Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα ιδανικό υποψήφιο για την παροχή αντικαρκινικών φαρμάκων. Σε προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι η έκθεση του μυελού των οστών ποντικού που προέρχεται στρωματικά κύτταρα στη δοξορουβικίνη τους οδήγησε να αποκτήσουν αντι-πολλαπλασιαστικού δυναμικού προς συν-καλλιεργήθηκαν αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSCs). έτσι Υποθέσαμε αν πρόσφατα απομονωμένων ανθρώπινων οστών μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα μυελού (hMSCs) και ώριμα στρωματικά κύτταρα ποντικού (γραμμή SR4987) πριμοδοτήθηκαν

in vitro

με αντικαρκινικά φάρμακα και, στη συνέχεια, εντοπίζεται κοντά στα καρκινικά κύτταρα, θα μπορούσε να αναστείλει τον πολλαπλασιασμό.

Μέθοδοι και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

η πακλιταξέλη (ΡΤΧ) χρησιμοποιήθηκε για να ξεκινήσει τον πολιτισμό των hMSCs και SR4987. Ενσωμάτωση ΡΤΧ σε hMSCs μελετήθηκε με τη χρήση FICT-σημασμένο-ΡΤΧ και αναλύθηκαν με FACS και συνεστιακή μικροσκοπία. Απαλλαγή των ΡΤΧ σε μέσο καλλιέργειας από ΡΤΧ γεμάτοι hMSCs (hMSCsPTX) ερευνήθηκε με HPLC. Culture των ενδοθηλιακών κυττάρων (ECs), και δοκιμασία αορτικού δακτυλίου χρησιμοποιήθηκαν για να ελεγχθεί η αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα του hMSCsPTX και ΡΤΧ γεμάτοι SR4987 (SR4987PTX), ενώ η δραστηριότητα κατά του όγκου ελέγχθηκε

in vitro

στον πολλαπλασιασμό των διαφόρων όγκου κυτταρικές γραμμές και in vivo με συν-μεταμόσχευση hMSCsPTX και SR4987PTX με καρκινικά κύτταρα σε ποντίκια. Παρ ‘όλα αυτά, παρά την απώλεια κυττάρων λόγω της χημειο-επαγόμενη απόπτωση, και τα δύο ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού και SR4987 ήταν σε θέση να ενσωματώσουν ταχέως ΡΤΧ και θα μπορούσε να απελευθερώσει αργά ΡΤΧ στο μέσο καλλιέργειας σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. ΡΤΧ πριμοδοτημένων κυττάρων αποκτήσει ένα ισχυρό κατά του όγκου και αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα

in vitro

που ήταν δοσοεξαρτώμενη, και αποδείξιμη χρησιμοποιώντας ρυθμισμένο μέσο τους ή με δοκιμασία συν-καλλιέργεια. Τέλος, hMSCsPTX και SR4987PTX συν-ένεση με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα (DU145 και U87MG) και κύτταρα μελανώματος ποντικού (Β16) σε ανοσοανεπαρκή και σε συγγενή ποντίκια καθυστερήσει σημαντικά όγκου παίρνει και μειωμένη ανάπτυξη του όγκου.

Συμπεράσματα

Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν, για πρώτη φορά, ότι χωρίς καμία γενετική χειραγώγηση, μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα μπορούν πρόσληψη και στη συνέχεια απελευθερώνουν αργά ΡΤΧ. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε πιθανή νέα εργαλεία για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας του καρκίνου

Παράθεση:. Pessina Α, Bonomi Α, Coccè V, Invernici G, Navone S, Cavicchini L, et al. (2011) μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα εκκινούνται με πακλιταξέλη παρέχει μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία του καρκίνου. PLoS ONE 6 (12): e28321. doi: 10.1371 /journal.pone.0028321

Επιμέλεια: Marc Tjwa, Πανεπιστήμιο της Φρανκφούρτης – Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Φρανκφούρτης, Γερμανία

Ελήφθη: 15 Απριλίου, 2011? Αποδεκτές: 5 Νοέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 20η Δεκεμβρίου του 2011

Copyright: © 2011 Pessina et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε μερικώς από AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) Έργο AIRC IG-9062, Εθνικό ιταλική Grant PUR 2008 και Fondazione Banca del Monte di Lombardia. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο κύριος στόχος στη χημειοθεραπεία του καρκίνου είναι να εντοπιστεί η επίδραση του φαρμάκου στο μικροπεριβάλλον του όγκου, προκειμένου να σκοτώσουν όσους περισσότερους καρκινικά κύτταρα όσο το δυνατόν, ενώ ταυτόχρονα παράγει τη χαμηλότερη τοξικότητα εξασφαλίσεις. Για να γίνει αυτό, ένα σημαντικό αριθμό τεχνικών προσεγγίσεων, από τη χρήση τοξικών ανοσοσυζευγμάτων για τη στόχευση του όγκου ειδικά αντιγόνα [1] στην εξελιγμένη χρήση νανοσωματιδίων [2] ή χειρισμό βλαστοκυττάρων [3] για την παράδοση φαρμάκων, έχουν ερευνηθεί και δημοσιεύθηκε τα τελευταία 20 χρόνια. Από μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) εύκολα να προσαρμοστούν σε συνθήκες καλλιέργειας απαραίτητες για

in vitro

χειραγώγηση και το σπίτι στο παθολογικούς ιστούς όταν εγχέεται

in vivo

, τα κύτταρα αυτά φαίνεται να αποτελούν την καλύτερη επιλογή για να παραδώσει την καταπολέμηση -tumor παραγόντων [4], [5]. Οι διαγονιδιακοί διαδικασίες έχουν χρησιμοποιηθεί για να επάγουν MSCs να εκκρίνουν θεραπευτικές κυτοκίνες ή αυξητικούς παράγοντες και ανασταλτικών [6], [7]. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι μηχανικής MSCs παράγουν παράγοντες κατά των όγκων που έχουν την ικανότητα να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα, τόσο

in vitro

και

in vivo

[3], [8] – [12]. Αν και υπάρχουν ενθαρρυντικά αποτελέσματα σε ζώα, η γενετική χειραγώγηση των MSCs στην κλινική εφαρμογή στον άνθρωπο έχει κάποιους κινδύνους [13].

