Αφηρημένο

Ιστορικό

Δύο μόρια σηματοδότησης που είναι ελκυστικά για στοχευμένη θεραπεία είναι η επιδερμική υποδοχέα αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ο ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γάμμα (ΡΡΑΡγ). Ερευνήσαμε το δυνατόν στιχομυθία μεταξύ αυτών των 2 μονοπάτια, ιδιαίτερα υπό το φως της πρόσφατης αποδεικτικά στοιχεία που εμπλέκουν PPARγ για αντικαρκινική θεραπεία.

Κύρια Ευρήματα

Όπως αξιολογήθηκε από προσδιορισμούς ΜΤΤ, gefitinib (αναστολέας του EGFR) και DIM- C (ΡΡΑΚγ αγωνιστής) ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυτταρικών γραμμών 9 κύστη με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά με μεταβλητή ευαισθησία. Επιπλέον, ο συνδυασμός του gefitinib και DIM-C επέδειξε μέγιστη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με κάθε φάρμακο μόνο. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν

in vivo

, όπου η θεραπεία συνδυασμού μέγιστο ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε αντίθεση με κάθε μόνος θεραπεία σε σύγκριση με τον έλεγχο (ρ & lt? 0,04). Η επαγωγή της έκφρασης ΡΡΑΚγ μαζί με πυρηνική συσσώρευση παρατηρήθηκε σε απόκριση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα CCAT /ενισχυτή-δέσμευσης πρωτεΐνης-β (CEBP-β). Σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, DIM-C σημαντικά ευαισθητοποιημένα καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές που ήταν ανθεκτικά στην αναστολή του EGFR σε ένα πρόγραμμα ειδικό τρόπο.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ΡΡΑΚγ αγωνιστή DIM-C μπορεί είναι μια εξαιρετική εναλλακτική λύση για την κύστη όγκων ανθεκτικών στην αναστολή του EGFR και την αποτελεσματικότητα συνδυασμός θα μπορούσε να επιτευχθεί σε ένα πρόγραμμα-ειδικό τρόπο

Παράθεση:. Mansure JJ, Nassim R, Chevalier S, Szymanski Κ, Rocha J, Aldousari S, et al. (2013) ένα νέο μηχανισμό των PPAR γάμμα επαγωγής μέσω του EGFR σηματοδότηση Αποτελεί Ορθολογική για Θεραπεία Συνδυασμού σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 8 (2): e55997. doi: 10.1371 /journal.pone.0055997

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Σεπτεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 3 Ιαν. 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Mansure et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Cancer Research Society. (https://www.src-crs.ca/en-CA) W. Kassouf είναι αποδέκτης μιας κλινικής βραβείο έρευνα λόγιος από την FRSQ. (https://www.frsq.gouv.qc.ca/en/index.shtml). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σχεδόν όλοι οι ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης υποκύψει στην ασθένεια, με μέση επιβίωση 18 μηνών, ακόμη και με τις βέλτιστες διαθέσιμες χημειοθεραπευτικών σχημάτων. Όπως κατανόηση της βιολογίας του καρκίνου του ουροφόρων (UC) βελτιώνει, νέες προσεγγίσεις πρέπει να μελετηθούν. Δύο μόρια σηματοδότησης που είναι ελκυστικά για στοχευμένη θεραπεία είναι ο υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και οι υπεροξυσωμάτων υποδοχέα γ που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (ΡΡΑΡγ). Η αναστολή της λειτουργίας EGFR είναι εξαιρετικά ελκυστική μεταξύ το ευρύ φάσμα των βιολογικών στόχων που εμπλέκονται στην καρκίνωμα ουροθηλίου (UC) εξέλιξης. Αν και μηχανισμός με τον οποίο EGFR ρυθμίζει βιολογία του όγκου στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης δεν είναι σαφώς καθορισμένη, έχει αποδειχθεί ότι η σηματοδότηση EGFR ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, και εισβολή [1]. Επιπλέον, EGFR εμπλέκεται στην προκαλούμενη από όγκο αγγειογένεση και μετάσταση [2]. Ωστόσο, κλινικές μελέτες με αναστολείς του EGFR στο κεφάλι και το λαιμό, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και του καρκίνου έδειξαν ότι μόνο μια μειοψηφία των ασθενών φάνηκε να ωφεληθούν από αυτή την προσέγγιση. Στο πλαίσιο των Κυττάρων μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), δείχθηκε ότι οι κλινικές ανταποκρίσεις που συνδέονται με την ενεργοποίηση μεταλλάξεων εντός του τομέα του EGFR κινάσης τυροσίνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η καλύτερη κατανόηση των βιολογικών επιδράσεων των αναστολέων EGFR επί του καρκίνου, θα βοηθήσει στον εντοπισμό των όγκων που θα ανταποκρίνονται στη θεραπεία [3], [4]. Παρά το γεγονός ότι κανένας από 17 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές UC ούτε οποιαδήποτε από τις 75 πρωτογενών όγκων αξιολογήθηκαν σε M. D. Anderson Cancer Κέντρο περιέχονται ενεργοποιώντας τις μεταλλάξεις της περιοχής της κινάσης του EGFR [5], αναστολείς EGFR μπλοκάρει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε 6/17 κυτταρικές σειρές UC. Έχουμε δείξει ότι η έκφραση υψηλού EGFR σχετίζεται με μια επιθετική φαινότυπο [6] και ότι η διαφοροποίηση της GSK-3β μπορεί να είναι ένας προγνωστικός δείκτης της απόκρισης σε αναστολείς EGFR στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [7]. Πιστεύουμε ότι EGFR παραμένει ένα ισχυρό άξονα σηματοδότησης στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, όπου η αναστολή μπορεί να τύχει επιλεγμένους ασθενείς.

