη διεισδυτικότητα, και ένα υποσύνολο αυτών των βλαβών προχωρήσουν σε αδενοκαρκινώματα.

Ένας υποψήφιος καρκίνο του πνεύμονα προγονικών κυττάρων (βρογχοκυψελιδικού βλαστικών κυττάρων ή BASC) έχει προσδιοριστεί σε μοντέλα ποντικών

K-ras

επαγόμενη καρκίνο του πνεύμονα. BASCs έχουν ένα συγκεκριμένο μοτίβο της έκφρασης δείκτη βλαστικών κυττάρων (Sca-1

pos CD34

pos CD45

αρν PECAM

αρνητικά), βρίσκονται στο τερματικό βρόγχους, και έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και υφίστανται διαφοροποίηση πολλών linage [8]. Αυτά τα κύτταρα μπορεί να είναι η ίδια όπως η παραλλαγή Clara (ή Clara

V) κύτταρα, τα οποία βρίσκονται δίπλα σε συστάδες των νευροενδοκρινικών οργανισμών βρόγχους και βρογχιόλια. Παρόμοια με BASCs, Κλάρα

V κύτταρα είναι ικανά να αποκαταστήσουν τον πληθυσμό των κυττάρων Clara μετά από τραυματισμό ναφθαλίνης [9]. Μετά από ενδο-ρινική εγκατάσταση του αδενοϊικού Cre σε Kras

LSL ποντίκια, τα οποία αναπτύσσουν αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα λόγω της ενεργοποίησης ενός υπό όρους ογκογόνο

K-ras

αλληλόμορφο [5], BASCs πολλαπλασιαστούν ταχέως πριν από την ανάπτυξη της ιστολογικής ανωμαλίες [8]. Οι BASCs σε αυτά τα ποντίκια περιέχουν

K-ras μεταλλάξεις

πανομοιότυπα με εκείνα που βρέθηκαν σε όγκους [8]. Βάσει των στοιχείων αυτών, οι BASCs τεκμηριωθεί ότι είναι πρόγονοι των πνευμονικού αδενοκαρκινώματος σε ποντικούς. Τα βιοχημικά σήματα που κινεί την επέκταση αυτού του κυτταρικού πληθυσμού δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Αυτή η ανεπάρκεια είναι σημαντικό, δεδομένου ότι η διαλεύκανση αυτών των σημάτων μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη θεραπεία για τους ασθενείς με NSCLC.

Προκακοήθεις αλλοιώσεις συνήθως υποβάλλονται σε παροδική αύξηση που ακολουθείται από προγραμματισμένο γήρανση, και μόνο μια μειοψηφία των πρώιμων αλλοιώσεων εξελίσσεται σε ένα πλήρως μεταμορφωθεί κατάσταση. Στην περίπτωση των Ras-εξαρτώμενη μοντέλα ποντικού καρκίνου, ο προγραμματισμένος γήρανση των προκακοήθων βλαβών ενεργοποιείται από μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάση κινάση /εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται σηματοδότηση κινάσης, η οποία αναστέλλει Ras μέσω οδών ανάδρασης που περιλαμβάνουν αυξημένη έκφραση SPROUTY πρωτεΐνες, Ras ΟΤΡάσης ενεργοποίησης πρωτεΐνες, και που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάση πρωτεΐνης φωσφατάσης-3 [10]. Το πρόγραμμα γήρανσης σε προκαρκινικές αλλοιώσεις μπορεί να μπλοκαριστεί από φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) ενεργοποίηση [10], υποδεικνύοντας ότι ΡΙ3Κ είναι κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας του κακοήθη εξέλιξη αυτών των βλαβών. Στην πραγματικότητα, σηματοδότηση PI3K είναι μόνιμα ενεργοποιημένη στα κύτταρα NSCLC μέσω αδρανοποίησης σωματικές μεταλλάξεις, ή επιγενετική αποσιώπηση,

φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγραφεί από το χρωμόσωμα 10

(

PTEN

), ένα λιπίδιο φωσφατάση ότι ρυθμίζει αρνητικά την ΡΙ3Κ σηματοδότηση καταρράκτη [11] – [15]

στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη σημασία της ΡΙ3Κ στην ρύθμιση της επέκτασης της BASCs σε δύο γενετικά μοντέλα ποντικών του ογκογόνου

K-RAS-.

που προκαλείται από τον καρκίνο του πνεύμονα. Οι ογκογόνο

K-ras

Τα αλληλόμορφα σε αυτά τα μοντέλα ενεργοποιούνται σωματικά σε ένα (Kras

LA1) και υπό όρους στην άλλη (Kras

LSL) (5, 7). Βρήκαμε αυξημένους αριθμούς BASCs σε αυτά τα ποντίκια σε σχέση με εκείνες του ίδιας γέννας αγρίου τύπου. BASC επέκταση και κακοήθη εξέλιξη στον πνεύμονα ήταν εξασθενημένο από φαρμακολογική αναστολή των PI3K και ενισχύεται από τη γενετική απενεργοποίηση του

PTEN

. Εμείς κάνουμε εικασίες με βάση αυτές τις διαπιστώσεις ότι η φαρμακολογική στρατηγικές για την αναστολή της ΡΙ3Κ θα είναι χρήσιμη στην πρόληψη και τη θεραπεία του NSCLC.