Σε μια προηγούμενη μελέτη, δείξαμε ότι το μυελό των οστών ποντικού (BM) που προέρχονται στρωματικό κύτταρο (SR4987 κυτταρική γραμμή) που καλλιεργήθηκαν με την παρουσία δοξορουβικίνη (DXR), μία ισχυρή ένωση κατά του καρκίνου, ήταν σε θέση να προσλαμβάνει σημαντικές ποσότητες του φαρμάκου χωρίς να εμφανίζουν σημαντικά σημάδια τοξικότητας. Σε αντίθεση, τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (HSCs) από ΒΜ ήταν πολύ ευαίσθητα στην DXR. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μια σημαντική αναστολή της HSCs επαγόμενης μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU) εάν συν-καλλιεργήθηκαν με SR4987 πρώτα ασταρωθεί με DXR. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα στρωματικά κύτταρα ποντικού μπορεί να δρα ως δεξαμενή για DXR ότι, στη συνέχεια, μπορεί να απελευθερώσει ορισμένους μεταβολίτες DXR ή ακόμη και DXR στην αρχική της μορφή, που οδηγεί σε HSCs επαγόμενη αναστολή CFU [14]. Κατά συνέπεια, υποθέσαμε ότι, επίσης

in vivo

, στρωματικά κύτταρα ΒΜ μπορεί να παίζουν ένα διπλό ρόλο στον έλεγχο της τοξικότητας του φαρμάκου, ανάλογα με την ικανότητά τους να προσλαμβάνει και να απελευθερώσει χημειοθεραπευτικά φάρμακα [14]. Λαμβάνοντας υπόψη αυτές τις ιδιότητες, είμαστε εδώ για να διερευνήσει κατά πόσον τα ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού (hMSCs) φρεσκομαγειρεμένα από BM και SR4987 ποντίκι, αφού γεμίσετε με την αντικαρκινική και αντι-αγγειογενετική πακλιταξέλη φάρμακο (ΡΤΧ), μπορούν να αποκτήσουν την ικανότητα να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα (ΘΚ) στην εγγύτητά τους .

η πακλιταξέλη είναι ένα εξαιρετικά λιπόφιλο φάρμακο (που προέρχεται από το

Taxus brevifolia

), πολύ δραστήρια σε πολλές συμπαγείς όγκους και επίσης σε θέση να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η πακλιταξέλη επηρεάζει κυτταροσκελετού των μικροσωληνίσκων μέσω της προώθησης του πολυμερισμού που επάγει την μιτωτική σύλληψη του κυττάρου [15], [16].

Έχουμε αποδείξει, για πρώτη φορά, ότι, σε μια εποχή που εξαρτάται κινητική, ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού και ποντίκι SR4987 γεμάτοι με ΡΤΧ (MSCsPTX, SR4987PTX) απελευθερώνουν το φάρμακο σε ποσότητα αρκετή για να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό των όγκων, να σκοτώσει ενδοθηλιακά κύτταρα (ECS)

in vitro

και, το σημαντικότερο, να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Τα αποτελέσματά μας είναι η πρώτη απόδειξη ότι, μέσω μιας απλής

in vitro

διαδικασία, ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού και στρωματικά κύτταρα ποντικού μπορεί να φορτωθεί με φάρμακα κατά του καρκίνου και χρησιμοποιήθηκε

in vivo

να τους απελευθερώσει εντός ενός όγκου μικροπεριβάλλον.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός των MSC, P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) έκφραση και ευαισθησία σε ΡΤΧ

Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν τρία διαφορετικά φρέσκα παρασκευάσματα hMSCs και η στρωματικά ποντίκι SR4987 κυτταρική γραμμή [17]. Καλλιεργημένα ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού αναλύθηκαν για να επιβεβαιωθεί η έκφραση των δεικτών MSC καθώς και πολυδύναμα ικανότητα διαφοροποίησης τους. Ήταν θετικά για CD44 +, CD73 +, CD90 +, CD105 +, και HLA-Ι και αρνητικό για CD14-, CD31-, CD34-, CD45-, CD80- και HLA-II. Όταν καλλιεργούνται υπό συνθήκες διαφοροποίησης, απέκτησαν οστεο-adipo και χονδροβλαστών δείκτες (Εικ. S1). Εμείς επόμενη αξιολογείται η ευαισθησία των hMSCs και SR4987 να ΡΤΧ, σε μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας 24 ώρες και σε μία δοκιμασία αντι-πολλαπλασιασμό σε 7 ημέρες (Σχ. 1Α, Β). SR4987 και ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού ήταν ευαίσθητα στην αντι-πολλαπλασιαστική δράση του ΡΤΧ, σύμφωνα με μια δοσοεξαρτώμενη κινητική με IC

50 τιμή 25,6 ± 11,08 ng /ml και 4,07 ± 1,75 ng /ml, αντίστοιχα. Αντίθετα, τόσο SR4987 και hMSCs ήταν έντονα ανθεκτικά σε ΡΤΧ άμεση κυτταροτοξικότητα, με πολύ λίγη κυτταρικό θάνατο ακόμα και σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 10.000 ng /ml (Σχ. 1Α, Β). Η αναστολή των hMSCs και τον πολλαπλασιασμό SR4987 από PTX επιβεβαιώθηκε με την πραγματοποίηση ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου, παρουσιάζοντας σημαντική συσσώρευση των κυττάρων στην S, και σε μικρότερο βαθμό, G2 /M φάση. Η βιωσιμότητα και των δύο hMSCs και κυττάρων SR4987 δεν επηρεάστηκε σημαντικά και τα κύτταρα αποσπώνται, πλύθηκαν και υποκαλλιεργήθηκαν σε απουσία φαρμάκου έδωσε μια μονοστοιβάδα των κυττάρων με ένα κύτταρο βιωσιμότητας στο εύρος των ελέγχων και ένα μοτίβο κυτταρικό κύκλο αποκαθίσταται μετά από 72 ώρες (Εικ. S2 ). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώθηκαν από τα ποσοστά των αποπτωτικών /νεκρωτικών κυττάρων μετρήθηκαν στις διάφορες πειραματικές συνθήκες με δοκιμασία αννεξίνη (Πίνακας S1). Η θεραπεία παράγει κάποια απώλεια κυττάρων λόγω χημειο-επαγόμενη απόπτωση, αν και η μόνη σημαντική αύξηση στην απόπτωση (Ρ & lt? 0,05) αποδείχθηκε σε κύτταρα SR4987 (στις 24 ώρες της θεραπείας με ΡΤΧ), που ανακτάται μετά την αντικατάσταση του φαρμάκου (24 + 24 h). Τα δεδομένα αυτά είναι σε συμφωνία με τις εκθέσεις των άλλων συγγραφέων στην ευαισθησία των στρωματικών κυττάρων προς πακλιταξέλη [18], [19].

