Αφηρημένο

Η ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξή τους κατά τη διάρκεια της νόσου προτρέπει την ανάγκη για πραγματικό χρόνο χαρακτηρισμό των επιμέρους καρκινικά κύτταρα για τη βελτίωση της αξιολόγησης των θεραπευτικών επιλογών. Νέες γενιές θεραπείες συχνά σχετίζονται με συγκεκριμένες γενετικές μεταβολές οδήγηση την ανάγκη να προσδιοριστεί η γενετική σύσταση των κυττάρων του όγκου. Εδώ, παρουσιάζουμε ένα microfluidic συσκευή για την παράλληλη ολόκληρο ενίσχυση γονιδίωμα ενός κυττάρου (pscWGA) για να ληφθούν αρκετά αντίγραφα μιας γονιδιώματος του κυττάρου για την ανίχνευση της παρουσίας των στόχων της θεραπείας και τη συχνότητα εμφάνισης της μεταξύ των κυττάρων του όγκου. Μεμονωμένα κύτταρα πρώτα συλλαμβάνονται και φορτώθηκαν σε οκτώ μονάδες παράλληλο ενίσχυσης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα λύθηκαν σε μια μάρκα και το DNA τους ενισχύθηκαν μέσω διαδοχικών εισαγωγή ειδικών αντιδραστηρίων κατά την ανάμιξη ενεργά με τη βοήθεια του ολοκληρωμένου κουμπιού βαλβίδες. Ο όγκος του θαλάμου αντιδράσεως για scWGA 23,85 NL, και ξεκινώντας από 6-7 pg DNA που περιέχεται σε ένα μόνο κύτταρο, περίπου 8 ng του DNA ελήφθη μετά WGA, που αντιπροσωπεύουν πάνω από 1000 φορές ενίσχυση. Τα ενισχυμένα προϊόντα από μεμονωμένες κύτταρα καρκίνου του μαστού συλλέχθηκαν από τη συσκευή για να είτε άμεσα διερευνήσει την ενίσχυση συγκεκριμένων γονιδίων με qPCR ή για την εκ νέου ενίσχυση του DNA για να ληφθεί επαρκές υλικό για αλληλούχιση ολόκληρο το γονιδίωμα. συσκευή pscWGA μας παρέχει επαρκή DNA από μεμονωμένα κύτταρα για γενετική χαρακτηρισμό τους, και θα επιτρέψει αναμφίβολα για την αυτοματοποιημένη προετοιμασία του δείγματος για το ενιαίο των καρκινικών κυττάρων χαρακτηρισμός του γονιδιώματος

Παράθεση:. Yang Υ, Swennenhuis JF, Rho ΕΣ, Le Gac S, Terstappen LWMM (2014) Παράλληλη Ενιαία Cancer Cell ολόκληρο το γονιδίωμα ενίσχυσης χρησιμοποιώντας Υποβοηθούμενη Button-βάνα ανάμιξης στην νανολίτρου Επιμελητήρια. PLoS ONE 9 (9): e107958. doi: 10.1371 /journal.pone.0107958

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 30 Απρ 2014? Αποδεκτές: 16 Αυγούστου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 18η Σεπτεμβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτείται από NanoNextNL, σε πολύ μικρές και νανοτεχνολογίας κοινοπραξία της κυβέρνησης των Κάτω Χωρών και 130 συνεργάτες. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η μελέτη χρηματοδοτείται από NanoNextNL, σε πολύ μικρές και νανοτεχνολογίας κοινοπραξία των εταιρειών, των πανεπιστημίων, ιδρύματα γνώσης και πανεπιστημιακά ιατρικά κέντρα. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Για τον χαρακτηρισμό των όγκων, η έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνών ή γονιδίων συνήθως παρέχεται ως παρούσα ή απούσα, για παράδειγμα, ER + ή ΕΚ-, HER2 + ή HER-και EGFR μετάλλαξη που υπάρχει ή απουσιάζει. Ο προσδιορισμός αυτός έχει σημαντικές συνέπειες για τις άμεσες θεραπευτικές αποφάσεις και να υποβάλλουν τους ασθενείς σε συγκεκριμένες θεραπείες. Για παράδειγμα, οι ασθενείς των οποίων τα κύτταρα του καρκίνου έχουν ενίσχυση του γονιδίου ERBB2 (Her2) είναι πιο πιθανό να ωφεληθούν από Her2 στόχευση φαρμάκων όπως Trastuzumab. [1] Δυστυχώς, οι όγκοι είναι πολύ πιο πολύπλοκα: επίπεδα έκφρασης μπορεί να ποικίλει ευρέως εντός ενός όγκου και μπορούν να αλλάξουν κατά τη διάρκεια της πορείας της νόσου. [2] – [4] Για παράδειγμα, σωματικές μεταλλάξεις μπορεί να είναι παρούσα μόνο σε ένα μικρό υποσύνολο των κυττάρων του όγκου του όγκου [5] και μπορεί να γίνει ανθεκτικός σε θεραπεία που σχετίζεται με γενετικές αλλοιώσεις. Να αποδείξει την ύπαρξη και την έκταση αυτής της ετερογένειας στην ανάλυση καρκινικών κυττάρων στο επίπεδο του ενός κυττάρου απαιτείται δεν πρέπει να χάσετε αυτό το σημαντικό πληροφορίες [5] – [7].

