Αφηρημένο

δεσμογλεΐνης 3 (DSG3) είναι ένα συστατικό του δεσμοσωμάτων, το οποίο παρέχει ισχυρή πρόσφυση κυττάρου-κυττάρου. Προηγουμένως, ένα ογκογόνο λειτουργία της DSG3 έχει βρεθεί σε καρκίνο του τραχήλου της κεφαλής (HNC). Εδώ, ερευνήσαμε το πώς αυτό το μόριο συμβάλλει στην κακοήθη φαινότυπο. Επειδή DSG3 συνδέεται με πλακοσφαιρίνης, εξετάσαμε κατά πόσο αυτές οι φαινοτυπικές μεταβολές αυτές προκαλούνται μέσω του μορίου πλακοσφαιρίνη. Ανοσοκαταβύθιση και χρώση ανοσοφθορισμού αποκάλυψε ότι DSG3 σίγηση διαταράσσεται η αλληλεπίδρασή της με πλακοσφαιρίνη και επαγόμενη πλακοσφαιρίνη μετατόπιση από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Εξόντωση DSG3 αύξησε σημαντικά την αλληλεπίδραση του πλακοσφαιρίνης με τον μεταγραφικό παράγοντα TCF και κατέστειλε την TCF /LEF μεταγραφική δραστικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα που ανατίθενται περαιτέρω σε μειωμένη έκφραση των γονιδίων κατάντη στόχου TCF /LEF, συμπεριλαμβανομένων c-myc, κυκλίνη D1, και ΜΜΡ-7. Λειτουργικές αναλύσεις έδειξαν ότι DSG3 σίγηση μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων και συνέλαβε κύτταρα σε φάση G0 /G1. Εκτός αυτού, η κυτταρική μετανάστευση και εισβολή ικανότητες μειώθηκαν επίσης. Αυτά τα κυτταρικά αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ξενομοσχεύματα όγκου σε ποντίκια, όπως DSG3 σίγηση οδήγησε στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου, της πλακοσφαιρίνης μετατόπιση και μειωμένη έκφραση των γονιδίων στόχων TCF /LEF σε όγκους. Ως εκ τούτου, η μελέτη μας δείχνει ότι η πρωτεΐνη των δεσμοσωμάτων DSG3 επιπλέον λειτουργίες για τη ρύθμιση των κακοήθων φαινοτύπων μέσω πυρηνικής σηματοδότησης. Συμπερασματικά, βρήκαμε ότι οι λειτουργίες DSG3 ως ογκογονίδιο και διευκολύνει την ανάπτυξη του καρκίνου και της εισβολής στα κύτταρα ΕΘΕΓ μέσω της οδού DSG3-πλακοσφαιρίνης-TCF /LEF

Παράθεση:. Chen YJ, Lee LY, Chao YK, Chang JT , Lu YC, Li HF, et al. (2013) DSG3 Διευκολύνει Καρκίνος ανάπτυξη των κυττάρων και εισβολή μέσω του DSG3-πλακοσφαιρίνη-TCF /LEF-Myc /κυκλίνης D1 /MMP μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (5): e64088. doi: 10.1371 /journal.pone.0064088

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Δεκέμβρη, 2012? Αποδεκτές: 10η του Απριλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 30, 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Chang Gung Memorial Hospital (αριθμοί επιχορήγηση CMRPD1A0641 και CMRPD190391-2) και από το Υπουργείο Υγείας της Ταϊβάν (αριθμός επιχορήγηση DOH99-TD-C-111-006). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

δεσμογλεΐνης 3 (DSG3) είναι ένα από τα συστατικά του δεσμόσωμα. Δεσμοσώματα είναι κομβιωτό σημεία ενδοκυτταρικής επαφής που επιτρέπουν την προσάρτηση των στοιχείων κυτταροσκελετική στη μεμβράνη του πλάσματος σε θέσεις του κυττάρου-κυττάρου. Με την αγκύρωση στο στρες που φέρουν ενδιάμεσα νημάτια, δεσμοσώματα παράσχει ισχυρή διακυτταρική προσκόλληση για να διατηρήσει την ακεραιότητα των ιστών και την ομοιοστασία [1] – [3]. Οι δεσμοσώματα αποτελούνται από πρωτεΐνες από τουλάχιστον τρεις διακριτές οικογένειες γονιδίων: καντερίνες (π.χ., DSG1-4 και DSC1-3), αρμαδίλου πρωτεΐνες (π.χ., πλακοσφαιρίνης και διάφορες plakophilins), και plakins (π.χ., δεσμοπλακίνες, envoplakin, και periplakin). Αυτές οι πρωτεΐνες των δεσμοσωμάτων συντονίζονται και συνδέονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν το δεσμόσωμα. Το προκύπτον supracellular σκαλωσιά διαδραματίζει βασικό ρόλο στην παροχή μηχανικής ακεραιότητας σε ιστούς [1] – [3]. Εκτός από το ρόλο τους στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, οι πρωτεΐνες καντερίνη και Armadillo μπορεί να λειτουργεί ως μοριακός μετατροπείς για τη μετατροπή ένα εξωκυτταρικό γεγονός σε ενδοκυτταρικά σήματα [4]. Για παράδειγμα, η ουρά του DSG3 έχει δειχθεί δεσμεύεται πλακοσφαιρίνης [1] – [3]. Πλακοσφαιρίνη είναι στενά συνδεδεμένη με τη β-κατενίνη, η οποία είναι ένα πολύ γνωστό μόριο καθοδικός τελεστής του Wnt κανονική οδό σηματοδότησης [5]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι μπορεί να DSG3 μεταγωγή μοριακό μηνύματα μέσω του πλακοσφαιρίνη μονοπάτι σηματοδότησης.