Διαφορετικές συγκεντρώσεις ΡΤΧ (από 0,1 έως 10,000 ng /ml) προστέθηκαν σε καλλιέργεια ανθρώπινων στρωματικών κυττάρων μυελού (Εικ. 1Α) και SR4987 ποντικού (Σχ. 1Β). Η κυτταροτοξική δραστικότητα αξιολογήθηκε στις 24 ώρες της θεραπείας? Η επίδραση επί του πολλαπλασιασμού σε 7 ημέρα της καλλιέργειας με δοκιμασία ΜΤΤ. Οπτική πυκνότητα που μετρήθηκε σε καλλιέργειες MSC που δεν έλαβαν ΡΤΧ θεωρήθηκαν ως 100% πολλαπλασιασμός. Σημειώστε ότι η συγκέντρωση ΡΤΧ έως 10.000 ng /ml δεν επηρέασε ούτε hMSCs ή τη βιωσιμότητα SR4987 κυττάρων. Τα μικρά τραπέζια εισάγετε στο Α και Β δείχνουν την IC

50 και IC

90 προκαλείται από ΡΤΧ στην hMSCs και SR4987 αντίστοιχα. Τόσο η ρυθμισμένα μέσα (CM) από ΡΤΧ πριμοδοτημένα κύτταρα (hMSCsPTX-CM και SR4987PTX-CM) παρήγαγε μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης των MOLT-4 αναφερθεί (Σχ. 1C) ως επί τοις εκατό εκείνης που παράγεται από CM από μη επεξεργασμένα κύτταρα (hMSCs-CM και SR4987-CM). Σημειώστε ότι στις 1:16 αραίωση τόσο hMSCsPTX-CM και SR4987PTX-CM παράγονται 100% αναστολή της ανάπτυξης ίσες με εκείνες που λαμβάνονται με 3,13 ng /ml ΡΤΧ. Αυτή η βιολογική δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί PEC που απελευθερώνεται με ενιαία ΡΤΧ αντιμετωπίζονται hMSC και συσσώρευση του στο μέσο καλλιέργειας κατά τη διάρκεια του χρόνου (D). Το ιστόγραμμα δείχνει PEC που απελευθερώνεται από hMSCPTX σε διαφορετικές χρονικές στιγμές του πολιτισμού. Η καμπύλη δείχνει τη συσσώρευση PEC στο hMSCsPTX-CM. Σημειώστε ότι κάθε hMSCPTX απελευθερώνει περίπου 1 pg του PEC σε 24 ώρες, φθάνοντας μέγιστη συγκέντρωση περίπου 1,7 pg μετά από 144 ώρες. Αξία είναι η μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) των πέντε ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Και τα δύο ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού και των κυττάρων SR4987 εξέφρασε P-gp που κάτω διαμορφώνεται με επεξεργασία με ΡΤΧ και με βεραπαμίλη (VP). Η παρουσία της VP αυξημένη ευαισθησία SR4987 με τη δραστηριότητα αντι-πολλαπλασιασμό των ΡΤΧ, ενώ δεν ήταν αποτελεσματική σε ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού (Εικ. S3).

ΡΤΧ πρόσληψη και την απελευθέρωση από hMSCs

Με βάση την προηγούμενες μελέτες [14], υπο-συρρέοντα καλλιέργειας (3 × 10

5) των προσκολλημένων hMSCs εκτέθηκαν για 24 ώρες για να 2,000 ng /ml ΡΤΧ (αρκετό για να εμποδίσει εντελώς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά δεν είναι σε θέση να επηρεάσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων). Μετά από αρκετές πλύσεις και κατεργασία με τρυψίνη, hMSCsPTX καλλιεργήθηκαν περαιτέρω για 24 ώρες και ρυθμισμένο μέσο τους (CM) ελέγχθηκε σε Molt-4, μια κυτταρική σειρά λευχαιμίας πολύ ευαίσθητα σε ΡΤΧ (IC

50 1,48 ± 1,06 ng /ml) [ ,,,0],20]. Το CM και από τις δύο καλλιέργειες hMSCPTX (hMSCsPTX-CM) παρήγαγε μια ισχυρή εξαρτώμενη από τη δόση αντι-πολλαπλασιαστική δράση επί MOLT-4, ισοδύναμες με εκείνες που λαμβάνονται με καθαρό ΡΤΧ σε δόσεις από 0,39 έως 50 ng /ml (Σχ. 1 C). Αντίθετα, το CM από κύτταρα ελέγχου (hMSCs-CM) δεν ήταν αποτελεσματικά. Συγκρίνοντας την ανασταλτική δράση των καθαρών ΡΤΧ και CM σε Molt-4, υπολογίσαμε το ΡΤΧ ισοδύναμη συγκέντρωση (PEC) στο CM που χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της PEC που απελευθερώνεται από ένα μόνο κύτταρο (PEC pg /κύτταρο). Η συνολική PEC εσωτερικεύεται από hMSCsPTX σε 24 ώρες, αξιολογήθηκε με τη δοκιμή των κυτταρολυμάτων hMSCsPTX, ήταν 2.67 ± 0.8 pg /κύτταρο, υποδηλώνοντας ότι ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού σε 24 ώρες θα μπορούσε να ενσωματώσει περίπου 8% του ΡΤΧ αρχικά διαθέσιμο (33,3 pg /κύτταρο). Αποτελέσματα σχετικά με προϊόντα λύσεως hMSCs σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη πριν ΡΤΧ αστάρωμα σημειώνεται κάποια μη ειδική δέσμευση του ΡΤΧ, που αντιστοιχεί σε 0,11 ± 0,01 του PEC pg /κύτταρο (περίπου 4% του συνόλου των PEC που υπάρχει στο λύμα των ζώντων κυττάρων).