Αποτελέσματα

PX-866 αναστέλλει πνεύμονα ογκογένεση στο Kras

LA1 ποντίκια

υποτεθεί ότι ΡΙ3Κ απαιτείται για κακοήθη εξέλιξη σε καρκίνο του πνεύμονα και δοκιμάζονται αυτή την υπόθεση, χρησιμοποιώντας ποντίκια Kras

LA1 ως μοντέλο πνεύμονα ογκογένεσης. Αρκετές εβδομάδες μετά τη γέννηση, Kras

ποντίκια LA1 παρουσιάζει πολυεστιακή βλαβών AAH που, από 2-3 μηνών, συγχωνεύονται σε στερεά ή θηλώδες αδένωμα, η οποία διευρύνει και να υποβληθούν σε ιστολογική μετασχηματισμό σε αδενοκαρκινώματα από 6-8 μήνες [7]. Αξιολογήσαμε πρώτα την έκφραση της ΡΙ3Κ (ρ110α και β ισομορφές) στους ιστούς του πνεύμονα σε διάφορα στάδια της ογκογένεσης (ΑΑΗ, αδένωμα, ή αδενοκαρκίνωμα). Αυτές οι ισομορφές PI3K εντοπίστηκαν και αφθονία τους αυξήθηκε με κακοήθη εξέλιξη (ΑΑΗ βλάβες

έναντι

αδενοκαρκινώματα:

P

= 0,006 για ρ110α?

P

& lt? 0,001 για ρ110β) ( Εικόνα 1Α).

(Α) έκφραση ΡΙ3Κ αυξάνει με κακοήθη εξέλιξη. Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημική χρώση των αλλοιώσεων σε μικροσυστοιχία ιστό και τον ποσοτικό προσδιορισμό τους σε παρακείμενες γραφήματα ράβδων. Βαθμονόμησης μπαρ στο κάτω δεξί πάνελ αντιπροσωπεύει 100 μm. Οι βαθμολογίες των μικτών (στερεό /θηλώδες) αδενώματα που περιλαμβάνονται σε γραφήματα ράβδων αλλά όχι σε εικόνες χρώσης PI3K. (Β) ΡΙ3Κ απαιτείται για την ανάπτυξη του όγκου. Οι μέσες μεταβολές στον αριθμό των όγκων και του όγκου καθορίζεται από μικρο-υπολογιστική τομογραφία που εκτελούνται πριν και μετά τη θεραπεία. (*

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το όχημα). (C) PX-866 αναστέλλει ΡΙ3Κ σε ιστούς του πνεύμονα. Western κηλίδωση του Ser473-φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (Ρ-ΑΚΤ) και Ser21 /9-φωσφορυλιωμένο GSK3 (P-GSK3α /β) σε προϊόντα λύσης ολικού πνεύμονα από ποντίκια (η = 7 για κάθε ομάδα θεραπείας). Οι θέσεις των δεικτών μοριακού βάρους υποδεικνύονται στα αριστερά. (D) PX-866 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημική χρώση του Ser28-φωσφορυλιωμένο Η3 ιστόνης (Ρ-Η3) στην αδενώματα στην μικροσυστοιχία ιστού (χ 20 μεγέθυνση, περιοχές με θετικά κύτταρα περικυκλώνεται) και ποσοτικοποίηση της χρώσης σε 16 αλλοιώσεις από ποντικούς υπό αγωγή με όχημα και 4 αλλοιώσεις από PX-866 κατεργασμένα ποντίκια (ραβδόγραμμα, *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με το όχημα). Κύριο θέμα απεικονίζει περικυκλώνεται κύτταρα σε × 40 μεγέθυνση. Βαθμονόμησης μπάρες αντιπροσωπεύουν 200 μm.

Η

Με βάση την αυξημένη αφθονία της σε πλήρως μετασχηματισμένα κύτταρα, έχουμε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν PI3K ήταν απαραίτητη για την ανάπτυξη του όγκου. Θεραπεία της K-ras

όγκος LA1 ποντικών με PX-866, ένας αναστολέας ΡΙ3Κ [16], μειωμένη πνευμονική βλάβη και πολλαπλότητα (Σχήμα 1Β). Αυτό συνοδεύτηκε από μείωση της δραστηριότητας ΡΙ3Κ όπως φαίνεται από τη δυτική αποτύπωση των προϊόντων λύσης ολόκληρου του πνεύμονα για την φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ και την κινάση συνθάση γλυκογόνου-3 (Σχήμα 1C). Τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε μείωση του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από PX-866 βασίζεται σε ενδοτραυματική Η3 φωσφορυλιωμένη ιστόνη (Σχήμα 1 D), αλλά δεν επέδειξαν κανένα βιοχημικές ενδείξεις απόπτωσης όπως δεικνύεται με κηλίδωση Western για διασπασμένης κασπάσης-3 και Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, η θεραπεία με ανταγωνιστή της PI3K ανέστειλε βαθιά την ανάπτυξη αυτών των πρώιμων βλαβών.

BASCs είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε PX-866

in vivo

και

in vitro

Η

επόμενο καθοριστεί αν η αντικαρκινική δράση του PX-866 στο Kras

ποντίκια LA1 ήταν εν μέρει οφείλεται στην αναστολή της επέκτασης BASC. Στο τερματικό βρόγχους, ένα υποσύνολο των επιθηλιακών κυττάρων εκφράζεται τόσο ειδική πρωτεΐνη Κλάρα κυττάρων (CCSP) και επιφανειοδραστικό πρωτεΐνη-C (SPC) (Σχήμα 2), το οποίο είναι ένα σήμα κατατεθέν της BASCs [8]. Ποσοτικοποίηση της διπλής-θετικών κυττάρων σε ποντικούς άγριου τύπου (με 83 βρόγχους) και Κ-ras

LA1 ποντίκια (με 66 βρόγχοι) αποκάλυψε ότι δεν ποντικούς άγριου τύπου είχε περισσότερο από 3 BASCs ανά τερματικό βρόγχο, ενώ ένα υποσύνολο τερματικό βρόγχων στην K-ras