Αρκετές αναφορές έχουν διαπιστώσει ότι δεσμοσωμικών πρωτεϊνών οι αφύσικα εκφράζονται σε διάφορους καρκίνους. Ενώ μερικοί ερευνητές έχουν αναφέρει ότι η έκφραση των πρωτεϊνών δεσμοσωμικών μειώνεται σε καρκίνους, άλλοι έχουν βρει ότι η έκφραση είναι αυξημένη. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί κάτω ρυθμισμένα του DSC2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου [6], DSC3 στο στήθος και τον καρκίνο του στόματος κοιλότητα [7], [8], και DSG2 σε γαστρικό καρκίνο [9], [10]. Ωστόσο, η υπερβολική έκφραση της DSG2 ή DSG3 έχει επίσης αποδειχθεί σε πολλές καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του δέρματος, του προστάτη, των πνευμόνων και του καρκίνου κεφαλής-αυχένα [11] – [14]. Όλες αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η κακή ρύθμιση του δεσμοσωμικών πρωτεϊνών παίζει ένα ρόλο κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης. Συνεπής με άλλες εκθέσεις, έχουμε βρει προηγουμένως ότι λειτουργεί DSG3 ως ογκογονίδιο σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου και συνδέεται με προχωρημένο κλινικό στάδιο [15]. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε περαιτέρω πώς αυτό το μόριο συμβάλλει στο σχηματισμό του καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι DSG3 προωθεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και εισβολή μέσω ενός μονοπατιού σηματοδότησης πλακοσφαιρίνη μεσολάβηση. Αυτά τα αποτελέσματα οδήγησαν σε μεταβολή του TCF /LEF μεταγραφική δραστηριότητα και επομένως μετέβαλε τις εκφράσεις του κατάντη μορίων, συμπεριλαμβανομένων των c-myc, κυκλίνη D1, και ΜΜΡ-7, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε κακοήθη φαινότυπο.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές, οι κατασκευές shRNA, και κυτταρική επιμόλυνση

Δύο κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και λαιμού, OECM1 και SAS [16], χρησιμοποιήθηκαν. Τα κύτταρα OECM1 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640, και τα κύτταρα SAS καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle κατά Dulbecco. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνη, 100 U /ml στρεπτομυκίνη, και 0,25 g /ml αμφοτερικίνη Β), και οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C με 5% CO

2.

Η shRNA αλληλουχία στόχευσης DSG3 (shDSG3), η οποία έχει περιγραφεί προηγουμένως [15], υποκλωνοποιήθηκε σε ένα pCI-neo πλασμίδιο και χρησιμοποιείται για να καθορίσει τις shDSG3 σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα . Πλακοσφαιρίνη στοχευμένη shRNA σχεδιάστηκε ως μια αίσθηση 22-nt και αντινόημα φουρκέτα που ήταν συμπληρωματική προς την αλληλουχία mRNA πλακοσφαιρίνη 5′-GGA TGC CCA GCG CCA CGT AGC Τ-3 ‘και κλωνοποιήθηκε στον φορέα πλασμιδίου ρΤΟΡΟ-U6, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15].

για το πλασμίδιο επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

5 σε ένα τρυβλίο 100 mm και καλλιεργήθηκαν για 16 ώρες. Όταν τα κύτταρα έφθασαν 60% συρροή, αυτά επιμολύνθηκαν με 6 μα πλασμιδίου ή shRNA τον κενό πλασμιδιακό φορέα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σε Opti-ΜΕΜ μειωμένο ορό μέσα (Invitrogen, Carlsbad, CA). Μετά από 16 ώρες, το μέσο Opti-ΜΕΜ αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​πλήρες μέσο. Τα σταθερά επιμολυσμένα κυτταρική κλώνοι επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα νεομυκίνη αντιδραστηρίου, διαλύματος αντιβιοτικού G418 (Sigma, St Louis, MO, USA).

Ασθενείς και καθορισμός της πρωτεΐνης εκφράσεις σε κλινικές ιστούς

Η μελέτη ήταν εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Institutional Review του Chang Gung Memorial Hospital, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. Εννέα βιοψία των ιστών από ασθενείς με καρκίνο κεφαλής-τραχήλου επισκέφθηκε στο Head-Neck Surgery κλινικές σε Chang Gung Memorial Hospital (Taoyuan, Ταϊβάν) ελήφθησαν, μεταξύ των οποίων τέσσερις κατάφωρα φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου και πέντε καρκίνο. πρωτεΐνες του ιστού εκχυλίστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοστυπώματος για τον προσδιορισμό των DSG3, πλακοσφαιρίνης, c-myc, κυκλίνη D1, και ΜΜΡ-7, όπως περιγράφεται παρακάτω.