στη συνέχεια, υπολογίσαμε το χρόνο εξαρτάται από την απελευθέρωση της PEC με hMSCsPTX με την αντικατάσταση και τη συλλογή CM τους σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Ανιχνεύσιμη δραστικότητα της PEC ήταν παρούσα μετά από 2 ώρες επώασης των hMSCsPTX επίτευξη PEC από 1 pg /κύτταρο κατά την διάρκεια των πρώτων 24 ωρών της καλλιέργειας, και μία μέγιστη συγκέντρωση από περίπου 1,7-2,0 pg /κύτταρο σε 144 ώρες (Σχ. 1D). Δεδομένου ότι αυτές οι τιμές δεν αυξήθηκε με μακρύτερους επώαση, υπολογίσαμε ότι περίπου το 25-30% της συνολικής PEC που βρέθηκαν σε κυτταρικό λύμα διατηρήθηκε από τα κύτταρα και δεν κυκλοφόρησε ποτέ. Η εσωτερίκευση του ΡΤΧ σε hMSCs διερευνήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας ΡΤΧ (ΡΤΧ-F) (Σχ. 2Α). ΡΤΧ-F εντοπισμού σε hMSCs αναλύθηκε σε βάθος χρόνου. Μετά από 1 ώρα εκκίνησης, η εσωτερίκευση του ΡΤΧ-F από hMSCs ήταν αισθητή. Η χρώση ήταν έντονη και εμπλουτίζεται μέσα κυστίδια κατά το τέλος της εκκίνησης (24 h). Μετά από 24 ώρες, παρατηρήθηκε ότι η κατανομή των ΡΤΧ-F παρέμεινε περιορίζεται σε κυστίδια, πολλές από τις οποίες ήταν κοντά στην κυτταρική μεμβράνη, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή έκκριση. Για να εκτιμηθεί αν ΡΤΧ-F εμπλουτίστηκε σε κυστίδια που προέρχονται από τη συσκευή Golgi, ανάλυση συν-εντοπισμό διεξήχθη σε ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού χρωματίστηκαν με το ειδικό BODIPY® δείκτη TR κεραμιδιού. Όπως φαίνεται στα λευκές κηλίδες σε μάσκα Σχήμα 2Α, παρατηρήσαμε ένα υψηλό επίπεδο colocalization μεταξύ ΡΤΧ-F και BODIPY® TR κεραμίδιο, πράγμα που σημαίνει ότι ΡΤΧ-F ήταν εσωτερικεύεται μέσα Golgi προερχόμενο κυστίδια. Έτσι, ΡΤΧ-F συσσωρεύεται στα κυστίδια αντί της συσσώρευσης σε μικροσωληνίσκους [15], όπως πολλές άλλες ξενοβιοτικών κάνουν [21], και τα επίπεδα της μειώνονται σε ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού μετά τις κινητική φαίνεται από ανάλυση FACS (Σχ. 2Α και το σχ. S4).

Η εσωτερικοποίηση του ΡΤΧ-F αναλύθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία (Α) σε ζώντα ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού γεμάτοι 1 (1) ή 24 (24) ώρες με ΡΤΧ-F (πράσινο) και φορτώθηκαν με το Golgi ειδικό δείκτη BOPIPY®TR κεραμιδιού (κόκκινος). Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν επίσης 24 ώρες μετά το στάδιο πλύσης (24 + 24). ΡΤΧ-F συσσωρεύεται στα κύτταρα και συνεντοπίζεται με συσκευή Golgi ή κυστίδια Golgi προέλευσης. πίνακας Μάσκα τονίζει την συν-εντοπισμό μεταξύ ΡΤΧ-F και BODIPY®TR κεραμίδιο δείχνει λευκές κηλίδες, που δείχνουν αυτά τα εικονοστοιχεία στην οποία τόσο οι σήματα φθορισμού ανιχνεύονται .. Λευκές γραμμές αντιπροσωπεύουν το όριο κυψέλης και βέλη δείχνουν κυστίδια κοντά στην κυτταρική μεμβράνη. μπαρ κλίμακας: 20 μm. Η απελευθέρωση του ΡΤΧ στην hMSCsPTX-CM στις 24 ώρες αναλύθηκε με HPLC. Το προφίλ έκλουσης (Β) συγκρίθηκε με εκείνη του καθαρού ΡΤΧ σε 1,000 ng /ml (C). Η φιγούρα αναφέρει ένα προφίλ χρωματογράφημα ενός τυπικού πειράματος όπου hMSCsPTX-CM αποδεικνύει ένα αιχμής που προσδιορίζονται σαφώς ΡΤΧ και ότι ποσοτικοποιήθηκε σε μια πρότυπη καμπύλη ΡΤΧ ως 68.1 ng /ml. Εικόνα 2D αναφέρει το προφίλ του hMSCs-CM καλλιεργούνται απουσία του ΡΤΧ. Η κορυφή επισημαίνονται ως I.S. είναι το εσωτερικό πρότυπο Κεφαλομαννίνη προστίθεται σε όλα τα δείγματα για την ορθή ποσοτικοποίηση της ΡΤΧ.

Η

Η παρουσία ΡΤΧ σε hMSCsPTX-CM επιβεβαιώθηκε με ανάλυση HPLC. Τα χρωματογραφήματα HPLC που λαμβάνεται από hMSCsPTX-CM και από ένα πρότυπο δείγμα του ΡΤΧ σε PBS (1,000 ng /ml) (Σχ. 2Β, C) δείχνουν ότι μια κορυφή ταυτόσημων χρόνος κατακράτησης ΡΤΧ εκλούστηκε από τη hMSCsPTX-CM. HPLC ανάλυση έδειξε την παρουσία άλλων μη ειδικών κορυφών (2,5-4 λεπτά) πιθανόν να οφείλεται σε ενώσεις που παράγονται από τα κύτταρα και δεν συσχετίζεται με την παρουσία του ΡΤΧ επειδή επίσης παρούσα στο χρωματογράφημα του ελέγχου μέσου hMSCs-CM (Σχ. 2D). Η παρουσία του κύριου μεταβολίτη ΡΤΧ, το 6 άλφα-υδροξυ-paclitaxel, κανονικά εκλούεται σε 5,5 λεπτά και των άλλων ΡΤΧ μεταβολιτών μπορεί να αποκλειστεί [22].

