Abstract

γαλεκτίνης-9 είναι ένα ευρέως εκφρασμένη πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην ανοσολογική ρύθμιση και tumorpathogenesis και χρησιμεύει ως δείκτης της κακής πρόγνωσης σε διάφορους τύπους καρκίνων. Ωστόσο, η κλινική επίδραση και ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο αυτή η πρωτεΐνη συμβάλλει στην εξέλιξη του όγκου του παχέος εντέρου είναι ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, ανιχνεύσαμε την έκφραση της γαλεκτίνης-9 και τα κύτταρα CD56 χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Κατάταξη συσχέτιση Spearman χρησιμοποιήθηκε για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ της έκφρασης γκαλεκτίνη-9 και φυσικοί φονείς (ΝΚ) κυτταρική διήθηση. Η επίδραση της γαλεκτίνης-9 επί ΝΚ-92 κυτταρική μετανάστευση αξιολογήθηκε in vitro χρησιμοποιώντας Transwell προσδιορισμούς χημειοταξίας. Ο ρόλος του rh-γαλεκτίνης-9 σε F-ακτίνη πόλωση σε ΝΚ-92 κύτταρα διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας σάρωσης με λέιζερ συνεστιακή μικροσκοπία. Δείξαμε ότι γαλεκτίνης-9 εκφράστηκε σε 101 (78,91%) σε ιστούς όγκων του παχέως εντέρου και ότι εκφράστηκε σε χαμηλότερα επίπεδα σε αυτούς τους ιστούς σε σχέση με τους ιστούς παρα-όγκου. Χαμηλά επίπεδα γαλεκτίνης-9 έκφρασης συσχετίζεται θετικά με μια φτωχή ιστολογική μετάσταση βαθμό και λεμφαδένα (Ρ & lt? 0,05). Μια μέθοδος Kaplan-Meier και ανάλυση αναλογικών κινδύνων κατά Cox παλινδρόμησης έδειξε ότι η συνολική επιβίωση ήταν μεγαλύτερη σε ασθενείς με υψηλή γκαλεκτίνη-9 έκφραση σε ένα 8-year παρακολούθησης (P & lt? 0,05). Κατάταξη συσχέτιση Spearman έδειξε ότι υπήρχε μια γραμμική συσχέτιση μεταξύ γκαλεκτίνη-9 έκφρασης και CD56

διείσδυση + ΝΚ κυττάρων (R

2 = 0,658? P & lt? 0,0001). Γκαλεκτίνη-9 διεγείρονται μετανάστευση στα ανθρώπινα κύτταρα ΝΚ-92 επηρεάζοντας F-ακτίνης πόλωσης μέσω της οδού σηματοδότησης Rho /ROCK1. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι γκαλεκτίνη-9 έκφρασης αποτελεί δυνητικά ένα νέο μηχανισμό για όγκους για να ξεφύγουν από το ανοσοποιητικό επιτήρησης σε όγκους του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Wang Υ, Sun J, Ma C, Gao W, Τραγούδι Β, Xue H, et al. (2016) μειωμένη έκφραση της γκαλεκτίνη-9 συμβάλλει στην κακή έκβαση για τον καρκίνο του παχέος εντέρου κατά ανασταλτικός ΝΚ κυττάρων χημειοταξία εν μέρει μέσω της Rho /ROCK1 μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 11 (3): e0152599. doi: 10.1371 /journal.pone.0152599

Επιμέλεια: Yves St-Pierre, INRS, Καναδάς

Ελήφθη: 21 Δεκεμβρίου του 2015? Αποδεκτές: 16 Μάρτη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 30 του Μαρτίου του 2016

Copyright: © 2016 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (https://www.nsfc.gov.cn/) να Xun Qu (Νο 31470885? 31270971? 81072406)? Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (https://www.nsfc.gov.cn/) να Jintang Sun (Νο 31300752)? Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (https://www.nsfc.gov.cn/) να Qianqian Shao (Νο 81300510)? και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (https://www.nsfc.gov.cn/) να Meixiang Γιανγκ (Νο 30901326)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Κάθε χρόνο, περίπου 1,2 εκατομμύρια ασθενείς αναπτύξουν καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) και 600.000 άτομα πεθαίνουν από την ασθένεια αυτή σε όλο τον κόσμο [1]. Παρά το γεγονός ότι υπήρξαν θετικές βελτιώσεις στην χειρουργική και φαρμακευτική στρατηγικές, CRC παραμένει μακριά από τη θεραπευτική ελέγχου [2]. Η παρούσα έλλειψη γνώσης σχετικά με τις ανοσολογικές και μοριακές βαθύτερα αίτια της CRC αποτελεί ένα σημαντικό εμπόδιο για τη βελτίωση των θεραπειών για αυτήν την disease.Hence εντοπισμό νέων βιοδεικτών είναι απαραίτητη για τη μελλοντική ανάπτυξη των στοχευμένων θεραπειών CRC.

Η ανάπτυξη του καρκίνου είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων που διέπεται όχι μόνο από πολυάριθμους κύτταρο εγγενείς παράγοντες, αλλά και από εξωγενείς παράγοντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου [3, 4]. Ως σημαντικά συστατικά της μικροπεριβάλλον του όγκου, ορισμένα είδη λευκοκυττάρων επηρεάσουν την εξέλιξη του όγκου και την πρόγνωση [5-7]. φυσικά κύτταρα φονείς (ΝΚ) είναι ένας από τους κύριους τύπους κυττάρων στο έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα. Στο CRC, εκτεταμένες ενδοογκική διήθηση από κύτταρα ΝΚ σχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση, ανάλογα με τα κυτταροτοξικά αποτελέσματά τους επί καρκινικών κυττάρων [8, 9]. Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι τα κύτταρα ΝΚ είναι γενικά σπανιότερα στο μικροπεριβάλλον CRC από ότι σε γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο παρά την παρουσία σχετικώς υψηλών επιπέδων χημειοκινών ΝΚ κυττάρων-ανταποκρίνεται σε ιστούς όγκων [10]. Αυτή η αντίφαση πρότεινε ότι οι χημειοκίνες από μόνη της δεν θα μπορούσε να είναι επαρκής για να προσλαμβάνουν κύτταρα ΝΚ στον όγκο.