Ένας άλλος υποδοχέας ενδιαφέροντος PPARγ, ένας υποδοχέας συνδέτη ενεργοποιηθεί και ένα μέλος της υπερ-οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων της παράγοντες μεταγραφής [8], [9]. Σημαντικά, ΡΡΑΚγ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση. ΡΡΑΚγ εκφράζεται εξαιρετικά σε δείγματα όγκων από διαφορετικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (ανασκόπηση στην παραπομπή [10]). ΡΡΑΚγ είναι ένα ενδιαφέρον στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, όχι μόνο λόγω της αυξημένης έκφρασής της σε όγκους, αλλά επίσης επειδή PPARγ αποτελέσματα ενεργοποίησης σε μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μειωμένη G

0 /G

1 έως S εξέλιξη φάση, αυξημένη τελική διαφοροποίηση, και την απόπτωση [11], [12], [13]. Περαιτέρω, ΡΡΑΚγ αγωνιστές είναι ισχυροί αναστολείς της αγγειογένεσης

in vitro

και

in vivo

, εν μέρει λόγω της προς τα κάτω ρύθμιση του VEGF [14], [15]. Πρόσφατα, μια νέα τάξη αγωνιστών ΡΡΑΚγ, 1,1-δις (3′-ινδολυλ) -1 – (

σ

-υποκατεστημένο φαινυλ) μεθάνια (ΡΡΑΚγ-δραστικό DIM-Cs), έχει αναπτυχθεί και έχει αποδειχθεί ότι να είναι σημαντικά πιο ισχυρές από την προηγούμενη γενιά φαρμάκων. Εμείς δημοσίευσε την πρώτη έκθεση σχετικά με τις σημαντικές αντιογκογένεσης δραστηριότητα του PPARγ-ενεργών DIM-Cs σε κύτταρα UC

in vitro

και

in vivo

[16]. Χρήση ισχυρών PPARγ-ενεργό DIM-Cs ήταν ελκυστική και εγγυάται περαιτέρω αξιολόγηση στην αγωγή της UC.

Μια προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι PPARγ αγωνιστές αυξάνουν αντικαρκινική δράση gefitinib του, πιθανόν μέσω επαγωγής της ΡΤΕΝ έκφρασης

στο vitro

[17]. Επιπλέον, η κουρκουμίνη δείχθηκε ότι επάγει την έκφραση ΡΡΑΚγ και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό σε ηπατικά αστεροειδή κύτταρα [18]. Άλλοι έχουν δείξει ότι η κουρκουμίνη μπορεί επίσης να αναστείλει την ενεργοποίηση του EGFR και τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν περαιτέρω το δυναμικό στιχομυθία μεταξύ των δύο σηματοδότησης άξονες ενδιαφέροντος.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί στιχομυθία μεταξύ των δύο αυτών αξόνων σηματοδότησης καθώς μοιράζονται μερικά κοινή κατάντη δράστες σηματοδότησης και να αξιολογεί κατά πόσον ο συνδυασμός των PPARγ αγωνιστή και ένας αναστολέας του EGFR μπορεί να ξεπεράσει την αντίσταση στη θεραπεία EGFR στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το UC κυτταρική γραμμή 253J BV παρήχθη από την κυτταρική γραμμή 253J ανθρώπινη UC όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19] και παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr Colin PN Dinney από M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas. Η σειρά UM-UC κυτταρικών σειρών καρκινώματος ουροφόρων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είχαν γονότυπο και παρέχονται από το δείγμα πυρήνα του ουροποιογεννητικού εξειδικευμένα προγράμματα της ερευνητικής αριστείας στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης σε MD Anderson Κέντρο Καρκίνου [20].

Ναρκωτικά

Gefitinib (Iressa Ζϋ1839) παρεσχέθη από την AstraZeneca, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο) και από του στόματος διαθέσιμη PPARγ-ενεργό DIM-C γενναιόδωρα από τον Dr. S. Safe, Houston, TX ως ξηρή σκόνη.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

καρκίνος της ουροδόχου κύστης κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του gefitinib (0,001 μΜ έως 100 μΜ) και DIM-C (0,01 μΜ έως 10 μΜ) σε ΕΜΕΜ συμπληρωμένου με 10% FBS για 48 hs πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς ΜΤΤ (Sigma-Aldrich, Canada). Η τιμή GI50 ορίστηκε ως η μέση συγκέντρωση του φαρμάκου που παράγεται το 50% της αναστολής της ανάπτυξης.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε -75% έως 80% συρροή σε ρυθμιστικό λύσης (RIPA ) και ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης και φωσφατάσης (Roche Diagnostics, Germany). Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA) με semidry ηλεκτροστύπωσης. Πρωτογενή μονοκλωνικά αντισώματα [EGF υποδοχέα (15F8), τουμπουλίνη και β-ακτίνης (Cell Signaling Technology, New England, ΜΑ)] και ΡΡΑΚγ (sc-7273, Santa Cruz Biotechnology, California, ΗΠΑ) εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση ζωνών ενδιαφέροντος. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα κουνελιού από κυτταρική σηματοδότηση: Akt? φωσφο-Akt (Ser473)? GSK-3β? φωσφο-GSK-3β (Ser9)? p21 WAF1 /Cip1? p44-42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2)? φωσφόρου-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2). Αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού ανοσοσφαιρίνες (IgGs) συζευγμένο με HRP /χρένο χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα σύμφωνα με το πρωτογενές αντίσωμα.