Ένα παρόμοιο ΡΤΧ αστάρωμα τεχνική εφαρμόστηκε στο SR4987 ποντίκι ότι παρουσίασε μια παρόμοια κινητική της ενσωμάτωσης και απελευθέρωσης του ΡΤΧ με υψηλότερη τάση της απελευθέρωσης του φαρμάκου κατά την διάρκεια των πρώτων 24 ώρες επώασης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

HMSCsPTX και SR4987PTX αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των διαφόρων ειδών TCs

in vitro

η

για να αξιολογηθεί η

in vitro

πιθανών αντι-όγκου των hMSCsPTX και SR4987PTX ποντίκι, μπορούμε στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση της hMSCsPTX-CM για δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (DU145, T98G ) και της SR4987PTX-CM για Β16 ποντικού κυτταρική γραμμή μελανώματος. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, η προσθήκη hMSCsPTX-CM στο 1:4 να 1:8 αραίωσης που προκαλείται από έως και 80% της αναστολής της ανάπτυξης σε όλες τις κυτταρικές γραμμές όγκου (Εικ. 3Α). Στο 1:02 αραίωση, που ισοδυναμεί με την προσθήκη περίπου 25 ng /ml καθαρής ΡΤΧ, 100% της αναστολής ανάπτυξης του όγκου ελήφθη (Σχ. 3Β). Ο συνδυασμός αυτών των δεδομένων με εκείνα από κινητικές απελευθέρωσης (Σχ. 1D), θα μπορούσαμε να εκτιμούν ότι, σε 24 ώρες, 3 × 10

5 hMSCsPTX μπορεί να απελευθερώσει περίπου 50-60 ng /ml PEC που αποτελούν τις συγκεντρώσεις 3-5 φορές το IC

90 τιμές των ΡΤΧ για τα καρκινικά κύτταρα που μελετήθηκαν. Η προσθήκη του ελέγχου hMSCs-CM δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό TCs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ικανότητα των hMSCsPTX να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των διαφορετικών TCs επιβεβαιώθηκε με ανάλυση συν-κουλτούρα στην οποία hMSCsPTX και το TCS αναμείχθηκαν σε διαφορετικές αναλογίες (από 1:01 έως 1:100). Η παρουσία του hMSCsPTX ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό όλων των κυτταρικών γραμμών όγκου που εξετάστηκαν, σύμφωνα με την ανάλογη παρουσία τους (Σχ. 3C, D, E). Αυτό μας επέτρεψε να υπολογίσουν μια αυθαίρετη τιμή εκφράζεται ως αναλογία μεταξύ hMSCsPTX και το TCS που παράγονται IC

50. Τα IC

50 τιμές ήταν 1:47 για MOLT-4, 1:05 για T98G και DU145 και μόνο 1:2-3 για τα κύτταρα Β16 όγκου. Η προσθήκη του hMSCs ελέγχου δεν επηρέασε ουσιαστικά τον πολλαπλασιασμό TCs, αν και ένα χαμηλό σημαντική αναστολή της ανάπτυξης (ρ & lt? 0,02) παρατηρήθηκε σε 1:01 αναλογία για όλες τις κυτταρικές σειρές όγκων ελέγχθηκαν

(Α) παρουσιάζεται. η κινητική της αναστολής της ανάπτυξης που επάγεται από διαδοχικές αραιώσεις hMSCsPTX-CM για T98G, DU145 και του SR4987PTX-CM για Β16 που συγκρίθηκε με δραστηριότητα διαφόρων συγκεντρώσεων ΡΤΧ στο ίδιο TCs (Β). Η προσθήκη CM παρήγαγε μια ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε όλες τις TCs δοκιμάζονται κατά τρόπο που εξαρτάται από τη δόση: 1:16 και 1:04 αραιώσεις IC

50 και IC

90 αναστολή της ανάπτυξης σε όλες τις γραμμές TC αντίστοιχα, που αντιστοιχεί στην οι συγκεντρώσεις ΡΤΧ απαραίτητο για την επίτευξη IC

50 και IC

90 σχετικά με τα διάφορα κύτταρα όγκου όπως αναφέρεται στον μικρό ένθετο πίνακα στο (Β). Η αναστολή του πολλαπλασιασμού TCs λήφθηκε επίσης με μία δοκιμασία άμεσης συν-καλλιέργεια. Primed hMSCsPTX μικτά, σε διαφορετικές αναλογίες (1:100-1:10-1:1 MSCs /ΘΚ), με MOLT-4 (C), T98G (D), DU145 (Ε) έδειξαν δοσοεξαρτώμενη ικανότητα να μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό TCs αξιολογούνται σε μια δοκιμή ΜΤΤ στις 7 ημέρες που εκφράζεται ως επί τοις εκατό του OD που μετρήθηκε για TCs καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελέγχου μόνο (CTR) ή σε παρουσία του δεν γεμάτοι hMSCs. SR4987PTX συμπεριφέρθηκε σαν hMSCsPTX. Ωστόσο, ακόμη και όχι γεμάτοι SR4987 per se έδειξε κάποια αντι-πολλαπλασιαστική ικανότητα στις Β16 μελανώματος σε 1:01 αναλογία (F). Τα ιστογράμματα αναφέρουν τη μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων με τη στατιστική σημασία ως ακολούθως:

* (ρ & lt? 0,05)

,

** (ρ & lt? 0,01) vs ανάπτυξη

όγκου κυττάρων (CTRL) .

η

ποντίκι SR4987PTX λειτούργησε σαν hMSCsPTX στην πρόσληψη και την απελευθέρωση του φαρμάκου όπως δοκιμάστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ για CM (Εικ. 1Α). Ωστόσο, στην δοκιμασία συν-καλλιέργεια, τα κύτταρα SR4987 «per se» παρήγαγε μια αναστολή των κυττάρων μελανώματος Β16 (ρ & lt? 0,05). Που δεν διαφέρει από εκείνη που παράγεται από SR4987PTX (Εικ. 3F)

hMSCSPTX και ποντίκι SR4987PTX εμφανίσει ισχυρές

in vitro

αντι-αγγειογενετική δραστικότητα

Επειδή ΡΤΧ θεωρείται ένας αναστολέας της αγγειογένεσης [16], [23], μπορούμε έτσι διερευνήσαμε εάν hMSCsPTX και SR4987PTX θα μπορούσε να επηρεάσει την αγγειογένεση

in vitro

(Εικ. 4). Η αντι-αγγειογενετική δραστικότητα της καθαρής ΡΤΧ αρχικά δοκιμάστηκε σε HUVECs και μικροαγγειακές ECs (HMECs) πολλαπλασιασμό. ΡΤΧ σε δόσεις έως και 10 ng /ml ήταν εξαιρετικά κυτταροτοξική για τα δύο HUVECs και HMECs. ΡΤΧ παρήγαγε περίπου το 50% της αναστολής της ανάπτυξης ECs (IC