γαλεκτίνες είναι διαλυτά μέλη της υπεροικογένειας λεκτίνης που χαρακτηρίζονται από την παρουσία μιας περιοχής αναγνώρισης υδατάνθρακα και συγγένεια δέσμευσης β-γαλακτοσίδη. Συνολικά 15 γαλεκτίνες θηλαστικών έχουν μέχρι στιγμής εντοπιστεί [11]. Μεταξύ αυτών των γαλεκτίνες, γαλεκτίνης-9 εκθέματα ανοσορυθμιστικά αποτελέσματα μέσω των οποίων παρεμβαίνει με την λειτουργία και βιολογικές συμπεριφορές των διαφόρων τύπων των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των Τ κυττάρων, τα δενδριτικά κύτταρα και ΝΚ κύτταρα [12, 13]. Στα ποντίκια που φέρουν όγκους, γαλεκτίνης-9 αύξησε τον αριθμό των κυττάρων ΝΚ στο περιτοναϊκό εξίδρωμα [14], υποδεικνύοντας ότι παίζει ένα δυναμικό ρυθμιστικό ρόλο που περιλαμβάνει ΝΚ κύτταρα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου. Ειδικότερα, έχουν χαμηλότερα επίπεδα γαλεκτίνης-9 έχουν παρατηρηθεί στους περισσότερους τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [15], το μελάνωμα [16], του καρκίνου του μαστού [17] και γαστρικού καρκίνου [18], σε σχέση με τα κανονικά αντίστοιχά τους . Λόγω της στενής σύνδεσης μεταξύ γαλεκτίνης-9 έκφρασης και οι αριθμοί των κυττάρων ΝΚ, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι ένα μειωμένο επίπεδο γαλεκτίνης-9 σε έναν όγκο συμβάλλει στην κακή διείσδυση των κυττάρων ΝΚ στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Ωστόσο, επειδή η παρουσία και η σημασία της γαλεκτίνης-9 έκφραση δεν έχει ακόμη αποδειχθεί σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου, παραμένει ασαφές εάν αυτή η σύνδεση συμβαίνει σε καρκίνο του παχέος εντέρου και ποια ρυθμιστικών μηχανισμών εμπλέκονται, αν υπάρχουν.

ο παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση γαλεκτίνης-9 ήταν μειωμένη σε ιστούς όγκων του παχέος εντέρου, η οποία συνδέεται με κακή πρόγνωση σε αυτούς τους ασθενείς. Πρέπει επίσης να παρέχουν αποδείξεις χρησιμοποιώντας το

in vitro

μελέτες που γκαλεκτίνη-9 ενισχύει τη μετανάστευση των κυττάρων ΝΚ ασκώντας επιδράσεις στην F-ακτίνη πόλωσης μέσω της οδού σηματοδότησης Rho /ROCK1. Αυτά τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μια δυνητικά νέο μηχανισμό, μέσω του οποίου οι όγκοι μπορεί να ξεφύγει από το ανοσοποιητικό επιτήρησης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και ιστοί

Η μελέτη μας περιλαμβάνονται τα στοιχεία που ελήφθησαν από 128 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο καρκίνο του παχέος εντέρου ο οποίος υποβλήθηκε σε χειρουργική επέμβαση στο Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong από Ιανουάριος 2004-Δεκέμβριος 2011 (Jinan, Shandong, Κίνα), αυτό μεταξύ των οποίων μία ομάδα 38 ασθενών στους οποίους έχουμε συγκριτικά παρα-όγκου με καρκινικό ιστό και μια άλλη ομάδα 90 ασθενείς συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση επιβίωσης. Η συλλογή και η χρήση των δειγμάτων ιστού συμμορφωθεί με τις σχετικές κατευθυντήριες γραμμές και τις θεσμικές πρακτικές της Επιτροπής Δεοντολογίας της Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Shandong, και γραπτή έγκριση αποκτήθηκε σε κάθε περίπτωση πριν από τη συλλογή δείγματος ιστού. Η επιτροπή δεοντολογίας της Qilu Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Shandong ενέκρινε την εν λόγω μελέτη (Kyll-2013-069). Τα βασικά κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 και τα συμπληρωματικά υλικά και μέθοδοι (S1 File).

Η

Ανοσοϊστοχημεία και Αξιολόγηση

Τομείς (4 μm) από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εγκλεισμένα σε παραφίνη δείγματα ιστού όγκου κόλου αποκηρώθηκαν, επανυδατώθηκαν και επωάστηκαν με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ανθρώπινης γαλεκτίνης-9 (SC-366141, 1: 200? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) και μονοκλωνικά ποντικού αντι- ανθρώπινο CD56 (3576, δύο παρα δέκα? Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA). Οι τομές στη συνέχεια χρωματίστηκαν με τις αντίστοιχες δευτερογενή αντισώματα. Δύο ανεξάρτητες παθολόγους που αγνοούσαν την κλινικά δεδομένα, αξιολόγησε τις ανοσοϊστοχημικές αποτελέσματα. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση των ιστών περιγράφεται στο συμπληρωματικό Υλικά και μέθοδοι (S1 File).

