Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκίνο του στομάχου (GC) είναι ένα από τα πιο συχνή κακοήθεια και κύρια αιτία της θανάτου σε ασθενείς με καρκίνο κινέζικα. Υποτροπή είναι ένας σημαντικός παράγοντας που οδηγεί στην αποτυχία της θεραπείας και το χαμηλό επίπεδο ποσοστό επιβίωσης 5 ετών σε ασθενείς GC μετά από χειρουργική εκτομή. Ως εκ τούτου, η αναγνώριση των βιολογικών δεικτών με τους πιθανούς στην πρόβλεψη του κινδύνου υποτροπής είναι το βασικό πρόβλημα της πρόγνωσης σε ασθενείς με GC.

Ασθενείς και Μέθοδοι

επιλέχθηκαν συνολικά 74 ασθενείς GC για συστηματική ανάλυση, που αποτελείται των 31 ασθενών με υποτροπή και 43 ασθενείς χωρίς υποτροπή. Πρώτον, οι μέθοδοι miRNAs μικροσυστοιχιών και βιοπληροφορικής χρησιμοποιήθηκαν για να χαρακτηρίσουν απόκλιση εκφράζεται miRNAs από δείγματα πρωτογενούς όγκου. Μετά, χρησιμοποιήσαμε μια μέθοδο ROC για να επιλέξετε την υπογραφή με την καλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα. Τέλος, θα επικυρωθεί με την υπογραφή σε δείγματα GC (κατεψυγμένα φρέσκα και δείγματα αίματος) χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR.

Αποτελέσματα

Έχουμε εντοπίσει 12 διαφορική miRNAs συμπεριλαμβανομένων 7 5 κάτω-ρυθμίζονται miRNAs up-ρυθμίζονται και σε υποτροπή της ομάδας. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ROC, διαπιστώσαμε περαιτέρω HSA-miR-335 ως μια υπογραφή για να αναγνωρίσουν υποτροπής και μη επανεμφάνιση περιπτώσεων στα δείγματα εκπαίδευσης. Επιπλέον, θα επικυρωθεί αυτή η υπογραφή χρησιμοποιώντας ποσοτική μέθοδο PCR σε 64 δείγματα δοκιμής με συνεπή αποτέλεσμα με σύνολο εκπαίδευσης. Μια υψηλή επανεμφάνιση συχνότητα και κακή επιβίωση παρατηρήθηκαν σε περιπτώσεις GC με το υψηλό επίπεδο της HSA-miR-335 (

P

& lt? 0.001). Επιπλέον, αξιολογήσαμε ότι HSA-miR-335 συμμετείχαν στη ρύθμιση γονιδίων-στόχων σε διάφορες ογκογόνο σήματος οδούς, όπως ρ53, ΜΑΡΚ, ΤΟΡ-β, Wnt, ErbB, mTOR, ΤοΙΙ υποδοχέα και εστιακή προσκόλληση.

Συμπέρασμα

τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η HSA-miR-335 έχει τη δυνατότητα να αναγνωρίζουν τον κίνδυνο υποτροπής και σχετίζονται με την πρόγνωση των ασθενών GC

Παράθεση:. Yan Z, Xiong Υ, Xu W, Gao J, Cheng Υ, Wang Ζ, et al. (2012) Στοιχεία της HSA-miR-335 ως προγνωστικός Υπογραφή σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 7 (7): e40037. doi: 10.1371 /journal.pone.0040037

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 21 Φεβρουαρίου 2012? Αποδεκτές: 30η Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 3 του Ιούλη του 2012

Copyright: © 2012 Yan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σήμερα, η χειρουργική επέμβαση εξακολουθεί να είναι η κύρια επιλογή για τη θεραπεία γαστρικού καρκίνου (GC), ωστόσο ακόμη και μετά την εκτέλεση θεραπευτική εκτομή, περίπου το 40-65% των ασθενών με GC θα βιώσουν μια υποτροπή της νόσου ενδεχομένως να περιλαμβάνει την τοπική υποτροπή, περιτοναϊκή διάδοση ή αιματογενής μετάσταση [1], [2]. Για το λόγο αυτό, το ποσοστό επιβίωσης 5-χρόνια των ασθενών GC ήταν ακόμα σε χαμηλά επίπεδα. Μια σημαντική πρόκληση για τη βελτίωση της κλινικής έκβασης είναι η καλύτερη κατανόηση μοριακών μηχανισμών και να αναγνωρίσουν ισχυρή υπογραφές για την πρόγνωση του GC.