50) σε 4,6 ng /ml (Σχ. 4Α). Η επίδραση της hMSCsPTX-CM για HUVECs και HMECs ήταν εξαιρετικά κυτταροτοξική στα 1:02 και 1:04 αραιώσεις (Σχ. 4Β, C). Στο 1:08 hMSCsPTX-CM ανέστειλε και τις δύο HUVECs και πολλαπλασιασμό HMECs αλλά λιγότερο από 5 ng /ml καθαρού ΡΤΧ. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με δοκιμασία συν-καλλιέργειας (Σχ. 4D, E, F). Αναλογία 1:01 και 1:05 του hMSCsPTX /ECs παρήγαγε μία ισχυρή κυτταροτοξική δράση στις δύο HUVECs και HMECs, ενώ σε μία αναλογία 1:10, καμία κυτταροτοξικότητα αλλά σημαντική αναστολή της ανάπτυξης ECs παρατηρήθηκε (Εικ. 4D, E). Είναι ενδιαφέρον, σε αναλογία 1:05, hMSCsPTX ξεκίνησε σκοτώνοντας HMECs κατά τη διάρκεια των πρώτων 24 ωρών της συγκαλλιέργειας? μετά από 72 ώρες επώαση πολύ λίγοι HMECs επιβίωσαν (Σχ. 4F). hMSCs-CM ελέγχου δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό ECs.

ΡΤΧ αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ECs (Α). HUVECs και HMECs (2 × 10

5) καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες με την παρουσία διαφορετικής συγκέντρωσης του ΡΤΧ. Το IC

50 ήταν περίπου 4,69 ng /ml ΡΤΧ και στα 10 ng /ml ΡΤΧ μπλοκαριστεί σημαντικά τόσο HUVECs και πολλαπλασιασμό HMECs, οι οποίες σε υψηλότερες δόσεις ήταν κυτταροτοξική. Παρομοίως, η προσθήκη του hMSCsPTX-CM αναστέλλουν σημαντικά HUVECs (Β) και HMECs (Γ) πολλαπλασιασμό. Στο 1:02 αραίωση, hMSCsPTX-CM ήταν κυτταροτοξική, ενώ σε υψηλότερες 1:04 και 1:08 αραιώσεις αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό ECs. Η αναστολή του πολλαπλασιασμού ECs ελήφθη με δοκιμασία συν-καλλιέργεια. HMSCsPTX συν-καλλιεργήθηκαν στους 1:01 και 1:05 αναλογία (MSCs /ECs) ήταν κυτταροτοξική τόσο για HUVECs (D) και HMECs (Ε). Σε αναλογία 1:10 hMSCsPTX συνέχισε να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό ECs. Ανεπεξέργαστα hMSCs ελέγχου δεν επηρέασε ECs. Στο (F) φωτογραφίες του πολιτισμού της hMSCsPTX αναμιγνύεται 1:05 με HMECs. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα φαίνεται. hMSCsPTX σκοτώσει HMECs ήδη 24 ώρες μετά τη σπορά. Λευκά βέλη δείχνουν τα νησιά του HMECs εξακολουθούν να υπάρχουν στον πολιτισμό. Σημειώστε ότι μετά από 72 ώρες οι περισσότεροι από τους HMECs σπέρνεται σκοτώθηκαν και μόνο hMSCsPTX παραμένουν στον πολιτισμό (20 × μεγέθυνση). Μπαρ στα σχήματα είναι οι μέσες τιμές ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα γίνονται εις τριπλούν.

* p & lt? 0,05

,

** p & lt? 0.01 vs

ανεπεξέργαστων hMSCs

Η

Η αντι-αγγειογενετική δυναμικό της hMSCsPTX διερευνήθηκε επίσης με τη χρήση του αορτή αρουραίου. δοκιμή δακτυλίου [24]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η προσθήκη του 1:02 και 1:04 αραίωση hMSCsPTX-CM μειώνεται έντονα είτε αυθόρμητη ή VEGFa επαγόμενη βλάστηση neocapillaries από δακτυλίους αορτής. Αραίωση 1:08 του hMSCsPTX-CM που αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό ECS δεν επηρέασε αορτή σχηματισμό τριχοειδών δακτύλιο (εικ. 5Α). HMSCsPTX-CM ήταν επίσης σε θέση να προκαλέσουν τριχοειδή παλινδρόμησης, αν προστεθεί σε δακτυλίους αορτής μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας. Υπό μικροσκοπική εξέταση, πολλές ζώνες νέκρωσης σκάφους παρατηρήθηκαν (Εικ. 5Β). Η προσθήκη του hMSCs-CM δεν επηρέασε ουσιαστικά τριχοειδή σχηματισμό (Εικ. 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα με SR4987PTX ελήφθησαν (Εικ. S5).

(Α) και δοκιμασία (Β) δακτύλιος αορτής αρουραίου χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί hMSCsPTX-CM αναστολή της ανάπτυξης μικροαγγείων. Στο (Α) hMSCsPTX-CM σε διαφορετικές αραιώσεις προστίθενται σε δακτυλίους αορτής αρουραίου με την παρουσία ή απουσία VEGFa προκάλεσε μια μεγάλη μείωση του τριχοειδούς έκφυσης σε σύγκριση με μέσο CTRL και να hMSCs-CM. VEGFa 20 ng /ml χρησιμοποιήθηκε ως θετικοί έλεγχοι (

** ρ & lt? 0,01 vs

hMSCs-CM). Στο (Β) φωτογραφίες δείχνουν hMSCsPTX-CM (σε 1:02 αραίωση), η οποία επάγεται τριχοειδή υποχώρηση όπως αποδεικνύεται από την παρουσία ρήξης σκάφους και νεκρωτικές ζώνες (βέλη) (μεγεθύνσεις 20 ×). Στο (C), (D) και (Ε) τα αποτελέσματα της hMSCsPTX

in vivo

επί του όγκου παίρνει (C), επί DU145 (D) και Β16 ανάπτυξης (Ε) δείχνονται. Περίπου 0,4 × 10

6 hMSCsPTX και τον έλεγχο χωρίς θεραπεία hMSCs αναμίχθηκαν (σε αναλογία 1:05 hMSCs /TCS /) με 2 × 10

6 DU145 ή Β16 και στη συνέχεια με ένεση υποδορίως (δ.ο.) σε ποντίκια. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με μέτρηση των διάμετροι των όγκων που λαμβάνονται κάθε δύο ημέρες, με διαμέτρημα. Η συν-έγχυση hMSCsPTX με DU145 ή Β16, προκάλεσε σημαντική καθυστέρηση της εμφάνισης του όγκου (Γ), καθώς και μια μεγάλη μείωση του DU145 (D) και Β16 (Ε) όγκου του όγκου, ενώ η συν-ένεση με ακατέργαστα ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού δεν το έκανε επηρεάζει ούτε DU145 ή Β16 όγκους, ούτε η ένεση ΣΤΛ αναμιγνύονται 5 λεπτά πριν από την ένεση με 2.000 ng /ml ΡΤΧ (βλέπε πίνακα 1). Το ένθετο σε (D) και (Ε) είναι η φωτογραφία των όγκων ελέγχου, hMSCsPTX και hMSCs ποντίκια με αγωγή κατά το χρόνο της θυσίας.