Cells και θεραπείες

Τα κύτταρα επωάστηκαν σύμφωνα με τις τυποποιημένες διαδικασίες που περιγράφονται στον οδηγό καλλιέργεια ATCC. Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές όγκων κόλου SW480, SW620 και ΗΤ29 αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) (Invitrogen, USA) συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Bio International, USA). Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά NK92 ήταν ένα δώρο από το δεύτερο Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Σαγκάη, Κίνα) [19] και καλλιεργείται με την Alpha ελάχιστο βασικό μέσο (Gibco, USA) που περιέχει 2 mM L-γλουταμίνη και 1.5 g /διττανθρακικού L νάτριο, αλλά χωρίς ριβονουκλεοσίδια και δεοξυριβονουκλεοζίτες, και διάφορα συστατικά προσετέθησαν να ληφθεί πλήρης μέσο ανάπτυξης: 0,2 mM ινοσιτόλη (17.508, Sigma, USA)? 0.1 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη (ES-007E, Merck Millipore, Γερμανία)? 0,02 mM φολικό οξύ (F8758, Sigma, USA)? 100-200 U /mL ανασυνδυασμένης IL-2? και προσαρμογή σε μια τελική συγκέντρωση 12.5% ​​ορό αλόγου (16050, Gibco, USA) και 12,5% εμβρυϊκό βόειο ορό. Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν σε 5% CO

2 σύμφωνα με τις τυποποιημένες διαδικασίες στον οδηγό καλλιέργεια ATCC.

Απομόνωση ανθρώπινων κυττάρων ΝΚ

Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) ελήφθησαν μετά φυγοκέντρηση με Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences, Σουηδία). ΝΚ κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ΝΚ κυττάρων Απομόνωση (MiltenyiBiotec, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η καθαρότητα των CD3

-CD56

+ κυττάρων ήταν σταθερά πάνω από το 95%, μετρούμενη με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

RNA παρεμβολής

Είμαστε παροδικά του siRNA κατά της ανθρώπινης γκαλεκτίνη-9 (siRNA # 378 και siRNA # 690, GenePharma, Σαγκάη, Κίνα) ή αγωνίζομαι siRNA σε κύτταρα ΗΤ-29 χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η knockdown αποτελεσματικότητα των siRNAs που στοχεύουν γαλεκτίνης-9 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR, ανάλυση κηλίδας Western και ELISA σε 36 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι ακόλουθες αλληλουχίες siRNA που στοχεύει ανθρώπινο γαλεκτίνης-9 χρησιμοποιήθηκαν:

siRNA378: sense, 5′-GGAAGACACACAUGCCUUUTT-3 ‘? αντινόημα, 5’-AAAGGCAUGUGUGUCUUCCTT-3 ‘? και siRNA 690: sense, 5’-CCAUUACCCAGACAGUCAUTT-3 ‘? αντίθετης φοράς, 5’-AUGACUGUCUGGGUAAUGGTT-3 ‘.

δοκιμασία Μετανάστευση

Χρησιμοποιήσαμε transwell θαλάμους με μεμβράνη πόρων 5-mm (Costar, Corning, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). ΝΚ-92 κύτταρα ή πρωτογενή κύτταρα ΝΚ καλλιεργήθηκαν στην κορυφή θαλάμους. Colon όγκος υπερκείμενο κυτταρικής καλλιέργειας ή κυμαινόμενες συγκεντρώσεις rh-γαλεκτίνης-9 (amp 2045-GA-050, R &? D, Minneapolis, ΜΝ, USA) προστέθηκαν στον κάτω θάλαμο. ΝΚ-92 κύτταρα ή πρωτογενή κύτταρα ΝΚ επιτρεπόταν να μεταναστεύσουν στον κάτω θάλαμο επί 4 ώρες στους 37 ° C, Οι μετά συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας σανίδες κύτταρο-count. Επειδή τα ΝΚ κύτταρα έχουν ένα σχετικά υψηλό ποσοστό αυθόρμητης μετανάστευσης, χρησιμοποιήσαμε τα εξής δείκτη μετανάστευσης (ΜΙ) για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων: δείκτης μετανάστευσης = ο αριθμός των κυττάρων που μετανάστευσαν /ο αριθμός των τυχαία μεταναστευτικά κύτταρα (όχι χημειοκίνη) [20]. Υ-27632 διυδροχλωρίδιο (20 μΜ) (ab120129, Abcam, Cambridge, Massachusetts, UK) και C3 τρανσφεράσης (2.0 μg /mL) (CT04-Α, Cytoskeleton, Denvor, CO, USA) προστέθηκαν την διερεύνηση του ρόλου της Rho /ROCK σηματοδότησης στην NK μετανάστευσης. IL-12 (7.5 ng /mL) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για χημειοπροσέλκυση ΝΚ κυττάρων (200-12P80, Peprotech, Chicago, USA) [21].

Western ανάλυση κηλίδος

Κυττάρων Προϊόντα λύσης επαναιωρήθηκαν σε μικρό όγκο ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως όπως περιγράφηκε προηγουμένως και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση Western blot [22]. Οι λεπτομέρειες της δυτικής blotprocedure περιγράφεται στον συμπληρωματικό Υλικά και Μέθοδοι (S1 File).

Σύνολο απομόνωση RNA, σύνθεση cDNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα /επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (15596026, Invitrogen, USA) και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -20 ° C. Χρησιμοποιώντας aReverTra Ace qPCR RT Kit (FSQ-101, Toyobo, Japan), μπορούμε αντίστροφη μεταγραφή 1 μα ολικού RNA σε DNA σε μια ενός σταδίου reaction.This ακολουθήθηκε από PCR για να ενισχύσει τα προϊόντα μεταγραφής του αντίστοιχου μορίου στόχου. Οι αντιδράσεις RT και τα στάδια της PCR διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο Πίνακας 2 παραθέτει τις αλληλουχίες εκκινητή που ελήφθησαν από Primer Bank. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου-στόχου κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα GAPDH που τρέχουν κατά την ίδια αντίδραση.

Η

ELISA

Τα υπερκείμενα των κυττάρων του όγκου ΗΤ29 συλλέχθηκαν σε 36 ώρες μετά την επιμόλυνση. Κάθε υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C.Ahuman γαλεκτίνης-9 κιτ ELISA (Cusabio, Wuhan, Hubei Province, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για τη μέτρηση της γαλεκτίνης-9 παραγωγής σε κάθε υπερκείμενο.

