Αφηρημένο

Το νευροβλάστωμα είναι η συχνότερη επιπλέον κρανιακή στερεά καρκίνο της παιδικής ηλικίας. Παρά την κλιμάκωση των θεραπευτικών σχημάτων, μια σημαντική μειονότητα των ασθενών που πεθαίνουν από τη νόσο τους. Disialoganglioside (GD2) εκφράζεται σταθερά σε υψηλά επίπεδα, σε όγκους νευροβλαστώματος, τα οποία έχουν στοχευμένες με κάποια επιτυχία, χρησιμοποιώντας θεραπευτικά μονοκλωνικά αντισώματα. GD2 εκφράζεται επίσης σε μια σειρά άλλων καρκίνου, αλλά με την εξαίρεση ορισμένων περιφερικών νεύρων είναι σε μεγάλο βαθμό απουσιάζει από τα μη μετασχηματισμένα ιστούς. Χιμαιρικό αντιγόνο υποδοχέων (αυτοκίνητα) είναι πρωτεΐνες τεχνητά τύπου Ι η οποία μοσχεύματος την ειδικότητα ενός μονοκλωνικού αντισώματος σε ένα Τ-κυττάρων. Κλινικά δεδομένα με πρώιμη σχέδια αυτοκινήτων που κατευθύνονται έναντι GD2 έχουν δείξει κάποια υπόσχεση στο νευροβλάστωμα. Εδώ, περιγράφουμε μια GD2 στόχευση κασέτα CAR ρετροϊικό, η οποία έχει βελτιστοποιηθεί για Τ-κυττάρων CAR επιμονή, την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια

Παράθεση:. Thomas S, Straathof Κ, Himoudi Ν, Άντερσον J, Pule Μ ( 2016) ένα βελτιστοποιημένο GD2-Στόχευση ρετροϊική κασέτα για πιο ισχυρός και Safer Κυτταρικής θεραπείας της Νευροβλάστωμα και άλλων μορφών καρκίνου. PLoS ONE 11 (3): e0152196. doi: 10.1371 /journal.pone.0152196

Επιμέλεια: Σοφία Ν Καραγιάννης, King College του Λονδίνου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 27 Γενάρη, 2016? Αποδεκτές: 10, Μαρ του 2016? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαρ, 2016

Copyright: © 2016 Thomas et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από νευροβλάστωμα Κοινωνία τώρα εκ νέου την ένδειξη «νευροβλάστωμα Ηνωμένο Βασίλειο». Αυτή η μικρή φιλανθρωπική οργάνωση που προβλέπεται επιχορήγηση ύψους £ 133.000 το 2005, για ένα έργο με τίτλο «Γενετική Μηχανική των Τ-κυττάρων για ανοσοθεραπεία Νευροβλάστωμα». Martin Pule υποστηρίζεται από το NIHR Κέντρο Ερευνών UK Βιοϊατρικής και το Wellcome Trust. John Anderson υποστηρίζεται από το Great Ormond Street Hospital, το Κέντρο Βιοϊατρικής Έρευνας και της Great Ormond Street Hospital Παιδική φιλανθρωπία. Karin Straathof υποστηρίζεται από το Great Ormond Street Hospital, το Κέντρο Βιοϊατρικής Έρευνας και το Wellcome Trust. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Βουλευτής έχει λάβει χρηματοδότηση για την έρευνα της σύμβασης από Cellectis. Κατέχει απόθεμα και λαμβάνει μισθό συνεισφορά Autolus Ltd. Είναι ένας εφευρέτης για τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας που κατατέθηκαν από UCLB και έχει λάβει και μπορούν να λάβουν τα δικαιώματα αυτά. Έχει λάβει αμοιβές από τη Roche και Amgen για την ομιλία. JA και ST ιδιοκτήτης απόθεμα από Autolos Ltd. Είναι εφευρέτες για τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας που κατατέθηκαν από UCLB και μπορούν να λάβουν τα δικαιώματα αυτά. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το νευροβλάστωμα αντιπροσωπεύει περίπου το 15% των θανάτων από καρκίνο στα παιδιά [1]. Παρά την έντονη εντατικοποίηση της θεραπείας, λιγότερο από το 40% των ασθενών υψηλού κινδύνου είναι μακροχρόνια επιζώντες, με τη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία και την αντίσταση αργά υποτροπές είναι το σήμα κατατεθέν της αποτυχίας [2] θεραπείας. Disialoganglioside (GD2), μία επιφάνεια γλυκολιπιδικό αντιγόνο που είναι πανταχού παρούσα και άφθονη σε κύτταρα νευροβλαστώματος, καθώς επίσης και έχοντας ειδική για τον καρκίνο έκφραση σε έναν αριθμό ενηλίκων και παιδιατρικών κακοηθειών [3], είναι ένας ιδανικός στόχος για ανοσοθεραπεία [4]. Πράγματι, αντι-GD2 μονοκλωνικά αντισώματα αποτελούν σήμερα μέρος της συνήθους θεραπείας για την υψηλή νευροβλάστωμα κινδύνου και την αποτελεσματικότητά τους και το προφίλ τοξικότητας είναι καλά εδραιωμένη [3,5].

Διοίκηση του όγκου-ειδικά Τ-κύτταρα (θετοί ανοσοθεραπεία) έχει αποδειχθεί ότι είναι μια αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου για λεμφώματα Epstein Barr ιός καθοδηγείται [6] και το μελάνωμα [7] με αποκρίσεις σε ογκώδη ανθεκτική νόσο. Ωστόσο, δεν έχει καταστεί δυνατόν να παράγει νευροβλάστωμα ειδικά Τ-κύτταρα χρησιμοποιώντας παραδοσιακές μεθόδους επιλογής και επέκτασης. Χιμαιρικό αντιγόνο υποδοχέων (αυτοκίνητα) μπορεί να κατασκευαστεί με σύνδεση της μεταβλητής περιοχής μονής αλυσίδας (scFv) από ένα μονοκλωνικό αντίσωμα σε ενδοκυτταρικά πεδία σηματοδότησης. GD2 στόχευση CARs επομένως αποδώσει μας μια εναλλακτική μέθοδος δημιουργίας νευροβλαστώματος ειδικών Τ-κυττάρων με γενετική μηχανική. θεραπεία CAR GD2 μπορεί να οδηγήσει σε βελτιωμένη απαντήσεις πάνω θεραπείας mAb οφείλεται σε συνεχιζόμενες και δυναμική απόρριψη του GD2 εκφράζουν όγκου.