* p & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0.01 vs μόνη

TCs ή

vs ποντίκια που έλαβαν θεραπεία

hMSCs

Η

hMSCsPTX και το ποντίκι SR4987PTX αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

η

In vitro

δεδομένα έδειξαν ότι τόσο hMSCsPTX και SR4987PTX ήταν έντονα ανασταλτικά για τους κορυφαίους συντελεστές, ακόμη και κυτταροτοξική με ΑΕΚ. Για να δούμε αν μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, hMSCsPTX και hMSCs ελέγχου συν-ένεση σε αναλογία 1:05 είτε με ανθρώπινη DU145 ή Β16 ποντικού καρκίνου κύτταρα μελανώματος σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια. Ομάδες ελέγχου ενέθηκαν επίσης μόνο με TCs ή TCs αναμιγνύονται, 1-2 λεπτά πριν από την ένεση, με 2.000 ng /ml ελεύθερης ΡΤΧ. Στον Πίνακα 1 και στην Εικόνα 5 τα αποτελέσματα συνοψίζονται. HMSCsPTX αναμιγνύεται είτε με DU145 ή Β16 μελανώματος προκάλεσε σημαντική καθυστέρηση σε όγκο παίρνει (Σχ. 5C) και μειωμένη τόσο DU145 (Σχ. 5D) και την ανάπτυξη του όγκου Β16 (Σχ. 5Ε). Το αποτέλεσμα κατά του όγκου επί DU145 επάγεται από hMSCsPTX ήταν πιο ισχυρό από ότι στις B16. Ωστόσο, τα βάρη των όγκων των DU145 και Β16 ήταν σημαντικά μειωμένες με επεξεργασία hMSCsPTX? 25% των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με DU145 και hMSCsPTX ήταν επίσης χωρίς όγκο (Πίνακας 1). Είναι ενδιαφέρον ότι η συν-έγχυση των κυττάρων DU145 και Β16 με υψηλή συγκέντρωση ελεύθερου ΡΤΧ δεν καθυστέρησε όγκου λαμβάνει ή επηρεάζουν την ανάπτυξη (Πίνακας 1), το οποίο υποδηλώνει ότι χρονικά εξαρτώμενη απελευθέρωση της ΡΤΧ από hMSCsPTX είναι απαραίτητο να επηρεάσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Αυτό μπορεί επίσης να συμβεί

in vivo

.

Η

Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τη χρήση του ποντικιού πάνω SR4987 Β16 μελανώματος (Πίνακας 1). SR4987PTX συν-ένεση με Β16 (κατά αναλογία 1:05) σε C57B16 ποντικούς, τα οποία είναι συγγενή για SR4987 [14], καθυστέρησε σημαντικά όγκου παίρνει και μειωμένη Β16 ανάπτυξη, αν και ο συν-ένεση με SR4987 ελέγχου «per se» παράγεται κάποια ανασταλτική δραστηριότητα για την ανάπτυξη Β16 (Εικ. S6).

Επιδράσεις της SR4987PTX το ποντίκι για την υποδόρια ξενομοσχεύματα κυττάρων U87MG γλοιοβλαστώματος

Πειράματα χρησιμοποιώντας RFP + U87MG γλοιοβλαστώματος κύτταρα και GFP + SR4987 έχουν σχεδιαστεί ώστε να εντοπίζουν τα δύο κλάσματα των κυττάρων και να διερευνήσουν τις αλληλεπιδράσεις τους

in vivo

. Οι ποντικοί ελέγχου, μπολιασμένα είτε με κύτταρα U87MG ή με κύτταρα U87MG και SR4987, απέδειξαν ότι η έκφραση του RFP και GFP δεν μετέβαλλε ογκογονικότητα και την επιβίωση αυτών των κυττάρων στο

in vivo

κατάσταση. Συνολικά, τα κύτταρα SR4987PTX είχαν ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της ανάπτυξης ξενομοσχευμάτων γλοιοβλαστώματος (Σχ. S7A-Β). Στα χρονικά σημεία 2, 4 και 6 εβδομάδων, η RFP + U87MG /GFP + SR4987PTX ξενομοσχεύματα ήταν σημαντικά μικρότερες από τις RFP + U87MG ξενομοσχεύματα (

σ

& lt? 0,01,

σ

& lt? 0,05 και

σ

& lt? 0.001, αντίστοιχα? Φοιτητών

t

-τεστ). Στα ίδια χρονικά σημεία, το RFP + U87MG /GFP + ξενομοσχεύματα SR4987-ΡΤΧ ήταν σημαντικά μικρότερες από ό, τι RFP + U87MG /ξενομοσχεύματα SR4987 GFP +, καθώς και (

σ

& lt? 0,02,

σ

& lt? 0,05, και

σ

& lt? 0.001, αντίστοιχα? Φοιτητών

t

-τεστ). μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι, στο πλαίσιο του όγκου, οι GFP + SR4987PTX ίδια τα κύτταρα διατεταγμένα σε κλώνους και στήλες για να σχηματίσουν δίκτυα που παγιδευτούν τα RFP + U87MG κύτταρα (Σχ. S7C). Αντίθετα, η GFP + SR4987 που δεν είχε προετοιμαστεί με PTX είχαν αναμιχθεί με τα κύτταρα U87MG χωρίς καμία τάση να οργανωθούν σε δευτερογενείς δομές (Σχ. S7C). Η ιστολογική εξέταση αποκάλυψε ότι τα ξενομοσχεύματα που περιέχουν SR4987 κύτταρα, ανεξάρτητα από αστάρωμα τους ΡΤΧ, δεν ανέπτυξαν εστίες νέκρωσης, που τυπικά παρατηρείται στα ξενομοσχεύματα U87MG κατά τον χρόνο επιβίωσης 4 και 6 εβδομάδα (Σχ. S7D). Τόσο το μέγεθος και την ιστολογική εμφάνιση U87MG και U87MG ξενομοσχεύματα /SR4987 δεν διέφεραν σημαντικά από αυτές ξενομοσχεύματα που παράγεται από ένεση του ιού σε μεταγωγή RFP + U87MG κύτταρα και RFP + U87MG /GFP + SR4987, αντίστοιχα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