συνεστιακής ανάλυσης για F-ακτίνης σε κύτταρα ΝΚ

ΝΚ-92 κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς rh-γαλεκτίνης-9 για 4 ώρες προστέθηκαν σε αντι-off διαφάνειες, μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και διαπερατά χρησιμοποιώντας 0.2% Triton Χ-100 (Χ100, Sigma-Aldrich, USA). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ροδαμίνη-σημασμένο φαλλοϊδίνη (PHDR1, Cytoskeleton, USA) και DAPI (C1002, Beyotime Biotechnology, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. σύλληψη και επεξεργασία εικόνας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό λέιζερ σάρωσης μικροσκόπιο (LSM710, Zeiss, Germany).

Στατιστικές αναλύσεις

Η επιβίωση μετρήθηκε ως ο αριθμός των μηνών από εκτομή με την τελευταία αναθεώρηση. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί καμπύλες επιβίωσης, και η δοκιμή log rank χρησιμοποιήθηκε για τις στατιστικές αναλύσεις. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση δοκιμών του Pearson χ2, ακριβές τεστ του Fisher, t και δοκιμές κατάταξης συσχέτισης Spearman του. Ένα Cox μοντέλο αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκαν για την μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντικές αναλύσεις για να αξιολογηθεί η προγνωστική αξία του κλινικοπαθολογοανατομικές παραγόντων. Όλες οι δοκιμασίες ήταν δύο όψεων, και p ≤ 0,05 θεωρήθηκε για να δείξει στατιστική σημαντικότητα. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση λογισμικό SPSS 17.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Αποτελέσματα

Η έκφραση της γκαλεκτίνη-9 σε ιστούς όγκων CRC

Κατ ‘αρχάς, διερευνήσαμε γαλεκτίνης-9 έκφραση σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αναλύοντας 128 βιοψίες από όγκους του παχέος εντέρου που εκτείνεται στάδια Ι-IV σύμφωνα με ΤΝΜ. Μεταξύ αυτών των δειγμάτων, 101 (78,91%) ήταν θετικοί για έκφραση γαλεκτίνης-9, και τα σκορ ανοσοποίηση των 1, 2, 3, και 4 παρατηρήθηκαν σε 31,25% (40 από 128), 18.75% (24 από 128), 19.53% (25 από 128) και 9,38% (12 από 128) των περιπτώσεων, αντίστοιχα.

η αξιολόγησή μας των δειγμάτων όγκου και ιστών παρα-όγκου που ελήφθησαν από 38 ασθενείς έδειξε ότι το γκαλεκτίνη-9 εκφράστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα τόσο όγκου και φυσιολογικών αδενικά κύτταρα αλλά δεν εκφράστηκε στον πυρήνα ή σε κύτταρα urfaces (Σχήμα 1Α-1C). Ωστόσο, το επίπεδο της έκφρασης γαλεκτίνης-9 μεταξύ των δύο τύπων ιστών ήταν σημαντικά διαφορετική. Στις κανονικές του παχέως δείγματα βλεννογόνου, γαλεκτίνης-9 εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα του φυσιολογικού κόλου αδενικού επιθήλια σε όλες τις περιπτώσεις. Μεταξύ των θετικών περιπτώσεων, 7 είχαν μια βαθμολογία από 1 (18%), 4 είχαν μια βαθμολογία από 2 (11%), 14 είχαν σκορ 3 (37%), και 13 είχαν ένα σκορ 4 (34%) ( Σχήμα 1 D). Ωστόσο, στα αντίστοιχα δείγματα ιστού όγκου, μόνο το 58% (22 από 38 περιπτώσεις) ήταν θετικά για γαλεκτίνης-9 έκφραση. Επιπλέον, η μέση βαθμολογία ανοσοϊστοχημεία για γκαλεκτίνη-9 ήταν μικρότερη στα δείγματα καρκινώματος του παχέος εντέρου σε σχέση με τις κανονικές δείγματα βλεννογόνου (P & lt? 0.001, σχήμα 1Δ).

γκαλεκτίνη-9 έκφρασης στον όγκο του παχέος εντέρου και παρα-όγκου δείγματα ιστού ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ένα στοιχείο ελέγχου ισοτύπου (Α) ή ένα αντίσωμα αντι-γαλεκτίνης-9 (Β). (C), Εκπρόσωπος γκαλεκτίνη-9

υψηλή (αριστερά) και γκαλεκτίνη-9

χαμηλή (δεξιά) έκφραση σε όγκο και παρα-καρκινικών ιστών. (D), Γραφική απεικόνιση της στατιστική κατανομή των γαλεκτίνης-9 επίπεδα έκφρασης σε 38 ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και την αντίστοιχη κανονική δείγματα βλεννογόνου τους. Η ένταση έκφρασης που απεικονίζεται ως ιστολογική βαθμολογία (Σpi), όπου ρ είναι το ποσοστό των γαλεκτίνης-9 θετικά καρκινικά κύτταρα (που σημειώνονται ως 1, 1-10%? 2, 11-50%? 3, 51-80%? ή 4, 81-100%) και i αντιπροσωπεύει την ένταση χρώσης (βαθμολογήθηκε ως 0, χωρίς χρώση? 1, ασθενής χρώση? 2, μέτρια χρώση? ή 3, ισχυρή χρώση). Ισχυρή (++++), μέτρια (+++), ήπια (++), ασθενές (+) και αρνητικό (-) χρώση ήταν 10-12, 7-9, 4-6, 1-3 και 0, αντίστοιχα.

η

γκαλεκτίνη-9 έκφρασης και κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου

Εμείς διερευνηθεί η προγνωστική αξία της γκαλεκτίνη-9 σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Συνολικά 90 περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου και συγγενείς κλινικές και την επιβίωση των πληροφοριών τους αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί ο ρόλος της γαλεκτίνης-9 έκφραση. Με βάση τη διάμεση τιμή των παρατηρούμενων επιπέδων γαλεκτίνης-9, οι ασθενείς με όγκο του κόλου χωρίστηκαν σε χαμηλές (0-1, n = 39) και υψηλή (2-4, n = 51) που εκφράζουν ομάδες. Σημαντικές διαφορές βρέθηκαν στην γκαλεκτίνη-9 έκφρασης σύμφωνα με το στάδιο TNM, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες, και ιστολογική βαθμό, αλλά όχι το φύλο, την ηλικία, ordistant μετάσταση (Πίνακας 3).