Μια κλινική μελέτη Φάσης Ι αντι-GD2 CAR μετάγονται Τ-κύτταρα σε υποτροπή ασθενείς νευροβλάστωμα υψηλού κινδύνου αναφερθεί κάποια αποτελεσματικότητα [8]. Ο ενδεχόμενος περιορισμός της μελέτης αυτής ήταν η χρήση ενός πρώτου αυτοκινήτου γενιά, παρέχοντας μόνο σήματα CD3ζ ΙΤΑΜ, η οποία μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την κακή επιμονή και την επέκταση. Ένας αυξανόμενος όγκος των κλινικών δεδομένων των CD19 CAR στην κακοηθειών Β-κυττάρων, καθώς και μια μελέτη διπλή σήμανση [9] δείχνουν ότι τα αυτοκίνητα παροχή πρόσθετων συν-διεγερτικά σήματα οδηγήσει σε βελτιωμένη επιμονή και αποτελεσματικότητα. Εδώ, περιγράφουμε τις προσπάθειές μας για την κατασκευή ενός πιο ισχυρό αλλά ασφαλή GD2 στόχευση κασέτα για χρήση κατά το νευροβλάστωμα, το οποίο χρησιμοποιεί μια προηγουμένως περιγράφεται γενιά endodomain τρίτη [10]. Το επίκεντρο αυτής της εργασίας είναι η βελτιστοποίηση του υπόλοιπου αρχιτεκτονικής CAR και κασέτα έκφρασης για μέγιστη αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια.

Το CAR διερευνήθηκε σε μελέτη που αναφέρθηκαν από Pule et al χρησιμοποίησαν ένα scFv που προέρχεται από 14-18 ένα mAb το οποίο σε ένα χιμαιρικό μορφή είναι σήμερα σε τακτική κλινική χρήση. Επομένως, έχουμε χρησιμοποιήσει ένα επικράτεια στόχευσης από μια διαφορετική οικογένεια αντι-GD2 mAb για να αποφευχθεί αντι-ιδιότυπου απόρριψη /ενεργοποίηση των CAR Τ-κυττάρων. Για να μειώσετε την πιθανότητα απόρριψης, ένα εξανθρωπισμένο έκδοση του αυτοκινήτου ελέγχθηκε και επαναληπτική βελτιστοποίηση της αρχιτεκτονικής του αυτοκινήτου. θεραπεία με αντι-GD2 mAb συνδέεται με περιφερική νευροτοξικότητα. Ενώ η αρχική μελέτη CAR GD2 δεν το αναφέρει [8], η ανησυχία καθυστερεί καθώς οι όλο και πιο ισχυροί αυτοκινήτων που είχαν θεσπισθεί στην κλινική. Εν αναμονή της αυτό το ενδεχόμενο, θα συν-εκφράζεται CAR με το γονίδιο iCasp9 αυτοκτονίας [11] και βελτιστοποιημένη ένα bi-κιστρονικού ρετροϊικό κασέτα για να διατηρήσει συν-έκφραση και συνεπής εξόδου διαγονιδίου. Το τελικό κατασκεύασμα δοκιμάστηκε in vivo. Έχουμε δημιουργήσει μια CAR GD2 στόχευση ρετροϊικό κασέτα βελτιστοποιηθεί για την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια.

Αποτελέσματα

CAR με ανθρωποποιημένα scFv δίνει παρόμοια έκφραση και την αυξημένη απελευθέρωση κυτοκινών και Τ-κυττάρων

επέκταση

KM8138 είναι ένα πλήρως εξανθρωπισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-GD2 κατασκευάστηκε με εμβολιασμό δεσμευτικός περιοχές καθορισμού συμπληρωματικότητας (CDRs) του μυϊκού αντι-GD2 αντίσωμα KM666 στο συμβατό ανθρώπινο V

H και V

περιοχές πλαισίου L [12] το επιτόπιο. Το προκύπτον ανθρώπινη αλληλουχία scFv διαφέρει από το μυϊκό σε 31 κατάλοιπα στις περιοχές πλαισίου εκτός των CDR. Ποντικού αντίσωμα 14.18 προερχόμενο scFv που χρησιμοποιούνται σε περιγράφηκε προηγουμένως GD2 αυτοκινήτων θα μπορούσε να είναι ένας στόχος για την ανοσολογική απόρριψη είτε λόγω αντι-ιδιότυπο (δεδομένου ότι τα θεραπευτικά mAbs στην τρέχουσα κλινική χρήση προέρχονται από τον ίδιο κλώνο), ή από τα αντισώματα αντι-ποντικού. Ως εκ τούτου, προέρχεται ένα αυτοκίνητο με βάση το εξανθρωπισμένο αντίσωμα KM8138 [12]. Για τον προσδιορισμό τυχόν επιπτώσεις της χρήσης ενός εξανθρωπισμένου scFv, δημιουργήσαμε επίσης ένα αυτοκίνητο που προέρχεται από το γονικό αντίσωμα ποντικού έτσι δημιουργήσαμε ένα ζεύγος αντι-GD2 CARs πανομοιότυπα εκτός από scFvs τους, οι οποίες προέρχονται από ένα μυϊκό αντι-GD2 mAb KM666, ή ανθρωποποιημένα ομόλογό KM8138 της [12]. Τα αυτοκίνητα είχαν ανθρώπινο IgG1 άρθρωσης-Ρο αποστάτες, το πεδίο CD28 διαμεμβρανική και την endodomain CD28-ΟΧ40-Zeta (Σχήμα 1Α). Αρχικά προσπαθήσαμε να συγκριθεί η έκφραση και η λειτουργία αυτού του ανθρωποποιημένα CAR (HuK666) με τον ομόλογό του ποντικού (MuK666). Φυσιολογικό δότη ανθρώπινα Τ-κύτταρα σε μεταγωγή με ίσο τίτλους του ρετροϊικού φορέα που κωδικοποιεί για κάθε υποδοχέα. Η επιφανειακή έκφραση του κάθε CAR προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής με ένα πολυκλωνικό αντι-Fc ήταν ταυτόσημο (Σχήμα 1Β). Η μέση ένταση φθορισμού (MFI) μεταγωγή Τ-κυττάρων δεν διέφερε μεταξύ ανθρωποποιημένου και ποντικού αυτοκίνητα. Τα μετατραπέντα κύτταρα Τ ήταν σε 4-ωρών δοκιμασία απελευθέρωσης χρωμίου CD56-εξαντλημένο Τ-κύτταρα που εκφράζουν είτε CAR αποδειχθεί συγκρίσιμη θανάτωση του GD2 φέρουν Lan-1 κυτταρική γραμμή νευροβλαστώματος και ένα ισοδύναμο απουσία δραστικότητα έναντι Α204 κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος που στερείται έκφραση του GD2. Ούτε μη μετατραπέντα κύτταρα Τ (ΝΤ), ούτε τα Τ κύτταρα σε μεταγωγή με ένα άσχετο CAR κατευθύνεται έναντι CD19 εμφανίζεται καμία κυτταροτοξικότητα είτε κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1C) Αμφότεροι οι υποδοχείς ήταν ικανό να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των μετατραπέντων κυττάρων Τ ως φρεάτια ως την έκκριση IL2 και IFN-g σε απόκριση LAN1 αλλά όχι Α204 (Σχήμα 1 D). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ huK666 και muK666 αυτοκίνητα για πολλαπλασιασμό (Σχήμα 1D), την απελευθέρωση της ιντερφερόνης γ (Σχήμα 1 Ε) ή ιντερλευκίνη 2 (IL-2) απελευθέρωση (Σχήμα 1 F) αν και υπήρξε μια μη σημαντική τάση για τις τρεις προς την ενισχυμένη λειτουργία του CAR huK666.