Για να διερευνήσουν το γονιδίωμα ενός απλού κυττάρου σε ένα εκτεταμένη και αξιόπιστο τρόπο, ολόκληρο το γονιδίωμα θα πρέπει να ενισχύεται ενώ διατηρείται η αρχική αναπαράσταση των γονιδίων για να εκτελέσει κατάντη ανάλυση όπως ο προσδιορισμός αλληλουχίας ολόκληρο το γονιδίωμα [6] – [8], η υβριδοποίηση array συγκριτική γονιδιώματος (aCGH) [9], [10] ή πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (RT-qPCR) [11], [12]. Κατά το χρόνο αυτό όλες αυτές οι τεχνικές απαιτούν δεκάδες νανο-γραμμάρια σε λίγα μικρο-γραμμάρια υλικού ολόκληρου του γονιδιώματος. ενίσχυση πολλαπλές μετατόπιση από φ 29 πολυμεράση είναι μία ελκυστική προσέγγιση για ολόκληρη την ενίσχυση του γονιδιώματος μόνο κύτταρο κάτω από ισοθερμικές συνθήκες. [13] ενίσχυση DNA χρησιμοποιώντας το ένζυμο phi29 έχει το πλεονέκτημα ότι μπορεί να παράγει κλώνους DNA μήκους (& gt? 10 kb) σε μεγάλες ποσότητες (μέχρι 1~2 μg) σε ένα σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα (2 ώρες). [14] – [16] Ωστόσο, η εξαιρετικά χαμηλή συγκέντρωση του DNA που βρέθηκαν σε ένα μόνο γονιδίωμα του κυττάρου στην ακόμα μεγάλο όγκο του μίγματος WGA (20-50 μΙ) συχνά οδηγεί σε μη ειδική ενίσχυση προκαταλήψεις και ενίσχυση. [17] – [19] Επιπλέον, η διαλογή και ο χειρισμός των μεμονωμένων κυττάρων για να εκτελέσει την ανάλυση μόνο κύτταρο μπορεί να είναι πολύ δύσκολο και κάθε χειρισμός μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια υλικού. Ο φθορισμός ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) [8], [20], μικροχειρισμού [10], [11], τη σύλληψη λέιζερ μικροανατομή (LCM) [9], [21] και DEP Array [22], [23] έχουν όλα εφαρμοστούν για την απομόνωση απλού κυττάρου, αλλά την επεξεργασία των κυττάρων για να ληφθεί DNA για μεταγενέστερους ανάλυση (π.χ. λύση, απομόνωση νουκλεϊκών οξέων και ενίσχυση) δεν έχει ή δεν μπορεί να ενσωματωθεί. Από την άλλη πλευρά, Microfluidics και μικρό-δομές επιτρέπουν την ενιαία χειρισμού των κυττάρων ενώ εύκολα συνδέεται με ένα μόνο βήμα ανάλυσης κύτταρο. [24] – [26] Επιπλέον, Microfluidics παρουσιάζει ένα-κλειδί πλεονέκτημα για WGA, αφού οι αντιδράσεις λαμβάνουν χώρα σε πολύ μικρότερες ποσότητες από ό, τι όταν χρησιμοποιείτε την παραδοσιακή πιπέτα και μικροσωληνίσκους (pico-λίτρων έναντι μικρο-λίτρα). Το πλεονέκτημα αυτό έχει ιδιαίτερα επισημανθεί για WGA του ενιαίου βακτηριακά κύτταρα χρησιμοποιώντας όγκους αντίδρασης 60 NL αποτέλεσμα χαμηλότερη υπόβαθρο και υψηλότερη κάλυψη με λιγότερη προκατάληψη ενίσχυση [27].

Σε microfluidic συσκευές, ανάμειξη εμφανίζεται φυσικά με παθητική διάχυση . Ειδικά η διάχυση των μεγάλων μορίων όπως phi29 πολυμεράση διαρκεί περισσότερο από μικρότερα μόρια και περιορίζει την αξιοπιστία και την ταχύτητα αντίδρασης στις μικρορροϊκές συσκευές. Περιστροφικό μίξερ έχει χρησιμοποιηθεί για να επιταχύνει αυτή τη διαδικασία ανάμειξης σε μικρορροϊκές συσκευές. [28], [29] Ωστόσο, το συνολικό μέγεθος των δομών αυτών περιορίζει τον αριθμό των παράλληλων αντιδραστήρων που μπορούν να τοποθετηθούν σε μια συσκευή και το μίγμα του δείγματος πρέπει να μεταφέρονται σε έναν άλλο αντιδραστήρα για το επόμενο στάδιο της ανάλυσης. Επιπλέον, η επιφάνεια του αντιδραστήρα είναι πολύ μεγαλύτερη, πράγμα που μπορεί να αυξήσει τα ζητήματα απώλεια δείγματος λόγω κολλήσει στα τοιχώματα του καναλιού. Εναλλακτικά, οι δομές της βαλβίδας μπορεί να εφαρμοστεί σε μια συνεχή αντιδραστήρα για την ενεργό ανάμιξη των αντιδραστηρίων.

Εδώ, έχουμε εισαγάγει μια microfluidic συσκευή για την παράλληλη μόνο κύτταρο WGA. Για επίδειξη μία συσκευή με 8 παράλληλους θαλάμους αντίδρασης σχεδιάστηκε και δοκιμάστηκε για να φορτώσει οκτώ μεμονωμένα κύτταρα όγκου τα οποία στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση υπό αλκαλικές συνθήκες που ακολουθείται από το στάδιο εξουδετέρωσης και WGA. DNA από μεμονωμένα κύτταρα ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας phi29 πολυμεράσης στον κλειστό θάλαμο PDMS για τους μεταγενέστερους ανάλυση off-chip. Κουμπί βαλβίδα υποβοηθούμενη ανάμιξη επιτυγχάνεται WGA μεμονωμένων καρκινικών κυττάρων με όγκο αντιδραστήριο του ~ 20 nl, σε σύγκριση με 20 μl σε παραδοσιακά WGA αντιδράσεις.

E.coli

DNA χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ως πρότυπο σύστημα για την προσαρμογή WGA χρησιμοποιώντας phi29 πολυμεράση, ακολουθούμενη από μεμονωμένα κύτταρα από κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού για καρκινικά scWGA. Ποιότητα της on-chip ενισχυμένου DNA εκτιμήθηκε με qPCR στόχευση 10 διαφορετικά γονίδια.