Αρκετοί παράγοντες κινδύνου, συμπεριλαμβανομένων των κρατικών παθολογικές ορογόνο, το καθεστώς του περιθωρίου κέρδους, οι αλλαγές μικροαγγειακή πυκνότητα όγκου και τη γονιδιακή έκφραση που σχετίζονται με επανάληψη έχουν αναφερθεί [3], [4]. Επιπλέον, έχουν λίγες πρόβλεψης ή διαγνωστικές μεθόδους που έχουν χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση του κινδύνου υποτροπής βασίζεται σε προφίλ γονιδιακής έκφρασης ή ένα σύνολο κλινικών μεταβλητών [5] – [8]. Ωστόσο, αυτές οι πολλαπλές παρατηρήσεις συμπεριλαμβανομένων αρκετών γονιδίων ή πρωτεϊνών αλλοιώσεις μπορεί να παρεμποδίσει την κλινική εφαρμογή τους. είναι αξιόπιστα και βολικό μοριακών δεικτών για κλινικοί ιατροί που απαιτούνται για την πρόγνωση σε GC.

Ένα ανακαλύφθηκε πρόσφατα από miRNAs είναι εντόνως διατηρημένες στα γονιδιώματα των ασπόνδυλων, σπονδυλωτών και φυτών. Εξυπηρετούν κρίσιμες λειτουργίες σε πολλαπλές βιολογικές διεργασίες [9], συμπεριλαμβανομένων αναπτυξιακές χρονισμού, διαμόρφωση και την εμβρυογένεση, διαφοροποίηση, οργανογένεσης, και την απόπτωση [10]. Δεδομένου πολλαπλές θεμελιώδεις βιολογικές λειτουργίες του, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι η έκφραση ανώμαλη miRNAs θα οδηγήσει σε ασθένειες και ακόμη και τον καρκίνο [11].

miRNAs έχουν παρουσιαστεί ως αποτελεσματικό δυναμικό βιοδείκτες για τον εντοπισμό της προέλευσης του ιστού σε κακοήθεις όγκους της αγνώστου πρωτοπαθούς προέλευσης [12]? προφίλ miRNAs έκφρασης είναι σε θέση να αντικατοπτρίζουν την αναπτυξιακή καταγωγή και διαφοροποιημένη κατάσταση των όγκων [11]. Συστηματική ανάλυση σχετικά με τη σταθερότητα των miRNAs, καθώς και βέλτιστες συνθήκες για την ανάλυση της έκφρασης χρησιμοποιώντας ενσωματωμένες σε παραφίνη και δείγματα αίματος φορμόλη-σταθερής έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [13] – [15], ρίχνοντας φως στις απροσδόκητες διαγνωστικών δυνατοτήτων τους. Υπάρχει ένας περιορισμένος αριθμός miRNAs [16] στο ανθρώπινο γονιδίωμα που είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν περίπου το 30% των γονιδίων [17]. Αυτά τα χαρακτηριστικά των miRNAs μπορεί να μας δώσει μια απλή μέθοδο για να προβλέψει τον κίνδυνο υποτροπής για τους ασθενείς με καρκίνο.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εντοπίσει ένα miRNA (HSA-miR-335) που έχει το δυναμικό να προβλέψει επανεμφάνιση του κινδύνου της GC με βάση την μικροσυστοιχία και κλινικά δεδομένα ενός δείγματος μικρού μεγέθους σε ασθενείς κινέζικα GC. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η HSA-miR-335 θα μπορούσε να ενεργήσει ως ένα κλινικό προγνωστικό υπογραφή για GC.

Η

Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Αυτή η μελέτη έχει εγκριθεί από η Επιτροπή Δεοντολογίας της Wuhan Γενικό Νοσοκομείο της Guangzhou Command, PLA. Όλοι οι ασθενείς με γαστρικό καρκίνο και μη καρκινικές ασθενείς με παθήσεις του πεπτικού συστήματος παρέχεται έγγραφη συγκατάθεση στη μελέτη μας.

Οι ασθενείς που υποβάλλονται σε γαστρεκτομή για δυνητικά ιάσιμη GC στο γενικό νοσοκομείο Wuhan της Guangzhou στρατιωτική διοίκηση ήταν υποκείμενα σε αυτή τη μελέτη. Επιλεξιμότητας για ένταξη στη μελέτη αυτή περιελάμβανε ιστολογικά επιβεβαιωμένο αδενοκαρκίνωμα του κόμβου στο στομάχι ή γαστροοισοφαγική. Όλοι οι ασθενείς είχαν λάβει πλήρη εκτομές συμπεριλαμβανομένης προσπάθεια πλήρη αφαίρεση του όγκου με συμπερίληψη της ευρείας αρνητικών περιθωρίων και να επεκταθεί οπισθοπεριτοναϊκή λεμφαδενεκτομή (τύπου D2). Πληροφορίες σχετικά με κλινικοπαθολογικοί, θεραπευτική, και τις παραμέτρους έκβαση των ασθενών από Μάιος 2005 – Φεβρουάριος 2012 συλλέχθηκαν αναδρομικά. σταδιοποίηση του καρκίνου έγινε σύμφωνα με την πέμπτη έκδοση του αμερικανικού Μικτής Επιτροπής σχετικά με τα κριτήρια του καρκίνου ΤΝΜ.