(α) σύγκριση των ακολουθιών αμινοξέων huK666 και muK666 scFvs συγκρίνονται. Οι περιοχές καθορισμού συμπληρωματικότητας εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα. Η συνδετική αλληλουχία εμφανίζεται με πράσινο χρώμα. Στα δεξιά, αρχιτεκτονικές των αυτοκινήτων που παράγονται για την αρχική σύγκριση των huK666 με muK666. Τόσο διαφέρουν μόνο στα scFvs που χρησιμοποιείται είναι είτε η αρχική αλληλουχίες ποντικού muK666, ή η εξανθρωπισμένη (CDR μοσχευμένο) huK666. Διαφορετικά, τα αυτοκίνητα αποτελούνται από ένα ανθρώπινο IgG 1 άρθρωση-CH2-CH3 αποστάτη, έναν τομέα TM προέρχεται από CD28 και μια ένωση endodomain αποτελείται από συγχωνεύσεις μεταξύ endodomains από CD28, ΟΧ40 και CD3-Zeta. (Β) Σταθερότητα της muK666 vs huK666 αυτοκίνητα. Τ-κύτταρα από 5 δότες μεταγωγή με ίσο τίτλους ρετροϊικού υπερκειμένου που κωδικοποιεί για muK666 ή huK666 αυτοκίνητα. έκφραση CAR ανιχνεύθηκε με αντι-ανθρώπινο-Ρο πολυκλωνικά αντισώματα. MFI ήταν ταυτόσημη σε αμφότερες τις κατασκευές. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα παρουσιάζεται με NT (πράσινο), muK666 (μπλε) και huK666 (κόκκινο) ιστογράμματα επικαλύπτονται. Αυτά CAR Τ-κύτταρα προκλήθηκαν με LAN-1 (μία κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος που εκφράζει GD2) και Α204 (ραβδομυοσαρκώματος μια κυτταρική γραμμή η οποία είναι GD2 αρνητικό). Η κυτταροτοξικότητα φαίνεται στο (γ), πολλαπλασιασμό την ημέρα 7 δείχνεται στο (d), IFN-γ σε (ε) και την αποδέσμευση της IL-2 στο (στ). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές +/- SEM από 6 ανεξάρτητα πειράματα με διαφορετικούς δότες.

Η

Spacer περιλαμβάνει IgG 1 Fc αποτελέσματα του τομέα στην βέλτιστη θανάτωση και την απελευθέρωση κυτοκινών

λειτουργία του αυτοκινήτου μπορεί να επηρεαστεί από spacer επιλογή τομέα [13-15]. Εκτός από το huK666 που βασίζεται CAR που περιγράφεται παραπάνω που περιέχει την IgG 1 ανθρώπινης περιοχής άρθρωσης-CH2-CH3 ως αποστάτη, δημιουργήσαμε επιπλέον παραλλαγές CAR huK666 στην οποία η περιοχή διαχωρισμού αποτελούνταν του μεντεσέ και μόνο, τον μεντεσέ συνδέονται με το μίσχο του CD8a ή ο CD8a μίσχο μόνο (Σχήμα 2Α). Η επιλογή αυτών των αποστατών βασίστηκε στην εξέταση μεγέθους, με IgG1 άρθρωση-alone είναι ένα μικρό διαχωριστικό, CD8 στέλεχος ενδιάμεσων και IgG 1 Fc είναι ένα μεγάλο αποστάτη. Μπορούμε υποτεθεί επίσης ότι ο μίσχος CD8 μπορεί να μην επιτρέπει επαρκή άρθρωση του scFv και ως εκ τούτου δημιουργείται μια πρόσθετη παραλλαγή με την άρθρωση IgG1 και το στέλεχος συνδέονται CD8. Για να επιτραπεί εύκολη ανίχνευση της CAR, έχουμε ετικέτα την huK666 με μία αμινο-τερματική ΗΑ-tag, παρεμβάλλεται μεταξύ του σήματος-πεπτιδίου και του VH. Περαιτέρω, για τον έλεγχο για μεταβολή στην έκφραση φορέα, θα κλωνοποιηθεί το πόδι πυρετού ακολουθία 2Α ασθένειας TAV (2ATaV) στο πλαίσιο με το καρβοξυ-τελικό άκρο του αυτοκινήτου, η οποία με τη σειρά της κλωνοποιήθηκε στο πλαίσιο για να περικοπεί CD34 (dCD34ngg). Θα μπορούσαμε επομένως να ανιχνεύσει έκφραση CAR σε σχέση με φορέα έκφρασης με χρώση για το ΗΑ και αντι-CD34.

πολλά αυτοκίνητα huK666 κλωνοποιήθηκαν σε ένα ταυτόσημο μορφότυπο οποία ο scFv έχει επισημανθεί με ένα ΗΑ-tag, και το αυτοκίνητο ήταν co -expressed με μια ακρωτηριασμένη ακολουθία του αφθώδους πυρετού-2A με ακρωτηριασμένη CD34. Η κασέτα έκφρασης δείχνεται στο (α) και κινούμενα σχέδια από αυτές τις μορφές που φαίνεται στο (b). Συν-έκφραση του CAR (ΗΑ) και γονίδιο δείκτη CD34 από τις διαφορετικές κασέτες. Οι τέσσερις περιοχές άρθρωσης συγκρίθηκαν σε όρους κυτταροτοξικότητα (c) (LAN1 = GD2 θετικό στόχο και Α204 = GD2 αρνητικός στόχου), η έκκριση IFN-γ (δ), IL-2 (ε) και τον πολλαπλασιασμό ειδικού στόχου (f). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές +/- SEM από 4 ανεξάρτητα πειράματα με διαφορετικούς δότες.

