Αφηρημένο

Στόχος

Αλληλεπίδραση στρωματικά κύτταρα και κύτταρα όγκου παίζει ένα δυναμικό ρόλο στην έναρξη και την ενίσχυση της καρκινογένεσης. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την στιχομυθία μεταξύ ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων (CRC) με ινοβλάστες στρωματικά και τα αντικαρκινικά αποτελέσματα της κουρκουμίνης και 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), ειδικά για τον καρκίνο των βλαστικών κυττάρων (CSC) επιβίωση σε ένα 3D-co ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ μοντέλο που μιμείται

in vivo

μικροπεριβάλλον του όγκου.

Μέθοδοι

Colon κύτταρα καρκινώματος HCT116 και MRC-5 ινοβλάστες ήταν συν-καλλιεργήθηκαν σε μια μονοστιβάδα ή υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου το μοντέλο

in vitro

με /χωρίς κουρκουμίνη ή /και 5-FU.

Αποτελέσματα

μονόφυλλο μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες που υποστηρίζονται εντατική στιχομυθία μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και ινοβλαστών και αυξημένη up -Κανονισμός του μεταστατικού δραστικών μορίων προσκόλλησης (β1-ιντεγκρίνης, ICAM-1), αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β μόρια σηματοδότησης (ΤΟΡ-β3, ρ-Smad2), πολλαπλασιασμός που σχετίζεται πρωτεΐνες (κυκλίνη D1, Ki-67) και επιθηλιακά-to- μετάβαση μεσεγχυματικά (EMT) παράγοντα (vimentin) σε HCT116 σε σύγκριση με όγκο μονο-καλλιέργειες. Υψηλή πυκνότητα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες συνεργικά αυξημένη παράγοντες προαγωγής όγκων (NF-κΒ, ΜΜΡ-13), TGF-β3, ευνοείται επιβίωση CSC (που χαρακτηρίζονται από τα πάνω ρύθμιση του CD133, CD44, ΑΙ_ϋΗ1) και ΕΜΤ-παράγοντες (αυξημένη βιμεντίνης και Slug, μειωμένη Ε-καδερίνης) σε HCT116 σε σύγκριση με το υψηλής πυκνότητας HCT116 μονο-καλλιέργειες. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτό συνεργιστική στιχομυθία ήταν ακόμα πιο έντονη σε παρουσία του 5-FU, αλλά μειώθηκε δραματικά με την παρουσία κουρκουμίνης, επάγουν βιοχημικές αλλαγές στα μεσεγχυματικά-επιθηλιακά μετάβασης (ΜΕΤ), ευαισθητοποιώντας έτσι ΚΕΠ σε θεραπεία 5-FU.

Συμπέρασμα

Εμπλουτισμός ΚΕΠ, αξιοσημείωτη ενεργοποίηση των παραγόντων προαγωγής όγκων και EMT σε υψηλή πυκνότητα συν-καλλιέργειας τονίζει ότι η αλληλοπαρεμβολές στο μικροπεριβάλλον του όγκου διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου, και αυτή η αλληλεπίδραση φαίνεται να διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, από τον TGF-β και EMT. Διαμόρφωση αυτής της συνεργιστική στιχομυθία με κουρκουμίνη θα μπορούσε να είναι μια πιθανή θεραπεία για CRC και την καταστολή της μετάστασης

Παράθεση:. Buhrmann C, Kraehe P, Lueders C, Shayan P, Goel Α, Shakibaei Μ (2014) Η κουρκουμίνη Καταστέλλει παρεμβολής μεταξύ Colon Cancer Stem Cells και στρωματικά ινοβλάστες στο μικροπεριβάλλον του όγκου: πιθανός ρόλος της EMT. PLoS ONE 9 (9): e107514. doi: 10.1371 /journal.pone.0107514

Επιμέλεια: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Ιατρική Σχολή, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 26 Ιουνίου του 2014? Αποδεκτές: 13 Αυγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 19, Σεπτεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Buhrmann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα που περιλαμβάνονται στο έγγραφο

Χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στον κόσμο και δημιουργεί μεγάλα κλινικά προβλήματα λόγω του υψηλού ποσοστού μετάσταση και η επανάληψη της [1], [2]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου οφείλεται σε γενετικούς και επιγενετικές μεταβολές που είναι το αποτέλεσμα πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων των μετασχηματισμένων κυττάρων με το μικροπεριβάλλον τους [1], [3]. Το μικροπεριβάλλον του όγκου θεωρείται ως η κλίνη του όγκου, η οποία αποτελείται από τα συστατικά του κατοίκου, όπως στρωματικά κύτταρα και τους παράγοντες που είναι σταθερές εντός του περιβάλλον του στρώματος, και τα συστατικά μη-κάτοικος όπως διαφορετικούς πληθυσμούς ανοσοκυττάρων, τα οποία επηρεάζουν την εισβολή όγκου και μετάσταση [4]. Η συνεργιστική επίδραση του μικροπεριβάλλοντος για φλεγμονώδεις αντιδράσεις και την εξέλιξη του όγκου θεωρείται πλέον να είναι ένα ουσιαστικό χαρακτηριστικό της καρκινογένεσης [1], και υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για την ταυτοποίηση παραγόντων που στοχεύουν ειδικά την αλληλεπίδραση διόδου μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και στρωματικών [5 ].