Η

Ένα σύνολο των 12 διαφορικό εξέφρασε miRNAs, συμπεριλαμβανομένων 7 up-ρυθμίζονται και 5 προς τα κάτω-ρυθμίζονται, εντοπίστηκαν από SAM σε δείγματα GC με και χωρίς υποτροπή σύμφωνα με τα κριτήρια της ομάδας FC & gt? 2, q = 0. Στήλες αντιπροσωπεύουν δείγματα και σειρές αντιπροσωπεύουν miRNAs (μαύρο, πράσινο, και κόκκινο αντιστοιχούν σε αμετάβλητη, κάτω-ρυθμίζονται και up-ρύθμιση, αντίστοιχα) . R: υποτροπή δείγματα? NR:. Δείγματα μη επανάληψης

Η

Η υποτροπή ορίστηκε ως οποιαδήποτε υποτροπή του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των λεμφαδένων, απομεινάρι του στομάχου, των τοπικών, περιτοναϊκή και αιματογενή μεταστάσεις. Όλοι οι ασθενείς που παρουσίασαν υποτροπή του καρκίνου διαγνώστηκαν κλινικά ή ακτινολογικά, και επιβεβαιώθηκε με βιοψία μέσω του ανώτερου γαστρεντερικού ενδοσκόπιο ή διαδερμική παρακέντηση. Το ακτινογραφικό πρότυπο για τη διάγνωση υποτροπής περιλαμβάνονται αξονική ή μαγνητική τομογραφία του θώρακα, την κοιλιά, τη λεκάνη, το κεφάλι και τα οστά σαρώσεις, ή άλλες διαγνωστικές εξετάσεις που χρησιμοποιείται μόνο κάτω από ειδικές περιστάσεις. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από χειρουργικά δείγματα ασθενών με αδενοκαρκίνωμα στομάχου και όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση αυτών των ιστών για ερευνητικούς σκοπούς. Εμείς επιλεγμένα δείγματα (συμπεριλαμβανομένων των κατεψυγμένων φρέσκο ​​και δείγματα αίματος) από 74 ασθενείς με και χωρίς υποτροπή GC.

miRNA μικροσυστοιχιών

Η ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA διεξήχθη όπως περιγράφεται λεπτομερώς στην ιστοσελίδα του CapitalBio ( https://www.capitalbio.com) και, επίσης, σύμφωνα με τη διαδικασία Hua του [18]. Εν συντομία, 50-100 μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση miRNAs χρησιμοποιώντας ένα κιτ απομόνωσης miRNA AM1560 (Ambion, USA). Φθορεσκεΐνη-σημασμένο miRNAs χρησιμοποιήθηκαν για υβριδισμό σε Affymetrix miRNA Chip που περιέχει 1075 ανιχνευτές. Το σήμα φθορισμού σαρώθηκαν από GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix, USA). Ανεπεξέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν και αναλύθηκαν σε GeneChip Console Command 1.1 λογισμικό (Affymetrix, ΗΠΑ).

Έχουμε λάβει 2 miRNAs HSA-miR-335 και HSA-miR-128b με καλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα στην ταξινόμηση των δειγμάτων GC με και χωρίς υποτροπή. Αριθμητικά στοιχεία (α) έως (ιβ) παριστάνουν τις καμπύλες ROC της HSA-miR-429, HSA-miR-3755, HSA-miR-128b, HSA-miR-133b, HSA-miR-133a, HSA-miR-335, HSA -miR-194, HSA-miR-142-5p, HSA-miR-373, HSA-miR-19a, HSA-miR-142-3p και HSA-miR-32, αντίστοιχα.

Η

RNA Εκχύλιση από κατεψυγμένα φρέσκα και δείγματα αίματος

RNA εξήχθη από κατεψυγμένα φρέσκα ιστούς GC χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο πρωτόκολλο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Για τα δείγματα αίματος, miRNA εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ miRNease (Qiagen). Εν συντομία, 700 μΐ αντιδραστηρίου QIAzol προστέθηκαν σε 200 μΙ δείγματος πλάσματος και επωάστηκε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 140 μΐ χλωροφορμίου, στροβιλίζονται για 15 δευτερόλεπτα και επωάστηκαν για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό ακολουθήθηκε από μια φυγοκέντρηση των 14 000 rpm στους 4 ° C για 15 λεπτά. Η άνω, υγρά φάση απομακρύνθηκε και 1,5 φορές του όγκου της προστιθέμενης σε 100% αιθανόλη. Κάθε 700 μΙ μίγματος τοποθετήθηκαν σε μία στήλη και φυγοκεντρείται στις 13000 rpm σε θερμοκρασία δωματίου για 15 sec. Μετά, 500 μΐ Buffer RPL προστέθηκε στη στήλη και φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm σε θερμοκρασία δωματίου για 2 λεπτά. Η στήλη στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις 13.000 rpm σε θερμοκρασία δωματίου για να στεγνώσει. Το ακόλουθο ήταν το στάδιο έκλουσης με 20 μΙ ύδατος άνευ νουκλεάσης. . Το εκλουσμένο RNA φυλάχθηκε στους -70 ° C