εκχύλιση κυτταρική πρωτεΐνη, ανοσοκαθίζηση και ανοσοστύπωμα ανάλυση

Οι μέθοδοι εκχύλισης πρωτεΐνης, ανοσοκαθίζηση και ανοσοστύπωμα διεξήχθησαν παρομοίως όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [18]. Εν συντομία, τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό CHAPS λύσης, επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά, και φυγοκεντρήθηκε για να ληφθούν οι κυτταρικές πρωτεΐνες. Για κλασματοποίηση των πυρηνικών πρωτεϊνών, χρησιμοποιήθηκαν οι commencial αντιδραστήρια εκχύλισης NE-PER πυρηνικά και κυτταροπλασματικά (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για την παρασκευή των σφαιριδίων ανοσοκαταβύθισης, 30 μλ σφαιριδίων G-Sepharose πρωτεΐνης Α /πρωτεΐνης συζεύχθηκαν με 4 μg ειδικών αντισωμάτων (κλώνος 5Η10 για DSG3, ο κλώνος Η80 για πλακοσφαιρίνης, κλώνος H125 για TCF4, Santa Cruz Biotech, CA). Για ανοσοκαταβύθιση, 1 mg του εκχυλίσματος κυτταρικής πρωτεΐνης επωάστηκε με 30 μΐ του συγκεκριμένου πρωτεΐνης Α /πρωτεΐνης G σφαιριδίων για 4 ώρες στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση, επαναιωρήθηκαν σε ένα ρυθμιστικό δείγματος και υποβλήθηκε σε ανάλυση ανοσοστυπώματος. Μη ανοσοποιημένα IgG ποντικού ή ορού κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος για τον προσδιορισμό του ειδικού επίδραση της ανοσοκατακρήμνισης.

Για ανάλυση ανοσοστυπώματος, 30 μg κυτταρικής πρωτείνης διαχωρίστηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 8% και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη υβριδοποιήθηκε με ένα από τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: κλώνος 5Η10 για DSG3, κλώνος Η1 για πλακοσφαιρίνης, κλώνος Μ-20 για Κυκλίνη D1, κλώνος 9Ε10 για c-myc (Santa Cruz Biotech, CA), ή στον κλώνο MAB3315 για MMP- 7 (Millipore, ΜΑ). Η μεμβράνη στη συνέχεια επωάζονται με ένα δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (Santa Cruz Biotech, CA). Η εικόνα πρωτεΐνη αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας ένα σετ αντιδραστηρίων χημικής φωταύγειας Αναγέννηση Western Blot (ΝΕΝ Life Science Products, ΜΑ) και αυτοραδιογραφία. Η πυκνότητα κάθε ζώνης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε μετά από κανονικοποίηση σε ένα Actin ζώνη ελέγχου, χρησιμοποιώντας λογισμικό J εικόνας (Scion Corporation, MD). Σύστημα Εικόνας Gel και

Η κυτταρική ανάπτυξη, τον σχηματισμό αποικίας και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Οι δοκιμασίες ανάπτυξης και σχηματισμού αποικίας διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], [20] Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

5 σε πιάτα 100 mm και η έκταση της κυτταρικής ανάπτυξης προσδιορίστηκε καθημερινά χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο. Για την ανάλυση σχηματισμού αποικίας, συνολικά 1.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να αναπτυχθούν χωρίς να μετακινούνται για 7 ημέρες σε πλήρες μέσο καλλιέργειας που περιείχε 20% FBS. Ο αριθμός των αποικιών των κυττάρων μετρήθηκε μετά από χρώση με 5% κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, μετά το συγχρονισμό των κυττάρων στην φάση G0 /G1 με ασιτία ορού, τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία (ένα διάστημα 6 ωρών για κύτταρα OECM1 και ένα διάστημα 3 ωρών για τα κύτταρα SAS). Τα κυτταρικά ιζήματα μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη, διαπερατά με Triton Χ-100 και RNase, και στη συνέχεια επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για την πυρηνική χρώση. Τα δείγματα αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής ΡΑΟδοαη (Becton Dickinson, San Jose, CA). Η κατανομή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με τη χρήση της Cell Quest Pro και το ModiFit λογισμικό. Δύο ανεξάρτητα πειράματα για κάθε σύνολο δεδομένων.

μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολή

Η μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολής διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, οι δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση θαλάμων πολυανθρακικό Transwell (Becton Dickinson Biosciences). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 6-φρεατίων με Transwell ένθετα που είχε μια πορώδη μεμβράνη πολυανθρακικού (8 μm μέγεθος) και επωάστηκαν σε κανονικό μέσα ενημέρωσης. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει στην κάτω πλευρά των ενθέτων Transwell σταθεροποιήθηκαν με γλουταραλδεΰδη, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και φωτογραφήθηκαν.

Η δοκιμασία κύτταρο εισβολή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των θαλάμων εισβολή BD Biocoat Matrigel (Becton Dickinson βιοεπιστήμες, Bedford, ΜΑ) και ο θάλαμος εισβολή Millicell (Millipore Corporation, Bedford, ΜΑ). Η μεμβράνη του ένθετου άνω θαλάμου Millicell, η οποία έχει ένα μέγεθος πόρου 8 μm, τοποθετήθηκε σε ένα τρυβλίο 24 φρεατίων και επικαλυμμένα με Matrigel. Τα κύτταρα σπάρθηκαν στα ανώτερα θαλάμους με μέσα που περιέχουν 1% FBS. Τα χαμηλότερα θάλαμοι περιείχαν πλήρες μέσο καλλιέργειας (10% FBS) για να παγιδεύουν τα εισβάλλοντα κύτταρα. Η ικανότητα εισβολής των κυττάρων προσδιορίστηκε κάθε 24 ώρες με μέτρηση των κυττάρων στους κατώτερους θαλάμους που είχαν περάσει με επιτυχία μέσα από το Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη.

Ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκοπία

Ο ανοσοφθορισμό και συνεστιακή μικροσκοπία ανάλυσης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. Εν συντομία, οι γυάλινες καλυπτρίδες πρώτα επικαλύπτονται με πολυ-L-λυσίνη και φορμαλδεΰδη. Τα σταθερά κύτταρα στη συνέχεια διαπερατά με Triton-X-100 και δεσμεύτηκαν με εμβρυϊκό βόειο ορό. Οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με αντι-DSG3 (κλώνος 5Η10), ένα αντι-πλακοσφαιρίνης (κλώνος Η-80, Santa Cruz Biotech), ένα αντι-β-κατενίνης (κλώνος Ε5), ή ένα αντι-TCF4 αντίσωμα (cloneD4), και χρωματίστηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) – ή ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με ροδαμίνη. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με μέσα στερέωσης που περιείχε ϋΑΡΙ (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Ο φθορισμός οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (Leica TCS Sp2 MP).

δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης για δράση προαγωγού TCF

Για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας TCF υποκινητή, η TOPflash (TOP) και η αρνητική χρησιμοποιήθηκαν ομόλογό ελέγχου FOPflash (FOP) πλασμίδια αναφοράς (Millipore, Corporation, Bedford, ΜΑ). Το TOP πλασμίδιο περιείχε TCF θέσεις δέσμευσης, ενώ η FOP περιείχε μεταλλαγμένη, ανενεργές θέσεις πρόσδεσης TCF. Τα σταθερά κύτταρα shDSG3 ή πλακοσφαιρίνη knockdown κύτταρα επιμολύνθηκαν με TOP ή FOP πλασμίδια ανταποκριτές, μαζί με τον υποκινητή-Renilla πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης θυμιδίνης κινάσης (Promega, Madison, WI) ως εσωτερικός έλεγχος. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, και οι δραστηριότητες TOP /FOP μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την Dual-Luciferase Assay System Reporter σε συνδυασμό με την GloMax 20/20 χημειοφωταύγειας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega). Η TOPflash ή FOPflash δραστικότητα κανονικοποιήθηκε έναντι της δραστικότητας λουσιφεράσης Renilla και ο διπλάσια αύξηση της TOP σε σύγκριση με το πλασμίδιο FOP ανταποκριτή (TOP /FOP) αναφέρθηκε.

Ποντίκι μοντέλα ξενομοσχεύματος και ανοσοϊστοχημική ανάλυση των ξενομοσχευμένων όγκων

Όλες οι διαδικασίες ζώων είχαν εγκριθεί από το IACUC (Θεσμικές φροντίδα ζώων και Επιτροπή χρήσης) στο Chang Gung Πανεπιστήμιο και ακολούθησε τις οδηγίες του Συμβουλίου έρευνας του οργάνου μας για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων. Ένας ελάχιστος αριθμός ποντικών χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Η μέθοδος δημιουργίας ξενομοσχευμάτων διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, ένα σύνολο 6 αρσενικά BALB /C null ποντίκια σε ηλικία 5 εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν για το πείραμα. Ένα σύνολο 5 × 10

5 κύτταρα σταθερό σίγηση DSG3 (shDSG3) ή σταθερή φορέα επιμολυσμένα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο άνω τμήμα του οπίσθιου άκρου. Το μέγεθος του όγκου παρακολουθούνταν καθημερινά με τον υπολογισμό του όγκου ως μήκος Χ πλάτος Χ ύψος χρησιμοποιώντας παχύμετρο. Το βάρος όγκου μετρήθηκε μετά οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία την ημέρα 38. Οι όγκοι ξενομοσχεύματος αφαιρέθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημεία (IHC) ή ανάλυση κηλίδος western.

IHC διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε ένα διάλυμα φορμαλδεΰδης και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Οι τομές αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο, βρασμένο σε κιτρικό ρυθμιστικό για να ανακτήσει τα αντιγόνα, και αποκλείστηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: αντι-DSG3 (κλώνος 32 – 6300, Zymed Laboratories Inc., CA, USA), αντι-c-myc (κλώνος 9Ε10, Santa Cruz Biotech, CA, USA), αντι-κυκλίνης D1 (κλώνος M20, Santa Cruz Biotech, CA, USA), ή αντι-ΜΜΡ-7 (MAB3315, Millipore, Corporation, Bedford, ΜΑ). ανάλυση IHC και ανάπτυξη χρώματος πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Dako Envision (Dako, Carpinteria, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίσωμα αραιωτικά υποκαταστάθηκαν για τα πρωτεύοντα αντισώματα ως αρνητικοί μάρτυρες και στη συνέχεια με αιματοξυλίνη (ΗΕ). Οι αντιδράσεις χρώσης προσδιορίσθηκαν με μικροσκοπική εξέταση.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t δοκιμή Student για σύγκριση δύο σύνολα δεδομένων μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων. Όλες οι τιμές ρ ήταν δύο όψεων. Ένα

σ

αξία & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

DSG3 αποσιώπηση διαταράσσει την αλληλεπίδρασή του με πλακοσφαιρίνη και προκαλεί πλακοσφαιρίνη μετατόπιση προς τον πυρήνα