LA1 ποντίκια είχαν 4 έως 7 (

P

= 0,042, άγριου τύπου

έναντι

Kras

LA1) (Σχήμα 2). Έτσι, ένα υποσύνολο των τερματικών βρόγχων σε Kras

LA1 ποντίκια είχαν διαστολή BASC. Επιπλέον, τριπλό μελέτες ανοσοφθορισμού αποκάλυψαν ότι BASCs εκφράζεται ρ110α και είχαν ανιχνεύσιμη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ (Σχήμα 3), ένα προς τα κάτω μεσολαβητής της ΡΙ3Κ, το οποίο αποδεικνύει την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ σε αυτά τα κύτταρα. Χρησιμοποιώντας τομές ιστών από τον Kras

LA1 ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με PX-866 (με 88 τερματικές βρόγχους) ή όχημα (με 81 τερματικές βρόγχων), προσδιορίσαμε τον αριθμό των BASCs ανά τερματικό βρόγχο στις ομάδες θεραπείας. Οι ποντικοί υπό αγωγή με όχημα είχε ένα υποσύνολο του τερματικού βρόγχων με 4 έως 7 BASCs ανά τερματικό βρόγχο, ενώ κανένα από τα PX-866-αγωγή ποντικοί είχαν περισσότερα από τρία BASCs ανά τερματικό βρόγχο (

P

= 0.025, όχημα

έναντι

PX-866-θεραπεία) (Σχήμα 4).

χρώση ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση κυττάρων σε τερματικό βρόγχους που συν-εκφράζουν CCSP και SPC. Περικυκλωμένη BASCs στην κορυφή πάνελ (x10 μεγέθυνση) φαίνεται στο κάτω πάνελ σε μεγαλύτερη μεγέθυνση (x40). ραβδόγραμμα δείχνει ποσοστά των τερματικών βρόγχων με τα αναφερόμενα αριθμούς BASCs. Βαθμονόμησης μπαρ σε εικόνες της H & amp? Ε βάφονται ιστούς αντιπροσωπεύουν το 50 μm

Η

χρώση ανοσοφθορισμού των τμημάτων ιστού για να ανιχνεύσει τριπλά χρωματισμένα κύτταρα (CCSP /SPC /ρ110α ή ρΑΚΤ) στον ακροδέκτη βρόγχων.. BASCs περικυκλώνεται (x40 μεγέθυνση). Βαθμονόμησης μπαρ στο κάτω δεξιό πίνακα αντιπροσωπεύει 50 μm.

Η

χρώση ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση κυττάρων σε τερματικό βρόγχους που συν-εκφράζουν CCSP και SPC. Περικυκλωμένη BASCs στην κορυφή πάνελ (× 10 μεγέθυνση) φαίνεται στο κάτω πάνελ σε μεγαλύτερη μεγέθυνση (× 40). ραβδόγραμμα δείχνει ποσοστά των τερματικών βρόγχων με τα αναφερόμενα αριθμούς BASCS. Βαθμονόμησης μπαρ σε εικόνες της H & amp? Ε βάφονται ιστούς αντιπροσωπεύουν το 50 μm

Η

Για να προσδιορίσετε αν PX-866 είχε άμεσες επιπτώσεις στην Kras

LA1 που προέρχονται BASCs, χρησιμοποιήσαμε πρωτογενείς καλλιέργειες BASC, που ήταν. απομονωθεί από τους πνεύμονες του Kras

ποντίκια LA1 από τη διαλογή για κύτταρα που ήταν Sca-1

pos, CD34

pos, CD45

αρνητικά και CD31

αρν. Αυτά τα διαλεγμένα κύτταρα συν-εκφράζονται CCSP και SPC (Σχήμα 5Α), που σχηματίζονται αποικίες όταν απλώνονται σε καλλιέργειες τροφοδοσίας (Σχήμα 5Β), και παρουσίασαν πολλαπλών δυνητική ικανότητα διαφοροποίησης όταν τοποθετήθηκαν σε matrigel (Σχήμα 5C), που είναι το σήμα κατατεθέν του BASCs [8] . PX-866 θεραπείας οδήγησε σε περίοπτη μείωση της δραστηριότητας σχηματισμού αποικιών BASC (Σχήμα 5D), υποδεικνύοντας ότι PX-866 είχε άμεση επίδραση στην BASCs.

(Α) Ταξινόμηση κύτταρα συν-express SPC και CCSP. KRAS

LA1 σύνολό τους ιστούς των πνευμόνων διαχωρίστηκαν και διαλογή για την απομόνωση Sca-1

pos CD45

αρν CD31

αρν CD34

pos κύτταρα (Ρ4 και Ρ5 στο αριστερό και το μεσαίο πάνελ, αντίστοιχα), που υποβλήθηκαν σε χρώση ανοσοφθορισμού (x40 μεγέθυνση, δεξί πάνελ). Βαθμονόμησης μπαρ στο δεξιό άκρο του πίνακα αντιπροσωπεύει το 10 μm. (Β) BASCs σχηματίσουν αποικίες όταν απλώνονται σε καλλιέργειες τροφοδότη. Φωτογραφία της αποικίας (x10 μεγέθυνση) σχηματίζεται κατά την αρχική επένδυση (Ρ1) και το πέρασμα 2 (P2). Βαθμονόμησης μπαρ στον πίνακα στα δεξιά αντιπροσωπεύει το 50 μm. (C) BASCs διαφοροποιούνται όταν τοποθετήθηκαν σε matrigel. Τα κύτταρα βάφτηκαν μετά από 7 ημέρες σε matrigel (x10 μεγέθυνση) και τον αριθμό των κυττάρων με τα χαρακτηριστικά των κυττάρων του κυψελιδικού τύπου ΙΙ (CCSP