Η

Η μονοπαραγοντική ανάλυση των κλινικοπαθολογοανατομικών παράγοντες έδειξε ότι το πρώιμο στάδιο ΤΝΜ (Ι /ΙΙ) και όχι λεμφαδένα μετάσταση (Ν-) συσχετίζονταν σημαντικά με καλά αποτελέσματα (P = 0.001and Ρ = 0.001, αντίστοιχα). Πιο συγκεκριμένα, η υψηλή έκφραση γκαλεκτίνη-9 ήταν σημαντικά σχετίζονται με την καλή επιβίωση (λόγος κινδύνου (HR): 0.483? 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): 0,269 – 0,867? P = 0,015) (Πίνακας 4). Οι μέσοι χρόνοι επιβίωσης σε ασθενείς με γκαλεκτίνη-9

υψηλή και γκαλεκτίνη-9

χαμηλή ήταν 87 και 34 μήνες αντίστοιχα. Οι καμπύλες επιβίωσης φαίνεται στο σχήμα 2Α (δοκιμασία log-rank, P = 0,012). Τα αποτελέσματα των αναλύσεων Kaplan-Meier ήταν σύμφωνα με το μονοπαραγοντική ανάλυση (Σχήμα 2Β και 2C). Επιπλέον, η συνολική επιβίωση ήταν καλύτερη σε ασθενείς με καλά έως μέτρια διαφοροποίηση ήταν καλύτερη από ό, τι σε φτωχά διαφοροποιημένο περιπτώσεις, αλλά η συσχέτιση αυτή δεν έφθασε σημασία (Σχήμα 2D, P = 0,051).

Είναι

Καμπύλες κατά Kaplan-Meier εμφανίζονται για να περιγράψει τη σχέση μεταξύ γαλεκτίνης-9 έκφραση και τη συνολική επιβίωση (Α), μετάσταση λεμφαδένα και τη συνολική επιβίωση (Β), το στάδιο TNM και τη συνολική επιβίωση (C), και ιστολογική διαφοροποίηση και τη συνολική επιβίωση (D). δείγματος (n = 90). Γκαλεκτίνη-9

υψηλή έκφραση, όχι μετάσταση στους λεμφαδένες και το στάδιο ΤΝΜ (Ι /ΙΙ) βρέθηκαν να προβλέψει φορές μεγαλύτερη επιβίωση (P & lt? 0,05, δοκιμασία log-rank)

Η

Επιπλέον, οι ανεξάρτητες παράμετροι που βρέθηκαν να είναι σημαντικά στην μονοπαραγοντική ανάλυση, συμπεριλαμβανομένων στάδιο TNM και την έκφραση γκαλεκτίνη-9, χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια σε άλλο πολυπαραγοντική ανάλυση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι γκαλεκτίνη-9 έκφρασης σε ιστούς όγκων του παχέος εντέρου (HR: 0,549, 95% CI: 0,303 – 0,995, P = 0,048) και το στάδιο ΤΔΔ (HR: 2,371, 95% CI: 1,306 – 4,304, P = 0,005) ήταν ανεξάρτητων δεικτών πρόγνωσης, αποδεικνύοντας ότι η έκφραση γαλεκτίνης-9 σε ιστούς όγκων του παχέος εντέρου είναι ένας θετικός προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση (Πίνακας 4).

σχέση μεταξύ της πυκνότητας του CD56

+ ΝΚ κύτταρα και γαλεκτίνης-9 έκφραση στα καρκινικά κύτταρα CRC

Είμαστε δίπλα διερευνήθηκε η διείσδυση των CD56

+ ΝΚ κυττάρων σε ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου και η σύνδεσή της με γκαλεκτίνη-9 έκφρασης. CD56

+ κύτταρα ανιχνεύθηκαν μέσα σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων φωλιές, αδένες του παχέος εντέρου και του στρώματος (Σχήμα 3Α). Ο διάμεσος αριθμός των CD56

+ κυττάρων ήταν 0,3 (εύρος: 0,0 ~ 26,6) ανά μεμονωμένο πεδίο υψηλής ισχύος (HPF) στον ιστό του όγκου του παχέος εντέρου και 16,25 (εύρος: 0,0 έως 42,4). Σε ιστούς παρα-όγκου

(Α), η έκφραση CD56 ανιχνεύθηκε σε όγκο του κόλου και δείγματα ιστού παρα-όγκου (38 περιπτώσεις), χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία με ένα αντίσωμα αντι-CD56 ή ενός στοιχείου ελέγχου ισοτύπου. Το βέλος δείχνει κύτταρα ΝΚ? Πάνελ δείχνουν τον αριθμό των CD56

+ ΝΚ κύτταρα που παρατηρήθηκαν σε κάθε μικροσκοπικό πεδίο στους ιστούς όγκου και παρα-όγκου. (Β), Εκπρόσωπος εικόνες από όγκους που εκφράζουν υψηλές ή χαμηλές ποσότητες γκαλεκτίνη-9 (επάνω) και CD56 (κάτω) στον ίδιο χώρο. (C), Πάνελ δείχνει τους αριθμούς των CD56

+ ΝΚ κύτταρα που παρατηρήθηκαν σε κάθε μικροσκοπικό πεδίο στην γαλεκτίνης-9

υψηλή ή γαλεκτίνη-9

δείγματα χαμηλής ιστού. (D), Η συσχέτιση μεταξύ γκαλεκτίνη-9 και έκφραση CD56 στα δείγματα ιστών.