Για να αποδείξουν η κυτταρική λειτουργία του DSG3, ιδρύσαμε shDSG3 εκφράζουν σταθερά κύτταρα που προέρχονται από την επιλογή των κυτταρικών σειρών HNC OECM1 και SAS μετά την επιμόλυνση του shRNA DSG3 στόχευσης. Η αποτελεσματικότητα του DSG3 knockdown δείχνεται στο Σχήμα 1Α. Σε κύτταρα OECM1, και οι δύο κλώνοι (SH1 και SH2) εμφάνισαν σημαντική knockdown του DSG3 (& gt? 90%) σε σύγκριση με τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με τον κενό φορέα. Στην SAS κύτταρα, SH1 και SH2 ​​μειωμένη έκφραση DSG3 στο 60% και 30%, αντίστοιχα. Γι ‘αυτό χρησιμοποιείται OECM1-SH1 και SAS-SH2 κλώνο κυττάρων σε όλη την περαιτέρω μελέτη.

έκφραση (Α) DSG3 κατεστάλη στα κύτταρα shDSG3 χρήση RNAi. OECM1 και SAS κύτταρα επιμολύνθηκαν με την DSG3-ειδική shRNA πλασμίδιο έκφρασης ή τον κενό φορέα πλασμιδίου, και επιλεγμένοι κλώνοι χρησιμοποιώντας G418. Τέσσερις κλώνοι (OECM1-SH1 και SH2 ​​OECM1-σε κύτταρα OECM1 και SAS-SH1 και SH2 ​​SAS-σε κύτταρα SAS) των κυττάρων shDSG3 επιλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασίες κηλίδος Western για να προσδιοριστεί το επίπεδο της πρωτεΐνης DSG3. Δύο κλώνοι (OECM1-V σε κύτταρα OECM1 και SAS-V σε κύτταρα SAS) των κυττάρων φορέα επιμολυσμένα επελέγησαν και ως έλεγχοι. Το επίπεδο της ακτίνης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος για έκφραση πρωτεΐνης. (Β) DSG3 σίγηση μείωσε την αλληλεπίδραση του DSG3 με πλακοσφαιρίνης, όπως προσδιορίζεται με ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) και immunoblot ανάλυση (ΙΒ). Εξετάστηκαν δύο ομάδες κυττάρων, κενό φορέα-επιμολυσμένα κύτταρα και shDSG3-επιμολυσμένα κύτταρα. Σε κάθε δείγμα, οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-DSG3 (D3), αντι-πλακοσφαιρίνης (Pg), ποντικού IgG (IgG) (ως αρνητικός έλεγχος) όπως αναφέρεται παραπάνω κάθε λωρίδα. Κάθε δείγμα στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν είτε με πλακοσφαιρίνης (PG) – ή DSG3 (D3) ειδικό αντίσωμα, όπως υποδεικνύεται στην αριστερή πλευρά κάθε συνόλου δειγμάτων. (Γ) DSG3 σίγηση επάγεται plakoglobinn μετατόπιση από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η εντόπιση της DSG3 και της πλακοσφαιρίνης στα δύο κενό φορέα επιμολυσμένα και shDSG3-επιμολυσμένα κύτταρα. DSG3 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα DSG3 ειδικό πρωτογενές αντίσωμα με ένα FITC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα και εμφανίζεται με πράσινο χρώμα. Πλακοσφαιρίνη ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα πλακοσφαιρίνη ειδικό πρωτογενές αντίσωμα με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με ροδαμίνη και εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα. χρώση ϋΑΡΙ Διεξήχθη πυρηνική χρώση για και δείχνεται στο μπλε. Οι εικόνες συγχωνεύθηκαν για να προσδιορίσει την υποκυτταρικό εντοπισμό των DSG3 και πλακοσφαιρίνη. Η γραμμή κλίμακας δείχνει το μέγεθος ως 40 μm. (D) Συνολική και εκχύλισμα πυρηνική πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί το επίπεδο της πλακοσφαιρίνης με προσδιορισμό ανοσοστυπώματος. πυκνότητα πρωτεΐνης μετρήθηκε με λογισμικό Image J. Σύνολο εκχυλισμάτων πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν με ακτίνη? εκχυλίσματα πυρηνική πρωτεΐνη κανονικοποιήθηκαν με HDAC να υπολογίσει σχετικό επίπεδο έκφρασης.

Η

Δεδομένου ότι DSG3 είναι ένα συστατικό του δεσμόσωμα και αλληλεπιδρά με άλλες πρωτεΐνες των δεσμοσωμάτων, όπως πλακοσφαιρίνης, για να διατηρηθεί προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου. Ερευνήσαμε κατά πόσο η οδός σηματοδότησης των DSG3 είχαν διαμεσολαβείται μέσω της αλληλεπίδρασής της με το κατάντη πλακοσφαιρίνη μόριο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, DSG3 σίγηση δεν είχε σημαντική επίδραση στο επίπεδο έκφρασης του πλακοσφαιρίνη. Όταν τα δείγματα πρωτεΐνης από τα κενά κελιά φορέα-επιμολυσμένα ανοσοκαταβυθίστηκαν με DSG3-ειδικό αντίσωμα και ανοσοστυπώθηκαν με ένα πλακοσφαιρίνη-ειδικό αντίσωμα, αυτά τα δύο μόρια αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Στα κύτταρα shDSG3, DSG3 παρουσίασαν πολύ ασθενέστερη σχέση με πλακοσφαιρίνη από τα κενά κελιά φορέα-επιμολυσμένα. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και στην αντίστροφη πείραμα. Όταν τα δείγματα πρωτεΐνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με ένα πλακοσφαιρίνη-ειδικό αντίσωμα και ανοσοστυπώθηκαν με ένα DSG3-ειδικό αντίσωμα, αν και οι αλληλεπιδράσεις δεν βρέθηκε μεταξύ αυτών των δύο μορίων στα κενά κελιά φορέα επιμολυσμένα και ο shDSG3, τα κύτταρα shDSG3 έδειξαν πολύ ασθενέστερη συσχέτιση. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι DSG3 knockdown διαταράσσει την αλληλεπίδραση μεταξύ DSG3 και πλακοσφαιρίνη.