ανοσοφθορισμού

κύτταρα καλλιεργημένα σε οκτώ φρεατίων πλαστικά θάλαμοι πλύθηκαν επί πάγου με ψυχρό PBS που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης (Roche Diagnostics, Germany) και σταθεροποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις του gefitinib (0, 2, 4 και 8 μΜ) για 24 hs και μετά επωάστηκαν με μονοκλωνικά ποντικού PPARγ πρωτογενές αντίσωμα (1:50) για όλη τη νύχτα. Ανοσοφθορισμός αποκαλύφθηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-ποντικού συζευγμένο με FITC (Alexa Fluor 488) ή ροδαμίνη (CY3? Invitrogen). 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. Μικροφωτογραφίες ελήφθησαν με ένα ανεστραμμένο της Olympus ΙΧ-81 μικροσκόπιο εφοδιασμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή CoolSnap HQ και το ImagePro + λογισμικό (έκδοση 5.0.1? Media Κυβερνητικής).

Απομόνωση RNA και Real Time PCR

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Η σύνθεση του cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας την Quantitec Reverse Transcription Kit (Qiagen, Mississauga, ΟΝ). Για την ενίσχυση RT-PCR, χρησιμοποιήθηκαν εναρκτήρες επικυρωθεί από την Qiagen (Hs_CEBPB_2_SG QuantiTect Primer Δοκιμασία QT00998494). Αριθ γενωμικού DNA μόλυνση ή ψευδογονίδια ανιχνεύθηκαν με PCR χωρίς το στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής στο συνολικό RNA που χρησιμοποιείται. β ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι αντιδράσεις ξεκίνησαν στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 10 s, 60 ° C για 20 s. Τήξη κορυφές των PCR προϊόντων προσδιορίστηκαν με θερμική μετουσίωση σε μία C βαθμίδα θερμοκρασίας 35 ° σε 0.2 ° C /s από 60 στους 95 ° C. Οι αριθμοί του κύκλου που διασχίζουν ένα αυθαίρετο όριο (

C

t) προσδιορίσθηκαν με τη χρήση MyIQ λογισμικού συστήματος, την έκδοση 1.0.410 (BioRad, CA, USA). Διπλώστε αλλαγή στο mRNA στόχου σε σχέση με το β ακτίνη υπολογίστηκε ως εξής: Διπλώστε αλλαγής = 2

-ΔΔ

C

t όπου ΔΔ

C

t = (

C

t

στόχος –

C

t β ακτίνη)

χρόνο

X

– (

C

t

στόχος –

C

t β ακτίνη)

χρόνο 0 χρόνος

X

είναι χρονικό σημείο μετά από 3 hs gefitinib. Χρόνος 0 αντιπροσωπεύει τον χρόνο του πειράματος εκκίνηση (προστέθηκε καθόλου φάρμακο).

Ξενομοσχεύματα ουροδόχου Tumor

Θηλυκά γυμνά ποντίκια (αγοράστηκε από την Charles Rivers, Wilmington, ΜΑ) ενέθηκαν υποδορίως με τα κύτταρα KU-7 (10

6 κύτταρα ανά ένεση). Τα ζώα της κάθε σειράς (10 ποντίκια ανά ομάδα) τυχαιοποιήθηκαν και να ανατίθενται σε θεραπεία και σε όπλα εικονικό φάρμακο. DIM-C χορηγήθηκε 60 mg /kg 3 φορές την εβδομάδα και gefitinib δόθηκε 2 mg /ημέρα, 5 φορές την εβδομάδα. Όλα τα φάρμακα και εικονικού φαρμάκου χορηγήθηκαν από του στόματος καθετηριασμό. Η θεραπεία συνεχίστηκε για 4 εβδομάδες και στη συνέχεια οι όγκοι συλλέχθηκαν και σταθμίζονται. Οι όγκοι καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για περαιτέρω ανάλυση.

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις τυποποιημένες διαδικασίες λειτουργίας για την Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου της Επιτροπής Φροντίδας Ζώων του Πανεπιστημίου McGill. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το Μηχανισμό Επιτροπή Φροντίδας Ζώων του Ερευνητικού Πανεπιστήμιο McGill Κέντρο Υγείας (Αριθμός Άδειας: 5428). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Η ανοσοϊστοχημεία

Serial τμήματα των ξενομοσχευμάτων όγκου από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με εικονικό φάρμακο και θεραπεία συνδυασμού (gefitinib συν DIM-C ) επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C, με πρωτογενή ειδικά αντισώματα έναντι PPARγ (sc-7273 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού IgG

1 αντίσωμα 1:1000 αραίωση, Santa Cruz, CA, USA), ρ21 (12D1 αντίσωμα κουνελιού 1:100 αραίωσης, Cell Signaling, ΜΑ, USA). αντι-κουνελιού IgG δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας πολυκλωνικό, συζευγμένο με HRP προστέθηκε και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ανάπτυξη χρώματος πραγματοποιήθηκε με υπόστρωμα DAB (Sigma Aldrich, Καναδάς), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανοσοχρώση εκτιμήθηκε σε μια ημιποσοτική μέθοδος βασίζεται στο μέσο όρο των πέντε εστίες σχετικά με το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων να παρουσιάζουν θετική έκφραση. Τα δείγματα βαθμολογήθηκαν με βάση την ένταση του αντισώματος πυρηνικής και κυτταροπλασματικής χρώσης σε κάθε διαφάνεια. Οι τιμές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένης εξέτασης t του Student.