Τα αποτελέσματα στο κατεψυγμένο φρέσκο ​​δείγματα έδειξαν ότι σε 26 περιπτώσεις με υποτροπή, 21 περιπτώσεις με υψηλής εκφράζεται της HSA-miR-335? και σε 38 περιπτώσεις χωρίς υποτροπή, 29 περιπτώσεις με χαμηλή εκφράζεται της HSA-miR-335. Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε δείγματα αίματος, σε 26 περιπτώσεις με υποτροπή, 19 περιπτώσεις με υψηλής εκφράζεται της HSA-miR-335? και σε 38 περιπτώσεις χωρίς υποτροπή, 30 περιπτώσεις με χαμηλή εκφράζεται της HSA-miR-335. Υπήρξαν 11 περιπτώσεις δεν ταιριάζουν στο επίπεδο έκφρασης της HSA-miR-335 σε σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ κατεψυγμένα φρέσκα και δείγματα αίματος.

Η

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Ζευγάρι miRNA ακολουθίες αποκτήθηκαν από τη βάση δεδομένων του Sanger Institute miRBase Sequence (https://microrna.sanger.ac.uk/sequences/). αντίστροφης μεταγραφής (RT) εκκινητές stem-loop σχεδιάστηκαν σύμφωνα με Chen [19]. Οι συνθήκες της αντίδρασης RT χρησιμοποιήθηκε εμπλέκονται επωάσεις στους 16 ° C για 30 λεπτά? 37 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια 72 ° C για 10 λεπτά. Το πρωτόκολλο θερμικής ανακύκλωσης για την PCR περιελάμβανε ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 ° C για 5 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 95 ° C για 30 s, 57 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s. Οι καμπύλες τήξης για κάθε PCR αναλύθηκαν προσεκτικά για να προσδιοριστεί οποιαδήποτε μη-ειδική ενίσχυση. Η έκφραση του κάθε miRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την 2

-ΔΔ

C

T τύπο και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση U6 snRNA [20].

Α. Η τιμή FC της HSA-miR-128b και HSA-miR-335 ήταν 1.647 και 3.589, σε σύγκριση επανάληψης με δείγματα μη επανάληψης βασίζεται σε δεδομένα PCR πραγματικού χρόνου, αντίστοιχα. Συνεπής αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε δεδομένα μικροσυστοιχιών. Β HSA-miR-335 ήταν πιο ευαίσθητη και συγκεκριμένη από HSA-miR-128b και HSA-miR-335 /128b στην ταξινόμηση των δειγμάτων υποτροπής και μη υποτροπής.

Η

Ανεξέλεγκτη Αλγόριθμος

SAM [21] χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει τον υπολογισμό χωρίς επίβλεψη ομαδοποίηση. Η οριακή τιμή για την σημαντικότητα καθορίζεται από ένα δέλτα παράμετρο ρύθμισης που επιλέγεται από τον χρήστη με βάση το ποσοστό ψευδώς θετικών και αντιπροσωπεύονται από την τιμή q. Εμείς επιλέξαμε μια φορές αλλαγή μεγαλύτερη από 2 και q = 0 και τα κριτήρια επιλογής για τη διαφορική έκφραση των miRNAs.

Α. καμπύλη επιβίωσης ομάδας επανάληψης σε σύγκριση με εκείνη του μη-επανάληψης ομάδα σε ασθενείς GC. Μια σημαντική διαφορά του χρόνου επιβίωσης παρατηρήθηκε μεταξύ των ασθενών GC με και χωρίς υποτροπή (

P

& lt? 0.001). καμπύλη Β Επιβίωση του miR-375 (+) ομάδα σε σύγκριση με το miR-375 (-) ομάδα σε ασθενείς με GC. miR-375 (+) η ομάδα έχει κακή πρόγνωση σε σύγκριση με το miR-375 (-) ομάδα (

P

& lt? 0.001)

Η

ROC και Kaplan-Meier επιβίωσης Ανάλυση Curve

ROC διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα πακέτα λογισμικού MedCalc (verison 8.2.1.0? Mariakerke, Βέλγιο). Οι AUC καμπύλες παρέχεται ένα μέτρο της συνολικής απόδοσης ενός διαγνωστικού τεστ. Η αναλογία των εντάσεων σήματος miRNA και Ct αξία του κάθε miRNA χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό ROC σε δείγματα. Επιβίωση αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν επίσης από το πακέτο λογισμικού MedCalc.