συζήτηση

Η στρωματικά ποντίκι SR4987 κυτταρική σειρά γεμάτοι πρώτη

in vitro

με DXR και στη συνέχεια συν-καλλιεργημένα με αποτέλεσμα HSCs σε μια ισχυρή αναστολή της CFU σχηματισμούς [14]. Σημειώνοντας αυτήν την ιδιότητα, αναρωτηθήκαμε αν hMSCs και SR4987 γεμάτοι με ένα αντικαρκινικό φάρμακο θα μπορούσε να αποκτήσει αντι-όγκου και, κατά συνέπεια, να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του καρκίνου.

Για να είναι έγκυρη αυτή η υπόθεση, τόσο SR4987 και hMSCs ποντίκι πριμοδοτήθηκαν με ΡΤΧ, επειδή αποδεικνύεται τόσο ισχυρή κατά του όγκου [15], [25] και αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα [16], [23]. Μόλις απελευθερώνονται από πριμοδοτημένα κύτταρα, ΡΤΧ μπορούσαν να επηρεάσουν τόσο του όγκου και τον πολλαπλασιασμό των ECs

Αρχικά πειράματα έδειξαν ότι ΡΤΧ ήταν σε θέση να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού και SR4987, αλλά δεν ήταν κυτταροτοξική.? μέχρι 10.000 ng /ml δεν επηρέασαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Αυτή η συγκέντρωση ΡΤΧ ήταν περίπου 500 φορές υψηλότερη από ό, τι εκείνων που είναι αναγκαίες για την παραγωγή ενός IC

50 επί MOLT-4, μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή λευχαιμίας πολύ ευαίσθητος σε δραστηριότητα ΡΤΧ [20] που χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της hMSCsPTX-CM και SR4987PTX-CM δραστηριότητα. Με βάση την προηγούμενη μελέτη [14], που καθορίστηκε έτσι ένα πρότυπο πρωτόκολλο για την προνομιακή hMSCs και SR4987 με PTX, που αποτελείται από θεραπεία 3 × 10

5 προσκολλημένων κυττάρων με 2.000 ng /ml ΡΤΧ για 24 ώρες σε καλλιέργεια. Περιληπτικά, βρήκαμε ότι: α) hMSCs ήταν σε θέση να ενσωματώσουν ταχέως ΡΤΧ όπως επιβεβαιώνεται με τη χρήση ΡΤΧ-F? β) hMSCsPTX μπορεί σιγά-σιγά απελευθερώσει ΡΤΧ, τουλάχιστον εν μέρει, στο μέσο καλλιέργειας σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο, όπως επιβεβαιώνεται από την ανάλυση HPLC? γ) φορμαλίνη ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα μυελού και δεν ήταν αποτελεσματικές για την πρόσληψη ΡΤΧ? δ) τόσο hMSCsPTX και SR4987PTX απέκτησε ένα ισχυρό κατά του όγκου και αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα

in vitro

που ήταν δοσοεξαρτώμενη, και αποδείξιμη χρησιμοποιώντας CM ή με δοκιμασία συν-καλλιέργειας τους? ε) hMSCsPTX συν-ενέθηκαν σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια με ανθρώπινα DU145 και SR4987PTX συν-ένεση με U87MG ή Β16 ποντικού μελανώματος, όγκου καθυστέρησε σημαντικά παίρνει και μειωμένη ανάπτυξη του όγκου. Στο μοντέλο μελανώματος Β16 παρατηρήσαμε ότι τα στρωματικά κύτταρα ποντικού SR4987 είναι σε θέση «per se» για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων σε ένα επίπεδο παρόμοιο με SR4987PTX. Η διαπίστωση αυτή φαίνεται να είναι σε συμφωνία με τα αντιφατικά στοιχεία που αναφέρθηκαν από τη βιβλιογραφία που προτείνουν τόσο η ικανότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων και στρωματικά κύτταρα να ευνοήσουν ή να αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου [26]. Ειδικότερα, το μοντέλο όγκου Β16 αντιπροσωπεύει μια κατάσταση στην οποία έχει αποδειχθεί στρωματικά κύτταρα ποντικού κατά του όγκου δραστικότητα [27]. Σε αυτή την κατάσταση μπορεί να είναι ότι PTX φορτωμένα κύτταρα SR4987 αυξήσει τα βασικά αντικαρκινική αποτελεσματικότητά τους χωρίς σημαντική μετρήσιμο αποτέλεσμα.

Ανεξάρτητα από αυτή τη διαπίστωση, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι τα αποτελέσματά μας, στο σύνολό τους, υποστηρίζουν σθεναρά την αρχική μας υπόθεση προτείνοντας ακόμη hMSCs ως φορέας για χημειοθεραπευτικά φάρμακα στον άνθρωπο. Κατά τη γνώμη μας, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν σημαντικές νέες γνώσεις σχετικά με τις λειτουργικές ιδιότητες των MSCs θηλαστικών. Από τοξικολογική άποψη, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την ιδέα ότι τα θηλαστικά, τουλάχιστον μέσα στο διαμέρισμα στρώμα ΒΜ, περιέχουν κύτταρα που μπορεί να παίζουν ένα διπλό ρόλο στον έλεγχο της τοξικότητας του φαρμάκου. Αυτά τα κύτταρα μπορούν να μειώσουν ή να βελτιώσουν την τοξικότητα του φαρμάκου, ανάλογα με την ικανότητά τους «να προσροφά» και στη συνέχεια να απελευθερώσουν ένα φάρμακο, ακόμη, όπως φαίνεται εδώ για ΡΤΧ, στην αρχική του μορφή. Αυτό το περιστατικό

in vivo

μένει να διευκρινιστεί. Ωστόσο, τα στοιχεία από ασθενείς με καρκίνο που λαμβάνουν πολύ υψηλές δόσεις χημειοθεραπείας φαίνεται να υποστηρίζουν αυτή την υπόθεση [28].