έχει προταθεί ότι ο σχηματισμός CRC προκύπτει από ένα μικρό υπο-πληθυσμό της αυτο-ανανέωσης καρκινικά βλαστικά κύτταρα που βρίσκονται εντός της κολονικής κρύπτης [6], [7]. Πράγματι, η CRC βλαστοκύτταρα ιδιότητες (CSC) παρουσιάζουν παρόμοια με φυσιολογικές βλαστικών κυττάρων και είναι υπεύθυνα για την εξέλιξη του όγκου [7], [8]. Πρόσφατα, έχει προταθεί ότι τα ΚΕΠ είναι ο μοναδικός τύπος κυττάρων στο μικροπεριβάλλον του όγκου που διατηρούν το μικροπεριβάλλον και να ενισχύσει τη μετάσταση και εισβολή καρκίνου του [4], [9]. Περαιτέρω, έχει δειχθεί ότι η CSC μπορούν άμεσα ή έμμεσα να αλληλεπιδρούν με διάφορους πληθυσμούς ανοσοκυττάρων εντός μικροπεριβάλλον του όγκου, οι οποίες πιστεύεται ότι επηρεάζουν σημαντικά την εξέλιξη του όγκου [4].

παράγοντες που είναι σε θέση να καταστείλει την στιχομυθία Προσδιορισμός μεταξύ καρκίνου και στρωματικών κυττάρων στο μικροπεριβάλλον του όγκου θα μπορούσε να είναι ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο για την καταστολή της μεταστατικό δυναμικό των ΚΕΠ. Προκειμένου να αναπτυχθούν νέες στρατηγικές θεραπείας για CRC, είναι συνεπώς απαραίτητο να μελετήσουν με μεγαλύτερη λεπτομέρεια την αλληλεπίδραση των ΚΕΠ με το

κάτοικος

και

μη κάτοικος

συστατικά σε μικροπεριβάλλον τους να διαφωτίσει τη λεπτομερή μηχανισμοί με τους οποίους ελέγχεται ανάπτυξη και την εξέλιξη CRC.

ως ένα μεγάλο ποσοστό του ΚΕΣ σχετίζονται με περιβαλλοντικούς παράγοντες [1], φαρμακοτροφίμων προσφέρουν οι ίδιοι ως ιδανικοί υποψήφιοι για να διαμορφώνει το μικροπεριβάλλον του όγκου και ως εκ τούτου υποστηρίζουν χημειοθεραπεία. Πράγματι, αυτό είναι σημαντικό καθώς πάνω από 15% των ασθενών αναπτύσσουν αντίσταση σε συμβατική /ρεύμα χημειοθεραπεία με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και περισσότερο από το 50% των ασθενών αναπτύσσουν υποτροπή [10]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει προηγουμένως ότι nutraceuticals, όπως κουρκουμίνη, μπορεί να επηρεάσει άμεσα CRC βλαστικά κύτταρα από αυξάνοντας χημειοευαισθησία τους να χημειοθεραπευτική αγωγή, έτσι εμφανώς αυξάνοντας θετική θεραπευτική έκβαση [11] – [13]. Προέρχεται από τα ριζώματα του φυτού

Curcuma longa

, κουρκουμίνη (diferuloylmethane) είναι ένα φυσικό κίτρινο πολυφαινόλη που διαμεσολαβεί τα αποτελέσματά της από τη διαφοροποίηση αρκετών σημαντικών μοριακών στόχων συμπεριλαμβανομένων παραγόντων μεταγραφής (NF-κΒ, AP-1, β κατενίνης), ένζυμα (π.χ. Cox-2, ΜΜΡ), προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες (π.χ. ΤΝΡ-α, IL-1β και IL-6), και μορίων προσκόλλησης κυτταρικής επιφάνειας (π.χ. καντερίνες, ιντεγκρίνες) [14] – [ ,,,0],16]. Διαφοροποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών πλέγματος (ΜΜΡ) έκφραση στον όγκο (μικρο) -Περιβάλλον είναι σημαντική καθώς οι MMPs γνωστό δείκτες για CRC εξέλιξης [17] – [19]. Μετάσταση όγκου και εισβολή επηρεάζεται επίσης από την αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα. Η προσκόλληση και τη σηματοδότηση μορίων, όπως ιντεγκρίνες παίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια CRC εξέλιξη και τη μετάσταση [20], [21]. Περαιτέρω, η ενδοκυτταρική προσκόλληση μόριο-1 (ICAM-1), έχει δειχθεί ότι ενισχύει τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων και εισβολή και έχει ταυτοποιηθεί ως υπεύθυνες για τα ενδοθηλιακά προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, έτσι επηρεάζουν έντονα μεταστατικό δυναμικό [22], [23]. Το μικροπεριβάλλον του όγκου επάγει επιπλέον ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ η οποία είναι γνωστό ότι ρυθμίζει διάφορα γονίδια που εμπλέκονται στην έναρξη του όγκου, την προώθηση, και μετάσταση [24], [25], και επάγουν Wnt δραστηριότητα, η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην βιολογία των βλαστικών κυττάρων CRC [ ,,,0],26].