Η

Πρωτογενή ανθρώπινα Τ-κύτταρα σε μεταγωγή με υπερκείμενο ίσες τίτλο από αυτά τα κατασκευάσματα και χρωματίστηκαν με αντι-ΗΑ και αντι-CD34. Μία αντιπροσωπευτική ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της παρούσας χρώση δείχνεται στο Σχήμα 2Β. Άρθρωση-CH2-CH3, άρθρωση-μίσχος και μίσχο έκφραση CARs αποστάτη ήταν πανομοιότυπα, ενώ η άρθρωση-alone αποστάτη CAR οδήγησε σε μειωμένη χρώση ΗΑ (Σχήμα 2Β). Αυτό μπορεί να οφείλεται σε μειωμένη σταθερότητα, ή να μειώνεται η πρόσβαση στο ΗΑ-tag σε αυτή τη μορφή. Λειτουργική πειράματα πραγματοποιήθηκαν δίπλα, και υπήρχαν σαφείς διαφορές στις ικανότητες των παραλλαγών αποστάτη για να μεσολαβήσει κυτταροτοξικότητα, απελευθέρωση κυτοκίνης και τον πολλαπλασιασμό σε απόκριση προς κύτταρα Lan-1. PBMCs μεταγωγή με οποιοδήποτε από τα αυτοκίνητα παραλλαγή αποστάτη εμφανίζεται κυτταροτοξικότητα προς Lan-1 κύτταρα? Ωστόσο, υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ της αποτελεσματικότητας ανάλογα με αποστάτη. CAR εκφράζουν το CH2-CH3 αποστάτη ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματικό από το μεντεσέ /κοτσάνι (Ρ = 0,009) και του μεντεσέ (p = 0,0003), αν και η τάση για αυξημένη θανάτωση σε σύγκριση με το κοτσάνι ήταν μη σημαντικές. Κανένα από τα παραλλαγή CARs αποστάτη μεσολάβηση οποιαδήποτε θανάτωση των αρνητικών κυττάρων Α204 GD2 (Σχήμα 2C). Διαφορές παρατηρήθηκαν επίσης στην ικανότητα των άλλων παραλλαγών αποστάτη να διεγείρει την παραγωγή της IFN-γ ή IL-2 μετά από καλλιέργεια με κύτταρα LAN1. CH2CH3 spacer επαγόμενη με συνέπεια τόσο από τις κυτοκίνες, και ήταν σημαντικά καλύτερη από μεντεσές για παραγωγή ΙΡΝ-γ (ρ & lt? 0,003, σχ 2D), και σημαντικά καλύτερη από μεντεσές /κοτσάνι (ρ & lt? 0,03) και άρθρωσης (ρ & lt? 0.006) για IL -2 παραγωγής (Σχήμα 2Ε). Με την εξαίρεση της παραλλαγής μεντεσέ όλοι οι υποδοχείς φάνηκε συγκρίσιμη σε σχέση με την ικανότητά τους να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε απόκριση προς GD2 φέρουν LAN1 παρά τη σημαντική διακύμανση μεταξύ των δοτών (Εικ 2F). Τ-κύτταρα που εκφράζουν την παραλλαγή του μεντεσέ έδειξε μικρή ανιχνεύσιμη πολλαπλασιασμός, η οποία είναι σύμφωνη με την μειωμένη ικανότητα αυτού του υποδοχέα να μεσολαβήσει την αποδέσμευση της IL-2. Συνολικά, η περιοχή IgG Fc φαίνεται να είναι η βέλτιστη αποστάτη για το αυτοκίνητο GD2 και χρησιμοποιείται αυτή τη μορφή του υποδοχέα στις επόμενες βελτιστοποιήσεις.

Ενισχυμένη λειτουργία CAR μέσω τροποποίησης της Spacer

Μια φυσιολογική λειτουργία του CH2 -CH3 περιοχή της Fc περιοχής των ανοσοσφαιρινών είναι η σύνδεση των υποδοχέων Fc στον ανοσολογικά δραστικά κύτταρα. Το ανθρώπινο IgG1 CH2-CH3 αποστάτη χρησιμοποιηθεί στο αυτοκίνητο GD2 είναι ο φυσικός συνδέτης για υψηλής συγγένειας ΡογΚΙ (CD64) που εκφράζεται σε έμφυτη τελεστές όπως τα μακροφάγα και μονοκύτταρα. Ως εκ τούτου, υπάρχει ένας θεωρητικός κίνδυνος εμπλοκής του CAR εκφράζουν Τ κυττάρων με μυελοειδή κύτταρα με δέσμευση του CD64 με αποτέλεσμα τόσο μακριά τοξικότητα στόχος μυελοειδή κύτταρα, και της εκτροπής του αυτοκινήτου Τ κυττάρων από την προβλεπόμενη λειτουργία δράστη τους. Πράγματι, αυτό το φαινόμενο των αυτοκινήτων περιέχει IgG1 CH2-CH3 αποστάτες έχει προηγουμένως αναφερθεί [16,17]. Τα κρίσιμα αμινοξέα για την αναγνώριση IgG1 κατοικούν στο πεδίο CH2 (PELLGG και ISR μοτίβα [18]), και Hombach et al έχουν δείξει ότι η αντικατάσταση αυτών των βασικών αμινοξέων με τα αντίστοιχα αμινοξέα από IgG2 στο πλαίσιο της κατασκευής αυτοκινήτων, δεν έχει καμία ανασταλτική δράση in vitro ενός CD30 στόχευσης CAR, αλλά εμποδίζει off λύση στόχος των κυττάρων CD64 εκφράζουν ΤΗΡ 1 [16]. Ως εκ τούτου, έχουμε μεταλλαχθεί η PELLGG και ISR κατάλοιπα σύμφωνα με την προσέγγιση της Hombach et al (Σχήμα 3Α) και αποδεικνύεται ισοδύναμη έκφραση στα κύτταρα Τ από αυτοκίνητο που μετέφερε το CAR μεταλλαγμένο (εν συντομία PVAA) (Σχήμα 3Β). Η PVAA-μεταλλαγμένο CAR διατηρούνται αντιγόνο συγκεκριμένη λειτουργία τελεστή εναντίον κυττάρων Supt1 τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν GD2 σε φωτεινά επίπεδα (Σχήμα 3C). Ενώ το CAR PVAA περιέχουν λύονται GD2 εκφράζουν LAN1 κυττάρων με ισοδύναμη αποτελεσματικότητα με άγριου τύπου, το CAR PVAA είχε μειωθεί σημαντικά μακριά κυτταρόλυση στόχου κατά CD64 εκφράζουν ΤΗΡ1 κύτταρα (p = 0,0005 Σχήμα 3D). Ομοίως, ενώ συν-καλλιέργεια των WT-CAR Τ κυττάρων με κύτταρα ΤΗΡ1 οδήγησε σε μέση ανιχνεύσιμο IL-1β σε υπερκείμενο του 886pg /ml, αυτό μειώθηκε σε τιμές που δεν ήταν πάνω από το υπόβαθρο με PVAA περιέχουν CAR (Σχήμα 3Ε). Συνεπώς, η ενσωμάτωση μιας μετάλλαξης για την πρόληψη της δέσμευσης του υψηλής συγγένειας ΡογΚ αποφεύγει off τοξικότητα στόχου από το GD2-CAR.