Η

Στη συνέχεια, η ανάλυση η κλινική σημασία των ΝΚ κυττάρων σε 38 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Με βάση τη διάμεση τιμή των κυττάρων ΝΚ διείσδυση, οι ασθενείς με όγκο του κόλου χωρίστηκαν σε αρνητικές και θετικές ομάδες. Σημαντικές διαφορές βρέθηκαν σε κύτταρα ΝΚ διήθησης σύμφωνα με το στάδιο ΤΝΜ (Πίνακας 5).

Η

Η ποσότητα του CD56

+ κυττάρων διείσδυση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς παρα-όγκου από ό, τι σε ιστούς όγκων (Ρ & lt ? 0.001, σχήμα 3Α). Επιπλέον, το ποσοστό των ενδοογκική διείσδυση από CD56

+ κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στην γαλεκτίνης-9

υψηλή ιστούς σε σχέση με γαλεκτίνης-9

χαμηλή ιστούς (όπως ο αριθμός των CD56

+ κύτταρα σε φωλιές καρκίνο και παρα-καρκινικών ιστών, διάμεσο 7,6 έναντι 0? εύρος μηδέν έως 42,4 έναντι 0-0,8? P & lt? 0.0001) (Σχήμα 3Β και 3C). Γκαλεκτίνη-9 έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με CD56

+ ΝΚ κυτταρική διήθηση σε καρκίνο του παχέος εντέρου και παρα-καρκινικά δείγματα (P & lt? 0,0001, Ρ

2 = 0,658, σχήμα 3D)

γκαλεκτίνη-9 αυξήθηκε χημειοταξία στα ανθρώπινα κύτταρα ΝΚ

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν τη σύνδεση μεταξύ γκαλεκτίνη-9 έκφρασης και διείσδυση ΝΚ κυττάρων στον ιστό του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα της γαλεκτίνης-9 σε κύτταρα ΝΚ επόμενη εξετάστηκαν in vitro. Πρέπει πρώτα διερευνηθεί κατά πόσον η έκκριση της γκαλεκτίνη-9 από τα καρκινικά κύτταρα είχαν χημειοτακτική επίδραση για τη μετανάστευση στα κύτταρα ΝΚ. Σε αυτά τα πειράματα, προσδιορίσαμε το επίπεδο της γαλεκτίνης-9 έκφραση σε 3 κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, συμπεριλαμβανομένων SW480, SW620 και ΗΤ29, χρησιμοποιώντας qRT-PCR και ανάλυση κηλίδας western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα ΗΤ29 είχε το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης γαλεκτίνης-9 μεταξύ αυτών των 3 κυτταρικών σειρών (Σχ 4Α και 4Β) και ως εκ τούτου αυτά τα κύτταρα επιλέχθηκαν για την ακόλουθη δοκιμή. Σχεδιάσαμε siRNA να γκρεμίσουμε γκαλεκτίνη-9 έκφρασης σε κύτταρα ΗΤ29. Όπως φαίνεται στο Σχ 4C-4Ε, γαλεκτίνης-9 mRNA, και τα επίπεδα πρωτεΐνης και η συγκέντρωση του γαλεκτίνης-9 στο υπερκείμενο της καλλιέργειας ήταν σημαντικά μειωμένη από δύο διαφορετικές αλληλουχίες siRNA, siRNA # 378 και # 690 siRNA. Είναι ενδιαφέρον ότι οι ΗΤ-29 υπερκείμενα καλλιέργειας επάγεται σημαντικά ενισχυμένη χημειοταξία σε ΝΚ-92 κύτταρα, τα οποία είναι CD56

+ ανθρώπινων κυττάρων ΝΚ [19]. Αυτά επίδραση των ΗΤ-29 υπερκείμενα επί ΝΚ-92 χημειοταξία σημαντικά αντιστρέφεται με την προσθήκη των γαλεκτίνης-9 siRNAs # 378 και # 690 ομάδες (Σχήμα 4F) .Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ένα άλλο κόλου κυτταρική γραμμή καρκινώματος SW620, έχουμε βρει ότι σταθερά γαλεκτίνης-9 εκκρίνεται από SW620 είχε επίσης μια χημειοτακτική επίδραση επί ΝΚ-92 κύτταρα μετανάστευση (S1 Σχήμα).

γαλεκτίνης-9 έκφραση εξετάστηκε σε κυτταρικές σειρές όγκων κόλου (ΗΤ29, SW480, SW620 και) χρησιμοποιώντας qRT- PCR (Α) και ανάλυση κηλίδος western (Β). ΗΤ29 κύτταρα χωρίστηκαν σε 5 ομάδες: μια ομάδα ελέγχου (καλλιεργημένα με μόνο μέτρια), μία ομάδα λιπο (επεξεργασμένο με Lipofectamine 2000), μία ομάδα NC (επιμολυσμένα με τον αρνητικό controlsiRNA), ένα γαλεκτίνης-9-siRNA (# 378) ομάδα και μια ομάδα γαλεκτίνης-9-siRNA (# 690). Οι knockdown αποτελεσματικότητες των siRNAs που στοχεύουν γαλεκτίνης-9 εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR (C) και ανάλυση κηλίδος western (D). * P & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο. (Ε), γαλεκτίνης-9 επίπεδα έκκρισης μετρήθηκαν σε διαφορετικές ομάδες χρησιμοποιώντας γαλεκτίνης-9 κιτ ELISA. Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή και SEM των πειραμάτων τετραπλούν * Ρ & lt?.. 0,05 ενάντια στον έλεγχο (F), χημειόταξη του ΝΚ-92 κύτταρα σε απόκριση προς υπερκείμενα ΗΤ29 σε επεξεργασία με γαλεκτίνης-9 siRNA? * P & lt? 0,05 ελέγχου εναντίον, και # P & lt? 0,05 έναντι NC. Αναλύσαμε χημειοταξία σε ΝΚ-92 κύτταρα σε απόκριση σε ποικίλες συγκεντρώσεις γαλεκτίνης-9 (G). Ένας δείκτης μετανάστευσης (ΜΙ) χρησιμοποιήθηκε για να εξηγήσει την υψηλή ποσότητα τυχαίας μετανάστευσης που σημειώθηκε στα κύτταρα ΝΚ. IL-12 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την κίνηση χημειοταξία σε ΝΚ-92 κύτταρα. * P & lt? 0,05 έναντι του ελέγχου, ** P & lt? 0,001 έναντι του ελέγχου. Τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται από τουλάχιστον 3 πειράματα.