Πειραματικές Μέθοδοι

Chip Κατασκευή και συσκευή παρασκευής

Οι μικρορροϊκές συσκευές κατασκευάζονται από πολυστρωματικές μαλακό την τεχνική της λιθογραφίας. [30], [31] Κατ ‘αρχάς, τα σχέδια μάσκα ετοιμάστηκαν από το λογισμικό CleWin (λογισμικό WieWeb, Χένγκελο, NL) και εκτυπώνονται σε ένα ποτήρι ασβέστη 5 «σόδα από μια γεννήτρια μάσκα LBPG Χαϊδελβέργη DWL200 (Χαϊδελβέργη Όργανα Mikrotechnik GmbH). Ο πλοίαρχος καλούπια κατασκευάστηκαν με μία τεχνική φωτολιθογραφική φωτοανθεκτικού-based. Θετική photoresist (Ω 40 XT, MICROCHEM Corp.) επικαλύφθηκε διά περιστροφής πάνω σε μία γκοφρέτα 4 «πυρίτιο, και με σχέδια χρησιμοποιώντας φωτολιθογραφία. Για την αξιόπιστη λειτουργία των Μικροβαλβίδες, το σχήμα της διατομής του μικροκανάλια στην κύρια ρευστού κανάλια στρογγυλοποιήθηκε με θέρμανση του καλουπιού στους 140 ° C για μία min μετά την ανάπτυξη. Το άνω στρώμα ρευστού παρήχθη με χύσιμο μη σκληρυμένη PDMS (GE RTV 615, ελαστομερές: cross-συνδέτης = 5:01) επάνω στο καλούπι για να επιτευχθεί ένα πάχος 7 ± 0,5 mm. Το κάτω στρώμα ελέγχου έγινε με spin-επικάλυψη που δεν έχει ωριμάσει PDMS (ελαστομερές: σταυροειδών δεσμών = 20:01) επί της κύριας καλούπι στις 2500 rpm για 1 λεπτό. Το προκύπτον πάχος του στρώματος ελέγχου ήταν 25 ± 2 μm. Οι ρευστού και ελέγχου στιβάδες σκληρύνθηκαν για 45 λεπτά και 30 λεπτά, αντίστοιχα, στους 80 ° C. Το ρευστό στρώμα αποσπάται από το καλούπι και οπές για εισόδους και εξόδους κτυπήθηκαν με μια γροθιά 25-gauge (Syneo Co., Angleton, TX, USA). Στη συνέχεια, το ρευστό στρώμα ευθυγραμμισμένο πάνω από το στρώμα ελέγχου χρησιμοποιώντας τα σημάδια ευθυγράμμισης και στις δύο στρώσεις κάτω από ένα στερεομικροσκόπιο και τα ευθυγραμμισμένα στιβάδες συνδέονται με ψήσιμο τους στους 80 ° C για 60 λεπτά. Τα συνδεδεμένα στρώματα στη συνέχεια αποκολλάται από το καλούπι, και οπές για θύρες ελέγχου τρυπήθηκαν. Τέλος, η συσκευή PDMS πολλαπλών στρώσεων καλύφθηκε από ένα προ-καθαρίζονται γυάλινο πλακίδιο (Fisher Scientific, Landsmeer, NL) και διατηρούνται σε κλίβανο στους 80 ° C για 12 ώρες για να ενισχύσει την πρόσφυση. Πριν από τη χρήση οι συσκευές προ-επικαλυμμένες με ροή ενός διαλύματος BSA (0,5 mg /ml) μέσα από τα κανάλια για 20 λεπτά. BSA λύσεις ωθήθηκαν από τον αέρα.

ολόκληρο το γονιδίωμα Ενίσχυση

Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκε για WGA. Η λύση (400 mM ΚΟΗ, 10 mM EDTA, 100 mM DTT), εξουδετέρωση (0,4 ml 1 Μ HCl και 0,6 ml 1 Μ Tris · HCl, ρΗ 7,5), και ωθώντας ρυθμιστικά (1Χ Tris · EDTA, 0,2% Tween -20) εισήχθησαν στους ειδικούς εισόδους στη συσκευή. Η αντίδραση ενίσχυσης διεξήχθη σε AmpliSpeed ​​διαφάνεια ανακυκλωτή (Advalytix AG, Μόναχο, Γερμανία) για 2 σετ ώρες στους 34 ° C. Μετά την ενίσχυση, τα δείγματα συλλέχθηκαν από τους επιμέρους μονάδων ενίσχυσης και μεταφέρθηκαν σε μια πλάκα PCR ακολουθείται από ένα στάδιο απενεργοποίησης στους 65 ° C για 10 λεπτά. Για την εκ νέου ενίσχυση των ενισχυμένων δειγμάτων on-chip, 17 μΙ του μίγματος WGA προστέθηκε σε 1 μΙ on-chip ενισχυμένο δείγμα με βάση το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και η αντίδραση διεξήχθη στους 30 ° C σε Bio-Rad CFX 384 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA,) για 70 λεπτά. Αυτό ακολουθήθηκε από ένα στάδιο απενεργοποίησης στους 65 ° C για 10 λεπτά.

Η ποσοτικοποίηση και Αξιολόγηση

qubit 2.0 φθοριόμετρο και qubit dsDNA ΕΣ Assay Kit (Invitrogen, Breda, NL) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση dsDNA. Σε πραγματικό χρόνο SYBR πράσινο qPCR χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό ειδικού στόχου DNA. Για

E.coli

WGA, εκκινητές έναντι μικρής υπομονάδας (SSU), 369 bp, του γονιδίου 16 S rRNA χρησιμοποιήθηκαν σε μια συγκέντρωση 500 ηΜ. Για την ενίσχυση μόνο των καρκινικών κυττάρων, εκκινητές σχεδιάζονται για τη στόχευση μικρή υπομονάδα του GAPDH (12p3), erbB2 (17p12), CCND1 (11q13), myc (8q24.21), PRMT2 (21q22.3), URB2 (1q42.13), FGFR1 (8p12), Ρ53 (17ρ13.1), TRAM1 (8q13.3), και ΡΑΚ1 (11q13-q14) χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 500 nm.

Cell Culture και Προετοιμασία

Η κυτταρική γραμμή καρκίνου του μαστού, SKBR-3 (ATCCHTB-30) και MCF-7 (ATCCHTB-22) κύτταρα, καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (Sigma Aldrich, Zwijndrecht, NL), συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Sigma Aldrich), 2 mM L-γλουταμίνη (Sigma Aldrich), 1% Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (Sigma Aldrich) στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO2. Πριν από τον πειραματισμό, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με CellTracker Orange CMTMR (Molecular Probes, Breda, NL) στους 37 ° C για 30 λεπτά και αποκολλήθηκαν με 0.05% Θρυψίνης /ΕΟΤΑ (Gibco, Paisly, UK). Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με μέσο καλλιέργειας και επαναιωρήθηκε σε διάλυμα PBS.

