Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στον κόσμο. 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά ως μονοθεραπεία καθιστά χαμηλά ποσοστά ανταπόκρισης. Άλφα κινάσης χολίνης (ChoKα), ένα ένζυμο που παίζει ένα ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μετασχηματισμού, έχει αναφερθεί υπερεκφράζεται σε πολλούς διαφορετικούς όγκους, συμπεριλαμβανομένων των όγκων του παχέος. αναστολείς ChoKα έχουν εισέλθει πρόσφατα κλινικές δοκιμές ως νέα στρατηγική κατά του όγκου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

ChoKα ειδικών αναστολέων, MN58b και TCD-717, έχουν αποδείξει μια ισχυρή αντικαρκινική δράση τόσο

στο vitro

και

in vivo

έναντι αρκετών ξενομοσχεύματα κυτταρικής σειράς που προέρχεται από όγκο, συμπεριλαμβανομένων CRC-προερχόμενες κυτταρικές γραμμές. Η επίδραση των αναστολέων ChoKα σε συνδυασμό με 5-FU ως μια νέα εναλλακτική λύση για τη θεραπεία των όγκων του παχέος εντέρου έχει διερευνηθεί τόσο

in vitro

σε CRC όγκου κυτταρικές γραμμές που παράγονται, και

in vivo

σε ξενομοσχεύματα ποντικών μοντέλα. Οι συνέπειες για θυμιδιλάτης συνθάσης (TS) και τα επίπεδα (ΤΚ1) κινάση θυμιδίνης, δύο ένζυμα που είναι γνωστό ότι παίζουν ένα ουσιαστικό ρόλο στον μηχανισμό δράσης της 5-FU, αναλύθηκαν με στύπωση western και ποσοτική ανάλυση PCR. Ο συνδυασμός της 5-FU με αναστολείς ChoKα είχε ως αποτέλεσμα μια συνεργική επίδραση

in vitro

σε τρεις διαφορετικές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου, και

in vivo

έναντι ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου κόλου σε γυμνά ποντίκια. αναστολείς ChoKα ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασης της TS και ΤΚ1 μέσω της αναστολής της E2F παραγωγής, παρέχοντας μια λογική για το μηχανισμό δράσης του.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι τα δύο φάρμακα σε συνδυασμό οθόνη ένα συνεργιστική αντικαρκινική δράση, λόγω ChoKα αναστολείς με γνώμονα διαμόρφωση του μεταβολισμού της 5-FU. Η κλινική σημασία αυτών των ευρημάτων υποστηρίζεται σθεναρά από το TCD-717 έχει εισέλθει πρόσφατα κλινικές δοκιμές Φάσης Ι έναντι στερεών όγκων

Παράθεση:. De la Cueva Α, Ramírez de Molina Α, Álvarez-Ayerza Ν, Ράμος ΜΑ, Cebrián Α, Pulgar TGD, et al. (2013) Συνδυασμένη 5-FU και Αναστολείς ChoKα ως νέα εναλλακτική θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου: Αποδείξεις σε ανθρώπους που προέρχονται από όγκους κυτταρικών γραμμών και Ξενομοσχεύματα ποντίκι. PLoS ONE 8 (6): e64961. doi: 10.1371 /journal.pone.0064961

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Μαρτίου, 2011? Αποδεκτές: 22 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 του Ιούνη, 2013

Copyright: © 2013 de la Cueva et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει χρηματοδοτηθεί από τις ακόλουθες ενισχύσεις: Comunidad de Madrid (S-BIO /0280/2006 και S2010 /BMD-2326), Ministerio Επιστημών e Innovación (SAF2008-03750, SAF2011-29699, RD06-0020-0016 και RD12 /0036 /0019) και της ΕΕ # 259737. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Juan Carlos Lacal είναι ένας από τους ιδρυτές του TCD Pharma και μέλος της επιστημονικής συμβουλευτικής επιτροπής της αλλά δεν είναι υπάλληλος της εταιρείας. TCD Pharma αναπτύσσει την ένωση TCD717, έναν αναστολέα ChoKα, που είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές Φάσης. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η πρώτη του καρκίνου πιο διαδεδομένη και αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στην Ευρώπη, με περίπου 212.000 θανάτους κάθε χρόνο [1]. Το πιο μελετημένο φάρμακο σε CRC είναι το αντιμεταβολίτης 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), που αναπτύχθηκε πάνω από 50 χρόνια [2]. 5-FU είναι ένα ανάλογο της ουρακίλης με ένα άτομο φθορίου. Ο μηχανισμός της κυτταροτοξικότητας συνίσταται σε λανθασμένη ενσωμάτωση της fluoronucleotides σε RNA και DNA, αλλά οι κύριες τοξικές επιδράσεις που προκαλούνται από την αναστολή του νουκλεοτιδίου συνθετικού ενζύμου θυμιδιλική συνθετάση (TS). 5-FU που χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία μιας σειράς καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων CRC, του μαστού και της κεφαλής και του λαιμού καρκίνους [3], [4]. Τα ποσοστά ανταπόκρισης για την 5-FU με βάση τη χημειοθεραπεία ως θεραπεία πρώτης γραμμής για τον προχωρημένο καρκίνο CRC είναι μόνο το 10-15% [5]. Συνδυασμός 5-FU με νέα κυτταροτοξικά φάρμακα όπως οξαλιπλατίνη και ιρινοτεκάνη έχει βελτιώσει τα ποσοστά ανταπόκρισης 40-50% [6], [7]. Επιπλέον, τα νέα βιολογικών παραγόντων όπως τα μονοκλωνικά αντισώματα cetuximab και bevacizumab απέδειξαν πρόσθετα οφέλη σε ασθενείς με μεταστατική νόσο [8], [9]. Έτσι, αυτή η προσέγγιση είναι η επίτευξη σημαντικών βελτιώσεων, και προωθεί νέες θεραπευτικές στρατηγικές που βασίζονται στην συνδυαστική θεραπείες.