Στατιστική Ανάλυση

Τα κλινικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Chi-Square. Η αθροιστική καμπύλη επιβίωσης σε σύγκριση με τη δοκιμασία log-rank. Για όλες τις αναλύσεις, μια διαφορά με το

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Το βασικό πλαίσιο αυτού του δικτύου οδού περιλαμβάνουν του p53, ΜΑΡΚ, TGF-β, Wnt, ErbB, mTOR , Toll-όπως υποδοχέα, εστιακή πρόσφυση

η

η

miRNA Στοχευμένες Gene πρόβλεψη και αναλύσεις σηματοδοτικό μονοπάτι

Αξιοποιήσαμε μια miRNA πρόβλεψη γονιδίου-στόχου βάση δεδομένων TargetScan (http.: //www.targetscan.org) για να επιλέξετε εφικτούς στόχους των διαφορικών εξέφρασε miRNAs. Μια ολοκληρωμένη βάση δεδομένων γονιδιακής οντολογίας του συστήματος μοριακού σχολιασμού (MAS3.0, https://www.capitalbio.com) χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση των miRNA στοχεύει γονιδίων και τη συμμετοχή τους σε διάφορες πορείες σημάτων.

Αποτελέσματα

Κλινικά Χαρακτηριστικά του GC ασθενείς

Ένα σύνολο των 74 ασθενών με /χωρίς υποτροπή επελέγησαν για συστηματική ανάλυση. 31 ασθενείς είχαν επαναλαμβανόμενες GC που αποδείχθηκε με βιοψία παθολογικά σε θέσεις αναστόμωση με ενδοσκόπηση. 43 ασθενείς χωρίς υποτροπή επελέγησαν ως ομάδα ελέγχου με αγώνες στο φύλο, την ηλικία κατά τη διάγνωση, σταδιοποίηση ΤΝΜ, τη θεραπεία και τον αριθμό των εμπλεκόμενων λεμφαδένων (Πίνακας 1).

Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο σεξ (

P

= 0,469), Ηλικία (

P

= 0.502), τη θέση του όγκου (

P

= 0.299), Διαφοροποίηση (

P

= 0,511) , λεμφαδένων εκτομή (

P

= 0,217) και της κατάστασης των επικουρική χημειοθεραπεία (

P

= 0,214). Υπήρχαν σημαντικές διαφορές στο στάδιο UICC (

P

= 0.108) και η αναλογία επιβίωσης /θανάτου σημειωθεί (8/23 στην ομάδα υποτροπή έναντι 34/9 στη μη επανεμφάνιση της ομάδας,

P

& lt ? 0.001), με μέσο χρόνο επιβίωσης 18,9 μήνες σε υποτροπή έναντι 43,9 μηνών σε μη επανάληψης ομάδα αντίστοιχα (

P

& lt?. 0.001) (Πίνακας 1)

miRNA έκφραση προφίλ που σχετίζονται με GC επανεμφάνιση

Χρησιμοποιήσαμε ένα τσιπ miRNAs μικροσυστοιχιών για να μετρήσει τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs σε 10 δείγματα GC με /χωρίς υποτροπή (5/5) ως σύνολο εκπαίδευσης. Κατά τη σύγκριση της έκφρασης των miRNAs μεταξύ των ομάδων, 7 up-ρυθμίζονται και 5 προς τα κάτω-ρυθμίζονται miRNAs βρέθηκαν ότι ήταν στατιστικά σημαντική στην ομάδα επαναλαμβανόμενες GC (Πίνακας 2). Αυτά τα 12 miRNAs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση μεταξύ GC με και χωρίς υποτροπή βασίζεται σε μια ιεραρχική ανάλυση συστάδων (Σχήμα 1).

HSA-miR-335 είναι η καλύτερη Υπογραφή για την ταξινόμηση GC με και χωρίς υποτροπή στην Εκπαίδευση Set

χρησιμοποιούμενη μέθοδος ROC για την ανάλυση της ευαισθησίας και της ειδικότητας των υποψηφίων βιοδεικτών με βάση τα δεδομένα μικροσυστοιχιών miRNA. Πήραμε 2 miRNAs HSA-miR-335 και HSA-miR-128b με καλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα στην ταξινόμηση των δειγμάτων GC με και χωρίς υποτροπή (Σχήμα 2, Πίνακας 3). Σε συνδυασμό με την αξία FC (FC

HSA-miR-335 = 4.675? FC

HSA-miR-128b = 1.453) κάθε βιοδείκτη, επιλέγουμε HSA-miR-335 για περαιτέρω μελέτη