Ο μετασχηματισμός του αυξητικού παράγοντα-β (ΤΟΡ-β) είναι ένα πολυλειτουργικό πολυπεπτίδιο που παίζει ουσιαστικό ρόλο στη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό και την εμβρυϊκή ανάπτυξη σε φυσιολογικούς ιστούς. κύτταρα των ιστών συνθέσει και εκκρίνουν ΤΟΡ-β στο μικροπεριβάλλον όπου συνδέεται με ειδικούς υποδοχείς ΤΟΡ-β για παρακρινείς και αυτοκρινείς σηματοδότηση. Αυτό το συγκρότημα συνδετήρα και του υποδοχέα διεγείρει την ενδοκυτταρική σηματοδότηση καταρρακτών που περιλαμβάνουν την κανονική οδό Smad2 σηματοδότησης [27], που σχηματίζουν σύμπλοκα με Smad4 και συσσωρεύεται και μετατοπίζεται εντός του πυρήνα. Στο πυρήνα, ενεργοποιείται σύμπλοκα Smad ρυθμίζουν τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων και, τελικά, ρυθμίζουν την επιδιόρθωση των ιστών [27] του κυτταρικού κύκλου και. Είναι γνωστό ότι ο TGF-β είναι ένας καταστολέας όγκων σε φυσιολογικά κύτταρα των ιστών και στα πρώτα στάδια της εξέλιξης του όγκου. Σε κύτταρα όγκου η ανασταλτική επίδραση αύξησης της σηματοδότησης ΤΟΡ-β είναι απορρυθμισμένη και μεταβαίνει από ογκοκατασταλτικό προς όγκων παράγοντα προαγωγής σε διαφορετικά όργανα [27], [28]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η διέγερση του ΤΟΡ-β επί στρωματικών κυττάρων προκαλεί έκκριση της IL-11 και αυξάνει την ικανότητα μετάστασης των κυττάρων CRC ενώ τα ζώα που έλαβαν θεραπεία με ένα συγκεκριμένο αναστολέα του υποδοχέα ΤΟΡ-β 1 είναι ανθεκτική στο σχηματισμό μετάστασης [ ,,,0],29]. Είναι ενδιαφέρον, έχει αναφερθεί ότι η έκκριση κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων από στρωματικά κύτταρα σε ένα μικροπεριβάλλον του όγκου ενεργοποιεί μια επιθηλιακή-προς-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) που υποστηρίζει αντοχή φαρμάκου, επανεμφάνιση του όγκου, εισβολή και μετάσταση των νεοπλασματικών κυττάρων [30]. Επιπλέον, η Ε-καντερίνη έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ και αυτό μπορεί να μπλοκαριστεί από δακτύλου ψευδαργύρου μεταγραφική καταστολείς, όπως Slug και αυτή η διαδικασία είναι αντιστρεπτή [31] – [34].

Χαρακτηρισμός μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην προώθηση του όγκου ρόλου του ΤΟΡ-β σηματοδότηση και ΕΜΤ σε ένα μικροπεριβάλλον του όγκου μεταξύ ινοβλάστες και καρκινικά κύτταρα μπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών έναντι ανάπτυξης όγκου όπως CRC. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρουσιάζονται μελέτης ήταν να διερευνήσει λεπτομερέστερα την αλληλεπίδραση των κυττάρων CRC με ινοβλάστες στρωματικά, η ενεργοποίηση του καρκίνου προάγουν πρωτεΐνες φλεγμονής, παρακρινής μεσολαβητών και τους διαμορφώνοντας επιδράσεις της κουρκουμίνης και 5-FU, ειδικά για τα βλαστικά κύτταρα CRC και EMT σε μια

in vitro

καρκίνο μικροπεριβάλλον συν-καλλιέργεια, η οποία προσομοιώνει τις

in vivo

στο μικροπεριβάλλον του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα

Τα μονοκλωνικά αντι-ΑΙ_ϋΗ1 ελήφθη από Acris Αντισώματα GmbH (Herold, Γερμανία). Τα μονοκλωνικά αντι-CD133 και αντι-CD44 ηγοράσθησαν από Abcam PLC (Cambridge, UK). Αντι-β-ακτίνης, αντι-κυκλίνης-D1, αντι-ΙΟΑΜ-1, αντι-βιμεντίνη, αντι-Ε-καδερίνης, αντι-Slug, αντι-ΤΟΡ-β3, αντι-ΤΟΡ-β3R και αντι-ρ-Smad2 ήταν που λαμβάνονται από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντι-ΜΜΡ-1, αντι-ΜΜΡ-9 και αντι-ΜΜΡ-13 αγοράστηκαν από την R &? D Systems, Inc., (Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Αντι-φωσφο-ειδικό ρ65 (NF-κΒ) και αντι-φωσφο-ειδικό ρ50 (NF-κΒ) ελήφθησαν από την Cell Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Εξουδετερωτικά αντισώματα παν-ΤΟΡ-β, η κανονική IgG κουνελιού και αντι-β1-ιντεγκρίνης αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Chemie (Μόναχο, Γερμανία). Αντι-Ki-67 και δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την επισήμανση φθορισμού αγοράστηκαν από Dianova (Αμβούργο, Γερμανία). δευτερογενή αντισώματα αλκαλικής φωσφατάσης συνδεδεμένο αντι-ποντικού προβάτου και προβάτου αντι-κουνελιού για ανοσοκηλίδωση αγοράστηκαν από την Millipore (Schwalbach, Γερμανία).

Μέσα ανάπτυξης, χημικές ουσίες και κυτοκίνες

Μέσο ανάπτυξης (F- του Ham 12 /τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (50:50) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 25 μg /ml ασκορβικό οξύ, 50 IU /ml στρεπτομυκίνη, 50 IU /ml πενικιλλίνη, 2.5 μg /ml αμφοτερικίνη Β, απαραίτητα αμινοξέα και L-γλουταμίνη), θρυψίνη /EDTA (ΕΚ 3.4.21.4) αγοράστηκαν από Biochrom (Βερολίνο, Γερμανία). 5-FU αγοράστηκε από τη Sigma (Μόναχο, Γερμανία). BCM-95 κουρκουμίνη, με καθαρότητα μεγαλύτερη από 95% αγοράστηκε από Dolcas Biotech LLC (NJ, USA). Αυτή η εμπορική πηγή της κουρκουμίνης περιέχει τρία βασικά συστατικά: Diferuloylmethane (το πιο άφθονο και ενεργό συστατικό του turmeric) (82%) και τα παράγωγά του διμεθοξυκουρκουμίνη (15%) και bisdemethoxycurcumin (3%), που μαζί αναφέρονται ως κουρκουμινοειδή [35], [ ,,,0],36]. Η κουρκουμίνη διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ως μία συγκέντρωση αποθέματος από 5.000 μΜ και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Διαδοχικές αραιώσεις παρασκευάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας. 100 mM απόθεμα της 5-FU (5-φθοριοουρακίλη) παρασκευάστηκε σε απόλυτη DMSO και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Η συγκέντρωση του DMSO ήταν μικρότερη από 1% της φαρμακευτικής αγωγής. Για τη θεραπεία, 5-FU αραιώθηκε σε ϋΜΕΜ και προστέθηκε σε καλλιέργειες για να δώσει την επιθυμητή τελική συγκέντρωση.