άλφα κινάσης χολίνης (ChoKα), το πρώτο ένζυμο στην οδό Kennedy, είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση της μείζονος φωσφολιπιδικά οι μεμβράνες του πλάσματος, φωσφατιδυλοχολίνη (PC). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι ChoKα παίζει σημαντικό ρόλο στον μετασχηματισμό των κυττάρων και επάγει

in vivo

ογκογένεση [10], [11]. Επιπλέον, ChoKα υπερεκφράζεται σε κόλον, του μαστού, του πνεύμονα, του προστάτη, των ωοθηκών και αιματολογικούς όγκους [11] – [16]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, ChoKα έχει χρησιμοποιηθεί ως νέο μοριακό στόχο να αναπτύξει μια νέα αντικαρκινική στρατηγική. αναστολείς ChoKα (ChoKIs) είναι παράγωγα της δομής Hemicolinium-3 (HC3), ένας γνωστός αναστολέας της κινάσης χολίνης με υψηλή νευροτοξικότητα

in vivo

[17] – [19]. MN58b [20], [21] αναγνωρίστηκε ως πρώτη γενιά HC3 παράγωγο με ισχυρή ανασταλτική δράση

in vitro

και αποτελεσματική δράση κατά όγκων

in vivo

σε γυμνούς συστήματα ποντίκια συμπεριλαμβανομένων των ξενομοσχευμάτων του παχέος εντέρου [10] , [21]. MN58b έχει χρησιμοποιηθεί ως μοντέλο για μια νέα γενιά των ενώσεων, και ένα προβάδισμα μόριο για τη μελέτη του μηχανισμού δράσης αυτής της νέας κατηγορίας αντικαρκινικών φαρμάκων.

Μια δεύτερη γενιά αναστολέων ChoKα έχει συντεθεί για να βελτιωθεί η ανεκτικότητα των αναστολέων ChoKα σε ποντικούς. TCD-717 έχει επιλεγεί μεταξύ των διαφόρων μορίων, διότι παρείχε τα καλύτερα αποτελέσματα

in vitro

και

in vivo

(αδημοσίευτα αποτελέσματα). αναστολείς ChoKα είναι πολύ ειδικά φάρμακα για τα κύτταρα του όγκου, αφού τα πρωτογενή κύτταρα είναι αναστρέψιμα συνελήφθησαν στην G1 και είναι σε θέση να ανακτήσει κινητική ανάπτυξης τους μόλις το φάρμακο έχει αφαιρεθεί. Ωστόσο, τα κύτταρα όγκου ενεργοποιούνται για ταυτόχρονη κυτταρικό θάνατο σε μια αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα κεραμίδια [22], [23]. Και τα δύο φάρμακα, MN58b και TCD-717, που προέρχεται από Hemicolinium-3, και ως τέτοια θεωρούνται και τα δύο ανταγωνιστικοί αναστολείς με χολίνη στο θύλακα σύνδεσης χολίνης [24] – [26].

Έχει περιγραφεί ότι η συνδυασμένη χρήση ενός χολίνης siRNA κινάση-ειδικά και 5-FU, οδηγεί σε μια συνεργιστική δράση για τη μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του μαστού [27]. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της συνδυασμένης χορήγησης αναστολέων χημικών ChoKα και 5-FU, που ψάχνουν για μια εναλλακτική θεραπεία που θα επιτρέψει τη βελτίωση της 5-FU ανταπόκριση ποσοστό στην επεξεργασία CRC και να μειώσει το συνδεδεμένο τοξικότητά του. Η κλινική σημασία αυτής της νέας θεραπείας υποστηρίζεται σθεναρά από το TCD-717 έχει πρόσφατα εγκριθεί να εισέλθουν κλινικές δοκιμές έναντι συμπαγών όγκων (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01215864).

Αποτελέσματα

ChoKα επίπεδα σε ανθρώπινο προέρχονται κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου

επίπεδα ChoKα αναλύθηκαν στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου τριών χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, DLD-1, ΗΤ29 και SW620 έναντι ενός μη καρκινική κυτταρική σειρά ορθοκολικού CCD -841. Το Σχήμα 1 δείχνει ότι τα επίπεδα ChoKα είναι περίπου 20-30 φορές υψηλότερη από την πρωτογενή κυτταρική γραμμή. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με προηγούμενη ανάλυση της έκφρασης ChoKα σε δείγματα όγκων συγκριτικά με συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς από τον ίδιο ασθενή [11], και παρέχει μια λογική για την πιθανή χρήση των αναστολέων ChoKα στην κλινική σε συνδυασμό με κλασική χημειοθεραπεία.

επιπέδων πρωτεΐνης ChoKα τριών παχέος κυτταρικές σειρές όγκων, DLD-1, ΗΤ29 και SW620 έχουν σχέση ως προς τη μη καρκινική κυτταρική σειρά ορθοκολικού CCD-841. Κάτω από το δυτικό εκπροσωπείται επίπεδα ποσοτικοποίησης (ChoKα /τουμπουλίνης).