η επικύρωση της υπογραφής σε δείγματα δοκιμής από την real-time PCR

το επίπεδο έκφρασης της HSA-miR-335 ανιχνεύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε 64 δείγματα δοκιμής GC σε σύγκριση με την συμφωνημένα παρακείμενο ιστό όπως τον έλεγχο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε 26 περιπτώσεις με υποτροπή, 21 περιπτώσεις (21/26, 80.8%) ήταν υψηλή εκφράζεται της HSA-miR-335? και σε 38 περιπτώσεις χωρίς υποτροπή, 29 περιπτώσεις (29/38, 76,3%) ήταν χαμηλή εκφράζεται της HSA-miR-335 (Σχήμα 3). Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε δείγματα αίματος χρησιμοποιώντας ένα δείγμα μικτού αίματος από 20 μη καρκινοπαθείς ασθενείς με παθήσεις του πεπτικού συστήματος, όπως έλεγχος: Σε 26 περιπτώσεις με υποτροπή, 19 περιπτώσεις (19/26, 73.1%) ήταν υψηλή εκφράζεται της HSA-miR -335? και σε 38 περιπτώσεις χωρίς υποτροπή, 30 περιπτώσεις (30/38, 78.9%) ήταν χαμηλή εκφράζεται της HSA-miR-335 (Σχήμα 3). Υπήρξαν 11 περιπτώσεις (11/64, 17,2%) δεν ταιριάζει στο επίπεδο έκφρασης της HSA-miR-335 σε σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ κατεψυγμένα φρέσκα και δείγματα αίματος.

Επιπλέον, εντοπίστηκε το επίπεδο έκφρασης της HSA-miR-128b σε 64 δείγματα αίματος GC χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε 26 περιπτώσεις υποτροπής, 18 περιπτώσεις (18/26, 69,2%) ήταν υψηλού εκφράζεται της HSA-miR-128b? και σε 38 περιπτώσεις χωρίς υποτροπή, 27 περιπτώσεις (27/38, 71,1%) ήταν χαμηλή εκφράζεται της HSA-miR-128b. Η τιμή FC της HSA-miR-128b και HSA-miR-335 ήταν 1.647 και 3.589, σε σύγκριση επανάληψης με δείγματα μη επανάληψης, αντίστοιχα (Εικόνα 4Α). Αναλύσαμε επίσης την ευαισθησία και την ειδικότητα της HSA-miR-335, HSA-miR-128b και HSA-miR-335 /128β (σε συνδυασμό με το miR-335 και miR-128b ως υπογραφή) με βάση την σε πραγματικό χρόνο τα δεδομένα PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η HSA-miR-335 ήταν πιο ευαίσθητη και ειδική με την AUC αξίας 0,88 από HSA-miR-128b (AUC = 0,79) και HSA-miR-335 /128β (AUC = 0,84) στην ταξινόμηση υποτροπής και μη δείγματα επανάληψης (Εικόνα 4Β, Πίνακας 3).

HSA-miR-335 ως μια υπογραφή την εξέλιξη της νόσου σε Προβλέψτε επανεμφάνιση κινδύνου σε ασθενείς GC

Οι 74 ασθενείς GC χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, συμπεριλαμβανομένων των 31 ασθενείς με υποτροπή ως ομάδα και 43 ασθενών χωρίς υποτροπή ως ομάδα. Οι ασθενείς που εμφάνισαν υποτροπή της GC είχαν σημαντικά μειωμένο διάμεσο ποσοστό επιβίωσης (

P

& lt? 0.001? Σχήμα 5Α). Διαπιστώσαμε τα επίπεδα έκφρασης της HSA-miR-335 σε όλα τα δείγματα 74 GC. Μια σημαντική διαφορά έχει παρατηρηθεί σε δύο ομάδες που αντιπροσωπεύουν υψηλής εκφράζεται της HSA-miR-335 ομάδα και χαμηλού εκφράζεται από ομάδα HSA-miR-335 ως εξής: miR-335 (+) και miR-375 (-). ασθενείς GC (n = 35) με miR-335 (+) είχε μειωθεί σημαντικά μέση επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους (n = 39) με miR-375 (-) (

P

& lt? 0,001? Σχήμα 5Β).