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κόλου (HCT116) και φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα ινοβλάστης (MRC-5) ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Συλλογή Καλλιεργειών κυττάρων (Salisbury, UK). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας ιστού με μέσο ανάπτυξης σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε μια ατμόσφαιρα 95% αέρα και

2 5% CO. Το μέσο αλλάχθηκε τρεις φορές την εβδομάδα και τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν όταν επιτεύχθηκε το 70% συρροή. Για μονοστιβάδα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες, HCT116 και MRC-5 ήταν συν-καλλιεργήθηκαν σε αναλογία 1:01 σε μονοστρωματική καλλιέργεια και τις συν-καλλιέργειες αφέθηκαν για μέχρι 3 ημέρες. Το συμπληρωμένο μέσο DMEM αλλάχθηκε κάθε 3-4 ημέρες και κύτταρα συλλέγονται στα χρονικά σημεία που υποδεικνύονται. Όλα τα συν-καλλιέργειες σπάρθηκαν σε συρροή για να εξασφαλιστεί η βέλτιστη επαφή μεταξύ των κυττάρων. Για υψηλή πυκνότητα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες, HCT116 καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας συν-καλλιεργήθηκαν με MRC-5 σε μονοστιβάδα. Για τον σχηματισμό των καλλιεργειών υψηλής πυκνότητας, ένα 10 μΙ σταγόνα εναιωρήματος κυττάρου που περιέχει περίπου 1 εκατομμύριο κύτταρα HCT116 τοποθετήθηκε σε ένα φίλτρο νιτροκυτταρίνης στην κορυφή ενός γέφυρας steelnet, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Σε αυτό το σύστημα τα κύτταρα συσσωματώνονται και τρέφονται με διάχυση. Τα κύτταρα MRC-5 αναπτύχθηκαν σε μονοστοιβάδα στον πυθμένα του τρυβλίου Petri. Αυτό το μοντέλο μιμείται ένα τρισδιάστατο

in vivo

κατάσταση και επιτρέπει την ανταλλαγή μεταξύ των συστατικών που κατοικούν και τα καρκινικά κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου σχετικά με την ενδιάμεση φάση μέσου αέρα. Υψηλή πυκνότητα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν μόνο κουρκουμίνη (5 μΜ) ή 5-FU μόνο (1, 5, και 10 μΜ) ή υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία επί 4 ώρες με κουρκουμίνη (5 μΜ) ακολουθούμενη από κατεργασία με 5-FU (0,1, 1, 2 και 3 μΜ) για την υποδεικνυόμενη φορά. Σε μερικά πειράματα, για τη διερεύνηση του ρόλου του ΤΟΡ-β κατά τη διάρκεια της αλληλοπαρεμβολές στο μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες, οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε αγωγή με ένα αντίσωμα εξουδετέρωσης του ΤΟΡ-β (10, 20, 30 ng /ml) ή IgG ελέγχου (10 , 20, 30 ng /ml) για τον υποδεικνυόμενο χρόνο.

Έμμεση ανάλυση ανοσοφθορισμού μικροσκοπία του μονοστιβάδας και υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες

HCT116 και MRC-5 ήταν συν-καλλιεργήθηκαν σε ένα αναλογία 1:01 σε γυάλινες πλάκες σε μονοστοιβάδα ή σε υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες. Μετά στερέωση με μεθανόλη για 10 λεπτά, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS και επικαλύπτονται με αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) για 30 λεπτά. Πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν 1:50 σε PBS /BSA, επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε υγρό θάλαμο, πλύθηκαν τρεις φορές με PBS /BSA που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με ροδαμίνη (αραιωμένο 1:80 σε PBS /BSA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και τέλος πλύθηκαν και πάλι τρεις φορές με απεσταγμένο νερό. χρώση Counter διεξήχθη με ϋΑΡΙ (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, Sigma) για την οπτικοποίηση πυρήνες κυττάρων. Τα πλακίδια καλύφθηκαν με Fluoromount έγκλεισης και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Leica, Germany).

Toluidine κυανή χρώση του μονοστιβάδας και υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες

κύτταρα MRC-5 καλλιεργήθηκαν σε μονοστιβάδα σε υψηλή πυκνότητα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες με κύτταρα HCT116. Υψηλή πυκνότητα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες είτε αφεθεί χωρίς θεραπεία, θεραπεία με κουρκουμίνη μόνο (5μΜ), 5-FU μόνη της (1 μΜ) ή υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία επί 4 ώρες με κουρκουμίνη (5 μΜ) ακολουθούμενη από κατεργασία με 5-FU (0.1, 1, 2, 3 μΜ). HCT116 και MRC-5 καλλιέργειες αξιολογήθηκαν μετά από 10 ημέρες. HCT116 υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες εγκλείστηκαν σε Tissue-Tek (Sakura Finetek Ευρώπη, The Netherlands), κρυοσυντηρημένα στους -80 ° C και κόβεται σε 5-7 μm τομές χρησιμοποιώντας ένα cryomicrotome (Zeiss, Germany). Μονόφυλλο κύτταρα MRC-5 σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη για 10 λεπτά. τμήματα HCT116 και MRC-5 μονοστιβάδες χρωματίστηκαν με μπλε τολουϊδίνης και εξετάσθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός (Leica, Germany).