(α) αλληλουχία αμινοξέων του άγριου τύπου (επάνω) και μεταλλαγμένου (PVAA) CH2 περιοχές υπεύθυνες για ΡογΚ δεσμευτική. (Β) να ρέει από χρώση με αντι-Ρο αντίσωμα για να δείξει συγκρίσιμα επίπεδο έκφρασης του υποδοχέα, με ή χωρίς τη μετάλλαξη PVAA. Ταυτόσημα αυτοκίνητα με και χωρίς PVAA συγκρίθηκαν δίπλα-δίπλα σε όρους κυτταροτοξικότητα εναντίον GD2 μηχανικής Supt1 και GD2 αρνητικές άγριου τύπου SipT1 κύτταρα (γ), η κυτταροτοξικότητα έναντι GD2 θετικά κύτταρα LAN1 και ΡοΚγ θετικά κύτταρα ΤΗΡ-1 (δ), και IL- απελευθέρωση 1β για τον πολιτισμό με ΤΗΡ-1 κύτταρα (ε). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές +/- SEM από 4 ανεξάρτητα πειράματα με διαφορετικούς δότες.

Η

Βελτιστοποίηση της συν-έκφραση με την αυτοκτονία του γονιδίου

Αν και παρέχοντας ένα ισχυρό πιθανή θεραπεία για τον καρκίνο, κασέτα Τ κύτταρα έχουν την ικανότητα να διαμεσολαβούν δυνητικά θανατηφόρες ανεπιθύμητες ενέργειες. GD2 στόχευση μπορεί να οδηγήσει σε σχετικά στοχευόμενα τοξικότητα εκτός του όγκου που προκαλείται από κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα έκφρασης GD2. Ένα μέσο για τη διαγραφή επιλεκτικά CAR Τ-κύτταρα στο πρόσωπο του μη αποδεκτής τοξικότητας είναι επιθυμητή. Για να επιτευχθεί αυτό, συν-εξέφρασαν την επαγώγιμη κασπάση 9 (iCasp9) γονίδιο αυτοκτονίας [11]. Συν-έκφραση της Κεντροαφρικανικής και iCasp9 χρησιμοποιούσε την αυτο-διάσπαση του αφθώδους πυρετού-2Α σαν ακολουθία TAV

13. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα υποχρεωτικά 1: 1 συν-έκφραση του CAR με γονίδιο αυτοκτονίας. Δεδομένου ότι ρετροϊική αποτελέσματα έκφρασης σε μια κανονική κατανομή της έντασης της έκφρασης, ένα ζήτημα είναι διαφυγή του χαμηλού επιπέδου iCasp9 εκφράζουν CAR Τ-κύτταρα. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα iCasp9 μπορεί να είναι basally τοξικά. Κύτταρα που εκφράζουν iCasp9 χαμηλού επιπέδου μπορούν να επιβιώσουν ενεργοποίηση γονιδίων αυτοκτονίας, γι ‘αυτό προσπάθησε να επιτύχει ομοιογενές φωτεινό έκφραση της Κεντροαφρικανικής και iCasp9, παρά την πρόσθετη μεταγραφική επιβάρυνσης που η 1.5 kb iCasp προσθέτει στο φορέα, και να δείξει ότι iCasp9 δεν ήταν basally τοξική σε επιτευχθούν επίπεδα έκφρασης. Εμείς τροποποιημένα τον φορέα και ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης ως εξής: διάνυσμα 3’LTR U3 τροποποιήθηκε ώστε να περιλαμβάνει το κοτόπουλο β-σφαιρίνης χρωματίνης μονωτής [19]. Η περιοχή σύνδεσης ικριώματος από το ανθρώπινο γονίδιο ιντερφερόνης-β εισήχθη εντός του 3’UTR [20] (Εικόνα 4Α). Δημιουργήσαμε επίσης κατασκευάσματα με τις δύο τροποποιήσεις μαζί αλλά οι τίτλοι ήταν πολύ χαμηλή για να είναι χρησιμοποιήσιμα και δεν δοκιμάστηκαν περαιτέρω (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, ολόκληρο το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης είχε βελτιστοποιηθεί με κωδικόνιο. Τέλος, για να εξασφαλιστεί ότι iCasp9 δεν είχε ως αποτέλεσμα βασικά τοξικότητα σε υψηλά επίπεδα έκφρασης δημιουργήσαμε μία μη λειτουργική μετάλλαξη με τη κυστεϊνη δραστικής θέσης μεταλλαγμένο σε σερίνη (Σχήμα 4Α). Τα PBMC μεταγωγή με ίσο τίτλους ρετροϊικού υπερκειμένου για κάθε υποδοχέα και έκφραση παρακολουθήθηκε 72 ώρες μετά την μεταγωγή με κυτταρομετρία ροής. Η μέση ένταση φθορισμού της κάθε παραλλαγής συντηγμένο με το μη λειτουργικό iCasp9 είναι ελαφρώς μεγαλύτερη από την αντίστοιχη μη βελτιστοποιημένο υποδοχέα που συνδέεται με μία λειτουργική iCasp9, υποδεικνύοντας ιδιαίτερα κύτταρα που εκφράζουν μπορεί να χαθούν λόγω της ακατάλληλης, μη-ειδική ενεργοποίηση του iCasp9 (Εικ 4Β και 4C)