Fluorescence Ιη Situ Hybridization (FISH)

SKBR-3 και MCF-7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν και συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές σταθεροποιήθηκαν σε εναιώρημα χρησιμοποιώντας στερεωτικό Carnoy του (Μεθανόλη (Fisher Scientific, Loughborough, UK): οξικό οξύ (Merck, Hohenbrunn, Γερμανία), 3:01) και έπεσε σε ένα απλό πλακίδιο μικροσκοπίου. Τα πλακίδια αφέθηκαν να στεγνώσουν για 30 λεπτά πριν από την επώαση για 15 λεπτά σε 2χ SSC (20χ SSC = 3 Μ χλωριούχο νάτριο (Merck), 0,3 Μ κιτρικό νάτριο (Merck), ρΗ 7,0), 0,5% Igepal (Sigma Aldrich) μετά την οποία τα πλακίδια αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλη (70%, 85%, 100%) για ένα λεπτό η κάθε μία. 3.5 μl HER2 /neu (ΕΚΒΒ2) (Kreatech, Άμστερνταμ, NL) μείγμα ιχνηλατών εφαρμόστηκε στις διαφάνειες που ακολουθείται από μια καλυπτρίδα Ø12 mm (Thermo Scientific, Breda, NL). Μετά την άκρη της καλυπτρίδας σφραγίστηκε με ελαστικό τσιμέντο (Kreatech), καθετήρες και στόχος μετουσιώθηκαν επί 10 λεπτά στους 76 ° C και αφήνονται να υβριδοποιηθούν για 16 ώρες στους 37 ° C. Μετά τον υβριδισμό οι καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν και αυστηρή έκπλυση εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας 0,4Χ SSC, 0,3% Igepal στους 72 ° C για 2 λεπτά. Τα πλακίδια ξεπλύθηκαν για 5 λεπτά σε 2χ SSC 0,1% Igepal και αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αιθανόλη (70%, 85%, 100%) για 1 λεπτό η κάθε μία. Διαφάνειες τελικά τοποθετηθεί σε DAPI /αντιξεθωριάσματος (Kreatech).

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Χαρακτηρισμός συσκευής

Ο σχεδιασμός και οι αρχές λειτουργίας της παράλληλης μόνο συσκευή κυττάρων WGA απεικονίζονται στο Σχήμα 1. Η συσκευή περιλαμβάνει 8 μονάδων ενίσχυσης με 6 εισόδους (ανοιχτό μπλε κύκλοι) και 10 εξόδους (στερεό μπλε κύκλοι) (σχήμα 1Α), και αποτελείται από δύο στρώματα, ένα ρευστό στρώμα (μπλε) και ένα στρώμα ελέγχου (σε κόκκινο και ροζ). Κάθε μονάδα ενίσχυσης (βλέπε Εικόνα 1Β) αποτελείται από τρεις κυκλικούς θαλάμους (1,2 NL) και ένα τετράγωνο θάλαμο (20,25 NL). Οι βαλβίδες διακοπής (σε κόκκινο) που λειτουργεί με πεπιεσμένο αέρα και να επιτρέψει τόσο για το χειρισμό των κυττάρων και τη φόρτωση των διαλυμάτων. Οι βαλβίδες ανάμιξης (σε ροζ) που βρίσκεται στο κέντρο των τριών κυκλικών θαλάμους που λειτουργούν με τον ίδιο τρόπο. Το κύριο κανάλι έχει τρεις εισόδους για την αντίστοιχη εισαγωγή του αιωρήματος κυττάρων, το ρυθμιστικό διάλυμα λύσεως και το ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης, τα οποία συνδέονται με πολυπλεξία κανάλια για να ωθήσει το περιεχόμενο των επιμέρους μονάδων ενίσχυσης 8 από την αντίθετη πλευρά. Τα προϊόντα WGA μπορούν να συλλέγονται σε 8 ατομικές δεξαμενές πρίζα. Η διαδικασία λειτουργίας της συσκευής απεικονίζεται στο Σχήμα 1 C, όπου το χρώμα βαφές εισήχθησαν στη συσκευή για σκοπούς απεικόνισης, και απεικονίζεται κάτω από ένα μικροσκόπιο. Η μπλε χρωστική αντιπροσωπεύει το μείγμα WGA, η πορτοκαλί βαφή το κυτταρικό εναιώρημα, το πράσινο χρωστική η ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, η κόκκινη χρωστική ουσία το ρυθμιστικό εξουδετέρωση και το μωβ χρωστική η ώθηση ρυθμιστικό. Πρώτα η μπλε χρωστική χρησιμοποιείται για να γεμίσει όλα τα ορθογώνια επιμελητήρια. Στη συνέχεια, η πορτοκαλί χρωστική ουσία φορτώθηκε στο κεντρικό κανάλι και έσπρωξε στις οκτώ πρώτες κυκλικές θαλάμους. Η ίδια λειτουργία πραγματοποιήθηκε για το πράσινο και το κόκκινο βαφές. Τέλος, η λύση που υπάρχει στα τρία κυκλικά θαλάμους και η μπλε χρωστική στην πλατεία θάλαμο ήταν ανάμεικτα. Αντιδραστήρια αναμίχθηκαν επιτυγχάνεται με την ενεργοποίηση των τριών βαλβίδων κουμπί, και αυτή η διαδικασία λειτουργίας εμφανίζεται σε μια ταινία (Ταινία S1). Για scWGA, χρησιμοποιήσαμε την ενεργοποίηση της βαλβίδας κουμπί μόνο για το βήμα αντίδρασης WGA στο Σχήμα 1 (C-j). Λόγω του χαμηλού αριθμού Reynolds που βρέθηκαν στα μικροκαναλιών, ανάμιξη συμβαίνει κατά την παθητική διάχυση. Για να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα ανάμιξης για ενίσχυση του DNA, βαλβίδες κουμπί σχήματος ενσωματώθηκαν στις κλειστές μονάδων ενίσχυσης της συσκευής, στο κέντρο των τριών κυκλικών θαλάμους. Συμπίεσης τις τρεις βαλβίδες κουμπί βοηθά διαδοχική ανάμιξη αντιδραστηρίων από τα κυκλικά και τετράγωνα θαλάμους. Η αποτελεσματικότητα ανάμιξης των βαλβίδων κουμπί για πρώτη φορά αξιολογήθηκε σε ανάμιξη δοκιμές με τη χρήση μπλε χρωστική χρώμα. Μετά το τετράγωνο θάλαμο WGA γέμισε με μπλε χρωστική ουσία χρώματος, οι τρεις κυκλικές αίθουσες γέμισαν με MiliQ νερό και η βαλβίδα διακοπής άνοιξε μεταξύ των κυκλικών και την πλατεία θαλάμους. Στη συνέχεια, οι βαλβίδες κουμπί άνοιξαν και έκλεισαν διαδοχικά σε μία δεδομένη συχνότητα. Παρατηρώντας την ανάμειξη των χρωμάτων την ακολουθία ανοίγματος και κλεισίματος των βαλβίδων κουμπί βελτιστοποιήθηκε. Για να αποκτήσετε πρόσβαση αποτελεσματικότητα ανάμιξη, η τιμή φωτεινότητας του πρώτου θαλάμου κύκλο καταγράφηκε κατά την ανάμειξη στην περιοχή που αναφέρεται ως κόκκινη γραμμή κύκλο στο σχήμα 2Α. Ο χρόνος για την πλήρη ανάμειξη με διάχυση μόνο βρέθηκε να είναι περίπου 30 λεπτά ενώ η βαλβίδα κουμπί υποβοηθούμενης ανάμιξη σε 2 Hz ήταν πολύ πιο γρήγορα και πήρε μόνο περίπου 4 λεπτά, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β. Η ολοκλήρωση της ανάμιξης ρυθμίζεται έτσι ώστε η τιμή φωτεινότητας μετρηθεί χρησιμοποιώντας Image J λογισμικό στον πρώτο θάλαμο φθάσει στο 110 (μπλε χρώμα) από το 220 μετριέται από το διαφανές MilliQ. Οι βαλβίδες που λειτουργούν δοκιμάστηκαν σε συχνότητες μεταξύ 0,1 και 30 Hz για 5 λεπτά και τα ανάμιξης αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 2C. Ανάμιξη αποδοτικότητα μειώθηκε κάτω από 0,5 Hz και άνω των 5 Hz, και χρειαζόταν τουλάχιστον 4 λεπτά ενεργοποίησης της βαλβίδας για βέλτιστη ανάμειξη. Καθώς το μοριακό βάρος επηρεάζει τον συντελεστή μοριακής διάχυσης και από το μοριακό βάρος της βαφής χρώμα τροφίμων είναι σημαντικά μικρότερη από εκείνη του phi29 πολυμεράσης (ΜΒ 68.000), μπορούμε επίσης να χρησιμοποιηθούν ροδαμίνη συζευγμένο δεξτράνης (MW 70.000) και ακριδιν Orange σημασμένο DNA να εκτιμηθεί η ανάμιξη στη συσκευή με μικροσκοπία φθορισμού. Η ανάμιξη ήταν πράγματι πιο αργή σε σύγκριση με την βαφή χρώματος τροφίμων και έφθασε συμπλήρωση σε περίπου 20 λεπτά σε 1 Hz. (Σχήμα S1).