Η διακοπή της αλληλεπίδρασης μεταξύ DSG3 και της πλακοσφαιρίνης στα κύτταρα SH-D3 περαιτέρω καταδείχθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού. Όπως φαίνεται στα συγχωνευθείσα χρώση και ο φθορισμός εικόνες πυρηνικής στο Σχήμα 1 C, DSG3 και πλακοσφαιρίνη συν-εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη στα κύτταρα ελέγχου. Στα κύτταρα SH-D3, δεν παρατηρήθηκε αυτή η συν-εντοπισμού. Αντ ‘αυτού, knockdown του DSG3 διευκολύνεται πλακοσφαιρίνης μετατόπιση από την κυτταρική μεμβράνη του δεσμόσωμα κόμβων προς τον πυρήνα. Επιπλέον, η συνολική πρωτεΐνη και πυρηνική πρωτεΐνη εκχυλίσματα εξετάστηκαν διανομή πλακοσφαιρίνης με προσδιορισμό ανοσοστυπώματος. Στην Εικόνα 1 D, πλακοσφαιρίνης επίπεδο αυξημένα σε εκχύλισμα πυρηνικών πρωτεϊνών σε κύτταρα SH-D3 από κύτταρα ελέγχου φορέα, αλλά η ποσότητα του πλακοσφαιρίνης συνολικά κλάσμα πρωτεΐνης δεν διαπίστωσαν σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων ελέγχου φορέα sh-D3 και. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι DSG3 knockdown διαταράσσει την αλληλεπίδρασή της με πλακοσφαιρίνη και προκαλεί πλακοσφαιρίνη μετατόπιση προς τον πυρήνα

DSG3 knockdown αυξάνει την αλληλεπίδραση του πλακοσφαιρίνης με τον μεταγραφικό παράγοντα TCF

πλακοσφαιρίνη είναι το κοντινότερο σπονδυλωτό συγγενής του β κατενίνης, η οποία είναι μεταγενέστερος μόριο τελεστή στην κανονική Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι, αν και έχουν διαφορετικά δυναμικά διενεργοποίησης [25] – [28]. Σηματοδότηση Wnt εκκινεί έναν καταρράκτη γεγονότων που επιτρέπει β-κατενίνης για να ξεφύγουν από πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμησης, η οποία εξασφαλίζει κανονικά ότι υπάρχει μόνο ένα χαμηλό βασικό επίπεδο της β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα. β-κατενίνη είναι τότε σε θέση να μετατοπίζονται στον πυρήνα, όπου συμπλέκεται με τον παράγοντα αύξησης-σύνδεσης (TCF /LEF) παράγοντες παράγοντας Τ-κυττάρων /λεμφοειδών οικογένεια μεταγραφή και ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων [25], [28]. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε κατά πόσον πλακοσφαιρίνη πυρηνική μετατόπιση προκλήθηκε από νοκ ντάουν της DSG3 επηρεάζει την αλληλεπίδραση μεταξύ πλακοσφαιρίνη και τον μεταγραφικό παράγοντα TCF. Οι μέθοδοι ανοσοκαθίζησης και ανοσοκηλίδος χρησιμοποιήθηκαν για να εξετάσουν τόσο OECM1 (Σχήμα 2Α) και κύτταρα SAS (Σχήμα 2Β). Όπως φαίνεται, DSG3 σίγηση αύξησε την πρόσδεση του TCF4 με πλακοσφαιρίνης, αλλά δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στην αλληλεπίδραση με β-κατενίνης. δοκιμασίες ανοσοφθορισμού αποκάλυψε επίσης συνεπή αποτελέσματα. Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που επιμολύνθηκαν με τον φορέα, knockdown DSG3 αύξησε το ποσό της πλακοσφαιρίνης στον πυρήνα, η οποία είχε δείξει εξέχουσα συν-εντοπισμό με μεταγραφικό παράγοντα TCF4 (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι knockdown του DSG3 επάγεται πλακοσφαιρίνης μετατόπιση σε πυρήνα, η οποία οδήγησε σε αύξηση της σύνδεσης προς τον μεταγραφικό παράγοντα TCF.

(Α, Β) εξόντωση DSG3 αυξήθηκε πλακοσφαιρίνης σύνδεση με τον μεταγραφικό παράγοντα TCF4, όπως καθορίζεται από ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) και ανοσοστυπώματος (ΙΒ) ανάλυση όπως προσδιορίζεται OECM1 (Α) και τα κύτταρα SAS (Β). Κυτταρικά εκχυλίσματα του φορέα ή των σταθερών επιμολυσμένα κύτταρα shDSG3 ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-TCF4, IgG κουνελιού (IgG) (ως αρνητικός έλεγχος) και στην συνέχεια με ανοσοαποτύπωση πλακοσφαιρίνης ή β-κατενίνης αντίσωμα. (Γ) Ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ plakpglobin και TCF4. Ο φορέας ή shDGS3 σταθερές επιμολυσμένα κύτταρα συν-χρώση είτε με πλακοσφαιρίνη και αντισώματα TCF4. Μετά την πλύση, τα πλακίδια επωάστηκαν με ροδαμινο ή FITC- συζευγμένο δεύτερο αντίσωμα. χρώση ϋΑΡΙ Διεξήχθη για την πυρηνική χρώση. Η γραμμή κλίμακας δείχνει το μέγεθος ως 40 μm.