(α) Εννέα διαφορετικές κασέτες έκφρασης συγκρίθηκαν:. Τρεις διαφορετικές ρετροϊικοί φορείς παράχθηκαν-άγριου τύπου SFG, SFG με περιοχή ικριώματος-προσκόλλησης (SAR) που εισάγεται στην 3’UTR και SFG με CHS4 εισάγεται μέσα στην περιοχή 3’LTR U3. (Φορείς ρετροϊών τόσο με SAR και CHS4 παρήχθησαν, αλλά παράγεται τίτλους πολύ χαμηλή φορέα και δεν συγκρίθηκαν περαιτέρω)? Σε αυτούς τους φορείς ρετροϊών εισήχθησαν άγριου τύπου iCasp9-2A-huK666 κατασκευάσματα CAR και εισήχθησαν iCasp9 σε 3 μορφές? βελτιστοποιημένων κωδικονίων, άγριου τύπου, και με την καταλυτική περιοχή μεταλλαχθεί. (Β) Histogrammes την ημέρα 3 μετά την μεταγωγή (μπλε γραμμές). επιστρώνονται Τ-κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 20ηΜ CID εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα. Bargraphs των ΝΧΙ των κυττάρων απουσία του CID κατά την ημέρα 3 (γ) και (δ) την ημέρα 7. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές +/- SEM από 5 ανεξάρτητα πειράματα με διαφορετικούς δότες.

Η

Για την αξιολόγηση οι επιδράσεις των τροποποιήσεων φορέα επί περισσότερο παρατεταμένες περιόδους, σε μεταγωγή PBMCs μετά καλλιεργήθηκαν για συνολικά 7 ημέρες. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου καλλιέργειας που σημειώνεται απόκλιση μείωση στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των 3 ομάδων: το μη τροποποιημένο (δεν SAR /CHS) και CHS υποδοχείς παρουσίασαν σημαντική μείωση των ΝΧΙ μέχρι που κυμαίνονται 22,4 έως 49,5% σε σύγκριση με την ημέρα 3 ΝΧΙ (Σχήμα 4D σύγκριση με το σχήμα 4C). Αυτή η μείωση στην έκφραση αναμενόταν και είναι πιθανόν να οφείλεται σε ανταπόκριση του MoMLV LTR για κατάσταση ενεργοποίησης των Τ-κυττάρων. Μετά από παρατεταμένη 7 ημέρες πολιτισμό η MFI των φορέων που περιέχουν SAR ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι umodified. Αυτή η μείωση στην έκφραση ήταν σημαντικά λιγότερο έντονη για τους υποδοχείς SAR-που περιέχει (ρ & lt? 0,02 για μη βελτιστοποιημένων κωδικονίων? Βλέπε Σχ 4D), υποδεικνύοντας ότι ο SAR λειτουργεί για την πρόληψη της προς τα κάτω ρύθμιση των GD2 αυτοκίνητα. Το φαινόμενο της κάτω MFI την ημέρα 7 σε σύγκριση με την Ημέρα 3 παρατηρείται εξίσου σε φορείς που περιέχουν ή δεν περιέχουν το C έως S μετάλλαξη που υποδηλώνει ότι η μη ειδική ενεργοποίηση του γονιδίου αυτοκτονίας δεν είναι υπεύθυνη για αυτή τη σίγηση.

Μετά επώαση με CID τα επίπεδα έκφρασης CAR ζώντων PBMCs αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 4Β). Όπως ήταν αναμενόμενο οι μεταλλαγμένους υποδοχείς C-προς-S ήταν ανθεκτικοί στη θεραπεία CID. Ούτε κωδικόνιο-βελτιστοποίηση ούτε συμπερίληψη της αλληλουχίας επηρεάζεται απόκριση CID SAR, αλλά η αλληλουχία CHS4 φάνηκε να οδηγεί σε μεγαλύτερα επίπεδα σε μεταγωγή κυττάρων Τ διαφυγή θεραπεία CID (Σχήμα 4Β). Διαφυγής από ενεργοποίηση γονιδίων αυτοκτονίας φάνηκε να παρατηρούνται κυρίως τα χαμηλά CAR-εκφραστές και αυτό ήταν σύμφωνο με την χαμηλότερη συνολική έκφραση που παρατηρήθηκε για τους υποδοχείς CHS4. Ενώ ένας πολύ μικρός αριθμός των υπολειμματικών CAR-εκφράζουν τα Τ κύτταρα ήταν ανιχνεύσιμα στο μη τροποποιημένο και SAR ομάδες μετά τη θεραπεία CID, δεν είναι σαφές εάν τα κύτταρα διατηρούν επαρκή έκφραση CAR για την εμφάνιση δραστικότητας.

Ως εκ τούτου, από την άποψη της έκφρασης , τη σταθερότητα και την απόκριση σε CID, το κωδικόνιο βελτιστοποιημένο SAR-υποδοχέα που περιέχει (iCasp-HUK) εκτελείται το καλύτερο και αυτό υποδοχέα σε σύγκριση με τον αρχικό CAR HuK666 για την ικανότητά της να προκαλεί κυτταροτοξικότητα και την απελευθέρωση κυτοκινών σε απόκριση σε κύτταρα LAN1 (σχήμα 5 ). Τα μετατραπέντα PBMCs επωάστηκαν για 72 ώρες απουσία ή παρουσία 10 nm CID και στη συνέχεια συν-καλλιεργήθηκαν με Lan-1 ή Α204 κύτταρα. Ένα παράδειγμα της έκφρασης αυτών των αυτοκινήτων στην παρουσία και απουσία του CID φαίνεται στο Σχήμα 5Α. Επίπεδα έκφρασης HuK666-iCasp9 ήταν ουσιαστικά εξαλειφθεί από την επαγωγή της iCasp9 (Σχήμα 5Α).

Η ΕΔΠ βελτιστοποιημένων κωδικονίων κασέτα λήφθηκε περαιτέρω και σε σύγκριση με την αρχική κασέτα χωρίς iCasp9. (Α) Έκφραση του αυτοκινήτου ήταν αμετάβλητη. Η εξάντληση δείχνεται με FACS μετά την προσθήκη του CID. Η λειτουργία των κασετών με και χωρίς iCasp9 αξιολογήθηκαν από (β) ελευθέρωση Killing (γ) ΙΡΝ-γ και την απελευθέρωση (δ) IL-2. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές +/- SEM από 4 ανεξάρτητα πειράματα με διαφορετικούς δότες.

Η

HuK666 μεταγωγή PBMCs εμφανίζονται συγκρίσιμα επίπεδα κυτταροτοξικότητας και την απελευθέρωση κυτοκινών σε απόκριση σε κύτταρα LAN1 ανεξαρτήτως της προηγούμενης καλλιέργειας με CID. Σε περίπτωση απουσίας του CID το κατασκεύασμα HuK666-iCasp9 εκτελούνται καθώς και τον υποδοχέα που δεν έχει το γονίδιο αυτοκτονίας. Ωστόσο, ένα 72-hr προεπεξεργασία με CID κατάργησε την απελευθέρωση κυτοκινών από (Σχ 5C και 5D) και την κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 5Β) Τ κύτταρα που εκφράζουν HUK-iCasp9.