Η

ChoKα αναστολείς συνεργεί με 5-FU προώθηση κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

Η επίδραση στον πολλαπλασιασμό των αναστολέων ChoKα σε συνδυασμό με 5-FU προσδιορίστηκε στις τρεις ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές σειρές: DLD-1, ΗΤ29 και SW620. Για την εκτίμηση των κατάλληλων συγκεντρώσεων για κάθε ένωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων με βάση τα αντίστοιχα IC

τους 50, μόνο του ή σε συνδυασμό. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από 1 έως 6 μΜ (MN58b και TCD717) και 2 8,5 μΜ 5FU τόσο ως ταυτόχρονη και διαδοχική αγωγές (Σχήμα S1). Ο καλύτερος συνδυασμός για να επιτευχθεί μια αποτελεσματική συνεργία ως αντιπολλαπλασιαστικά φάρμακα ήταν μια διαδοχική θεραπεία ξεκίνησε με έναν αναστολέα ChoKα και ακολουθούμενη από 5-FU. Η ανασταλτική επίδραση προσδιορίστηκε ποσοτικά με τη δοκιμασία ΜΤΤ, και τα ποσοστά αναστολής αναλύθηκαν με την μέθοδο των Chou και Talalay και συνδυασμός ευρετήρια (CIS) εκτιμάται σύμφωνα με το πρόγραμμα CalcuSyn [28]. Αγροτεμάχια ελήφθησαν όταν οι αναστολείς ChoKα TCD-717 και MN58b συνδυάστηκαν με 5-FU σε DLD-1, κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και SW620 (σχήμα S1). ΠΙ και μια αντιπροσωπευτική εικόνα του κάθε διαφορετική κυτταρική γραμμή CRC από τον διαδοχικό συνδυασμό των αναστολέων ChoKα και 5-FU δείχνονται (Σχήμα 2).

6 × 10

3 καρκινικών κυττάρων ήταν καλά πλάκες καλλιεργήθηκαν σε 96 . Μετά από 24 ώρες επώαση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε TCD-717 (αριστερό πάνελ) για 24 ώρες ή MN58b (δεξιά πάνελ) για 9 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο αλλάχθηκε για μέσο που περιέχει 5-FU για 60 ώρες σε πλάκες είχαν λάβει προηγουμένως θεραπεία με MN58b και επί 24 ώρες σε πλάκες που έλαβαν θεραπεία με TCD-717. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ και αντιπροσωπεύονται ως ποσοστό ελέγχου, μη κατεργασμένα κύτταρα. τιμή CI σε κάθε περίπτωση είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα πραγματοποιείται εις τετραπλούν. CI & lt? 1 υποδεικνύει μια συνεργική επίδραση. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Το αποτέλεσμα αυτού του συνδυασμού ερευνήθηκε, και διανομή του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από TCD-717 και 5-FU μόνη της ή σε συνδυασμό αναλύθηκαν (Σχήμα 3). Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε μία σημαντική επαγωγή του κυτταρικού θανάτου μετά την αγωγή με ChoKIs με περαιτέρω αύξηση σε συνδυασμό με 5-FU, υποδεικνύοντας ότι η συνδυασμένη αγωγή είχε ισχυρότερη επίδραση από μεμονωμένες θεραπείες. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα κύτταρα του όγκου είναι ευαίσθητα σε αναστολείς ChoKα αν εκτεθούν σε φάση G1, αλλά γίνονται αδρανείς στην φάση S. [23]. επαγόμενη από έκθεση συσσώρευση φάσης S 5-FU, αλλά η συνδυασμένη θεραπεία μείωσε δραστικά συσσώρευση φάσης S και αυξημένα ποσοστά κυτταρικού θανάτου. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την απαίτηση διαδοχική θεραπεία ξεκίνησε με αναστολείς ChoKα εξηγεί την έλλειψη συνέργεια παρατηρήθηκε με εναλλακτικά προγράμματα θεραπείας.

2,5 × 10

5 DLD-1 και κυτταρικές σειρές SW620 σπάρθηκαν σε 6 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες με TCD-717 ακολουθούμενη από 5-FU για 24 ώρες μόνα τους ή σε συνδυασμό. Ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων αυξημένο κυτταρικό θάνατο σε σύγκριση με τα δύο φάρμακα μόνο του. Τραπέζια κάτω από τα γραφικά δείχνουν το ποσοστό των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου, όταν αντιμετωπίζουν με TCD-717 και 5-FU μόνα τους ή σε συνδυασμό. * P & lt?. 0,05 σύγκριση μεταξύ των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου έναντι του ελέγχου

Η

In vivo

συνέργεια των αναστολέων ChoKα και 5-FU σε άτριχα ποντίκια

Τα αποτελέσματα συνδυαστικών θεραπειών των αναστολέων ChoKα και 5-FU στο

in vivo

ανάπτυξης όγκου από DLD-1 και SW620 ξενομοσχεύματα σε γυμνούς ποντικούς επόμενο αντικείμενο έρευνας. DLD-1 ξενομοσχευμάτων εμβολιάστηκαν σε αθυμικά ποντίκια και όταν οι όγκοι έφθασαν το πρότυπο όγκου περίπου 0,2 cm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (10 όγκοι /ομάδα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία μετά την επόμενη χρονοδιάγραμμα: αναστολείς ChoKα χορηγήθηκαν σε 2 mg /kg /ημέρα, τρεις φορές την εβδομάδα κατά τη διάρκεια 3 εβδομάδων και 5-FU χορηγήθηκε στα 40 mg /kg /ημέρα δύο φορές την εβδομάδα για 3 εβδομάδες. Η ανάπτυξη του όγκου καταγράφηκε μετά την έναρξη της θεραπείας. Οι όγκοι του όγκου μειώνεται σε όλες τις ομάδες που έλαβαν ανεξάρτητα από τη θεραπεία, σε σύγκριση με εκείνα του ελέγχου, χωρίς αγωγή ποντικούς (Σχήμα 4). Η ανάπτυξη του όγκου των ομάδων συνδυασμού σε κάθε πείραμα ήταν σημαντικά μικρότερα από εκείνα που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς ChoKα ή 5-FU μόνο (ρ-τιμές & lt? 0,05). υποδεικνύοντας μία ισχυρή μείωση του όγκου του όγκου στους πίνακες συνδυασμό