(Α) Σχηματική όψη της συσκευής. Η συσκευή περιέχει 8 μονάδες ενίσχυση με 6 εισόδους και 10 εξόδους. (Β) Μεγέθυνση των δύο μονάδων ενίσχυσης. Το μπλε χρώμα αντιπροσωπεύουν τα κανάλια ροής, το κόκκινο χρώμα αντιπροσωπεύουν τα στρώματα ελέγχου για τις βαλβίδες διακοπής και το ροζ χρώμα αντιπροσωπεύουν τα στρώματα ελέγχου για τις βαλβίδες κουμπί. Οι μονάδες ενίσχυσης αποτελείται από τρεις κυκλικούς θαλάμους (1,2 NL) για την αναστολή των κυττάρων, ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, και ρυθμιστικό εξουδετέρωσης και ένα τετράγωνο θάλαμο (20,25 NL) έχει σχεδιαστεί για μίγμα WGA. Οι βαλβίδες Ανάμιξη βρίσκεται στο κέντρο του τρία κυκλικά θαλάμους. διαδικασία λειτουργίας (C) της συσκευής. Φωτεινό πεδίο εικόνες μιας μονάδας ενίσχυσης με χρώμα βαφές αποδεικνύουν διαδικασία λειτουργίας. (Α-ι).

Η

(Α) φωτεινού πεδίου εικόνα μιας μονάδας ενίσχυσης όπου η πλατεία θάλαμος γεμίζει με μπλε χρωστική χρώμα και τρεις κυκλικές θαλάμους με νερό, που λαμβάνονται σε t = 0. Μέσος όρος φωτεινότητα αξία του πρώτου θαλάμου (κόκκινος κύκλος) παρακολουθήθηκε ως συνάρτηση του χρόνου μετά το άνοιγμα της βαλβίδας. (Β) Ανάμιξη αποτελεσματικότητα των βαλβίδων κουμπιού. Μετρημένες μέσες τιμές φωτεινότητας στην πρώτη εγκύκλιο θάλαμο με βαλβίδα λειτουργίας-υποδεικνύεται ως μαύρο και χωρίς ανάμειξη λειτουργία της βαλβίδας υποδεικνύονται ως πράσινες ανάμειξη. (Γ) Ανάμιξη δοκιμή της αποτελεσματικότητας σε διάφορες συχνότητες της ανάμιξης λειτουργία της βαλβίδας. Μέσες τιμές φωτεινότητας του πρώτου θαλάμου μετράται κατά τη διάρκεια 5 λεπτών.

Η

ολόκληρο το γονιδίωμα Ενίσχυση σε ένα τσιπ

Προσαρμογή του πρωτοκόλλου WGA για ισοθερμική ενίσχυση του DNA με το ένζυμο phi29 σε μια microfluidic συσκευή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση

E.coli

ολόκληρο το γονιδίωμα ως πρότυπο δείγμα. Κατ ‘αρχάς, ένα

E.coli

διαλύματος DNA (6 ng /μl) φορτώθηκε στο κύριο κανάλι, και από το κλείσιμο των βαλβίδων για το κύριο κανάλι μια ακριβή όγκο 1,2 nl θα μπορούσε να μετρηθεί και να φορτωθεί στην πρώτη θαλάμους των μονάδων ενίσχυσης της συσκευής, που αντιστοιχεί στο ποσό του DNA (7,2 pg) που βρέθηκε σε ένα μόνο καρκινικό κύτταρο. Ένα ρυθμιστικό διάλυμα (1Χ Τρις · EDTA, 0,2% Tween 20) ωθήθηκε μέσω του πρώτου θαλάμου της κάθε μονάδας ενίσχυσης για την πλήρωση των τριών κυκλικών θαλάμους, ενώ φροντίζοντας οι βαλβίδες μεταξύ των κυκλικών και την πλατεία θάλαμοι κλείσει σωστά για να απομονώσει το μίγμα WGA θαλάμους. Το μίγμα WGA στη συνέχεια εισήχθη από την άμεση είσοδο σε όλα τα τετραγωνικά θαλάμους πριν από την αντίδραση. Πλευρά βαλβίδες της πλατείας θάλαμοι διαχωρίζονται τα επιμέρους μονάδων ενίσχυσης. Μετά το άνοιγμα των βαλβίδων απομόνωσης μεταξύ της κυκλικής και τετράγωνο θάλαμο, το μίγμα της αντίδρασης ενισχύσεως που αποτελείται από phi29 πολυμεράσης, τυχαίων εξαμερών και dNTPs στην πλατεία θάλαμο και το