αρν ΕΚΠ

pos), τα κύτταρα Clara (CCSP

pos ΕΚΠ

αρν ), ή BASCs (CCSP

pos ΕΚΠ

pos) μετρήθηκαν και εκφράστηκαν ως ποσοστά του συνόλου των 158 υπολογίζονται τα κύτταρα σε ένα γράφημα πίτας. Τα παραδείγματα των κυττάρων με τα χαρακτηριστικά των κυττάρων ΑΤΙΙ (ΑΤΙΙ) και τα κύτταρα Clara (CC) που υποδεικνύεται. Βαθμονόμησης μπαρ στο δεξιό άκρο του πίνακα αντιπροσωπεύει το 50 μm. (D) PX-866 αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών BASC. Οι φωτογραφίες (x10 μεγέθυνση) και τον ποσοτικό προσδιορισμό των αποικιών ανά πηγάδι (5 φρέατα ανά κατάσταση) που σχηματίζεται μετά από 6 d σε παρουσία ή απουσία PX-866. Βαθμονόμησης μπαρ στον πίνακα στα δεξιά αντιπροσωπεύει 50 μm.

Η

PTEN

ανεπάρκεια ενισχύει τον ογκογόνο

K-ras

επαγόμενη BASC συσσώρευση

Ως ένα άλλο προσέγγιση για την αξιολόγηση του ρόλου της ΡΙ3Κ σε επέκταση BASC, έχουμε αδρανοποιούνται

ΡΤΕΝ

, ένας αρνητικός ρυθμιστής της ΡΙ3Κ, σε κύτταρα CCSP εκφράζουν.

PTEN

γενετικά αδρανοποιηθεί χρησιμοποιώντας

PTEN

Flox /+ ποντίκια, τα οποία έχουν ένα

PTEN

αλληλόμορφο που περιέχει

ΙοχΡ

περιοχές γύρω από το τομέα ΡΤΕΝ φωσφατάσης που κωδικοποιείται από το εξόνιο 5 [17].

ΡΤΕΝ

ανασυνδυάσθηκε ειδικώς στον πνεύμονα με διασταύρωση αυτών των ποντικών με CCSP

Cre /+ ποντίκια, που εκφράζουν Cre υπό τον έλεγχο του

CCSP

γονίδιο [18]. Επιπλέον, θα αξιολογηθεί κατά πόσον

PTEN

αδρανοποίηση συνεργάστηκε με ογκογόνο

K-ras

για την προώθηση της επέκτασης BASC.

ΡΤΕΝ

ελλιπή ως ποντικοί διασταυρώθηκαν με K-ras

ποντίκια LSL, στην οποία η έκφραση των ογκογόνων

K-ras

G12D

ελέγχεται από ένα στοιχείο τερματισμού της μεταγραφής STOP αφαιρούμενο [5]. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, τα ποντίκια δημιουργήθηκαν με βρόγχους που

PTEN

ελλιπή ως (PTEN

Δ5 /Δ5? CCSP

Cre /+), εκφράζουν ογκογόνο

K-ras

( KRAS

Lox /+? CCSP

Cre /+), έχουν

PTEN

ανεπάρκεια και ογκογόνο

K-ras

έκφρασης (ΡΤΕΝ

Δ5 /Δ5? Kras

Lox /+? CCSP

Cre /+), ή έχουν ούτε (PTEN

Flox /Flox? CCSP

+ /+). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν σε 4 εβδομάδες ή 12 εβδομάδες, και οι ιστοί των πνευμόνων τους υποβλήθηκαν σε μελέτες ανοσοφθορισμού για την ποσοτικοποίηση BASCs.

Όπως ήταν αναμενόμενο, τριπλή χρώση ανοσοφθορισμού (CCSP /SPC /ΡΤΕΝ) αποκάλυψε απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ σε BASCs από ποντίκια που ήταν και οι δύο

PTEN

ελλιπή ως και

K-ras-μεταμορφωμένων

(PTEN

Δ5 /Δ5? Kras

Lox /+? CCSP

Cre /+) αλλά όχι σε ποντίκια που ήταν μόνο

K-ras-μεταμορφωμένων

(Kras

Lox /+? CCSP

Cre /+) (Σχήμα 6). Ποσοτικοποίηση των BASCs ανά τερματικό βρόγχο στις 4 εβδομάδες αποκάλυψε ότι

PTEN

-deficiency μόνο (PTEN

Δ5 /Δ5? CCSP

Cre /+) δεν ήταν αρκετή για να αλλάξει BASC αριθμούς σε σχέση με εκείνη του ελέγχου ποντίκια (PTEN

Flox /Flox? CCSP

+ /+) (Σχήμα 7). Ωστόσο, η σύγκριση των αριθμών BASC στην PTEN

Δ5 /Δ5? KRAS

Lox /+? CCSP

Cre /+ ποντίκια με εκείνη του Kras

Lox /+? CCSP

/+ ποντίκια Cre έδειξε ότι

PTEN

ανεπάρκεια εντυπωσιακά βελτιωμένη επέκταση BASC από ογκογόνο

K-ras

(

P

= 0,006, PTEN

Δ5 /Δ5? Kras

Lox /+? CCSP

Cre /+

έναντι

Kras

Lox /+? CCSP

Cre /+) (Σχήμα 7). Εκτός από αυτά τα ευρήματα στο τερματικό βρόγχων, συστάδες CCSP

pos ΕΚΠ

κύτταρα pos παρατηρήθηκαν στους βρόγχους και μικρών βρόγχων του PTEN

Δ5 /Δ5? KRAS

Lox /+? CCSP

Cre /+ ποντίκια? Αυτές οι συστάδες κυττάρων ήταν εμφανής ήδη από ηλικία των 4 εβδομάδων και δεν ήταν παρόντες στους βρόγχους ή βρόγχους των Kras

Lox /+? CCSP

/+ ποντίκια Cre (Σχήμα 8). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι

PTEN

αδρανοποίηση συνεργάστηκε με ογκογόνο

K-ras

για την ενίσχυση της συσσώρευσης BASC.