Οι ποντικοί εκτέθηκαν σε 2 mg /kg /ημέρα αναστολέων ChoKα τρεις ημέρες την εβδομάδα και 40 mg /kg /ημέρα της 5-FU δύο ημέρες της εβδομάδας, σε συνδυασμό ή μόνα κατά τη διάρκεια 3 εβδομάδων. Tumor ρυθμός αναστολής ανάπτυξης φαίνεται παρακάτω κάθε πείραμα. (Α) DLD-1 όγκων σε επεξεργασία με MN58b ως αναστολέας ChoKα και 5-FU. (Β) DLD-1 όγκων σε επεξεργασία με TCD-717. (C) SW620 όγκους που εκτίθενται σε TCD-717 και 5-FU.

Η

Ως επικύρωση, SW620 ξενομοσχευμάτων διερευνήθηκαν επίσης μετά από ένα πανομοιότυπο πρόγραμμα με συνδυασμό TCD-717 και 5-FU. Μια στατιστικά σημαντική επίδραση παρατηρήθηκε επίσης στη θεραπεία συνδυασμού (Σχήμα 4).

ChoKα αναστολείς ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασης των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της 5-FU

Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός του αυτή η συνεργιστική δράση των αναστολέων ChoKα και 5-FU, εξετάσαμε την επίδραση των αναστολέων ChoKα στα επίπεδα έκφρασης των βασικών ενζύμων στη μεταβολική οδό της 5-FU, όπως θυμιδυλική συνθάση (TS) και κινάση θυμιδίνης (ΤΚ1). κύτταρα SW620 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις των αναστολέων ChoKα από 2 έως 10 μΜ (Σχήμα 5Α) δείχνει ένα δοσολογία εξαρτώμενη μείωση των επιπέδων αυτών των πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, SW620, ΗΤ29 και DLD-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς ChoKα (TCD-717 6 και 10 μΜ, MN58b 10 και 15 μΜ) και 5-FU (5,5 μΜ), μόνα τους ή σε διαδοχικό συνδυασμό να προσδιοριστούν οι επιδράσεις στην έκφραση επίπεδα αυτών των ενζύμων (Σχήμα 5Β). Free (δραστική μορφή) και τριμερές σύμπλοκο (ενεργός μορφή) της TS και ΤΚ1 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Όπως αναμένεται, κύτταρα κατεργασμένα με 5-FU έδειξε τόσο το τριαδικό σύμπλοκο TS (άνω ζώνη) και τα ελεύθερα TS (κάτω ζώνη). Οι αναστολείς ChoKα προκάλεσε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω των δύο δωρεάν TS (δραστική μορφή) και τριμερές σύμπλοκο (ενεργός μορφή), καθώς και ΤΚ1 (σχήμα 5Β). Έτσι, η διαδοχική συνδυασμός αναστολέων ChoKα και 5-FU επαγόμενη τους δύο μηχανισμούς αδρανοποίησης, μειωμένο σχηματισμό τριμερούς συμπλόκου και μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του TS ενεργή (ελεύθερη μορφή). Επιπλέον, ChoKIs μειωμένα επίπεδα ΤΚ1, επηρεάζοντας επίσης τον μηχανισμό που σχετίζεται με την αντίσταση 5-FU. Αυτή η επίδραση θα μπορούσε να εξηγήσει το μηχανισμό της συνεργίας μεταξύ των δύο φαρμάκων.

2,5 × 10

5 DLD-1, κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και SW620 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες. (Α) SW620 κυτταρική γραμμή εκτίθεται σε αυξημένες συγκεντρώσεις των αναστολέων ChoKα για 24 ώρες. κυτταρικές σειρές DLD-1 (Β) SW620, ΗΤ29 και εκτέθηκαν σε δύο συγκεντρώσεις των αναστολέων ChoKα [TCD-717: 6 μΜ (αριστερή γραμμή) ή 10 μΜ (δεξιά γραμμή)? MN58b: 10 μΜ (αριστερή γραμμή) ή 15 μΜ (δεξιά γραμμή)]. Όπου ενδείκνυται, μέσο απομακρύνθηκε μετά τη θεραπεία με αναστολείς ChoKα ως ανωτέρω και άλλαξε για φρέσκο ​​μέσο με 5,5 μΜ 5-FU για επιπλέον 24 ώρες. Η πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντι-θυμιδιλάτης Συνθάσης TS106 κλώνος για TS και μονοκλωνικά αντι-θυμιδίνης κινάσης κλώνος F12 για ΤΚ1. Το σχήμα δείχνει στην κορυφή αντιπροσωπευτική κηλίδα, στο κάτω μέρος επίπεδα πρωτεΐνης (σύνολο TS, ενεργός TS, και TK1 /τουμπουλίνη) που υπολογίζεται από τη μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) 2,5 × 10