Η

DSG3 αποσιώπηση καταστέλλει TCF /LEF μεταγραφική δραστηριότητα και τα κατάντη γονίδια στόχους c-myc, κυκλίνη D1, και ΜΜΡ-7

διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον πλακοσφαιρίνη πυρηνική μετατόπιση προκλήθηκε από DSG3 αποσιώπηση προκάλεσε επίσης επιπτώσεις στην TCF /LEF μεταγραφική δραστηριότητα. Δεδομένου ότι ο ρόλος της πλακοσφαιρίνης επί της οδού των Wnt δεν είναι καλά καθορισμένη, μπορούμε επομένως προσδιόρισε την λειτουργία του πλακοσφαιρίνης στην TCF /LEF μεταγραφική δραστικότητα. Η δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης TOPflash /FOPflash χρησιμοποιήθηκε [28]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, knockdown έκφρασης πλακοσφαιρίνης αύξησε το TCF /LEF μεταγραφική δραστικότητα πάνω από 2-φορές και στα δύο κύτταρα OECM1 και SAS μετά από 1 ημέρα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι σε αντίθεση με της β-κατενίνης, πλακοσφαιρίνης λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής του σηματοδότηση Wnt και το TCF /LEF μεταγραφική οδό.

(Α) και (Β) Τα αποτελέσματα του TCF /LEF μεταγραφική δραστηριότητα μετά πλακοσφαιρίνης ή DSG3 νοκ ντάουν. Η σταθερή σίγηση πλακοσφαιρίνη (sh-Pg) ή DSG3 σίγηση κύτταρα (sh-D3) επιμολύνθηκαν με TOPflash ή FOPflash πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης και το πλασμίδιο Renilla. Μετά από 24 ώρες, η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Αντιδραστήριο Λουσιφεράσης Steady-Glo. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιήθηκε έναντι της δραστικότητας λουσιφεράσης Renilla και του πλάσια αύξηση της δραστικότητας TOPflash σύγκριση με τη δράση FOPflash αναφέρθηκε. (Γ) και (Δ) Οι εκφράσεις του TCF /LEF γονίδια προς τα κάτω στόχος c-myc και η κυκλίνη D1 προσδιορίστηκε στα κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με συγκεκριμένο στόχο Τα siRNAs να πλακοσφαιρίνη (-Pg sh) ή DSG3 κύτταρα (sh-D3), σε σύγκριση με το φορέα επιμολυσμένα σταθερώς κύτταρα. Σε κάθε δείγμα, οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και αναλύθηκαν με προσδιορισμούς κηλίδος western για να προσδιοριστούν τα επίπεδα έκφρασης του c-myc, κυκλίνη D1, και ΜΜΡ-7.

Η

Το δυναμικό αποτέλεσμα του DSG3 σίγασης στο TCF /εξετάστηκε LEF μεταγραφική δραστηριότητα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, knockdown του DSG3 κατέστειλε την TCF /LEF μεταγραφική δραστικότητα στο επίπεδο του 53% των κυττάρων ελέγχου στα κύτταρα OECM1 και 59% σε κύτταρα SAS μετά από 1 ημέρα. Μαζί με προηγούμενες μελέτες, τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι DSG3 knockdown διαταράσσεται η αλληλεπίδρασή της με πλακοσφαιρίνης (Εικόνα 1Β), προκαλώντας πυρηνική εισαγωγή πλακοσφαιρίνης (εικόνα 1C), διευκολύνοντας την αλληλεπίδραση του με TCF (Εικόνα 2), και οδηγεί στην ενίσχυση της κατασταλτικής επίδρασης της στην η TCF /LEF μεταγραφική δραστηριότητα (Εικόνα 3Β).

για να διερευνήσουν περαιτέρω το πώς DSG3 ρυθμίζει το μονοπάτι /σηματοδότησης LEF πλακοσφαιρίνη-TCF που οδηγούν σε μεταβολές στην κυτταρική ομοιόσταση, εξετάσαμε διάφορα μόρια κατάντη στόχο TCF, συμπεριλαμβανομένων των c-myc , κυκλίνη D1, και μεταλλοπρωτεϊνάσης 7 (ΜΜΡ-7) [29] – [31], τα οποία διαθέτουν σημαντικές λειτουργίες στην κυτταρική ανάπτυξη και εισβολή. Όπως προσδιορίζεται με ανάλυση κηλίδος Western, πλακοσφαιρίνης φίμωση ουσιαστικά αύξησε τις εκφράσεις του c-myc, κυκλίνη D1, και ΜΜΡ-7 στις κυτταρικές γραμμές OECM1 και SAS (Σχήμα 3C), ενώ DSG3 σίγηση κατέστειλε τις εκφράσεις αυτών των πρωτεϊνών στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι DSG3 σίγηση κατέστειλε την TCF /LEF μεταγραφική δραστηριότητα, η οποία θα μπορούσε να αναστείλει την περαιτέρω τις εκφράσεις των κατάντη μορίων c-myc, κυκλίνη D1, και ΜΜΡ-7.