Microarray Analysis

όγκους της ουροδόχου κύστης ξενομοσχεύματα, είχαν τομεακό χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και οι όγκοι χαρτογραφήθηκαν για περαιτέρω απομόνωση. Ολικό RNA εκχυλίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. RNA μετρήθηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop-ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) και την ποιότητα παρακολουθήθηκε με την Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Genome Κεμπέκ Κέντρο Καινοτομίας, CA). αναλύσεις των μικροσυστοιχιών διεξήχθησαν στο Πανεπιστήμιο McGill και Γονιδιώματος Κεμπέκ Κέντρο Καινοτομίας, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Illumina BeadArray ™. Η HumanHT-12 Έκφραση BeadChip ™ χρησιμοποιήθηκε και περιείχε περισσότερα από 22.000 ανιχνευτές από τη βάση δεδομένων NCBI REFSEQ, η οποία παρέχει υψηλότερες επεξεργασίας απόδοση των 12 δειγμάτων ανά chip. Υπάρχει μια κάλυψη & gt? 99,99% όλων των τύπων χάντρα σε οποιαδήποτε δεδομένη HumanHT-12. TotalPrep RNA Amplification κιτ από Ambion χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει ένα γύρο ενίσχυσης από 50-500 ng ολικού RNA. Η σύνθεση cDNA και

in vitro

ενίσχυση μεταγραφής που ακολουθείται από υβριδισμό. Οι BeadChips απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας BeadArray ή iScan αναγνώστη Illumina του. Στατιστική ανάλυση και απεικόνιση των δεδομένων από πειράματα μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό πακέτο FlexArray έκδοση 1.6 αναπτύσσονται και παρέχονται από Genome Κεμπέκ. Λειτουργικές και σηματοδότησης αναλύσεις οδού αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση λογισμικού (IPA).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση STATA 10,0 λογισμικού. Τα αποτελέσματα από

in vivo

συγκρίθηκαν με τη χρήση ANOVA επαναλαμβανόμενης μέτρησης και ακριβή δοκιμασία Fischer. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Βασική έκφραση του PPARγ και EGFR σε ένα πάνελ ουροθηλιακά καρκίνωμα κυτταρικών γραμμών

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η αναστολή της. EGFR άξονας σηματοδότηση και η ενεργοποίηση του άξονα ΡΡΑΚγ είναι αμφότερα αποτελεσματικά στην αναστολή σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ανθρώπινου καρκινώματος μέσω διαφορετικών οδών, εν μέρει συγκλίνοντα προς ΡΙ3Κ /Akt, κυκλίνη D1, και αναστολείς κινάσης εξαρτώμενης από κυκλίνη [7], [16]. Σε προηγούμενη εργασία μας, έχουμε δείξει σημαντική έκφραση των μελών της οικογένειάς του σε διάφορες UC κυτταρικές σειρές [7]. Για να διερευνηθεί περαιτέρω για την αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αξόνων σηματοδότησης, πρέπει πρώτα σε διαλογή για τον χαρακτηρισμό των επιπέδων του EGFR και της έκφρασης ΡΡΑΚγ σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών 9 UC. Όπως αποκαλύπτεται στο Σχήμα 1 Α, όλες οι κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν εξέφρασαν διάφορα επίπεδα EGFR και ΡΡΑΚγ. Εμείς δεν έδειξε συσχέτιση μεταξύ βασικής γραμμής επίπεδα έκφρασης και το στάδιο της νόσου από τις οποίες οι κυτταρικές γραμμές 9 προήλθαν από (από επιφανειακή σε επεμβατικές σε μεταστατική). Έχουμε καθορίζεται επίσης την απόκριση δόσης μεταξύ των καρκινικών κυττάρων ουροφόρων γραμμές (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, UM-UC13, RT4, 253JP, 253J-BV, KU7) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του EGFR αναστολέα (gefitinib) και PPARγ αγωνιστή (DIM-C) μετά από 72 hs της θεραπείας (Σχήμα 1 Β). Ήμασταν σε θέση να διαστρωμάτωση διάφορες κυτταρικές σειρές UC που κυμαίνονται από πολύ ευαίσθητο σε σχετικά ανθεκτικές σε αναστολή του EGFR, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές για να δικαιολογήσουν τη διαστρωμάτωση σε απάντηση DIM-C. Αξίζει να σημειωθεί ότι UC5, η πιο ευαίσθητη κυτταρική γραμμή να gefitinib, είναι διαφορετικό από το υπόλοιπο των κυτταρικών σειρών, καθώς περιέχει ενίσχυση γονιδίου EGFR.

(Α) Εκφραση του ΡΡΑΚγ και EGFR σε σχέση με ενδογενή επίπεδα β- ακτίνης και της τουμπουλίνης, αντίστοιχα, και εκπροσωπείται σε μονάδες μεταξύ κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης 9 αντικατοπτρίζουν διαφορετικά στάδια της νόσου (από επιφανειακές έως Επεμβατική & amp? καμία μετάσταση, Επεμβατική και του λεμφικού μετάσταση). (Β) Δόση-απόκριση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικών σειρών προς ΡΡΑΚγ αγωνιστή (DIM-C) και αναστολέα EGFR (gefitinib). Η τιμή GI50 ορίστηκε ως η μέση συγκέντρωση του φαρμάκου που παράγει 50% της αναστολής της ανάπτυξης σε σύγκριση με τους ελέγχους.