ανοσοφθορισμού χρώση τομών ιστού για να ανιχνεύσει τριπλά βάφονται (CCSP /SPC /ΡΤΕΝ) κύτταρα σε τερματικό βρόγχων. BASCs (περικυκλώνεται) απεικονίζονται στο × 10 μεγέθυνση. Βαθμονόμησης μπαρ στο κάτω δεξί πάνελ αντιπροσωπεύει 100 μm.

Η

χρώση ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση κυττάρων σε τερματικό βρόγχους που συν-εκφράζουν CCSP και SPC. BASCs (περικυκλώνεται) απεικονίζονται στο × 40 μεγέθυνση. ραβδόγραμμα δείχνει ποσοστά των τερματικών βρόγχων με τα αναφερόμενα αριθμούς BASCS. Βαθμονόμησης μπαρ στο κάτω δεξί πάνελ αντιπροσωπεύει 100 μm.

Η

χρώση ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση κυττάρων που συν-εκφράζουν CCSP και SPC. BASCs (περικυκλώνεται) απεικονίζονται στο × 10 μεγέθυνση. γράφημα ράβδων απεικονίζει τα ποσοστά των βρόγχων με τα αναφερόμενα αριθμούς BASCS. Βαθμονόμησης μπαρ στο κάτω δεξί πάνελ αντιπροσωπεύει 100 μm.

Η

Συζήτηση

Εδώ αναφέρουμε ότι PI3K ήταν απαραίτητη για την επέκταση BASC ξεκίνησε από ογκογόνο

K-ras

και, όταν συστατικά ενεργοποιείται από

PTEN

αδρανοποίηση, PI3K συνεργάστηκε με ογκογόνο

K-ras

σε αυτή τη διαδικασία. Το συμπέρασμα αυτό βασίζεται σε ευρήματα από πειράματα που ενσωματώνονται φαρμακολογικές και γενετικές προσεγγίσεις για τη στόχευση PI3K σε δύο διαφορετικά γενετικά μοντέλα ποντικών και ένα

in vitro

μοντέλο. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι

PTEN

αδρανοποίηση συνεργάζεται με ογκογόνο

K-ras

για την επιτάχυνση των πνευμόνων ογκογένεση, προκαλώντας όγκους του πνεύμονα που είναι πιο ιστολογικά προηγμένη και πιο γρήγορα εμποδίζουν βρογχικό αυλούς και αντικαταστήστε τα κυψελιδικά χώρους από εκείνους ποντικών με ογκογόνο

K-ras

μόνος [18]. Μαζί, αυτά τα ευρήματα εγείρουν την πιθανότητα ότι PI3K προωθείται πνεύμονα ογκογένεση μέσω της επίδρασής της στην BASCs. Ωστόσο, αποδεικτικά στοιχεία στο πλαίσιο αυτό θα απαιτήσει την απόδειξη ότι αδενοκαρκινώματα προκύπτουν από BASCs. μελέτες μεταμόσχευσης για να διαπιστωθεί αν οι ενέσεις BASC είναι επαρκείς για να ανακεφαλαιώσω την ανάπτυξη αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα σε ποντίκια έχουν μέχρι στιγμής δεν έχουν αναφερθεί. Ένας πληθυσμός βλαστικών κυττάρων έχει εντοπισθεί στους πνεύμονες των ποντικών και στους όγκους από ασθενείς με NSCLC που εκφράζει CD133, εκθέματα βλαστικά χαρακτηριστικά των κυττάρων

in vitro

(μορφές σφαίρες και μπορεί να διεγείρονται για να υφίστανται τελική διαφοροποίηση), και είναι ογκογόνο σε γυμνούς ποντικούς [19]. Παρά το γεγονός ότι ορισμένα χαρακτηριστικά του πληθυσμού των βλαστικών κυττάρων είναι παρόμοια με εκείνα των BASCs (δηλαδή απάντηση ναφθαλίνη που προκαλείται από βλάβη των πνευμόνων), η σχέση τους μένει να διευκρινιστεί.

Όταν ξεκίνησε κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, υπό τον όρο

PTEN

αδρανοποίηση στον πνεύμονα οδηγεί σε υποξία και περιγεννητική θάνατο, υποδεικνύοντας ότι

ΡΤΕΝ

έκφραση απαιτείται για τη φυσιολογική ανάπτυξη των πνευμόνων [20]. Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση της Cre σε CCSP

Cre ποντικών ξεκίνησε κατά τη μεταγεννητική ημέρα 4, που μας επιτρέπει να αξιολογήσει

PTEN

‘s ρόλο στη διατήρηση της λειτουργίας των πνευμόνων μετά τη γέννηση. Αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε το ενδεχόμενο ότι ανεπαίσθητες αλλαγές στη λειτουργία των πνευμόνων συνέβη, το