In vivo

λειτουργία της κασέτας iCasp9-CAR

για να επιβεβαιωθεί ότι η αποτελεσματικότητα και η ειδικότητα της συν-εκφράζεται βελτιστοποιημένο γονίδιο CAR και την αυτοκτονία που παρατηρήθηκε in vitro ήταν πιθανό να ισοδυναμεί με την κλινική αποτελεσματικότητα αξιολογήσαμε την κασέτα iCasp9-CAR σε ένα φυσιολογικό ανοσοποιητικό σύστημα μοντέλο ποντικού. Το αντιγόνο GD2 είναι ένα γαγγλιοσίδιο ταυτόσημων χημικής δομής μεταξύ των ειδών έτσι ώστε η ScFv huK666 ScFv δεσμεύει GD2 εξίσου σε κύτταρα ποντικού και ανθρώπου. Κάναμε χρήση του ασθενώς ανοσογονικών CT26 καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή, η οποία σχηματίζει με συνέπεια οι όγκοι υποδορίως σε ποντικούς Balb /c. κύτταρα CT26 υπέστησαν μεταγωγή με ένα gammaretrovirus κωδικοποιεί GD2 και GD3 συνθετάσες, και ένας κλώνος (αριθμός 7) με φωτεινή έκφραση GD2 επιλέχθηκε για την ανάλυση του GD2 στόχευση από το GD2-CAR σε ανοσοεπαρκείς μοντέλο (S1 Εικ). CT26-κλώνου 7 κυττάρων που επάγεται ειδική απελευθέρωση της IL-2 και ΙΡΝ-γ μετά την συν-καλλιέργεια με σπληνοκύτταρα μεταγωγή με GD2-CAR (S2 Εικ). In vivo, CT26-GD2 κλώνος 7 προερχόμενα όγκοι αποτελεσματικά εξαλειφθεί με το αυτοκίνητο μετάγονται σπληνοκύτταρα σε αντίθεση με αρνητικά κύτταρα CT26 GD2 που αυξήθηκαν με τον ίδιο ρυθμό όπως οι όγκοι σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με μη μεταδιηγερμένα κύτταρα σπλήνας (Σχήμα 6).

Balb-C ποντίκια innocultaed με 1×10

6 CT26 ή CT26-GD2 κυττάρων αναμειγνύονται σε matrigel. 10 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου, οι ποντικοί ήταν υπο-θανατηφόρα ακτινοβολημένων (200 rads) και δύο εβδομάδες μετά την ένεση του όγκου, τα ποντίκια ενδοφλεβίως μεταμοσχεύθηκαν με συνολικά 1.5×10

6 μετάγονται σπληνοκυττάρων ή όχι μεταγωγή ελέγχων από ένεση στην φλέβα της ουράς. Άγριου τύπου CT26 χρησιμοποιήθηκαν ως αντιγόνο αρνητικοί μάρτυρες (α, γ) ενώ CT26 -GD2 όγκοι αντιμετωπίζονται με μη μεταδιηγερμένα κύτταρα Τ (β) δεν υποχωρούν, ενώ CT26-GD2 όγκους που προκλήθηκαν με CAR Τ κύτταρα εξασθενήσει. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει ένα ποντίκι.

Η

Συζήτηση

υψηλού κινδύνου νευροβλάστωμα αποτελεί ένα άλυτο κλινικό πρόβλημα. όγκους νευροβλαστώματος εκφράζουν την diasialoganglioside GD2 άφθονα και παντού. GD2 είναι ένα από τα λίγα αντιγόνων στερεού όγκου με σχετικά μικρή έκφραση σε άλλους ιστούς, ειδικά την έκφραση GD2-χαμηλό επίπεδο σε περιφερικά νεύρα, καθιστώντας GD2 ένας ελκυστικός στόχος για θεραπεία CAR. Μια μελέτη των Τ-κυττάρων νωρίς CAR GD2 Διεξήχθη η οποία συνέκρινε EBV-CTLs και το περιφερικό αίμα Τ-κύτταρα μετάγονται με τα αυτοκίνητα στον ίδιο ασθενή. Οι απαντήσεις ήταν παροδικές και μόνο χαμηλού επιπέδου εμμονή του CAR Τ-κυττάρων παρατηρήθηκε [8].

Ο ενδεχόμενος περιορισμός της μελέτης αυτής ήταν η χρήση ενός υποδοχέα πρώτης γενιάς [21], το οποίο μεταδίδει μόνο ανοσολογικό σήμα 1 κατά απολίνωση. έχουν τα αυτοκίνητα δεύτερης γενιάς έχουν περιγραφεί, η οποία διαβιβάζει επίσης συν-διεγερτικά σήματα [22]. Ένα διπλό σύγκριση σήμανση του πρώτου και το δεύτερο αυτοκίνητο γενιάς υποδηλώνει ανωτερότητα του τελευταίου [9]. Πράγματι, ένας αυξανόμενος όγκος των κλινικών δεδομένων με τα αυτοκίνητα δεύτερης γενιάς που στοχεύουν CD19 θεραπεία Τ-κυττάρων CAR στη Β-κυτταρικές κακοήθειες επιβεβαίωσε την ανωτερότητα των αυτοκινήτων δεύτερης γενιάς [23,24]. Εδώ, έχουμε ενσωματώσει μια endodomain που μεταδίδει δύο συν-διεγερτικών σημάτων, ένα κάθε από την Ig υπεροικογένεια συν-υποδοχέα της οικογένειας (CD28) και η οικογένεια οικογένεια συν-υποδοχέα του TNF (ΟΧ40).