Η

επιδράσεις των αναστολέων EGFR και συνδυασμένης PPARγ αγωνιστές Therapy

ερευνήσαμε την αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της συνδυασμένης θεραπείας, gefitinib και DIM-C, σε σύγκριση με κάθε μόνη της στην ανάπτυξη της ουροδόχου κύστης καρκινικών κυττάρων ναρκωτικών

in vitro

. Την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρακολουθήθηκαν με προσδιορισμούς ΜΤΤ και διεξάγεται σε δύο σχετικά EGFR-ανθεκτικές κυτταρικές σειρές (KU7 και UM-UC13). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 72 hs και χρησιμοποίησε ένα σταθερό αναλογία των διαφορετικών κλασμάτων του GI50 (0.25, 0.5, 1.0 και 2.0) για κάθε φάρμακο μόνο σύμφωνα με τη μέθοδο του μέσου αποτελέσματος. Η μέγιστη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων αποδείχθηκε στη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με κάθε φάρμακο μόνο του (Σχήμα 2). DIM-C κατέστησε τα ανθεκτικά κύτταρα ευαίσθητα στην αναστολή του EGFR.

Η ανάπτυξη παρακολουθήθηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ gefitinib και DIM-C 3 μΜ και σε σύγκριση με κάθε φάρμακο μόνο. Κόκκινο: gefitinib? Κίτρινο: DIM-C? Μπλε: gefitinib + DIM-C

Η

Επίδραση του συνδυασμού στην κατάντη Σηματοδοσίας EGFR και PTEN Έκφραση

Η σύνδεση του EGFR με τη ρίζα της οδηγεί στην ενεργοποίηση των διαφόρων σημάτων, συμπεριλαμβανομένων των Ras. /Raf /ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) [21]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την επίδραση του συνδυασμού στην κατάσταση φωσφορυλίωσης του ρ42 /44 ΜΑΡΚ (Erk1 /2). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, μία σημαντική απενεργοποίηση χρονικής πορείας του μονοπατιού Erk παρατηρήθηκε, σε σύγκριση με τον έλεγχο, μεταξύ των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με gefitinib 5 μΜ και DIM-C 3 μΜ. Επιπλέον, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η έκφραση της ΡΤΕΝ αυξήσεις των μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) που έλαβαν θεραπεία με τους αγωνιστές ΡΡΑΚγ, ροσιγλιταζόνη [17]. Συνεπώς, διερευνήσαμε επίσης την επίδραση της θεραπείας συνδυασμού σε έκφραση ΡΤΕΝ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, καμία διαφορά στην έκφραση ΡΤΕΝ παρατηρήθηκε, σε σύγκριση με τον έλεγχο, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συνδυάστηκαν gefitinib και DIM-C για 24 hs.

(Α) πρότυπο Φωσφορυλίωση του ρ42 /44 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με gefitinib 5 μΜ και DIM-C 3 μΜ για 5, 15 και 30 λεπτά. Τ0 είναι το μη επεξεργασμένο έλεγχο. λύματα ολόκληρων κυττάρων ανοσοστυπώθηκαν με phosho-P42 /44 ΜΑΡΚ και ρ42 /44 ΜΑΡ. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης στην κηλίδωση Western. (Β) Σύγκριση της έκφρασης ΡΤΕΝ σε κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με gefitinib 5 μΜ και DIM-C 3 μΜ για 24 hs. Τ0 είναι το μη επεξεργασμένο έλεγχο.

Η

επιδράσεις της θεραπείας σε ουροδόχου κύστης ανάπτυξη του όγκου in vivo

Για να αξιολογηθεί κατά πόσο τα ευρήματα αυτά μπορούν να μεταφραστούν

in vivo

, άτριχων ποντικών ήταν εμβολιάσθηκαν υποδορίως με σχετικά ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα κύστης (KU-7 κύτταρα). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με παράγοντες στόχους μέσω στοματικής σίτισης (ΡΡΑΚγ-δραστικό DIM-Cs δοθεί 60 mg /kg 3 φορές την εβδομάδα, gefitinib δόθηκαν 2 mg /ημέρα, 5 φορές την εβδομάδα, ή και τα δύο) για 4 εβδομάδες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα βάρη των όγκων ήταν σημαντικά μειωμένη σε συνδυασμένες ομάδα σε αντίθεση με κάθε φάρμακο μόνο σε σύγκριση με τον έλεγχο (

ρ

& lt? 0,02). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν συνδυασμένη θεραπεία έχει μια καλύτερη αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, η έκφραση γονιδίου προφίλ ανάλυση των ξενομοσχευμάτων όγκου κύστης, έδειξε ότι πολλά γονίδια που εμπλέκονται σε κυτταρικό κύκλο, κυτταρικό θάνατο, κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό ήταν διαφορετικά εκφράζονται στην ομάδα συνδυασμένης θεραπείας σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (Τραπέζι 1). Αξιοσημείωτα, αναστολέας εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάσης (CDKN1A ή ρ21), το οποίο λειτουργεί ως ρυθμιστής της προόδου του κυτταρικού κύκλου στο G1, ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (φορές μεταβολής 2,6,

σ

αξία & lt? 0,02) και αυτό επικυρώθηκε από ανοσοϊστοχημεία δείχνει υψηλότερο ποσοστό θετικών κυττάρων p21 στη συνδυασμένη βραχίονα

in vivo

(66% vs 15%, ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 5Α), καθώς και

in vitro

(Σχήμα 5Β) . Είναι ενδιαφέρον, έχει αναφερθεί ότι ΡΡΑΚγ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο μεσολαβώντας τη διαφοροποίηση εξαρτώμενη καταρράκτη έκφραση κινάσης αναστολέων εξαρτώμενων από κυκλίνη, παρέχοντας έτσι μία διακοπή της ανάπτυξης σύζευξης μοριακός μηχανισμός και λιποκυττάρων διαφοροποίηση [22].