5 SW620, ΗΤ29 και κυτταρικές σειρές DLD-1 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες. (Α) SW620, (Β) ΗΤ29 και (C) DLD-1 κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε δύο συγκεντρώσεις των αναστολέων ChoKα [TCD-717: 6 μΜ (αριστερή γραμμή) ή 10 μΜ (δεξιά γραμμή)? MN58b: 10 μΜ (αριστερή γραμμή) ή 15 μΜ (δεξιά γραμμή)]. Όπου ενδείκνυται, μέσο απομακρύνθηκε μετά τη θεραπεία με αναστολείς ChoKα ως ανωτέρω και άλλαξε για φρέσκο ​​μέσο με 5,5 μΜ 5-FU για επιπλέον 24 ώρες. Η πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με στύπωμα ννεδίεπι χρησιμοποιώντας αντι-E2F1. Το σχήμα δείχνει στην κορυφή ενός αντιπροσωπευτικού κηλίδα, στο κάτω μέρος επίπεδα πρωτεΐνης (E2F1 /GAPDH) που υπολογίζεται από την μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Τόσο ΤΚ1 και TS έχουν δειχθεί ότι είναι κάτω από μεταγραφικό έλεγχο του E2F1 [29], [30]. Έτσι ερευνήσαμε κατά πόσον η δραστική μείωση των επιπέδων του ΤΚ1 ένα TS μετά αναστολή ChoK επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση μιας επίδρασης επί των επιπέδων αυτού του παράγοντα μεταγραφής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν, μια δραστική μείωση των επιπέδων του E2F1 παρατηρήθηκε συνεπής με το ρόλο του ως ρυθμιστής του TS και σύνθεσης ΤΚ1.

Στη συνέχεια, για τη διερεύνηση της δυναμικό επαγωγής της απόπτωσης μετά ChoK inibition, ως χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης, τα επίπεδα της PARP αναλύθηκαν υπό όμοιες συνθήκες, και μια δραστική μείωση παρατηρήθηκε σε επίπεδα PARP σε SW620 (Σχήμα 6Α), ΗΤ29 (Σχήμα 6Β) και DLD-1 (Σχήμα 6C) κύτταρο γραμμές μετά τη θεραπεία με το χρονοδιάγραμμα συνδυασμό. PARP είναι μια πρωτεΐνη εμπλέκεται στην επιδιόρθωση του DNA και η μείωσή του έχει μια παρόμοια φυσιολογική έννοια με εκείνη της διάσπασης της, διότι μειώνονται τα επίπεδα της PARP αποφεύγουν την επιδιόρθωση του DNA και τα κύτταρα ενεργοποιούνται για εμπλοκή της απόπτωσης.

(Α-Γ) SW620, κύτταρα ΗΤ29 και DLD-1 σπάρθηκαν όπως περιγράφεται υπό το Υλικά και Μέθοδοι και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δύο συγκεντρώσεις αναστολέων ChoKα [TCD-717: 6 μΜ (αριστερή γραμμή) ή 10 μΜ (δεξιά γραμμή)? MN58b: 10 μΜ (αριστερή γραμμή) ή 15 μΜ (δεξιά γραμμή)] για 24 ώρες και, όπου υποδεικνύεται, με 5,5 μΜ 5-FU ή το όχημα για επιπλέον 24 ώρες. Η πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας αντι-PARP πολυκλωνικό αντίσωμα. Πίσω από κάθε γράφημα, τα δεδομένα δείχνουν τα επίπεδα πρωτεΐνης (PARP /GAPDH) που υπολογίζεται από την μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Α) SW620. (Β) ΗΤ29. (C) DLD-1. (D) PARP και τα επίπεδα έκφρασης ChoKα σε κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και SW620 επιμολυσμένα με ένα συγκεκριμένο ChoKα siRNA προσδιορίστηκε με ανάλυση Western blot ή σκαρφάλωμα ελέγχου siRNA (SCR). Η πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα ChoKα και αντι-PARP πολυκλωνικό αντίσωμα. Κάτω από κάθε Δυτική αναλογία PARP /τουμπουλίνης εκπροσωπείται. δραστηριότητας (Ε) κασπάσης 3 (άνω πάνελ) και η αποκοπή (κάτω πίνακας) του προσδιορίσθηκαν σε κύτταρα ΗΤ29 μετά από θεραπεία με MN58b για 24 ώρες. (F) κασπάσης 3 ενζυματική δραστηριότητα μετρήθηκε επίσης μετά από επιμόλυνση των κυττάρων ΗΤ29 με ChoKα ειδικό siRNA ή όργανα ελέγχου siRNA (SCR) για 48 ώρες. κηλίδα Western αντιπροσωπεύει τα επίπεδα ChoKα μετά την επιμόλυνση και η σχετική μείωση της ανηγμένης σε επίπεδα GAPDH.

Η

ΗΤ29 και κύτταρα SW620 επίσης επιμολυνθεί με ένα ειδικό siRNA-ChoKα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6D, ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα του ChoKα φαρμακολογική αναστολή, με δραστική μείωση των επιπέδων PARP, η ένδειξη της ειδικότητας λόγω αναστολής ChoKα.

Ως επιπλέον απόδειξη της επαγωγής της απόπτωσης μετά αναστολείς ChoK σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου, χρησιμοποιήθηκαν δύο εναλλακτικές μέθοδοι για την έναρξη του αποπτωτικού μηχανημάτων σηματοδότησης. δραστηριότητα κασπάσης 3 και διάσπαση ανιχνεύθηκε εύκολα μετά την επεξεργασία των κυττάρων MN58b ΗΤ29 (Σχήμα 6Ε). Προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ChoKα από συγκεκριμένες siRNA αυξήθηκε επίσης δράση της κασπάσης, μια περαιτέρω στήριξη της ιδιαιτερότητας αυτού του αποτελέσματος με βάση τη μείωση της δραστηριότητας ChoKα (Σχήμα 6F). Έτσι, οι αναστολείς ChoK είναι ικανά να επάγουν απόπτωση με την ενεργοποίηση της κασπάσης 3.