Η πρόσληψη της κουρκουμίνης σε μονοστιβάδας και μικροπεριβάλλον του όγκου υψηλής πυκνότητας συν-καλλιέργειες

Η κυτταρική πρόσληψη της κουρκουμίνης στα monolayer- και υψηλής πυκνότητας συν-καλλιέργειες, όπως περιγράφεται παραπάνω, αξιολογήθηκε με την μέθοδο φθορισμού. Εν συντομία, για τα τμήματα HCT116 εξέταση φθορισμού και MRC-5 καλλιέργειες σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεϋδη, που καλύπτεται με Fluoromount έγκλεισης και εξετάζεται κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Leica, Γερμανία).

ανάλυση Western blot

ολόκληρου κυττάρου λύματα HCT116 υψηλής πυκνότητας ή μονο- συν-καλλιέργειες παρασκευάστηκαν και κλασματοποιείται με SDS-PAGE [12]. Εν συντομία, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν σε PBS, και οι πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris /HCl (ρΗ 7,2), 150 mM NaCl, 1% (ν /ν) Triton Χ-100, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 50 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 100 mM φθοριούχο νάτριο, 0,01% (ν /ν) απροτινίνη, πεπστατίνη Α (4 μg /ml), λευπεπτίνη (10 μg /ml), και φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο 1 mM (PMSF)) για 30 λεπτά σε πάγο. Μετά τη ρύθμιση της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης με σύστημα δικιγχονινικού οξέος (Pierce) χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού σαν πρότυπο, ίσες ποσότητες (500 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα) του συνόλου των πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE υπό αναγωγικές συνθήκες. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και επωάσθηκαν σε ρυθμιστικό αποκλεισμού (5% (w /v) σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος σε PBS, 0,1% Tween 20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε ρυθμιστικό αποκλεισμού στους 4 ° C σε έναν αναδευτήρα, πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, και στη συνέχεια επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 φορές σε 0.1 Μ Tris (ρΗ 9.5) που περιέχει 0.05 Μ MgCl

2 και 0.1 Μ NaCl. Ειδικά σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας nitroblue tetrazolium και 5-βρωμο-4-χλωρο-3-indoylphosphate (

σ

-τολουϊδίνης άλας? Pierce, Rockford, IL, USA). Ως υποστρώματα για αλκαλική φωσφατάση

Στατιστική ανάλυση

τα αριθμητικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσες τιμές (+/- SD) για ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Τα μέσα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

υποθέτοντας ίσες διακυμάνσεις δοκιμασία του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν η

σ

αξία ήταν μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

Για να καταλάβουμε μερικά από τα βασικά βιολογικές συμπεριφορές των στρωματικών και καρκινικών κυττάρων και να προσομοίωση ενός

in vivo

μικροπεριβάλλον του όγκου,

in vitro έχουν θεσπίσει συστήματα

συν-καλλιέργεια. Η εστίαση αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η αλληλεπίδραση του HCT116 ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων με ανθρώπινων ινοβλαστών MRC-5 κύτταρα σε ένα μοντέλο μικροπεριβάλλον συγκαλλιέργειας υψηλής πυκνότητας, με ή χωρίς κουρκουμίνη ή /και 5-FU επί του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων, παράγοντες προαγωγής όγκων , εισβολή, ΕΜΤ και του παχέος ΚΕΠ.

Η εντατική αλληλοπαρεμβολές μεταξύ HCT116 και MRC-5 κύτταρα σε μονοστιβάδα συγκαλλιέργεια επιρροές μικροπεριβάλλον έκφραση των μορίων που εμπλέκονται στην προσκόλληση, εισβολή ή /και τον πολλαπλασιασμό

HCT116 και MRC-5 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με αναλογία 1:01 για τρεις ημέρες σε μονοστιβάδα και αξιολογήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο. κύτταρα HCT116 κυριολεκτικά συσσωρευμένη και συγκεντρωμένα γύρω στα κύτταρα MRC-5 και την αναζήτηση για την ίδρυση κοντά κύτταρο-προς-κύτταρο επαφή με τα κύτταρα MRC-5 σε όγκο συν-καλλιέργειας (Σχ. 1, PC). Στη συνέχεια, εκτελέσαμε χρώση ανοσοφθορισμού των μονοστοιβάδας συν-καλλιέργειες να διερευνηθεί κατά πόσον η παρατηρηθείσα κυτταρική αλληλεπίδραση οδηγεί σε λειτουργικές αλλαγές στα κύτταρα. HCT116 κύτταρα σε καλλιέργεια μονοστοιβάδας ή HCT116 και MRC-5 κύτταρα σε μονοστοιβάδα συν-καλλιέργειες σημάνθηκαν με β1-ιντεγκρίνης, ICAM-1, Ki-67, κυκλίνη D1, ΤΟΡ-β3, ρ-Smad2 και βιμεντίνη (Σχ. 1, IF ). Παρατηρήσαμε ισχυρή έκφραση της προσκόλλησης και μεταστατικών μόρια β1-ιντεγκρίνης, ICAM-1, δραστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου Ki-67, κυκλίνη D1, του ΤΟΡ-β3, ρ-Smad2 και του EMT βιμεντίνης δείκτη σε HCT116 συν-καλλιέργειες σε σύγκριση με HCT116 μονο-καλλιέργειας (Εικ. 1). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αλληλεπίδραση των στρωματικών κυττάρων είναι ζωτικής σημασίας για την προώθηση των όγκων, δημιουργώντας έτσι ένα κυτταρικό μικροπεριβάλλον που ρυθμίζει την εξέλιξη του καρκίνου.