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε κατά πόσο γκαλεκτίνη-9 είναι ένα χημειοελκτικό για τα κύτταρα ΝΚ. Σε αυτά τα πειράματα, διαφορετικές δόσεις rh-γαλεκτίνης-9 αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί χημειοτακτική επίδραση γαλεκτίνης-9 για ΝΚ-92 κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το 25 και 50 ng /mL rh-γαλεκτίνης-9 επαγόμενη χημειοταξία σε ΝΚ-92 κύτταρα, αλλά ότι η διαφορά δεν ήταν σημαντική. Σε μια συγκέντρωση των 100 ng /mL, ΝΚ-92 κυτταρική μετανάστευση ήταν ειδικά αυξημένη κατά μήκος της μεμβράνης transwell κατά περίπου 2-φορές (Ρ & lt? 0.001, σε σύγκριση με τον μάρτυρα, Σχήμα 4G)

γαλεκτίνης-9 προωθεί. F-ακτίνη αναδιατάξεις σε κύτταρα ΝΚ με την ενίσχυση της έκφρασης της οικογένειας Rho σε κύτταρα ΝΚ

Τα λεμφοκύτταρα υφίστανται δραματικές ανακατατάξεις κυτταροσκελετική κατά τη διάρκεια της κυτταρικής migration.The μικρό ΟΤΡάσης Rho είναι ένα καίριο ρυθμιστής του κυτταροσκελετού της ακτίνης, και Rho κινάση, η οποία είναι επίσης γνωστό ως Rho-σχετίζεται συσπειρωμένη σπείρα κινάσης (ROCK), είναι μία πρωτεΐνη τελεστή Rho. Για να αξιολογηθεί η εμπλοκή των Rho /ROCK στη μετανάστευση των κυττάρων ΝΚ, δοκιμασίες χημειόταξης πραγματοποιήθηκαν σε παρουσία του καλά χαρακτηρισμένα αναστολέας ROCK, Y27632, και ένα άλλο Rho-ειδικός αναστολέας, C3 τρανσφεράσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Y27632 και C3 τρανσφεράσης αναστέλλει σημαντικά ΝΚ-92 κυτταρική μετανάστευση (Σχήμα 5Α).

(Α), χημειόταξη ανεστάλη από Rho και αναστολείς ROCK σε ΝΚ-92 κύτταρα. ΝΚ-92 κύτταρα διεγέρθηκαν χρησιμοποιώντας μέσο μόνο για 4 ώρες ή μέσο που περιέχει Y27632 (20 μΜ) ή C3-τρανσφεράσης (2 μg /mL) για 1,5 ώρες. Ένας δείκτης μετανάστευσης (ΜΙ) χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί υπόψη η υψηλή τυχαίας μετανάστευσης που παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΝΚ. * P & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο. (Β), η έκφραση του RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhOH, RhoQ και RhoT1 mRNA χρησιμοποιώντας RT-PCR σε ΝΚ-92 κύτταρα τα οποία επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία του rh-γαλεκτίνης-9 σε μία συγκέντρωση 100 ng /mL για 4 ώρες? * P & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο. (Γ), η έκφραση του ROCK1 πρωτεΐνης σε ΝΚ-92 κύτταρα τα οποία επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία του rh-γαλεκτίνης-9 σε μια συγκέντρωση 100 ng /mL για 24 ώρες. (D), Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα του ΝΚ-92 κύτταρα τα οποία επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία του rh-γαλεκτίνης-9 σε μια συγκέντρωση 100 ng /mL για 4 ώρες. F-ακτίνης βάφτηκε με ροδαμίνη-σημασμένο phalloidin (κόκκινο), και οι πυρήνες των κυττάρων σημάνθηκαν με DAPI (μπλε) (630 Χ). Τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται από τουλάχιστον 3 πειράματα.

Η

Τα παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι γκαλεκτίνη-9 ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων ΝΚ. Επομένως, εξετάσαμε την επόμενη τις επιδράσεις της rh-γαλεκτίνης-9 επί Rho οικογενειακούς μορίων σε κύτταρα ΝΚ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι rh-γαλεκτίνης-9 αύξησε σημαντικά την έκφραση πολλαπλών μελών της οικογενείας Rho, συμπεριλαμβανομένων RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhOH, και RhoT1 (Σχήμα 5Β). Όπως φαίνεται στο Σχ 5C, τα επίπεδα πρωτεΐνης ROCK1 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα ΝΚ που είχαν διεγερθεί με rh-γαλεκτίνης-9 για 24 h.These αποτελέσματα έδειξαν ότι γαλεκτίνης-9 ρυθμίζει μία ποικιλία Rho οικογένειας μορίων σε κύτταρα ΝΚ.

Θα εξεταστεί αν γκαλεκτίνη-9 επιρροές ανακατατάξεις στο F-ακτίνης του κυτταροσκελετού σε ΝΚ-92 κύτταρα. ΝΚ-92 κύτταρα κατεργάστηκαν με rh-γαλεκτίνης-9 σε μια συγκέντρωση 100 ng /mL για 4 ώρες, και στη συνέχεια εξετάστηκαν αλλαγές στο F-ακτίνης πολυμερισμού σε ΝΚ-92 κύτταρα. Στην ομάδα ελέγχου, το F-ακτίνης σε ΝΚ-92 κύτταρα σχημάτισαν μια ξεχωριστή φαλλοϊδίνης-χρωματισμένο δαχτυλίδι γύρω από την κυτταρική μεμβράνη. Μετά την επεξεργασία με rh-γαλεκτίνης-9, το F-ακτίνης έγινε συγκεντρωτικά στο ένα άκρο του κυττάρου, όπως φαίνεται στο Σχ 5D.