E.coli

DNA στα κυκλικά τμήματα άρχισαν να διαχέονται και ήταν αναμιγνύεται ενεργά με τη βοήθεια των βαλβίδων κουμπί ενεργοποιείται στο 1 Hz. Μετά από 2 ώρες, τα δείγματα ωθήθηκαν σε ένα ρύγχος πιπέτας φόρτωσης γέλη τοποθετείται στην έξοδο του καναλιού με την εισαγωγή 5 μl ρυθμιστικού πιέζει από την είσοδο, και το περιεχόμενο του ρύγχος πιπέτας στη συνέχεια μεταφέρονται σε μία πλάκα PCR. Μετά την αδρανοποίηση των συλλεχθέντων δειγμάτων στους 65 ° C για 10 λεπτά, qPCR στόχευση της SSU 16 S rRNA γονιδίου πραγματοποιήθηκε για να ελέγξετε την ποιότητα του ενισχυμένου προϊόντος. Οι σε πραγματικό χρόνο καμπύλες qPCR χρησιμοποιώντας δεκαέξι δείγματα 1 μΙ on-chip ενισχυμένου DNA παρουσιάζεται στην Εικόνα 3 (πράσινες γραμμές), και αντιστοιχούν σε ένα μέσο όρο Cq από 14.77 ± 0.55 (η = 16). Για λόγους σύγκρισης, δεκατέσσερα δείγματα των 6 ng /μl διαλύματος DNA στη NL θάλαμο 1.2 αναλύθηκαν χωρίς καμία ενίσχυση. Εκείνοι αντιπροσωπεύονται από τις μαύρες γραμμές στο σχήμα 3, και οδήγησε σε μια μέση τιμή Cq από 23.43 ± 0.02 (η = 14). Μεγαλύτερο ποσό από την έναρξη του DNA δείχνουν αργότερα αξίας Cq για RT-qPCR και τη διαφορά των τιμών Cq (ΔCq) μπορεί να ποσοτικοποιηθεί η διαφορά του ποσού μεταξύ των δειγμάτων με βάση τις πρότυπες καμπύλες. ΔCq των δειγμάτων χωρίς ενίσχυση και τα δείγματα μετά την ενίσχυση ήταν περίπου 9. Ως εκ τούτου, η qPCR στόχευση SSU του 16 S rRNA γονιδίου οδήγησε σε ενίσχυση του DNA στόχου-ειδικό του 512 φορές (2

ΔCq = 2

9, 100% αποδοτικότητα). Παρόμοια πειράματα πραγματοποιήθηκαν χωρίς ανάμειξη με τη χρήση των βαλβίδων κουμπί οδήγησε σε μια μέση τιμή Cq από 20.18 ± 2.07 (η = 7), η οποία καταδεικνύει σαφώς το πλεονέκτημα της δραστικής ανάμειξης κατά τη διάρκεια του σταδίου ενίσχυσης (Εικόνα S2).

Σε πραγματικό καμπύλες χρόνου qPCR στόχευση SSU 16 S rRNA γονίδιο του επιμέρους συλλεχθέντα δείγματα από τη συσκευή. On-chip ενισχύονται δείγματα εκπροσωπήθηκαν ως πράσινο καμπύλες (n = 16), ενώ τα δείγματα ελέγχου χωρίς ενίσχυση εκπροσωπήθηκαν ως μαύρο καμπύλες (n = 14).