Τέλος, τα επίπεδα TS αναλύθηκαν σε όγκους που προέρχονται από τον

in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος DLD-1 μετά από θεραπεία με MN58b και 5-FU και σύγκριση με τον έλεγχο, χωρίς θεραπεία ποντικούς (Σχήμα 7). Μια στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων TS (τόσο συνολικός και ενεργός πρωτεΐνη) παρατηρήθηκε σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με MN58b μόνη ή σε συνδυασμό με 5-FU, ενώ δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στους όγκους από ποντικούς που έλαβαν μόνο 5-FU.

ποντίκια εμβολιάστηκαν με κύτταρα DLD-1 όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι και είτε αφεθεί χωρίς θεραπεία, ή σε επεξεργασία με MN58b ή 5-FU μόνη της ή σε συνδυασμό. Α) TS επίπεδα έκφρασης κάθε ομάδας πειράματος: Έλεγχος, MN58b, 5-FU και ο συνδυασμός ομάδας. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) Διάγραμμα αντιπροσωπεύει σημαίνουν τα επίπεδα της πρωτεΐνης ως αναλογίες TS /τουμπουλίνης για κάθε ομάδα. Μαύρες μπάρες αντιπροσωπεύουν συνολική TS /τιμές τουμπουλίνης? Γκρι μπάρες αντιπροσωπεύουν TS ενεργές τιμές. (*) Στατιστικά σημαντική (ρ & lt? 0,05)., Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

κάτω ρύθμιση των επιπέδων mRNA του γονιδίου TS και ΤΚ1 μετά τη θεραπεία με αναστολείς ChoKα και 5FU σε DLD-1, SW620 και κύτταρα ΗΤ29

προκλινικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση TS είναι καθοριστικός παράγοντας της ευαισθησίας 5-FU και της κλινικής έκβασης [31], [32]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά, γονίδιο ενίσχυση του TS με επακόλουθες αυξήσεις στην TS mRNA και η πρωτεΐνη, έχει παρατηρηθεί σε κυτταρικές σειρές που είναι ανθεκτικά σε 5-FU [31], [33], [34].

με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, SW620, ΗΤ29 και κύτταρα DLD-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MN58b και TCD-717 για 24 ώρες. Η θεραπεία με αναστολείς της ChoKα οδήγησε σε μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω των δύο TS και τα επίπεδα mRNA ΤΚ1 όπως προσδιορίζεται με πραγματικό χρόνο δοκιμασία Q-PCR χρησιμοποιώντας τους ειδικούς ανιχνευτές Hs00426591_m1 για TS και Hs01062125_m1 για ΤΚ1 (σχήμα 8). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης της TS και της ΤΚ1 που προκαλείται από τους αναστολείς ChoKα αποτελέσματα από μια δραστική μείωση στο μεταγραφικό επίπεδο, με σημαντική επίδραση σε αμφότερες TS, και διάσωσης οδός του διαμεσολαβείται από ΤΚ1. Δεδομένου ότι τα επίπεδα του E2F1 επίσης δραστικά μειωμένη, είναι λογικό να προταθεί ότι αυτός ο παράγοντας μεταγραφής είναι υπεύθυνα για τις παρατηρούμενες επιπτώσεις στην TS και αναστολή ΤΚ1 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29], [30].

2,5 × 10

5 DLD-1, κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και SW620 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και επωάστηκαν υπό τις βέλτιστες συνθήκες για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των αναστολέων ChoKα για 24 ώρες. Επίπεδα TS και ΤΚ1 αναλύθηκαν με RT-qPCR όπως περιγράφεται υπό το Υλικά και Μέθοδοι. 18S χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος για την κανονικοποίηση.

Η

Τα πιο πάνω αποτελέσματα θα είναι συνεπής με τη γενική επίδραση στη μεταγραφή γονιδίων που προκαλείται από τους αναστολείς ChoKα. Για να ελεγχθεί αυτή η δυνατότητα, τα επίπεδα mRNA των άλλων πρωτεϊνών που εμπλέκονται επίσης σε 5-FU μηχανισμό δράσης διερευνήθηκαν. Σε αντίθεση με ό, τι παρατηρήθηκε με TS ή ΤΚ1, ουριδίνη φωσφορυλάση (

UPP1

) αυξήθηκε μετά τη θεραπεία με αναστολείς ChoKα (Σχήμα 9). Αυτή η αύξηση μπορεί να είναι φυσιολογικά σημαντικά διότι

UPP1

είναι υπεύθυνη για τη μετατροπή της 5-FU σε ένα ενδιάμεσο μεταβολίτη που θα μετατραπεί στο ενεργών μεταβολιτών φθοροουριδίνης τριφωσφορική (FUTP) και φθοροδεοξυουριδίνη τριφωσφορική (FdUTP). Έτσι, οι επιδράσεις που παρατηρούνται σε E2F1, TS και ΤΚ1 δεν ανταποκρίνονται σε μια γενική, μη ειδική επίδραση στη μεταγραφή του γονιδίου.

2,5 × 10

5 DLD-1, ΗΤ29 και SW620 κυτταρικών σειρών σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και επωάστηκαν 24 ώρες υπό πρότυπες συνθήκες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολείς ChoKα, TCD-717 (6 και 10 μΜ) και MN58b (10 και 15 μΜ) επί 24 ώρες. 18S χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο

Η

Επίδραση των αναστολέων ChoKα σε ΜΑΡΚ, σηματοδότησης ΑΚΤ και τα επίπεδα κεραμίδια

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς και την ομάδα Chesney του [40] – [42]. αναστολή της ChoKα έχει επίδραση επί της κινάσης ΜΑΡΚ και ΑΚΤ μονοπάτια σηματοδότησης με δραστική μείωση των φωσφορυλιωμένων μορφών σε διάφορους τύπους κυττάρων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά, όταν τα κύτταρα SW620 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς ChoKα, μια δραστική μείωση τόσο ρ42 /ρ44 παρατηρήθηκε (Σχήμα 10Α). Ωστόσο, σε αντίθεση με προηγούμενες αναφορές σε άλλες κυτταρικές σειρές, σημαντική επίδραση παρατηρήθηκε στη φωσφορυλίωση του ρΑΚΤ-Ser

473 (Σχήμα 10Β). Επιπλέον, καμία επίδραση στις δύο μονοπατιού σηματοδότησης παρατηρήθηκε με κατεργασία των κυττάρων SW620 με 5-FU μόνη της, και καμία σημαντική τροποποίηση των επιδράσεων που παρατηρήθηκαν όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολείς ChoKα παρατηρήθηκε κάτω από συνθήκες συνένωσης.