HCT116 κύτταρα (βέλη) ήταν είτε καλλιεργήθηκαν μόνα τους ή συν-καλλιεργήθηκαν με MRC-5 κύτταρα (*) σε αναλογία 1:01 για τρεις ημέρες σε γυάλινες πλάκες σε μονοστιβάδα και σταθεροποιείται με μεθανόλη. Για ανοσοϊστοχημικής κύτταρα επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον β1-ιντεγκρίνης, ICAM-1, Ki-67, η κυκλίνη D1, ΤΟΡ-β3, ρ-Smad2 και βιμεντίνη) που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα ροδαμίνη-συζευγμένα και αντικηλίδωση με ϋΑΡΙ να απεικονίσει κύτταρο πυρήνες. Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων. PC: αντίθεσης φάσης? ΕΑΝ: ανοσοφθορισμού? Μεγέθυνση 400 ×? bar = 30 nm.

Η

Η κουρκουμίνη ή /και 5-FU επηρεάζουν έντονα την ακεραιότητα των κυττάρων σε υψηλή πυκνότητα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες , HCT116 σε υψηλής πυκνότητας συν-καλλιεργήθηκαν με MRC-5 σε μονοστιβάδα, που μιμούνται το

in vivo

κατάσταση για τη διερεύνηση των επιδράσεων της παρακρινούς θεραπευτικών παραγόντων για την αλληλοπαρεμβολές μεταξύ των κυττάρων και στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου, όγκου-προώθηση παράγοντες, εισβολή και ο σχηματισμός σφαιρών όγκου, ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Πράγματι, έχει αναφερθεί ότι τα φυσιολογικά κύτταρα ινοβλαστών είναι σε θέση να επάγει διαφοροποίηση των κυττάρων του όγκου, όπως ενός ανθρώπινου κυττάρου καρκινώματος του κόλου γραμμής [38], [39]. Τα αποτελέσματα του 5-FU ή /και η κουρκουμίνη στην κυτταρική ακεραιότητα και σχηματισμός colonosphere σε καλλιέργειες μικροπεριβάλλον του όγκου αξιολογήθηκαν σε κύτταρα HCT116 μετά από 10 ημέρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της κουρκουμίνης ή 5-FU (0, 0,1, 1, 5 και 10 μΜ) και το σχηματισμό colonosphere αξιολογήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Το άτομο IC

50 της κουρκουμίνης ή 5-FU ήταν περίπου 5μΜ ή 3.5μm, αντίστοιχα (ρ & lt? 0,05). Για να αξιολογηθεί η επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας, τα κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 5 μΜ κουρκουμίνη για 4 ώρες και στη συνέχεια συν-επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της 5-FU (0, 0,1, 1, 5 και 10 μΜ) για 10 ημέρες. Είναι ενδιαφέρον ότι, η προθεραπεία με κουρκουμίνη μειωμένη IC

50 τιμές για 5-FU σε 0,1 μΜ σε HCT116 (ρ & lt? 0,05) (Σχ. 2Α). Αυτό υποδηλώνει ότι η κουρκουμίνη ευαισθητοποιεί κύτταρα HCT116 σε 5-FU. Περαιτέρω, τολουϊδίνης μπλε χρώση σε καλλιέργειες ελέγχου έδειξαν ότι τα κύτταρα που σχηματίζονται καλά ανεπτυγμένες αποικίες σφαιροειδές κατά τη διάρκεια της περιόδου καλλιέργειας (Σχήμα 2Β: α.). Θεραπεία των καλλιεργειών HCT116 με 5-FU (5 μΜ) ή κουρκουμίνη (5 μΜ) μόνο του ή με κουρκουμίνη και 5-FU (5 μΜ /0.1 μΜ) δείχθηκε ότι είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην αναστολή σχηματισμού colonosphere και την ενίσχυση της διάσπασης των σφαιρών όγκου υψηλής πυκνότητας σε σύγκριση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου (σχήμα 2Β: α.). Αυτή η επίδραση ήταν υψηλότερη με κουρκουμίνη ή κουρκουμίνης /5-FU κατεργασία συν-καλλιέργειες (Σχήμα 2Β: α.). Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την κυτταρική πρόσληψη της κουρκουμίνης από HCT116 σε μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες με μικροσκοπία φθορισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι η κουρκουμίνη λήφθηκε από όλα τα κύτταρα HCT116 σε θεραπεία κουρκουμίνη μικροπεριβάλλον συν-καλλιέργειες (Σχήμα 2Β: β.). Για να ερευνηθεί, εάν η μονοστιβάδα MRC-5 κύτταρα στο μικροπεριβάλλον συν-καλλιέργειες επιβιώσει από την αγωγή με 5-FU, η κουρκουμίνη ή /και 5-FU, εμείς χρώση των κυττάρων με κυανούν τολουϊδίνης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C: α, τα κύτταρα MRC-5 είναι καλά χρωματισμένο το οποίο είναι ένα σημάδι της ζωτικότητας. Επιπλέον, η κουρκουμίνη παρελήφθη από όλους τους 5 MRC-κύτταρα σε αγωγή κουρκουμίνη μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες (Εικ 2C: β.).

Α: Ποσοτικοποίηση του αριθμού των colonosheres επιτεύχθηκε με μέτρηση του αριθμού των σφαιροειδούς αποικίες από 10 μικροσκοπικά πεδία στα υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον συν-καλλιέργειες. Οι καλλιέργειες είτε αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (Co) ή υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-FU (0.1, 1, 5 ή 10 μΜ), κουρκουμίνη (0.1, 1, 5 ή 10 μΜ) ή υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με κουρκουμίνη (5 μΜ) για 4 ώρες, και στη συνέχεια εκτίθενται σε 5-FU (0.1, 1, 5 ή 10 μΜ) επί 10 ημέρες και αξιολογήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο. Οι τιμές σε σύγκριση με τον έλεγχο και στατιστικά σημαντικές αξίες με

p & lt?