Η

WGA των κυττάρων όγκου

Για να αποδειχθεί η εφικτότητα του γενετικού χαρακτηρισμού των μεμονωμένων καρκινικών κυττάρων στο μικρορροϊκή συσκευή χρησιμοποιήσαμε κύτταρα από την κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού SKBR-3 και MCF-7. Δεδομένου ότι η ποσότητα του DNA (6-7 pg) που περιέχεται σε ένα μόνο κύτταρο είναι πάρα πολύ χαμηλή για μία άμεση εξέταση της σύνθεσής του, το σύνολο του γονιδιώματος ενισχύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Στο κύριο κανάλι η μορφολογία και η ανοσοφαινότυπο των κυττάρων μπορούν να εξεταστούν και μετά από επαλήθευση ότι τα κύτταρα ταιριάζει κριτήρια επιλογής μας μεμονωμένα κύτταρα μπορούν να μετακινηθούν μέσα στο πρώτο θάλαμο των μονάδων ενίσχυσης. Ένα κυτταρικό εναιώρημα από SKBR-3 και MCF-7 κύτταρα χρωματίστηκαν με CellTracker Orange εγχύθηκε στο κύριο κανάλι, και εντοπίσαμε κύτταρα να υποβληθούν για περαιτέρω ανάλυση με χρώση φθορισμού τους και τη μορφολογία, όπως το μέγεθος και το σχήμα. Μετά τη φόρτωση των μεμονωμένων κυττάρων εντός του πρώτου θαλάμου μιας μονάδας ενίσχυσης, αέρας ωθήθηκε να αδειάσει το κύριο κανάλι. Όπως πολυπλέκονται γραμμές ροής συνδέεται με το κύριο κανάλι κάθε γραμμή μπορεί να ανοίξει ξεχωριστά με λειτουργία συνδυασμού των βαλβίδων και μόνο τα κύτταρα ενδιαφέροντος μπορούν να υποστούν περαιτέρω επεξεργασία. [32] Φωτογραφίες από ένα κύτταρο SKBR-3 σε ένα θάλαμο ενισχύσεως φαίνονται στα Σχήματα 4Α & amp? B. Αφού το κύτταρο μεταφέρθηκε στη μονάδα ενίσχυσης άλλου, το ρυθμιστικό λύσης φορτώθηκε, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, μετράται από το κλείσιμο των βαλβίδων, και ωθείται χρησιμοποιώντας 1Χ Tris · EDTA, 0,2% Tween-20 για να αναμιχθεί με το κύτταρο . Για να φιλοξενήσει τον όγκο η βαλβίδα μεταξύ του πρώτου και δεύτερου θαλάμου κύκλος ανοίχθηκε και λύση έλαβε χώρα κατά τα δύο πρώτα τμήματα για 10 λεπτά με διάχυση. Κατά τον ίδιο τρόπο, το ρυθμιστικό εξουδετέρωση εισήχθη και εξουδετέρωση πραγματοποιήθηκε στους τρεις θαλάμους κύκλο, επίσης για 10 λεπτά με βάση την διάχυση. ενεργοποίηση της βαλβίδας για την ανάμιξη δεν ήταν αναγκαία για λύση και εξουδετέρωση ως χρόνος διάχυσης μεταξύ 2 ή 3 κυκλικούς θαλάμους ήταν αρκετά γρήγορα για την εκτέλεση της αντίδρασης. Πραγματική λύση των κυττάρων παρακολουθήθηκε με μικροσκοπία. Το μίγμα WGA φορτώθηκε εντός των τετραγωνικών θαλάμους χρησιμοποιώντας ξεχωριστά στόμια εισαγωγής και εξαγωγής, και στη συνέχεια, οι βαλβίδες κουμπί λειτουργούσαν σε 1 Hz κατά τη διάρκεια 2 h αντίδραση για την ανάμιξη του προϊόντος λύσης των κυττάρων και το μίγμα WGA, και ενισχύουν το DNA. Περίπου 8,27 ng του DNA λήφθηκε από την ενίσχυση on-chip, και, ως ένα μόνο κύτταρο περιέχει 6-7 pg του DNA, πάνω από 1000 φορές ενίσχυση επιτεύχθηκε. Επικύρωση του εκμαγείου DNA ειδική διεξήχθη με qPCR στόχευση του τόπου του γονιδίου GAPDH ως μεταβολές του GAPDH δεν έχουν αναφερθεί στις δύο κυτταρικές σειρές. Η κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού SKBR-3 και MCF-7 χρησιμοποιήθηκαν για να αποδείξουν διαφορές στη γονιδιακή ενίσχυση ErbB2. Το Σχήμα 4C δείχνει τις σε πραγματικό χρόνο qPCR καμπύλες GAPDH για έξι επιμέρους SKBR-3 κύτταρα (μαύρο καμπύλες) και έξι μεμονωμένες MCF-7 κύτταρα (πράσινο καμπύλες), αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές συσκευές. τιμές Cq για την ενίσχυση του GAPDH ποσοτικοποιείται με βάση πρότυπες καμπύλες 23,22 ± 0,6. Αυτό συνεπάγεται ότι το 33% του συνολικού ποσού του DNA, που μετράται με τη δοκιμασία qubit, ήταν πρότυπο-εξαρτώμενη προϊόν. Στα Σχήματα 4Δ και εικόνες FISH Ε μετά από υβριδισμό των ανιχνευτών ERBB2 (κόκκινο) και κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 17 (πράσινο) ενός SKBR-3 και MCF-7 κυττάρων δείχνονται. Ενώ 2 αντίγραφα του χρωμοσώματος 17 και 2 αντίγραφα του γονιδίου ERBB2 παρατηρήθηκαν στο κύτταρο MCF-7, τέσσερα αντίγραφα του χρωμοσώματος 17 και & gt? 10 αντίγραφα του γονιδίου ERBB2 βρέθηκαν στο κελί SKBR-3. Στη συνέχεια, η ίδια ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας scWGA σε μικρορροϊκή συσκευή μας χρησιμοποιώντας ERBB2 συγκεκριμένες qPCR, για μεμονωμένες SKBR-3 και MCF-7 κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4 F, τη μέση τιμής ERBB2 Cq στο ενισχυμένο DNA των μεμονωμένων SKBR-3 κύτταρα ήταν 24,95 ± 0,68 (η = 6) έναντι 29,80 ± 1,96 (η = 5) για τα μεμονωμένα κύτταρα MCF7, ενώ η τιμή GAPDH Cq για δύο κυτταρικές σειρές ήταν 23,22 ± 0,6 (η = 12) που φαίνεται στην Εικόνα 4C. Η κατώτερη τιμή Cq μετρήθηκε για SKBR-3 κύτταρα συσχετίζεται καλά με τα πολλαπλά αντίγραφα του γονιδίου ERBB2 παρατηρηθεί από FISH (Εικόνα 4D), γεγονός που υποδηλώνει ότι on-chip WGA μας ακολούθησε qPCR για συγκεκριμένα γονίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να καθοριστεί εάν ή όχι ένα γονίδιο ενισχύεται.

(α) φωτεινού πεδίου μικροσκόπιο εικόνα ενός ενιαίου SKBR-3 κυττάρων που απομονώνονται σε μικρορροϊκή θάλαμο, συγχωνεύθηκε με μια εικόνα φθορισμού. εικόνα (Β) φθορισμού ενός ενιαίου SKBR-3 κυττάρων βάφονται με CellTracker Orange στο μικρορροϊκή θάλαμο. (C και F) qPCR στόχευση GAPDH και τα γονίδια ERBB2 του on-chip ενισχυμένου DNA για τον ποσοτικό προσδιορισμό και το χαρακτηρισμό χρησιμοποιώντας 1 μΙ on-chip ενισχυμένα δείγματα (5 μΙ) από άτομο SKBR-3 (n = 6) και MCF-7 (Ν = 6) ως πρότυπα. (C) σε πραγματικό χρόνο qPCR καμπύλες της ενίσχυσης του γονιδίου GAPDH. Ενισχυμένο DNA του ενιαίου SKBR-3 παριστάνεται με μαύρο καμπύλες, ενώ εκείνη των κυττάρων και μόνο MCF-7 αναπαρίσταται ως πράσινο καμπύλες. γραμμή κατώτατο όριο είναι σε γκρι χρώμα. (Δ και Ε) Εικόνες φθορισμού in situ υβριδισμού (FISH) με ανιχνευτές ERBB2 (κόκκινο) και κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 17 ανιχνευτές (πράσινο) για μεμονωμένες SKBR-3 (D) και MCF-7 (Ε). Οι πυρήνες βάφτηκαν με Hoechst (μπλε) τιμές (F) Cq του γονιδίου ΕΚΒΒ2 σε οικόπεδο κουτί. τιμές Cq του ErbB2 αντιπροσωπεύθηκαν ως μαύρο κουτί σε SKBR-3 (n = 6) και κόκκινο κουτί σε MCF-7 (η = 5, * Cq από 1 δείγμα λείπει εξαιτίας σφάλματος PCR). . (25% -75%: □, διάμεση τιμή: -, Μέση τιμή: □, Min /Max: °, Εύρος Min /Max: Ι)