DSG3 σίγηση αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει κυτταρική διακοπής κύκλου στη φάση G0 /G1

από DSG3 απέδειξε ως ένα μοριακό μετατροπέα για τη ρύθμιση των εκφράσεων του c-myc, κυκλίνη D1 και ΜΜΡ7, εξετάσαμε αν αυτό το μόριο λειτουργεί στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, DSG3 σίγηση κατέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων OECM1 κατά 64% την ημέρα 3 και κατέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων SAS κατά 76% την ημέρα 3. Το φαινόμενο αυτό ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας που έδειξε το 90% αναστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα OECM1-shD3 και 80% αναστολές ανάπτυξης σε κύτταρα SAS-shD3. Για να διερευνηθεί η επίδραση της DSG3 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, κυτταρομετρία ροής εκτελέστηκε ανάλυση. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, knockdown του DSG3 κατέληξε σε κύτταρα που συνελήφθησαν στη φάση G0 /G1, όπως απεικονίζεται από την καθυστέρηση στην έναρξη S φάση. κύτταρα OECM1 άρχισε να εισέρχεται σε φάση S στις 12 ώρες (45,0%), ενώ τα κύτταρα OECM1-shD3 δεν αρχίσουν να τίθενται σε φάση S, μέχρι περίπου 18 ώρες (49,3%). Ομοίως, τα κύτταρα SAS ξεκινώντας την είσοδο στη φάση S σε 3 ώρες (48,9%), ενώ τα κύτταρα SAS-shDSG3 δεν τίθεται σε φάση S, μέχρι περίπου 6 ώρες (40.27%). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι DSG3 νοκ ντάουν ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων με τη σύλληψη των κυττάρων στη φάση G0 /G1 καθυστέρηση αρχίζει να φάσης S.

(Α) Η ανάπτυξη των κυττάρων μειώθηκε στα κύτταρα shDSG3. Ένα σύνολο 10

5 κύτταρα των κενών κυττάρων φορέα-επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα shDSG3-(sh-D3) σπάρθηκαν σε πλάκα 10 mm και καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν (***, ρ & lt? 0.001) (άνω πάνελ). σχηματισμός αποικιών μειώθηκε σε κύτταρα shDSG3. Ένα σύνολο είτε 1.000 κενών κελιών φορέα-επιμολυσμένα ή shDSG3-επιμολυσμένα κύτταρα (sh-D3) σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων και επωάστηκαν για 7 ημέρες για να επιτραπεί ο σχηματισμός αποικιών. αποικίες κυττάρων απεικονίστηκαν και μετρήθηκαν μετά από χρώση με 5% κρυσταλλικό ιώδες. (***, P & lt? 0.001) (κάτω πίνακας). (Β) Το κυτταρικό κύκλο που συνελήφθησαν κατά τη φάση G0 /G1 στα κύτταρα shDSG3. Τα κύτταρα shDSG3 (sh-D3) (5 × 10

5 κύτταρα ανά cm τρυβλίου 10) συγχρονίστηκαν στη φάση G0 /G1 καλλιεργώντας τους σε μέσα άνευ ορού για 24 ώρες. Το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας στη συνέχεια άλλαξε για να ολοκληρωθεί μέσα για να επιτραπεί στα κύτταρα να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν κάθε 6 ή 3 ώρες, και το καθεστώς του κυτταρικού κύκλου τους προσδιορίστηκε μέσω κυτταρομετρίας ροής. (Γ) Η ικανότητα κυτταρική μετανάστευση μειώθηκε σε κύτταρα shDSG3, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. Είτε κενό φορέα-επιμολυσμένα ή shDSG3-επιμολυσμένα κύτταρα (sh-D3) σπάρθηκαν σε πυκνότητα 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων με ένθετα Transwell που είχε μια πορώδη μεμβράνη πολυανθρακικού (8 μm μέγεθος) και επωάζονται σε τακτική μέσα ενημέρωσης. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει στην κάτω πλευρά των ενθέτων Transwell βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. (***, P & lt? 0.001). (Δ) Η ικανότητα των κυττάρων εισβολή μειώθηκε σε κύτταρα shDSG3, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία εισβολή Matrigel. Είτε κενό φορέα-επιμολυσμένα ή shDSG3-επιμολυσμένα κύτταρα (sh-D3) σπάρθηκαν σε πυκνότητα 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 24-φρεατίων με Matrigel επικαλυμμένα θάλαμοι εισβολής Millicell και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Οι αριθμοί των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω της Matrigel στον κάτω θάλαμο προσδιορίστηκαν κάθε 12 και 24 ώρες. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν (***, ρ & lt? 0.001).

Η

DSG3 σίγηση αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή

Από λειτουργίες DSG3 σε αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, εξετάσαμε αν DSG3 νοκ ντάουν επηρεάζονται κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή. Τα κυτταρική μετανάστευση αποτελέσματα από τον προσδιορισμό Transwell φαίνεται στο Σχήμα 4C. Η μετανάστευση των δύο κυτταρικών σειρών SH-D3 μειώθηκε δραματικά μετά από 24 ώρες σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές ελέγχου. Τα αποτελέσματα κυτταρικής εισβολής από την δοκιμασία Matrigel φαίνεται στο Σχήμα 4D.