0,05 ορίστηκαν με αστερίσκο (*) και

p & lt?

0,01 ορίστηκαν με αστερίσκο (**). Τολουϊδίνης μπλε προφίλ χρώσης (2Β /C, α) και κυτταρική πρόσληψη κουρκουμίνης (2Β /C, β) του HCT116 (Β) σε υψηλή πυκνότητα και σε MRC-5 (C) σε μονοστρωματική συν-καλλιέργεια. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες είτε αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (Co) ή υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-FU (5 μΜ) (5-FU), κουρκουμίνη (5 μΜ) (παρούσα) ή υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με κουρκουμίνη (5 μΜ) για 4 ώρες, και στη συνέχεια εκτίθενται σε 5-FU (0,1 μΜ) (Cur + 5-FU) επί 10 ημέρες και αξιολογήθηκαν κάτω από ένα φως ή μικροσκόπιο φθορισμού. Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. F = Φίλτρο. (*) = Colonosheres HCT116. Μεγέθυνση 4Β, 4Ca: 200x, 4ΚΤ: 400x? bar = 30 nm.

Η

Τα ΚΕΠ του παχέος εντέρου σε πληθυσμούς κυττάρων CRC στοχεύει στην υψηλή πυκνότητα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες με 5-FU, η κουρκουμίνη και η συνδυασμένη θεραπεία

Έχει αναφερθεί ότι το μικροπεριβάλλον του όγκου παίζει ουσιαστικό ρόλο στην διαιώνιση της ΚΕΠ Προώθηση των επηρεάζεται από στρώμα, φλεγμονώδη κύτταρα, κυτοκίνες και αυξητικοί παράγοντες που εκκρίνονται από τα ινοβλάστες στρωματικά [26], [40]. Επομένως, εξετάσαμε την συμπεριφορά του ΚΕΠ εντός του κυτταρικού πληθυσμού CRC, υψηλής πυκνότητας μονο-καλλιέργειες κυττάρων HCT116 αφέθηκαν χωρίς θεραπεία. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες των HCT116 κυττάρων /MRC-5 ήταν είτε αφεθεί χωρίς θεραπεία, ή θεραπεία με 5-FU (5 μΜ), κουρκουμίνη (5 μm) ή σε προεπεξεργασία με κουρκουμίνη (5 μΜ) για 4 ώρες και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 5-FU (0,1 μΜ) για 10 ημέρες. Οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε ανοσοφθορισμό επισήμανση με πρωτεύοντα αντισώματα για τον προσωπικό CSC (CD133). Ελαφρά έκφραση του CD133 ανιχνεύθηκε στην βασική έλεγχο μονο-καλλιέργειες (Σχ. 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση, CD133 θετικά κύτταρα από τα κύτταρα HCT116 σε μικροπεριβάλλον συν-καλλιέργειες υψηλότερη σε σύγκριση με εκείνη στον έλεγχο μονο-καλλιέργειας (Σχ. 3Α), υποδεικνύοντας τη σημαντική συνεργιστική ρόλο της γειτονικής παρεμβολής μεταξύ HCT116 και MRC-5 κύτταρα σε στήριξη προώθηση των όγκων. Επιπλέον, CD133 θετικά κύτταρα από τον πληθυσμό γραμμή HCT116 κυττάρων έδειξαν αυξημένη σημαντικά την επιβίωση μετά από αγωγή με 5-FU σε σύγκριση με κουρκουμίνη ή /και 5-FU (Σχ. 3Α). Με την παρουσία της κουρκουμίνης και /ή 5-FU, εμφάνισαν σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση του CD133 θετικών κυττάρων (Εικ. 3Α και 3Β), αποδεικνύοντας την εξέχουσα χημειοευαισθητοποιητική επίδραση της κουρκουμίνης σε ΚΕΠ. Με ποσοτικοποίηση, επιβεβαιώσαμε ότι ο αριθμός των CD133-επισημασμένων κυττάρων αυξήθηκε στο μικροπεριβάλλον HCT116 συν-καλλιέργειες σε σύγκριση με τον έλεγχο όγκου μονο-καλλιέργειας (Σχ. 3Α), και CD133 θετικών κυττάρων αυξήθηκε στην επιζώντα πληθυσμό κυττάρων κατά την κατεργασία με 5-FU , αλλά όχι με κουρκουμίνη ή τη συνδυασμένη θεραπεία (σχήμα 3Β).

Α:. υψηλής πυκνότητας μονο-καλλιέργειες κυττάρων HCT116 αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (Α, Co.HD-μονο-καλλιέργεια), υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργεια HCT116 /κύτταρα MRC-5 είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (Α, Co.Microenv-HD-Co-καλλιέργειας), ή θεραπεία με 5-FU (5 μΜ) (Α, 5-FU-Microenv-HD-CO- καλλιέργειας), κουρκουμίνη (5 μΜ) (Α, Cur-Microenv-HD-Co-καλλιέργειας) ή προ-θεραπεία με κουρκουμίνη (5 μΜ) για 4 ώρες, και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 5-FU (0,1 μΜ) (Α, Cur + 5FU -Microenv-HD-Co-καλλιέργειας) για 10 ημέρες. Ανοσοεπισήμανση εκτελέστηκε με πρωτεύοντα αντισώματα για κόλον δείκτη CSC (CD133) που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με ροδαμίνη και αντικηλίδωση με ϋΑΡΙ να απεικονίσει πυρήνες κυττάρων. Οι εικόνες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων. Μεγέθυνση 400 ×. μπαρ 30 nm. Β: Για την ποσοτικοποίηση της ποσότητας του CD133-θετικών κυττάρων σε καλλιέργειες υψηλής πυκνότητας που περιγράφηκε παραπάνω, 100 κύτταρα από 15 μικροσκοπικά πεδία μετρήθηκαν. Η εξέταση έγινε εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα παρέχονται ως μέσες τιμές με S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές σε σύγκριση με τον έλεγχο και στατιστικά σημαντικές αξίες με

p & lt?