(Α ) 2,5 × 10

5 SW620 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες και εκτέθηκαν σε δύο συγκεντρώσεις των αναστολέων ChoKα [TCD-717: 6 μΜ (αριστερή γραμμή) ή 10 μΜ (δεξιά γραμμή)? MN58b: 10 μΜ (αριστερή γραμμή) ή 15 μΜ (δεξιά γραμμή)]. Όπου ενδείκνυται, μέσο απομακρύνθηκε μετά τη θεραπεία με αναστολείς ChoKα και άλλαξε για φρέσκο ​​μέσο με 5,5 μΜ 5-FU για επιπλέον 24 ώρες. Η πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με western blot χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντι-φωσφο ρ44 /ρ42 ΜΑΡΚ και αντι-ρ44 /ρ42 ΜΑΡΚ. Το σχήμα δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) κύτταρα SW620 αναπτύχθηκαν και κατεργάστηκαν όπως αναφέρεται στο (Α) με 15 μΜ MN58b και 5,5 μΜ 5-FU μόνη της ή σε συνδυασμό για 24 ώρες. Η πρωτεϊνική έκφραση αναλύθηκε με στύπωμα ννεδίεπι χρησιμοποιώντας αντι-pAKT- Ser

473, αντι-ΑΚΤ ή αντι-GAPDH. Το σχήμα δείχνει στην κορυφή ενός εκπροσώπου κηλίδα, στο κάτω μέρος επίπεδα πρωτεΐνης (ρΑΚΤ-Ser

473 /συνολικό AKT /GAPDH) από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. (Γ) 2 × 10

6 SW620 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες Ρ100 και επωάζονται 24 ώρες κάτω από τυποποιημένες συνθήκες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 15 μΜ MN58b και 5,5 μΜ 5-FU μόνη της ή σε συνδυασμό για 24 ώρες. Τα συνολικά επίπεδα κεραμιδιού αναλύθηκαν με UPLC-TOF. Η μέση ± SD δύο ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν απεικονίζονται.

Η

Τέλος, η παραγωγή των κεραμιδιών έχει παρατηρηθεί ειδικώς σε κύτταρα Jurkat μετά από θεραπεία με MN58b ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση σε ανθρώπινα πρωτογενή λεμφοκύτταρα [22 ]. Αυτό μπορεί να είναι υπεύθυνη για την επαγωγή της απόπτωσης σε αυτό το κυτταρικό σύστημα και θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει την παρατηρούμενη συνεργικότητα στη μελέτη αυτή. Ωστόσο, καμία επίδραση στα επίπεδα κεραμίδια παρατηρήθηκαν μετά την αγωγή με 5-FU μόνη της ούτε μετά συνδυαστική χρονοδιαγράμματα με MN58b και 5-FU (Σχήμα 10Β), με εξαίρεση αυτού του μηχανισμού ως υπεύθυνη για την συνέργεια παρατηρείται όταν 5-FU συνδυάστηκε με αναστολείς ChoK.

Συζήτηση

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις πιο συχνές αιτίες θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Η τυπική θεραπεία για CRC βασίζεται σε 5-FU ως πρώτης γραμμής συνήθως σε συνδυασμό με άλλα κυτταροτοξικά φάρμακα, όπως η οξαλιπλατίνη ή την αναστολέας τοποϊσομεράσης Ι της CPT-11 (ιρινοτεκάνη) [33] – [35].

η καλύτερη γνώση της μοριακής βιολογίας των όγκων CRC έχει αλλάξει τη διαχείριση των ασθενών CRC, με την ιδιότητα των μεταλλάξεων του K-ras είναι ένα κρίσιμο ζήτημα λήψης αποφάσεων. Πολυάριθμες κλινικές δοκιμές είναι σε εξέλιξη για τη βελτίωση χρονοδιαγράμματα για τους ασθενείς CRC, όπως και για πολλούς άλλους τύπους καρκίνου. Ωστόσο, τα χαμηλά ποσοστά των θεραπευτικών αγωγών που διατίθενται καθιστά ακόμη απαραίτητο να διερευνηθούν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις για την επίτευξη καλύτερα ποσοστά στην επιβίωση. Με αυτή την έννοια, ένα πολύ ενεργό αναζήτηση για νέες θεραπείες που βασίζονται σε συνδυαστική χημειοθεραπεία και στοχευμένη θεραπεία έχει δημιουργήσει νέες υποσχόμενες εναλλακτικές λύσεις. Η στρατηγική αυτή βασίζεται σε προγράμματα που έχουν αυξήσει τα ποσοστά ανταπόκρισης 10-15% με 5-FU και μόνο σε 40-50% σε συνδυασμό χημειοθεραπείας [6], [7].