PTEN

ελλιπή ως ποντίκια στη μελέτη αυτή δεν είχε καμία εμφανή αλλαγές στη δομή των πνευμόνων τους και δεν παρουσίασαν καμία νοσηρότητα σε ποσοστό μέχρι και 12 μηνών, γεγονός που υποδηλώνει ότι, μετά τη γέννηση, τους ιστούς των πνευμόνων μπορεί να λειτουργήσει κανονικά χωρίς

PTEN

. Αυτή η φαινομενική ανθεκτικότητα των ιστών του πνεύμονα στο

ΡΤΕΝ

ανεπάρκεια έρχεται σε αντίθεση με ενήλικα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα, τα οποία εξαντλούνται εντός 40 ημερών μετά την αδρανοποίηση των

ΡΤΕΝ

[21], υποδεικνύοντας ότι η αυτο-ανανέωση ικανότητες των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων δεν μπορεί να διατηρηθεί σε απουσία ρυθμιστικών σημάτων αρνητικής ανάπτυξης ΡΤΕΝ του. Αν και οι λόγοι για αυτήν την διαφορά δεν είναι σαφής, μπορεί να σχετίζεται εν μέρει με τη σχετική σπανιότητα με την οποία πνεύμονα βλαστοκύτταρα κανονικά διαιρούνται [9].

ΡΙ3Κ έχει αναφερθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση ξεκίνησε από ογκογόνο

K-ras

. KRAS

LA2 ποντίκια που έχουν αλυσιδωτές στο

PIK3CA

μετάλλαξη που αναστέλλει την αλληλεπίδραση της PI3K με K-ras αναπτύσσουν πολύ λιγότερες όγκους του πνεύμονα από ό, τι Kras

LA2 ποντίκια με άγριου τύπου

PIK3CA

[22], που δείχνει έναν βασικό ρόλο για την PI3K ως μεταγενέστερος μεσολαβητής του K-ras. Επιβεβαιώνοντας το σημείο αυτό, βρήκαμε ότι η θεραπεία PX-866 ανέστειλε την ανάπτυξη των όγκων του πνεύμονα σε Kras

LA1 ποντίκια. Ωστόσο, με βάση άλλα ευρήματα που αναφέρονται εδώ, η σημασία της PI3K στο

K-ras

επαγόμενη πνευμονική καρκινογένεση δεν μπορεί να περιορίζεται σε ρόλο της ως κατάντη μεσολαβητής του K-ras. Κατ ‘αρχάς, η έκφραση PI3K αυξήθηκε Kras

ιστούς LA1 πνεύμονα υποβλήθηκαν σε κακοήθη εξέλιξη από AAH σε αδενοκαρκίνωμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι PI3K ενεργοποιήθηκε σε αυτά τα ιστολογικά προχωρημένες βλάβες εν μέρει μέσω του K-ras-ανεξάρτητους μηχανισμούς. Δεύτερον, τα ευρήματα που αναφέρονται εδώ και αλλού [18] δείχνουν ότι

PTEN

αδρανοποίηση ενισχυμένη ογκογόνο

K-ras

επαγόμενη καρκινογένεση του πνεύμονα σε ποντίκια. Παρέκταση από αυτά τα ευρήματα, σωματικές μεταλλάξεις στα κύτταρα NSCLC που αφορούν γονίδια που ρυθμίζουν την PI3K-εξαρτώμενη σηματοδότησης (π.χ.

PTEN, EGFR

, και

PIK3CA

, μεταξύ άλλων [σχετ. 23]) μπορούν να μετατρέψουν αυτά κύτταρα εν μέρει από τη συνεργασία με ογκογόνο

K-ras

. Η πιθανή σημασία των δευτερευόντων σωματικών μεταλλάξεων στην προώθηση ογκογόνο

K-ras

επαγόμενη πνευμονική ογκογένεση απεικονίζεται από τα μακρά λανθανουσών του αδενοκαρκινώματα που προκύπτουν σε ποντίκια τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν μεταλλαγμένο

K-ras

, η οποία αναπτύξουν αλλοιώσεις των πνευμόνων γρήγορα και με μεγάλη διεισδυτικότητα, αλλά μόνο ένα κλάσμα των βλαβών εξελίσσονται σε αδενοκαρκινώματα και απαιτούν αρκετούς μήνες για να το πράξουν [3] – [7]

τα ευρήματα που αναφέρονται εδώ διέφεραν από αυτές που αναφέρθηκαν προηγουμένως σε ένα. διαφορετικό στέλεχος της ποντίκια που υποβάλλονται υπό όρους

PTEN

διαγραφή που προκαλείται από SPC με γνώμονα την έκφραση της Cre [20]. Στην εν λόγω έκθεση,

PTEN

αδρανοποίηση ήταν αρκετή για να αυξήσει τον αριθμό BASC και να προκαλέσουν όγκους των πνευμόνων, η οποία έρχεται σε αντίθεση με τα ευρήματα που παρουσιάζονται εδώ και αλλού [18] που

PTEN

ανεπάρκεια δεν είναι επαρκής για να αυξήσει αριθμούς BASC ή επάγουν όγκους του πνεύμονα. Ότι η προηγούμενη έκθεση διέφεραν επίσης σε σχέση με τα γενετικά γεγονότα που συνεργάστηκε με το

PTEN

ανεπάρκεια. Στην εν λόγω μελέτη,

PTEN

αδρανοποίηση επιτάχυνση των πνευμόνων ογκογένεση προκαλείται από ουρεθάνη, μια καρκινογόνος ουσία που προκαλεί συχνά

K-ras

μεταλλάξεις, αλλά μόνο 2 από 6 όγκων αξιολογήθηκαν είχαν

K-ras

μεταλλάξεις, που αφήνει ανοιχτό το ενδεχόμενο ότι η ουρεθάνη συνεργάζεται με το

PTEN

απώλεια με την πρόκληση σωματικών μεταλλάξεων των γονιδίων, εκτός από

K-ras

. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με το μοντέλο μας με τον οποίο οι υπό όρους

K-ras

και

PTEN

αλληλόμορφα ανασυνδυάζονται στα ίδια κύτταρα (CCSP εκφράζουν). Ως εκ τούτου, οι ανόμοιες αποτελέσματα αυτών των μελετών θα μπορούσε να σχετίζεται με δευτερογενή γενετικά γεγονότα στα ποντίκια ή διαφορές στο πειραματικό σχεδιασμό, όπως τα γενετικά υπόβαθρα των ποντικών ή τα συγκεκριμένα στοιχεία προαγωγέα που οδηγεί έκφραση Cre ουρεθάνη αγωγή.

μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Τα αντισώματα που αγοράστηκαν για τις μελέτες αυτές περιλαμβάνουν αντι-ρ110α (sc-7174), ρ110β (sc-7175), SPC (SC-13979), γίδινο αντι-CC10 (sc -9772) και PTEN (sc-6818) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-συνολική ΑΚΤ (9272), Ser473-φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (9271), Ser21 /9-φωσφορυλιωμένη ΟδΚ3α /β (9331), σύνολο GSK3 (9332), που διασπάται κασπάσης-3 (9661), πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (9542), φωσφορυλιωμένου-ιστόνης Η3 (9701), Ser28-φωσφορυλιωμένο Η3 ιστόνης (9713P) (Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ) , αντι-SPC κουνέλι (WRAB-SPC, το Seven Hills Bioreagents, Cincinnati, ΟΗ), αντι-CCSP (07-623, Upstate Biotechnologies, Lake Placid, ΝΥ), συζευγμένο με FITC αντι-Sca-1 (557405), βιοτίνη συζευγμένο αντι-CD45 (553.771) συζευγμένο με βιοτίνη-CD31 (558.737), ΡΕ-συζευγμένο αντι-CD34 (12-0341-33, eBioscience), αντι-κουνελιού IgG Alexa Flour 488 (A11008), και αντι-κατσίκα IgG Alexa αλεύρι 594 (A11058) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Άλλες αγοράστηκαν αντιδραστήρια περιλαμβάνουν στρεπταβιδίνη APC (554067, BD Pharmigen), TSA κιτ 22 (T20932), 25 (T20935), και 27 (T20937), αβιδίνη /βιοτίνη κλείδωμα kit (00-4303) (Invitrogen), Dispase (354,235, BD Biosciences), κολλαγενάση /δισπάση (10269638001, Roche Biosciences) και 7-αμινοακτινομυκίνης D (A1310, Invitrogen).

μελέτες ποντίκι

Για να ελέγξετε αν PI3K προωθεί την ανάπτυξη των όγκων, 9 Κ- ras

LA1 ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή για 4 εβδομάδες με 2 mg /kg /d ενδογαστρικού PX-866, ένα μικρό αναστολέα μόριο της ΡΙ3Κ [12], και 12 δόθηκε όχημα που αρχίζει σε 4 μήνες, μια ηλικία κατά την οποία πνεύμονα βλάβες (AAH και αδενώματα) είναι μετρήσιμη από μικρο-υπολογιστική τομογραφία σαρώσεις. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αυτές τις σαρώσεις κατά την έναρξη και την ολοκλήρωση της θεραπείας για να μετρήσει τους αριθμούς βλάβης και την αξιολόγηση των μεταβολών του όγκου βλάβης συναρτήσει του χρόνου όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [24].

Πριν από την έναρξη τους, όλες οι μελέτες ποντικών υποβλήθηκαν και που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο του Τέξας-M. D. Anderson Κέντρο Καρκίνου. Οι ποντικοί έλαβαν τα πρότυπα φροντίδας και υποβλήθηκαν σε ευθανασία σύμφωνα με τα πρότυπα που ορίζονται από το IACUC. Ποντίκια και τα κύτταρα και αποκτήθηκαν μέσα από συνεργασίες με τον Δρ Tyler Jacks, MIT (ποντίκια Kras

LA1, και Kras

LSL ποντίκια), Δρ Χονγκ Γου, UCLA (PTEN

Flox ποντίκια), και ο Δρ Francesco Demayo, Baylor College of Medicine (CCSP

Cre ποντίκια).

μικροσυστοιχίες ιστών και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις

Πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση της PI3K σε μια μικροσυστοιχία ιστού που περιέχει AAH (n = 17) , στερεά αδενώματα (n = 31), μικτή στερεού /θηλώδες αδένωμα (n = 36), θηλώδη αδενώματα (n = 45), και αδενοκαρκινώματα (n = 14) για να προσδιοριστεί κατά πόσο τα επίπεδα της ΡΙ3Κ αλλάξει κατά τη διάρκεια κακοήθη πρόοδο. Αναλύσαμε την έκφραση των ισομορφών ΡΙ3Κ (ρ110α και β).