0,05 ορίστηκαν με αστερίσκο (*) και

p & lt?.

0,01 ορίστηκαν με αστερίσκο (**)

η κουρκουμίνη έχει ισχυρή επίδραση χημειοευαισθητοποίηση για τον καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων σε πληθυσμούς κυττάρων CRC σε υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες

στη συνέχεια, οι δείκτες CSC (CD133, CD44 και ΑΙ_ϋΗ1) εξετάστηκε η έκφραση για ικανότητα σχηματισμού όγκων και η επίδραση χημειοευαισθητοποίηση κουρκουμίνη στους δείκτες CSC σε HCT116 3D υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες. Οι συν-καλλιέργειες είτε αφεθεί χωρίς θεραπεία, θεραπεία με κουρκουμίνη (5 μΜ), 5-FU (1, 5, και 10 μΜ) μόνη ή υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία επί 4 ώρες με κουρκουμίνη (5 μΜ) ακολουθούμενη από κατεργασία με 5-FU (0,1, 1 , 2, 3 μΜ) για 10 ημέρες (Εικ. 4). Επιπλέον, σε μια άλλη σειρά πειραμάτων, τα κύτταρα HCT116 επωάστηκαν σε υψηλή πυκνότητα μονο-καλλιέργειες, χωρίς ινοβλάστες ως βασική ελέγχου. Έλεγχος υψηλής πυκνότητας μονο-καλλιέργειες HCT116 έδειξε βασική έκφραση των δεικτών CSC (Εικ. 4: a, b, c). Σε αντίθεση με αυτό, ανάλυση ανοσοκηλίδωσης των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου έδειξε σημειώνονται πάνω ρύθμιση του CD133, CD44 και ΑΙ_ϋΗ1 σε HCT116 στον έλεγχο και σε 5-FU κατεργασία υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 4 :αλφάβητο). Ωστόσο, έχει ενδιαφέρον προ-θεραπεία με κουρκουμίνη που ακολουθείται από κατεργασία με 5-FU σημαντικά κάτω-ρυθμισμένη έκφραση δείκτη CSC σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο σε κύτταρα HCT116 σε υψηλή πυκνότητα όγκου συν-καλλιέργειες (Εικ. 4: a, b, c). Η πυκνομετρική ανάλυση των τυπικών πειραμάτων Western Blot που δείχνουν προς τα κάτω ρύθμιση των δεικτών CSC σε κύτταρα HCT116 σε καλλιέργειες που κατεργάζονται είτε με 5-FU, η κουρκουμίνη ή /και 5-FU κουρκουμίνη (Εικ. 4: a, b, c). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παρακρινής αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και στρωματικών είναι ζωτικής σημασίας για την προώθηση της ΚΕΠ και ότι υπάρχει μια ισχυρή χημειοευαισθητοποιητική επίδραση της κουρκουμίνης επί του παχέος εντέρου CSC σε υψηλή πυκνότητα μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες.

HCT116 υψηλής πυκνότητα μονο-καλλιέργειες είτε αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (HCT, Co.) ή συν-καλλιεργήθηκαν με MRC-5 σε μικροπεριβάλλον του όγκου. Στο μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες είτε αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (Οο), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κουρκουμίνη μόνο (5μΜ), 5-FU μόνο (1, 5, και 10 μΜ) ή υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία επί 4 ώρες με κουρκουμίνη (5 μΜ) ακολουθούμενη από κατεργασία με 5 -FU (0,1, 1, 2, 3 μΜ). Μετά από 10 ημέρες καλλιέργειας, συνολικά κυτταρολύματα καλλιεργειών υψηλής πυκνότητας HCT116 παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με στύπωση western και ποσοτική πυκνομετρία για δείκτη CSC ΑΙ_ϋΗ1 (α), CD133 (β) και CD44 (γ). Η πυκνομετρική αξιολόγηση της έκφρασης πρωτεΐνης όπως αποκαλύπτεται με ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε εις τριπλούν. Καθαριότητας πρωτεΐνη β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης σε όλα τα πειράματα. Τιμές σε σχέση με τον έλεγχο και στατιστικά σημαντικές αξίες με

σ

& lt? 0,05. Οι σημαντικές τιμές που σημειώνονται με (*).

Η

Η κουρκουμίνη ή /και 5-FU παρεμβαίνει στη συνεργιστική στιχομυθία μεταξύ CRC- /CSC-κύτταρα και ινοβλάστες σε υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες

για να εξεταστεί η αλληλεπίδραση μεταξύ CRC- /CSC-κύτταρα και ινοβλάστες και να αξιολογηθεί η επίδραση της κουρκουμίνης και /ή 5-FU σε αυτή τη συνεργιστική στιχομυθία, επί των καρκινικών κυττάρων τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και παράγοντες προαγωγής όγκων (MMPs, NF -κB) έκφραση σε μεγαλύτερη λεπτομέρεια, εκτελέσαμε ανάλυση κηλίδος Western των υψηλής πυκνότητας μικροπεριβάλλον του όγκου συν-καλλιέργειες.