ανάπτυξη της ουροδόχου κύστης του όγκου του βραχίονα θεραπείας συνδυασμού σε σύγκριση με το σκέλος ελέγχου (P & lt? 0,02). Δέκα ποντίκια ανά ομάδα υποβλήθηκαν σε αγωγή με εικονικό φάρμακο? DIM-C δόθηκε 60 mg /kg 3 φορές την εβδομάδα? Gefitinib δόθηκε 2 mg /ημέρα, 5 φορές την εβδομάδα. Όλα τα φάρμακα χορηγήθηκαν από του στόματος καθετηριασμό. Η θεραπεία συνεχίστηκε για 4 εβδομάδες.

Η χρώση

(Α) ανοσοϊστοχημεία (IHC) για ρ21 σε ιστούς ξενομοσχεύματος όγκου. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με εικονικό φάρμακο ή θεραπεία συνδυασμού (Gefitinib 2 mg /ημέρα, 5 φορές την εβδομάδα και DIM-C 60 mg /Kg, 3 φορές την εβδομάδα). Γραφικές στη δεξιά πλευρά αντιπροσωπεύει την ποσοτικοποίηση των θετικών κυττάρων χρώση. (Β) Ιη vitro έκφραση του p21 σε κηλίδα Western κυττάρων κυτταρολύματος σε επεξεργασία με 5 μΜ gefitinib και DIM-C 3 μΜ για 24 hs. Γραφικό στη δεξιά πλευρά, αντιπροσωπεύει την ποσοτικοποίηση της έκφρασης p21 που σχετίζονται με την GAPDH.

Η

EGFR Αναστολή Διεγείρει Gene Expression του PPARγ σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο

Είμαστε αξιολόγησε την επίδραση του gefitinib στα μέλη των αξόνων σηματοδότησης PPARγ. Δύο ανθεκτικών κυττάρων (KU-7 και UM-UC13) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις αναστολέα EGFR για 24 hs. έκφραση ΡΡΑΚγ προσδιορίσθηκε με κηλίδωση Western αναλύσεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, μια δραματική επαγωγή της έκφρασης ΡΡΑΚγ παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, και ακολούθησε η αναστολή EGFR. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια πυρηνική συσσώρευση του PPARγ παρατηρήθηκε επίσης μετά προς τα πάνω ρύθμιση, η οποία είναι στην πραγματικότητα η δραστική μορφή του υποδοχέα. (Σχήμα 6Β). Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν

in vivo

, όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, που δείχνει έκφραση ΡΡΑΚγ είναι υψηλότερη μεταξύ των όγκων ξενομοσχεύματος σε επεξεργασία με gefitinib σε σύγκριση με την ομάδα του εικονικού φαρμάκου. Αξίζει να σημειωθεί ότι μια πυρηνική χρώση παρατηρήθηκε επίσης, γεγονός που υποδηλώνει μια πυρηνική μετατόπιση του PPARγ μετά την επαγωγή της έκφρασης του.

(Α) φορές αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο προσδιορίσθηκε μετά από κανονικοποίηση με β-ακτίνη ως έλεγχο των εξωτερικών φόρτωσης. (Β) Η αναβάθμιση και πυρηνική συσσώρευση των PPARγ μετά από θεραπεία με gefitinib (24 hs).

Η

Graphic στο χαμηλότερο επίπεδο αντιπροσωπεύει ποσοτικοποίηση των θετικών κυττάρων χρώση. Μαύρα βέλη δείχνουν την πυρηνική χρώση.

Η

Πρόγραμμα-ειδική αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού

Αν τα κύτταρα ευαισθητοποιούνται στην αναστολή του EGFR μέσω επαγωγής της έκφρασης του PPARγ, τότε θα περίμενε κανείς ότι η αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού μπορεί επίσης να επηρεαστεί σημαντικά και βελτιώθηκε κατά σειρά χορήγησης του gefitinib και ΔΗΜ-C. Στην πραγματικότητα, παρατηρήσαμε σημαντική επίδραση επί του πολλαπλασιασμού μεταξύ των τριών σχετικά ανθεκτικό και ένας ευαίσθητος κυτταρικές γραμμές να gefitinib (KU-7, UM-UC3? UM-UM13) όταν τα κύτταρα προ-αγωγή με gefitinib για 24 hs για να επιτρέψει για την επαγωγή του ΡΡΑΚγ έκφραση σε σύγκριση με όταν τα κύτταρα ήταν ταυτόχρονη έκθεση στο gefitinib και DIM-C (Σχήμα 8). Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ΡΡΑΚγ αγωνιστής θα μπορούσε να ευαισθητοποιούν σημαντικά κυτταρικές σειρές UC, ιδιαίτερα εκείνοι που ήταν ανθεκτικά στην αναστολή EGFR σε χρονοδιάγραμμα-ειδικό τρόπο και παρέχουν μια εξαιρετική δυνατότητα για θεραπεία συνδυασμού.