για ανοσοϊστοχημική χρώση, 4 μm τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη ψήθηκαν στους 60 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια ψύχεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι τομές επωάστηκαν διαδοχικά σε ξυλόλιο (5 λεπτά δύο φορές), 100% αιθυλική αλκοόλη (5 λεπτά δύο φορές), 95% αιθυλική αλκοόλη (5 λεπτά δύο φορές), και το 80% αιθυλική αλκοόλη (5 λεπτά). Μετά από πλύση με νερό, οι τομές αντιγόνο ανακτάται χρησιμοποιώντας κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 6,0, ϋΑΚΟ) σε ατμιστή για 20 λεπτά και ψύχθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι τομές στη συνέχεια πλένονται με TBS-T και αποσβέστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε TBS για 10 λεπτά, αποκλείστηκαν για δραστικότητα αβιδίνη /βιοτίνη, και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα ως εξής: Για ρ110α και ρ110β χρώση, οι τομές δεσμεύτηκαν με 5% ορό κατσίκας για 1 ώρα, επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, και στη συνέχεια πλένονται με TBS-T? για Ser28-φωσφορυλιωμένη χρώση ιστόνης Η3, οι τομές δεσμεύτηκαν με 10% ορό κατσίκας σε 4 ° C όλη τη νύκτα, επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, και πλύθηκε με ΤΒδ-Τ. Η χρώση αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας DAB σύστημα υποστρώματος. Οι αρνητικοί έλεγχοι συμπεριλαμβάνονται παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος και προ-επώαση του πρωτογενούς αντισώματος με κλείδωμα πεπτίδιο. Χρώση ποσοτικά από έναν ερευνητή (M.G.R.) τυφλωμένοι όπως στην ομάδα θεραπείας. Ενδοτραυματική έκφραση βαθμολογήθηκε με βάση την ένταση χρώσης και επέκταση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Ανίχνευση BASCs στους ιστούς των πνευμόνων

Αντιγόνα ανακτήθηκαν από ιστούς πνεύμονα ποντικού με 0.01 mol κιτρικού /L (ρΗ 6? DakoCytomation, Glostrup, Δανία) για 25 λεπτά σε ένα ατμόπλοιο. Τα πλακίδια σβήστηκε σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 1,5% εντός αλατούχου ρυθμιστικού διαλύματος Τρις για 10 λεπτά και αποκλείστηκαν σε ϋΑΚΟ μπλοκ πρωτεΐνη χωρίς ορό (Dako) για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-SPC (SC-7705, Santa Cruz Biotechnology? WRAB-SPC, το Seven Hills Bioreagents) και αντισώματα στους 4 ° C για μια νύχτα αντι-CCSP (07-623, Upstate Biochemicals). Η ανοσοφθορισμού αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας TSA κιτ 25 και 22 (Invitrogen) με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή. Χρησιμοποιήσαμε το κλείδωμα πεπτίδια και παραλείπονται τα πρωτογενή αντισώματα ως αρνητικοί έλεγχοι για να προσδιοριστεί η ειδικότητα των αποτελεσμάτων ανοσοχρώση. Ανοσοφθορισμός οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο με ένα σύστημα αντανακλάται φθορισμού (Olympus Μοντέλο IX71SIF-2). απόκτηση χρώμα και φθορισμό υποβάθρου είχαν βελτιστοποιηθεί με τη χρήση του λογισμικού DPController και DPManager (Όλυμπος).

απομόνωση BASC και τον πολιτισμό

Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 12 εβδομάδες, και οι πνεύμονες διαχύθηκαν με 10 mL ισορροπημένου διαλύματος άλατος Hank μέσω της δεξιάς κοιλίας έως ότου καθαριστεί από το αίμα. Οι τραχείες εγχύθηκαν με Dispase (μη αραιωμένο υγρό, BD Biosciences) που ακολουθείται από 0,5-1 mL 1% LMP αγαρόζη σε νερό. Οι πνεύμονες τοποθετήθηκαν σε πάγο, κομμένο σε κομμάτια, επωάζεται με 0.001% ϋΝΑση (Sigma D-4527) και 2 mg /mL κολλαγενάσης /δισπάσης (100 mg /mL, Roche) σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό στους 37 ° C για 45 min, διηθήθηκε (100 μm που ακολουθείται από 40 μm φίλτρο με μέγεθος πόρων), και φυγοκεντρήθηκε. Τα προκύπτοντα ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 2 mL PF10 (10% εμβρυϊκό βόειο ορό σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό), το οποίο τυπικά παράγει 1-2 εκατομμύρια συνολικά κύτταρα ανά ποντικό. Τα ερυθρά κύτταρα λύθηκαν. BASCs απομονώθηκαν με διαλογή της Sca-1

CD45 pos

αρν PECAM

αρν CD34

πληθυσμό POS κυττάρων σε φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογέα τριών λέιζερ 13 χρωμάτων FACS Aria (BD Biosciences) ότι είναι ικανή διαλογής τέσσερα υπο-πληθυσμούς σε χαμηλή πίεση με μέγιστη ταχύτητα 20 εκατομμυρίων κυττάρων /ώρα. BASCs αντιπροσώπευε περίπου 0,1% του συνολικού ταξινομημένο κυτταρικό πληθυσμό.

Η ομοιομορφία ή την καθαρότητα των διαλεγμένων κυττάρων δεν ήταν συνήθως ελέγχεται επειδή τα κύτταρα ενδιαφέροντος θα έχουν καταναλωθεί κατά τη διαδικασία. Τούτου λεχθέντος, τα κύτταρα του είδους-καθαρίζεται με τη μεγαλύτερη δυνατή καθαρότητα με περίφραξη σε μέγεθος (από εμπρός και πλευρική σκέδαση), με εξαίρεση τα ζεύγη (από εμπρός πλάτος διασποράς

έναντι

περιοχή και πλάτους πλευρά διασποράς

σε σχέση με

περιοχή), και την απομόνωση κυττάρων με τους δείκτες που παρουσιάζουν ενδιαφέρον. Επιπλέον, η ομοιομορφία των πληθυσμών ταξινομημένων κυττάρων που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις δοκιμασίες ήταν αντικατοπτρίζεται από την επαναληψιμότητα των ευρημάτων μας?