γαλεκτίνης-9 ενισχύει την πρωτογενή χημειοταξία των κυττάρων ΝΚ

Προκειμένου να επικυρώσει περαιτέρω τα αποτελέσματά μας, μπορούμε να εκτελέσουμε τα βασικά πειράματα με πρωτογενή κύτταρα ΝΚ. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μετανάστευση των πρωτογενών κυττάρων ΝΚ μπορεί να επηρεάζεται τόσο από γαλεκτίνης-9 εκκρίνεται από ΗΤ29 (Σχήμα 6Α) ή rh-γαλεκτίνης-9 (Σχ 6Β). Rho και αναστολείς ROCK αναστέλλουν τη χημειοταξία των πρωτογενών κυττάρων ΝΚ (Σχήμα 6C). Επιπλέον, rh-γαλεκτίνης-9 επίσης αυξάνουν την έκφραση του Rho οικογένειας (Σχήμα 6D) και ROCK1 (Σχήμα 6Ε).

χημειοταξία των πρωτογενών κυττάρων ΝΚ σε απόκριση σε υπερκείμενα ΗΤ29 σε επεξεργασία με γαλεκτίνης-9 siRNA (Α ) ή διάφορες συγκεντρώσεις της γαλεκτίνης-9 (Β). Ένας δείκτης μετανάστευσης (ΜΙ) χρησιμοποιήθηκε για να εξηγήσει την υψηλή ποσότητα τυχαίας μετανάστευσης που συνέβη στην πρωτογενή κύτταρα ΝΚ. IL-12 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την κίνηση χημειοταξία πρωτογενή κύτταρα ΝΚ. * P & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο. Και # P & lt? 0,05 έναντι NC. (C), χημειόταξη ανεστάλη από Rho και αναστολείς ROCK πρωτογενή κύτταρα ΝΚ. Πρωτογενή κύτταρα ΝΚ διεγέρθηκαν χρησιμοποιώντας μέσο μόνο για 4 ώρες ή μέσο που περιέχει Y27632 (20 μΜ) ή C3-τρανσφεράσης (2 μg /mL) για 1,5 ώρες. * P & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο. (D), η έκφραση του RhoA, RhoB, RhoC, RhoF, RhoG, RhOH, RhoQ και RhoT1 mRNA χρησιμοποιώντας RT-PCR σε πρωτογενή κύτταρα ΝΚ που επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία rhGalectin-9 σε μια συγκέντρωση 100 ng /mL για 4 ώρες? * P & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο. (Ε), η έκφραση της πρωτεΐνης ROCK1 σε πρωτογενή κύτταρα ΝΚ που επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία rhGalectin-9 σε μια συγκέντρωση 100 ng /mL για 24 ώρες. Τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται από τουλάχιστον 3 πειράματα.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι γκαλεκτίνη-9 έκφραση είναι χαμηλότερη σε ιστούς όγκων του παχέος εντέρου σε σχέση με το αντίστοιχο φυσιολογικούς ιστούς και οι γκαλεκτίνη-9 επίπεδα που σχετίζονται με ΝΚ κυττάρων διείσδυση και την επιβίωση των ασθενών. Οι in vitro μελέτες έδειξαν ότι γαλεκτίνης-9 αυξήθηκε στρατολόγηση κυττάρων ΝΚ ασκώντας επιδράσεις στην Rho /έκφραση ROCK1 και F-ακτίνης πόλωση. Ως εκ τούτου, έχουμε εντοπίσει ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο γκαλεκτίνη-9 επιρροές πρόσληψη των ΝΚ κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου του παχέος εντέρου, και αυτό αυξάνει την τρέχουσα γνώση μας για τη μοριακή συμμετοχή των γκαλεκτίνη-9 στην ανοσία όγκου.

γκαλεκτίνη-9 έχει παρατηρήθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διάφορους τύπους όγκων, όπως το μελάνωμα [16], του τραχήλου της μήτρας καρκίνο πλακωδών κυττάρων [23], του καρκίνου του μαστού [24] και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [25], και αυτό πιθανώς χρησιμεύει ως κλινικώς σημαντική βιοδείκτη για την πρόβλεψη των αποτελεσμάτων σε αυτούς τους ασθενείς. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τις λεπτομέρειες που αφορούν την έκφραση του γαλεκτίνης-9 σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αν και η πλειονότητα των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου εκφράζουν γαλεκτίνη-9, τόσο ο θετικός ρυθμός και το επίπεδο της έκφρασης είναι χαμηλότερα σε αυτούς τους ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς κόλου. Σε όγκους, υψηλότερη έκφραση γαλεκτίνης-9 συνδέεται με το πρώιμο στάδιο TNM, καμία μετάσταση στους λεμφαδένες λέμφου, καλή ιστολογική διαφοροποίηση και μεγαλύτερη συνολική χρόνους επιβίωσης. Σημαντικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αυτή η πρωτεΐνη θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη βιοδείκτης για την επιβίωση σε ασθενείς με όγκους του παχέος εντέρου.

Τα αποτελέσματα της γαλεκτίνης-9 σε όγκους είναι σύνθετα τα οποία εμπλέκονται σε διάφορες παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένης της προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων [15] , απόπτωση και κυτταρικό κύκλο [16], η μετανάστευση [26], και την αγγειογένεση [27]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι γαλεκτίνης-9 που ασκείται ανοσορυθμιστικού ρόλους σε μικροπεριβάλλον του όγκου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι γαλεκτίνης-9 επαγόμενη μακροφάγα να διαφοροποιηθούν σε πλασματοκυτταροειδή δενδριτικών κυττάρων που μοιάζουν με μακροφάγα [14, 28], η οποία αυξήθηκε Tim-3

+ δενδριτικά κύτταρα και CD8

+ Τ κύτταρα [29].