μονοπάτι σηματοδότησης και Γονιδιακή Οντολογία αναλύσεις της HSA-miR-335 Στοχευμένες γονίδια

για να διερευνηθούν οι πιθανοί μηχανισμοί ρύθμισης της HSA-miR-335 στην διαδικασία της επανάληψης GC, χρησιμοποιήσαμε μια βάση δεδομένων βιοπληροφορικής για να επιλέξετε εφικτούς στόχους αυτού του miRNA. Ένα σύνολο 255 γονιδίων προβλέφθηκαν ως γονιδίων στόχων του HSA-miR-335. Μονοπάτι σηματοδότησης αναλύσεις έδειξαν ότι οι περισσότερες από τις στοχευμένες γονίδια που ρυθμίζονται από HSA-miR-335 συμμετείχαν στα ίδια μονοπάτια, όπως το p53, ΜΑΡΚ, TGF-β, Wnt, ErbB, mTOR, Τοίΐ υποδοχέα, εστιακή πρόσφυση ( Ο Πίνακας 4, Σχήμα 6). Προτείναμε ότι αυτές οι πολλαπλές αλλαγές μονοπάτι μπορεί να εμπλέκεται σε κλινικές παθολογικά χαρακτηριστικά και την έκβαση του GC ασθενών. Εν τω μεταξύ, χρησιμοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη βάση δεδομένων γονιδιακής οντολογίας για να σχολιάσετε την μοριακή λειτουργία των miRNA στοχεύει γονίδια. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα γονίδια που ρυθμίζονται από HSA-miR-335 συμμετείχε στις περισσότερες από τις σημαντικές βιολογικές διαδικασίες που σχετίζονται με την ανθρώπινη καρκίνο (Πίνακας 5).

Συζήτηση

Η υποτροπή είναι συχνή σε ασθενείς με GC μετά από χειρουργική επέμβαση ? Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να εντοπιστούν περιπτώσεις με υψηλό κίνδυνο υποτροπής. Παραδοσιακά κλινική παθολογικοί παράγοντες είναι μερικές φορές ανεπαρκείς για την πρόβλεψη υποτροπής σε άτομα και πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν προσπαθήσει να εντοπίσει βιοδείκτες με τη χρήση νέων τεχνολογιών που μπορούν να διακρίνουν αυτές τις περιπτώσεις υψηλού κινδύνου. Ένας αριθμός των πρόσφατων ερευνών έχουν τεκμηριώσει miRNA αλλαγές που εμπλέκονται στην έναρξη και την πρόοδο των ανθρώπινων καρκίνων. προφίλ έκφρασης των miRNAs των ανθρώπινων όγκων έχουν εντοπίσει υπογραφές έκφραση που σχετίζονται με τη διάγνωση, σταδιοποίηση, την εξέλιξη, την πρόγνωση και την ανταπόκριση στη θεραπεία.

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε τις περιπτώσεις πρωτογενούς GC με σκοπό την πρόγνωση υποτροπή της νόσου και ορίζεται μη επαναλαμβανόμενα περιπτώσεις όπως εκείνες χωρίς GC για τουλάχιστον ένα χρόνο μετά την θεραπευτική εκτομή. Εντοπίσαμε HSA-miR-335 ως εύλογο πρόγνωση υπογραφή του GC με βάση τα δεδομένα μικροσυστοιχιών από 10 δείγματα GC ως σύνολο εκπαίδευσης. Επιπλέον, επικυρωμένη υπογραφή αυτή επί 64 δείγματα δοκιμής με περισσότερους από έναν μέσο όρο 85% ευαισθησία και ειδικότητα. Η επιβίωση αναλύει τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα έκφρασης της HSA-miR-335 είχαν μειωμένη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους με χαμηλά επίπεδα έκφρασης της HSA-miR-335. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η υπογραφή αυτή είχε τη δυνατότητα να προβλέψει επανάληψη του GC.

τεχνολογία μικροσυστοιχιών έχει αναπτυχθεί σημαντικά και να γίνει μια ολοκληρωμένη και χρήσιμη μέθοδος για να μας βοηθήσει στην καλύτερη καταλαβαίνει καρκίνων [22]. Είναι πλέον ευρέως χρησιμοποιείται για τη μελέτη των λειτουργικών ρόλων των miRNAs σε πολλούς τύπους καρκίνου [23], με αρκετές σημαντικές επιδράσεις miRNA σε ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια εντοπίστηκαν. Από τις 12 miRNAs που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, HSA-miR-373 ήταν ένα από τα κάτω-ρυθμίζονται miRNAs στην υποτροπιάζουσα ομάδα. Αυτό μπορεί να είναι ένα ογκογονίδιο λειτουργεί μέσω του γνωστού μονοπάτι ρ53 που εμπλέκεται στην καρκινογένεση [24]. Μερικά miRNAs, όπως HSA-miR-19a και HSA-miR-32, που βρίσκεται στο γονιδιωματικές περιοχές σχετίζονται με τον καρκίνο, η οποία μπορεί να εμπλέκεται σε κακοήθειες μέσω διαγραφής, ενίσχυση, ή επιγενετική τροποποίηση [25]. Επιπλέον, HSA-miR-429 ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε υποτροπιάζουσες περιπτώσεις και συγκεντρωμένα στο χρωμόσωμα 1, που επιβεβαιώνει ότι ορισμένοι miRNAs όπως HSA-miR-200b συγκεντρωμένα με HSA-miR-429 και είναι σε θέση να συν-ρύθμιση στοχευμένες γονίδιά τους [26 ].