Αύξηση κλινική εμπειρία έχει αποδείξει ότι τα αυτοκίνητα που ενσωματώνουν περιοχές δέσμευσης που προέρχεται από αντισώματα ποντικού μπορούν να προκαλέσουν σοβαρές αντιδράσεις σε ασθενείς, που μπορούν να συμβάλουν στην ενίσχυση της εκκαθάρισης των μετάγονται Τ κυττάρων και ενεργοποίηση αυτοκίνητο με σημαντική τοξικότητα [25,26]. Αυτό το ενδεχόμενο είναι πιο πιεστική στο Νευροβλάστωμα: Επειδή η θεραπεία με αντι-GD2 mAb είναι πλέον πρότυπο-of-care, πολλοί ασθενείς θα έχουν εκτεθεί στο χιμαιρικό 14-18 mAb. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτά τα θεραπευτικά αντισώματα που προέρχονται από τον ίδιο κλώνο με το αυτοκίνητο χρησιμοποιείται από Pule et al. έχουν τα αυτοκίνητα που περιέχουν 14,18-based scFv δειχθεί πρόσφατα να οδηγήσει σε τονωτικό σηματοδότησης επαρκή για την αναστολή της λειτουργίας [27]. Ως εκ τούτου, επιχειρήσαμε να αντιμετωπίσουν την πιθανότητα τόσο προ-σχηματισμένα και CAR-επαγόμενη αντι-ιδιότυπου και αντι-ποντικού απόκριση πλαίσιο. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται ένα διαφορετικό οικογένεια συνδετικό υλικό, το οποίο ήταν εξανθρωπισμένο.

Η λειτουργία του υποδοχέα και η επιλογή του σωστού αποστάτη μπορεί να είναι σημαντική για την κλινική αποτελεσματικότητα [13,14,21,28]. Guest et al έχουν ερευνήσει το πώς η αλληλουχία της λειτουργίας αποστάτη και CAR φαίνεται να σχετίζεται με την απόσταση της θέσης σύνδεσης υποδοχέα στο αντιγόνο-στόχο από την κυτταρική μεμβράνη στόχο [13]. Οι συγγραφείς σημειωθεί ότι στην περίπτωση του NCAM και 5Τ4, αντιγόνα στα οποία το επιτόπιο CAR βρίσκεται δίπλα στην μεμβράνη, συγγενές αυτοκίνητά τους απαιτείται η παρουσία ενός Fc αποστάτη για τη βέλτιστη λειτουργία. Η απομάκρυνση αυτού του αποστάτη είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της έκκρισης κυτταροτοξικότητα και ΙΡΝ-γ από τα Τ κύτταρα σε μεταγωγή σε απόκριση προς κύτταρα όγκου που εκφράζουν αντιγόνο. Το αντίθετο εμφανίστηκε αλήθεια στην περίπτωση του CD19 και CEA, αμφότερα τα αντιγόνα στην οποία η θέση CAR-δέσμευσης είναι πιο μακριά από τη μεμβράνη. CARs που κατευθύνονται έναντι αυτών των δύο τελευταίων αντιγόνα εμφάνισε μειωμένη απόκριση IFN-γ, εφόσον περιείχαν την Fc αποστάτη, αν και κυτταροτοξικότητα ήταν ανεπηρέαστη. Hudecek κ.ά. στα μοντέλα ROR-1 και CD19 έχουν προτείνει ότι η βέλτιστη διάρκεια και η ευελιξία του αποστάτη εξαρτάται επίσης από τη θέση ενός επίτοπο στόχο σε σχέση με την επιφάνεια του κυττάρου [14,28].

Παρατηρήσαμε ότι μεταβολή του αποστάτη σε GD2 CAR μας οδήγησε σε μεταβολές στην κυτταροτοξική δυναμικό και την έκκριση κυτοκίνης μεταγωγή PBMCs. Συνολικά, το Fc αποστάτη έδωσε την βέλτιστη απόκριση, ενώ δύο παραλλαγές του υποδοχέα που περιέχει το στέλεχος CD8 εμφανίστηκε υπο-βέλτιστη όσον αφορά την κυτταροτοξικότητα και την απελευθέρωση IL-2, αν και παρατηρήθηκαν με συνέπεια ο μίσχος-παραλλαγή μεταγωγή PBMCs να εκκρίνουν υψηλότερα επίπεδα IFN-γ κατά την διέγερση από PBMCs σε μεταγωγή με την παραλλαγή Fc. Η έλλειψη συσχετισμού μεταξύ κυτταροτοξικότητας, του πολλαπλασιασμού και της έκκρισης κυτοκίνης για ορισμένα κατασκευάσματα υποδοχέα έχει αναφερθεί προηγουμένως [13] [29,30]. επίπεδα Μεταγωγή ήταν σταθερά ίσες για όλες τις παραλλαγές αποστάτη και αυτό δεν φαίνεται να αντιπροσωπεύουν παρατηρούμενες διαφορές στη λειτουργία εκτός από την περίπτωση της παραλλαγής άρθρωσης, η οποία ασθενώς εκφράζεται στην κυτταρική επιφάνεια των μετατραπέντων κυττάρων, και εμφανίζεται μικρή ή καθόλου αντιδραστικότητα εναντίον του όγκου κύτταρα σε οποιαδήποτε από τις μετρούμενες παραμέτρους. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην περιορισμένη πρόσβαση του αντισώματος ανίχνευσης αντι-ΗΑ προς την ετικέτα ΗΑ στον υποδοχέα μεντεσέ ή σε μειωμένη σταθερότητα στην επιφάνεια του κυττάρου, αν και αυτή η διαμόρφωση του υποδοχέα έχει παρατηρηθεί να είναι λειτουργικό σε άλλα συστήματα [13,21]. Ενσωματώνοντας την περιοχή άρθρωσης στην παραλλαγή στέλεχος εμφανίστηκε αρνητικά να επηρεάζει τη λειτουργία του υποδοχέα και βελτιώνεται η έκκριση κυτοκινών σε σύγκριση με το κοτσάνι και μόνο. Έχει προταθεί ότι το βασικό χαρακτηριστικό της περιοχής διαχωρισμού για να καθοριστεί η λειτουργία είναι η ευελιξία, που επιτρέπει το πεδίο σύνδεσης για πρόσβαση στο αντιγόνο-στόχο. Μια πιθανότητα είναι ότι η συμπερίληψη του τμήματος άρθρωσης μπορεί να μειώσει την ευελιξία του υποδοχέα και ότι αυτό μπορεί να ξεπεράσει οποιοδήποτε όφελος που προέρχεται από μια μικρή αύξηση στο μήκος του υποδοχέα.

Τελικά, έχουμε επιλέξει την παραλλαγή Fc-αποστάτη ως βέλτιστη στα χέρια μας και πήρε αυτό προς τα εμπρός για περαιτέρω έρευνα. Ωστόσο, ένα ζήτημα που έχει σημειωθεί με τα αυτοκίνητα που περιέχει την IgG Fc είναι η σύνδεση της περιοχής με τους υποδοχείς Ρογ (ΡογΚ) στα κύτταρα του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος με αποτέλεσμα την ακατάλληλη ενεργοποίηση off-στόχο των μετάγονται Τ κυττάρων [16,17]. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.