Τρία σχετικά ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές να gefitinib (UM-UC3, UM-UC13 και KU-7) και ένα ευαίσθητο (UM-UC6). Ανάπτυξη (ΜΤΤ) μετά από θεραπεία 48 hs. Gefitinib: 2 μΜ. DIM-C:. 2 μΜ

Η

Έκφραση C /ΕΒΡβ Μετά Gefitinib Induced-PPARγ Έκφραση

Σημαντικές ενδείξεις δείχνουν ότι CCAAT /ενισχυτή-δεσμευτική πρωτεΐνη β (C /ΕΒΡβ) ενεργεί ως ένας μεταγραφικός ενεργοποιητής για τα γονίδια ΡΡΑΚγ [23], [24]. Αυτή η πεποίθηση υποστηρίζεται από το γεγονός ότι το εγγύς υποκινητών της διατηρούν ρυθμιστικά στοιχεία Ο /ΕΒΡ που είναι απαραίτητα για τρανσενεργοποίηση του ΡΡΑΚγ διαγονιδίων προαγωγού-ανταποκριτή. Εδώ αναφέρουμε πειστικές αποδείξεις ότι διαδοχική επαγωγή έκφρασης ΡΡΑΚγ με αναστολή EGFR διαμεσολαβείται από C /ΕΒΡβ (Σχήμα 9). Όταν τα κύτταρα προ-επεξεργασμένο με gefitinib στις ίδιες συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται για την επαγωγή της έκφρασης του PPARγ, μια αύξηση σε C /ΕΒΡβ ήταν επίσης παρατηρηθεί υποδηλώνοντας gefitinib επαγόμενη-ΡΡΑΚγ έκφραση μπορεί να προκαλείται από C /ΕΒΡβ.

(Α ) RT-PCR των κυττάρων σε επεξεργασία με gefitinib (Β) Western blot της έκφρασης CEBPβ ​​σε κυτταρικές γραμμές UM-UC-13 KU-7 και σε απόκριση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του gefitinib.

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα από ένα μεγάλο σώμα των προκλινικών μελετών και κλινικών δοκιμών δείχνουν ότι η στόχευση του EGFR αντιπροσωπεύει μια σημαντική συμβολή στη θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, το θέμα της συστατικής αντίστασης σε έναν μεγάλο αριθμό ασθενών και την ανάπτυξη της επίκτητης αντοχής στα ανταποκρίθηκαν παραμένει ανεξερεύνητη αντικείμενο της έρευνας. Καρκίνος κύτταρο ανθεκτικότητα σε ανταγωνιστές EGFR μπορεί να οφείλεται σε διάφορους λόγους, όπως γενετικές αλλοιώσεις, οι οποίες τους επιτρέπουν να έχουν μια εγγενή αντοχή σε αντικαρκινικά φάρμακα. Επιπλέον, αρκετές διαφορετικές μοριακές μεταβολές σημαντική σε εξαρτώμενα ή ανεξάρτητη από μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης EGFR θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη αντοχής σε αυτούς τους αναστολείς. Για παράδειγμα, έχουμε δείξει προηγουμένως αποσύνδεση του EGFR με μιτογόνο οδών μπορεί να προκαλέσει αντίσταση σε ανταγωνιστές EGFR [7]. Επί του παρόντος, η συνδυασμένη θεραπεία έχει γίνει μια σημαντική ανακάλυψη στη θεραπεία του καρκίνου. Σε μια σειρά από φορείς του όγκου, η προσέγγιση αυτή έχει εντυπωσιακά αποτελέσματα. Συνδυασμένη θεραπεία αγωνιστών ΡΡΑΚγ και άλλων παραγόντων έχει δειχθεί ότι είναι πιο αποτελεσματική από τη χρήση κάθε παράγοντα ξεχωριστά. [25], [26]. Σε καρκινικά κύτταρα ουροδόχου κύστης

in vitro

και όγκου κύστης

in vivo

, αποδείξαμε ότι ΡΡΑΚγ ενεργός DIM-Cs έδειξαν σημαντική αντι-ογκογόνο δράση και ήταν περισσότερο ισχυροί αναστολείς της ανάπτυξης καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με ροσιγλιταζόνη, η χρησιμοποιείται σήμερα συνθετικό PPARγ αγωνιστή [16]. Στο σύνολό τους, σε συνδυασμό με στόχο τόσο του EGFR και άξονες PPARγ μπορεί να αποκαλύψει πολλά υποσχόμενη μόρια για να στοχεύσει στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα ανθρώπινα urothelial καρκινικές κυτταρικές σειρές εμφανίζουν αξιοσημείωτη ετερογένεια προς την ευαισθησία σε αναστολείς EGFR. Υψηλού ενδιαφέροντος, τα επίπεδα έκφρασης του EGFR και PPARγ διέφερε σημαντικά μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών, αλλά δεν συσχετίζονται με το στάδιο της νόσου (εύρος από επιφανειακές θηλώδες σε επεμβατικές σε μεταστατικούς όγκους). Επιπλέον, αυτή η συσχέτιση δεν ήταν τέλεια, καθώς με την ευαισθησία είτε να αναστολείς του EGFR ή PPARγ αγωνιστή με εξαίρεση του UM-UC5 που δείχνει υψηλά επίπεδα έκφρασης EGFR και εμφανίζουν υψηλή ευαισθησία σε αναστολείς του EGFR. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα από άλλες ομάδες που έχουν αναφέρει, σε ένα πάνελ 17 ανθρώπινων καρκινικών ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές, ότι παρά την ισχυρή συσχέτιση μεταξύ gefitinib-ανταπόκρισης, επιφανειακή έκφραση EGFR και η έκφραση πρωτεΐνης p27kip1 στις πιο δεκτικά γραμμές, gefitinib-αποκρισιμότητα δεν ήταν ως στενά συνδεδεμένη με την επιφανειακή έκφραση του EGFR εντός του πίνακα των κυτταρικών γραμμών ως σύνολο [27]. Τα αποτελέσματα αυτά είναι αξιόλογα, αλλά παραμένει ασαφές εάν η έκφραση βασικής γραμμής θα μπορούσε να προβλέψει εξαρτάται EGFR αύξηση στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Αντιστρόφως, όταν δύο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές (KU-7 και UM-UC13) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σταθερό αναλογία των διαφορετικών κλασμάτων του GI50 κάθε φάρμακο μόνο (gefitinib ή DIM-C), η θεραπεία συνδυασμού δυνητικά εξασκεί προσθετική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων UC. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχονται περαιτέρω πληροφορίες για τις δυνατότητες συνδυασμένης θεραπείας για να ξεπεράσει την αντίσταση σε κάθε φάρμακο μόνο του, ιδιαίτερα με αναστολέα του EGFR. Πράγματι,