Μέχρι τώρα, το miRNA που ορίζεται στην παρούσα μελέτη για την πρόβλεψη του κινδύνου υποτροπής GC δεν έχουν καλά χαρακτηριστεί. HSA-miR-335, το οποίο μεταγράφεται από την γονιδιωματική περιοχή χρωμόσωμα 7q32.2, έχει αναφερθεί ότι εκφράζεται σε απόκλιση καλοήθεις και κακοήθεις όγκους [27]. Είναι σημαντικό, είναι επίσης αποδειχθεί ότι το miR-335 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Rb1 και τους ελέγχους σε p53-εξαρτώμενο τρόπο [28]? συμμετέχει στην ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού [29]? ρυθμίζει την ανάπτυξη και την εισβολή των κακοήθων κυττάρων [30]. Η πιο πρόσφατη έρευνα αναφέρει ότι το miR-335 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας μετάσταση σε GC στοχεύοντας Bcl-2 και το SP1, και θα μπορούσε να αναπτυχθεί περαιτέρω ως πιθανή προγνωστικός παράγοντας [31]. Για να συνοψίσουμε τα παραπάνω απόψεις, η λειτουργία των miR-335 ήταν αμφιλεγόμενη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι HSA-miR-335 ήταν ρυθμισμένα σε δείγματα επανάληψη GC και εμπλέκονται στις περισσότερες από τις ογκογόνους μονοπάτια σηματοδότησης, όπως ρ53, ΜΑΡΚ, ΤΟΡ-β, Wnt, ErbB, mTOR, ΤοΙΙ υποδοχέα, εστιακή προσκόλληση . Αυτές οι πολλαπλές αλλαγές οδό σήματος, συμπεριλαμβανομένων ιδίως της οδού p53, μπορεί να επηρεάσει λογικά κλινική έκβαση συμπεριλαμβανομένου του κινδύνου υποτροπής GC [32]. Αν και η προγνωστική ρόλος της HSA-miR-335 σε καρκίνο του στομάχου είναι άγνωστη, τα ευρήματά μας είναι ενθαρρυντικά.

Το αίμα είναι το πιο προσιτό δείγμα στα νοσοκομεία. Η κλινική σημασία της αναγνώρισης των βιολογικών δεικτών που θα μπορούσαν να ανιχνευθούν εύκολα ακριβώς όπως HSA-miR-335 είναι προφανώς. Επιπλέον, αρχειοθετημένα δείγματα εγκλεισμένα σε παραφίνη είναι επίσης ένα από τα άμεσα διαθέσιμα υλικά στα νοσοκομεία, οι οποίες συχνά φυλάσσονται με καλά τεκμηριωμένη κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένων. Αντιπροσωπεύουν εξαιρετικές πηγές για την προγνωστική εφαρμογή τόσο σε βασική έρευνα και κλινικές μελέτες. miRNAs κυμαίνονται σε μέγεθος από 19-25 nt και προστατεύονται από το σύμπλοκο σίγηση του RNA επαγόμενη, η οποία μπορεί να καταστήσει λιγότερο ευαίσθητο σε αποικοδόμηση RNA σε σύγκριση με mRNA σε αυτούς τους ιστούς [33]. Έτσι, ήταν σε θέση να ανιχνεύσει έκφραση miRNA σε δείγματα ενσωματωμένες σε παραφίνη και επικεντρώθηκε στη συστηματική ανάλυση χρησιμοποιώντας αυτή την υπογραφή για τις σχετικές προγνωστική αξία. Η μέθοδος ταξινόμησης που βασίζεται στην PCR, ως εκ τούτου, φαίνεται να μας δώσει έναν τρόπο, χρησιμοποιώντας εύκολα διαθέσιμα κλινικά δείγματα, για την πρόβλεψη υποτροπής της νόσου.

Εν ολίγοις, έχουμε εντοπίσει μια πρόγνωση που σχετίζονται με miRNA που μπορεί να προβλέψει επανεμφάνιση του κινδύνου της ασθενείς GC. Με το συνδυασμό αυτό υπογραφής με τη συμβατική κλινικοπαθολογική παράγοντες, θα πρέπει να είμαστε σε θέση να προβλέψουμε το αποτέλεσμα της νόσου του ασθενούς με μεγαλύτερη ακρίβεια. Επιπλέον, η αναγνώριση των ασθενών υψηλού κινδύνου θα οδηγούσε στην εξέταση των πρόσθετων θεραπευτική παρέμβαση και μπορούν έτσι να ενημερώσει το γιατρό για ένα καλύτερο πρόγραμμα παρακολούθησης.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Λι Γουάνγκ (Εθνικό Ινστιτούτο Περιβαλλοντικών Επιστημών Υγείας, USA) για σχόλια διορατικότητα και χειρογράφων μοντάζ.