Η

Για την γενετική ανάλυση όπως αλληλουχίας ή ανάλυση συστοιχίας υψηλής απόδοσης, μεγαλύτερη ποσότητα DNA (μικρογραμμάρια) είναι υποχρεωτικά. Για την αξιολόγηση της καταλληλότητας του νέου ενισχυμένων προϊόντων για γονιδιακή αναπαράσταση, μπορούμε ενισχυμένο off-chip 1 μΐ 5 μΐ on-chip ενισχυμένο DNA από ένα μόνο SKBR-3 κυττάρων σε 17 μΐ μίγματος WGA, ακολουθούμενη από qPCR στόχευση 10 διαφορετικές θέσεις στο ολόκληρο το γονιδίωμα. Για το σκοπό αυτό επιλέγουμε 10 γονίδια που παρουσιάζουν ενδιαφέρον για το πεδίο έρευνας για τον καρκίνο και βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Τα ενισχυμένα προϊόντα αυτών των γονιδίων μπορεί να παρέχει πληροφορίες σχετικά με την εκπροσώπηση του αρχικού DNA στα ενισχυμένα προϊόντα. 10 ng από 8 εκ νέου ενισχυμένα δείγματα που συλλέγονται από δύο συσκευές (4 δείγματα ανά συσκευή) συγκρίθηκαν με 10 ng γενωμικού DNA (gDNA) του SKBR-3. Το Σχήμα 5Α δείχνει τον συντελεστή διακύμανσης (CV,%) των τιμών Cq στις 4 δειγμάτων σε κάθε συσκευή που παρουσιάζεται ως πράσινο και μαύρες γραμμές για τα 10 θέσεις εξετάζονται. Ο μέσος όρος της CV για τα εν λόγω 10 γονίδια ήταν 3,8% για την πρώτη συσκευή (πράσινο) και 2,9% για τη δεύτερη συσκευή (μαύρο), και παραλλαγή λιγότερο από 7% παρατηρήθηκε στα γονίδια any10 μεταξύ των δειγμάτων στην ίδια συσκευή. Οι τιμές ΔCq για τα μεμονωμένα 8 δείγματα σε σύγκριση με gDNA καθορίστηκαν για τα 10 γονίδια (βλέπε σχήμα 5Β). Οι επιμέρους γραμμές στο σχήμα 5Β αντιστοιχούν σε μία αντίδραση για τσιπ. ΔCq κυμαινόταν μεταξύ γονιδίων αλλά και οι 10 γονίδια ενισχύθηκαν σε 10 ng δειγμάτων scWGA (n = 8). Οι αριθμοί αντίγραφο των γονιδίων στόχων υπολογίστηκαν με βάση τις τυπικές καμπύλες qPCR του gDNA. Οι γκρι ράβδοι σε σχήμα 5C αντιπροσωπεύουν τους αριθμούς αντίγραφο των μεμονωμένων scWGA σε 10 ng DNA, ενώ οι μαύρες μπάρες αντιπροσωπεύουν τους αριθμούς αντίγραφο του γονιδιακού DNA σε 10 ng. Οι κατά μέσο όρο αριθμό αντιγράφων για τα 10 γονίδια σε 10 ng του DNA είναι: 128 αντίτυπα του ErbB2, 47 αντίγραφα CCND1, 140 αντίτυπα του MYC, 201 αντίγραφα PRMT2, 213 αντίγραφα URB2, 1182 αντίτυπα της FGFR1, 42 αντίγραφα του Ρ53, 348 αντίγραφα TRAM1, 332 αντίγραφα ΡΑΚ1, και 513 αντίγραφα του GAPDH, το οποίο αντιστοιχεί σε ποσοστά εκπροσώπησης του 4,8%, 1,4%, 6,6%, 7,5%, 5,4%, 34,1%, 1,5%, 9,1%, 10,7%, και 15,5%, αντίστοιχα. Καθυστερημένη τιμές Cq και ενίσχυση φόντο οδήγησε σε λιγότερες αριθμό αντιγράφων των γονιδίων σε σύγκριση με gDNA στα 10 ng. Δεδομένου ότι παρατηρήθηκε το ίδιο αποτέλεσμα όταν ενισχύθηκαν μικρό αντίγραφα gDNA, υποθέτουμε αυτό προκατάληψη είναι ένα τεχνούργημα που προκαλείται από το εμπορικό κιτ. Επιπλέον, με βάση φθορισμό DNA ποσοτικοποίηση, την εκ νέου ενίσχυση, τις διαδικασίες qPCR, και ποσοτικοποίηση στηρίζεται σε τυπικές καμπύλες του γενωμικού DNA μπορεί να διαφέρουν τα αποτελέσματα. Άλλα μη ισοθερμική και μέθοδοι ισοθερμικής ενίσχυσης του DNA μπορούν να εφαρμοστούν σε μικρορροϊκή συσκευή μας αν και οι όγκοι της αντίδρασης και τα στάδια της αντίδρασης θα πρέπει να προσαρμοστούν και για μη ισοθερμικές έλεγχος θερμοκρασίας θα πρέπει να εισαχθούν.

Τιμές

Cq 10 ng τα πρότυπα του DNA προσδιορίστηκε με SYBR πράσινο qPCR στόχευση 10 γονίδια. (Α) Ο συντελεστής μεταβλητότητας (%) των τιμών Cq από 4 δείγματα ενισχύεται στο ίδιο τσιπ. Τα δείγματα σε 2 διαφορετικές συσκευές υποδεικνύονται ως πράσινες και μαύρες μπάρες. (Β) Ατομική γραμμή αντιπροσωπεύει ένα ενισχυμένο δείγμα σε ένα τσιπ από ένα μόνο κύτταρο. άξονας Υ αντιπροσωπεύει δέλτα τιμές Cq μεταξύ 10 ng DNA ενισχύονται σε ένα τσιπ από μονοκύτταρους και γονιδιακό DNA. (C) Εκτιμώμενος αριθμός αντίγραφο των μεμονωμένων δειγμάτων εκπροσωπήθηκαν ως γκρι ράβδοι. (N = 8) Μαύρο μπάρες αντιπροσωπεύουν εκτιμώμενο αριθμό αντιγράφων του γονιδιακού DNA σε 10 ng.

Η

Συμπεράσματα

Εδώ, παρουσιάσαμε μια microfluidic συσκευή για την παράλληλη επεξεργασία μεμονωμένα κύτταρα να αποκτήσουν επαρκείς ποσότητες DNA με ενίσχυση ολόκληρο το γονιδίωμα για τους μεταγενέστερους ανάλυση. Κουμπί σχήματος μεμβράνες εφαρμόστηκαν ως βαλβίδες ανάμιξης, και διαδοχική ενεργοποίηση των εν λόγω βαλβίδων βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της ανάμιξης. WGA σε όγκο 23,85 nl αντίδρασης βελτιστοποιούνται με τη χρήση του

E. coli

gDNA.