Η στοχευμένη θεραπεία είναι μια θεραπεία με επικεντρώθηκε μηχανισμός που δρα ειδικά παρεμβαίνει ένα καλά καθορισμένο στόχο ή βιολογικής οδού [36]. Επί του παρόντος, αυτές οι νέες προσεγγίσεις αποτελούν πραγματικό υπόσχεση για βελτιωμένη διαχείριση και την έκβαση των ασθενών με καρκίνο, δεδομένου ότι δρα ειδικά έναντι καρκινικών κυττάρων και ως εκ τούτου θα πρέπει να έχουν λιγότερες παρενέργειες από ό, τι άλλοι τύποι θεραπευτικών αγωγών.

ChoKα υπερεκφράζεται σε ένα μεγάλη ποικιλία ανθρώπινων όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος [11] – [16]. Αυξημένα επίπεδα των ολικών μεταβολιτών χολίνης, συμπεριλαμβανομένης φωσφοχολίνη, το προϊόν της δραστηριότητας ChoK, είναι επίσης ένα κοινό χαρακτηριστικό πολλών τύπων όγκων [37]. Ως εκ τούτου, ChoKα είναι μια νέα ενδιαφέρουσα στόχο για την ανάπτυξη θεραπειών καρκίνου. Κατά συνέπεια, οι αναστολείς ChoKα συντεθεί να παρεμβαίνουν ειδικά με τη δραστηριότητά της [10], [18], [20], [21].

Ο συνδυασμός των siRNA-ChoK με 5-FU στον καρκίνο του μαστού κυττάρων έχει δείξει μια μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό [27]. Ωστόσο, αυτή η θεραπεία βασίζεται στη χρήση ενός siRNA το οποίο δεν μεταφέρεται προς το στόχο κύτταρα

in vivo

με αποτελεσματικό τρόπο. Εδώ, χρησιμοποιούμε δύο χημικούς αναστολείς που έχουν σχεδιαστεί ειδικά κατά ChoKα (MN58b και TCD-717) με υψηλή δραστικότητα έναντι κυττάρων όγκου

in vitro

και

in vivo

, να διερευνήσει την επίδραση του συνδυασμού της 5-FU και η νέα αυτή στοχευμένη θεραπευτική προσέγγιση για τη βελτίωση τρέχουσες θεραπείες CRC. Μια ισχυρή συνεργική αντικαρκινική επίδραση όταν αναστολείς της 5-FU και ChoKα χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό εναντίον αρκετών κυτταρικών σειρών CRC έχει αναφερθεί.

Προηγούμενες αναφορές από την ομάδα μας δείχνουν ότι η επαγωγή της απόπτωσης μέσω της αναστολής της ChoKα σχετίζεται με την ειδική γενεά των κεραμιδιών σε κύτταρα όγκου [22], [23]. Μια δραματική διαφορά στην απόκριση προς ειδικούς αναστολείς ChoKα έχει παρατηρηθεί μεταξύ των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων. Ότι μπλοκάρισμα του

de novo

φωσφοχολίνη (PCho) σύνθεση με MN58b σε πρωτογενή κύτταρα επάγει ρετινοβλάστωμα (Rb) αποφωσφορυλίωση και καταλήγει σε αναστρέψιμη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G0 /G1 φάση, τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται μια δραστική ταλάντευση στο μεταβολισμό του κύρια λιπίδια της μεμβράνης φωσφατιδυλοχολίνη και σφιγγομυελίνη, με αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων των κεραμιδιών που προάγει την απόπτωση [22], [23]. Αυτά τα αρχικά πειράματα έχουν αναπαραχθεί σε επιπλέον τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του παχέος εντέρου προέρχονται κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πρόσθετα αποδεικτικά στοιχεία έχει αναφερθεί ότι δείχνει μια σαφή αναστολή των οδών σηματοδότησης PI3K /AKT και ERK από αναστολείς ChoK [38], [39], [40]. Ωστόσο, στα συστήματα κελάρι χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή, ούτε ΜΑΡΚ ούτε ΑΚΤ σηματοδότησης ή ceramides γενεά μεταβάλλονται σημαντικά με επεξεργασία με 5-FU μόνο. Καμία σημαντική επίδραση παρατηρείται είτε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις συνδυαστικές καθεστώτα που έδειξε μια ισχυρή συνέργεια τόσο υπό in vitro ή in vivo συνθήκες. Αυτά τα αποτελέσματα συνολικά δείχνουν ότι οι προηγούμενες ενέργειες που αναφέρθηκαν σχετικά με τους μηχανισμούς της δράσης των αναστολέων ChoKα είτε σε ΜΑΡΚ, ΑΚΤ και ceramides σηματοδότηση δεν είναι υπεύθυνη για την συνεργική δράση που παρατηρείται στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα όταν συνδυάζοντας αναστολείς ChoKα και 5-FU.

Εδώ ερευνήσαμε περαιτέρω τον μηχανισμό του συνεργισμού των αναστολέων ChoK και 5-FU για μια καλύτερη κατανόηση και τη βελτίωση των δυνατοτήτων χρήσης του στην κλινική. TS πρωτεΐνη έχει ένα κεντρικό ρόλο στη βιοσύνθεση της θυμιδυλικής, ουσιαστικό πρόδρομος για τη σύνθεση του DNA [41]. Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης TS είναι υψηλότερα σε αρκετούς όγκους ιστούς σε σύγκριση με τα κανονικά αντίστοιχά τους [42]. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα TS συνδέεται με κακή πρόγνωση σε αυτούς τους καρκίνους [43] – [45]. Ένα άλλο κρίσιμο ένζυμο για τον μεταβολισμό θυμιδίνης είναι ΤΚ1 που αυξημένη δραστηριότητα αντιπροσωπεύει δυνητική μηχανισμό αντίστασης στην 5-FU [46].

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι οι αναστολείς ChoKα να προκαλέσει μια ισχυρή προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων των δύο TS και