in vivo

ευρήματά μας, έδειξαν θετικά τις επιδράσεις των συνδυασμένων αναστολέων EGFR και αγωνιστές ΡΡΑΚγ στην ανάπτυξη των ανθρώπινων ουροθηλιακό όγκων. Στην πραγματικότητα, ξενομοσχεύματα γυμνά ποντίκια με τις σχετικά ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα κύστης (κύτταρα KU-7) έδειξαν σημαντικά μειωμένη βάρος του όγκου σε συνδυασμένες ομάδα, σε αντίθεση με κάθε θεραπεία μόνη της, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ακόμη και σχετικά ανθεκτικά κύτταρα,

in vitro

, έδειξε ευαισθησία

in vivo

στη συνδυασμένη θεραπεία, υποδηλώνοντας ΡΡΑΚγ αγωνιστής θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί για να ευαισθητοποιήσει καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές που ήταν ανθεκτικά σε αναστολή του EGFR.

Πρόσφατα, η κουρκουμίνη δείχθηκε ότι επάγει την έκφραση ΡΡΑΚγ σε ηπατικά αστεροειδή κύτταρα και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δυνητικά

μέσω

αναστέλλοντας την ενεργοποίηση του EGFR [28]. Σε αυτή τη μελέτη, Zhou et al, ανέφεραν ότι η διακοπή του PDGF και EGF μονοπάτια σηματοδότησης με κουρκουμίνη, διεγείρει έκφραση γονιδίου του ΡΡΑΚγ σε ενεργοποιημένα κύτταρα ηπατικά αστεροειδή (HSC), που οδηγεί στην μείωση της ανάπτυξης των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων επαγωγή κυτταρικού σύλληψης και απόπτωσης . Ομοίως, παρατηρήσαμε μια επαγωγή της έκφρασης ΡΡΑΚγ κατά αναστολή του EGFR σε ανθεκτικά κύτταρα KU-7 και UM-UC13. Αυτό ήταν ένα ελκυστικό αποτέλεσμα, αφού παρατηρήθηκε επαγωγή της έκφρασης ΡΡΑΚγ σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, και ακολουθήθηκε από μια πυρηνική συσσώρευση του ΡΡΑΚγ, τα οποία είναι, στην πραγματικότητα, η λειτουργική μορφή του υποδοχέα. νέα παρατήρηση μας αντικατοπτρίζει το γεγονός ότι η αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού μπορεί επίσης να επηρεαστεί σημαντικά και να βελτιωθεί με αλληλουχία διοίκηση του gefitinib και PPARγ αγωνιστή. Στην πραγματικότητα, ΡΡΑΚγ αγωνιστή αισθητά ευαισθητοποιημένα καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές, ιδιαίτερα εκείνοι που ήταν ανθεκτικά στην αναστολή EGFR σε χρονοδιάγραμμα-ειδικό τρόπο, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να είναι μια εξαιρετική εναλλακτική λύση, όταν τα κύτταρα είναι ανθεκτικά στις προαναφερθείσες μονοθεραπείες. Ο μηχανισμός της επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου PPARγ με gefitinib δεν είναι ακόμη σαφής. Κατά τη διάρκεια της λιπογένεσης, σημαντικές ενδείξεις δείχνουν ότι η πράξη CEBP /β ως μεταγραφικός ενεργοποιητής των γονιδίων PPARγ [23]. Αυτή η πεποίθηση υποστηρίζεται από το γεγονός ότι εγγύς υποκινητές του ΡΡΑΚγ κατέχουν Ο /ΕΒΡ ρυθμιστικά στοιχεία απαραίτητα για μετενεργοποίηση της. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι CEBP /β εκφράζεται κατά το πρώιμο στάδιο στη συνέχεια σε θεραπεία με επαγωγείς διαφοροποίησης [29] που ακολουθείται από έκφραση του ΡΡΑΡγ. Πράγματι, τα ευρήματά μας δείχνει την αναστολή του EGFR έκφραση επάγεται CEBP /β και έχει ενδιαφέρον, προς τα πάνω ρύθμιση του παρατηρήθηκε επίσης σε πρώιμο στάδιο μετά την αγωγή gefitinib, μία διαδικασία παρόμοια με την ενεργοποίηση του αδιπογονική γονιδίων κατά τη διαφοροποίηση, και η οποία προηγείται επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου ΡΡΑΚγ. Ωστόσο, οι μελλοντικές μελέτες είναι αναγκαίες για να καθοριστεί η άμεση ρόλος του C /ΕΒΡβ σε επαγωγή έκφρασης ΡΡΑΚγ διαμεσολαβείται από gefitinib. Κατά την ερμηνεία αποτελεσμάτων μας, είναι σημαντικό να αναγνωρίσουμε τους περιορισμούς της προκλινικές μελέτες.