Αφηρημένο

Ιστορικό

Η μοριακή συνοδός Hsp90 είναι ένα πολλά υποσχόμενο νέο στόχο στη θεραπεία του καρκίνου και των εκλεκτικών αναστολέων της Hsp90 είναι σήμερα σε κλινικές δοκιμές. Προηγουμένως έχουν αυτοί οι αναστολείς έχουν αναφερθεί ότι επάγουν είτε αναστολή του κυτταρικού κύκλου ή κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα. Αν η διακοπή του κυτταρικού κύκλου είναι αναστρέψιμες ή μη, δεν έχει σε γενικές γραμμές έχουν αξιολογηθεί. Εδώ έχουμε εξετάσει λεπτομερώς τα κυτταρικού κύκλου σύλληψης και κυτταρικό θάνατο αντιδράσεις του ανθρώπινου μικροκυτταρικού καρκίνου γραμμές του πνεύμονα σε αναστολή της HSP90.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αναλύσεις ΜΤΤ, μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα έδειξαν μία διφασική απόκριση στους αναστολείς Hsp90 γκελνταναμυκίνη και ραδισικόλη, με χαμηλές συγκεντρώσεις προκαλεί τη σύλληψη του πολλαπλασιασμού και υψηλές συγκεντρώσεις που προκαλούν κυτταρικό θάνατο. Αξιολόγηση της Hsp90 ενδοκυτταρικής δραστηριότητας χρησιμοποιώντας απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης πελάτη έδειξε ότι γελδαναμυκίνης συγκεντρώσεις που ανέστειλαν Hsp90 συσχετίζεται στενά με εκείνα που προκαλεί τη σύλληψη του πολλαπλασιασμού, αλλά δεν κυτταρικό θάνατο. Η σύλληψη του πολλαπλασιασμού που επάγεται από χαμηλές συγκεντρώσεις γκελνταναμυκίνη δεν ανατράπηκε για μια περίοδο άνω των τριάντα ημερών μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου και έδειξε τα χαρακτηριστικά της γήρανσης. Σπάνιες πληθυσμοί των καρκινικών κυττάρων παραλλαγή μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα θα μπορούσε να απομονωθεί η οποία είχε επιπλέον γενετικές μεταβολές και πλέον υπέστη μη αναστρέψιμη σύλληψη του πολλαπλασιασμού ως απάντηση σε αναστολείς Hsp90

Συμπεράσματα /Σημασία

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι:. ( 1) αναστολή της HSP90 διεγείρει κυρίως την πρόωρη γήρανση, παρά τον κυτταρικό θάνατο, σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα? (2) μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων μπορεί να παρακάμψει αυτή τη γήρανση μέσω της περαιτέρω γενετικές αλλοιώσεις? (3) Hsp90 που προκαλείται από αναστολέα του κυτταρικού θανάτου σε μικρά καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα οφείλεται στην αναστολή ενός στόχου, εκτός από κυτοσολικά Hsp90. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν επιπτώσεις σε σχέση με το πώς αυτοί οι αναστολείς θα συμπεριφερθεί σε κλινικές δοκιμές και για το σχεδιασμό των μελλοντικών αναστολέων σε αυτή την κατηγορία

Παράθεση:. Restall IJ, Lorimer ΕΕΚ (2010) Πρόκληση Πρόωρη Γήρανση του Hsp90 Αναστολή στην μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 5 (6): e11076. doi: 10.1371 /journal.pone.0011076

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 του Δεκέμβρη, 2009? Αποδεκτές: 17η Μαΐου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 11 του Ιουνίου 2010

Copyright: © 2010 Restall et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις σε IL από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (number62797 επιχορήγησης) (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) και το καναδικό Αντικαρκινική Εταιρεία (αριθμός επιχορήγηση 020.121) (http : //www.cancer.ca/canada-wide.aspx sc_lang = en). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Hsp90 δρα ως συνοδός σε φυσιολογικά κύτταρα, προωθώντας την σωστή αναδίπλωση των δύο πρόσφατα συντεθεί πρωτεΐνες και πρωτεΐνες που έχουν μερικώς μετουσιωμένη οφείλεται στο στρες [1]. Φαίνεται να συμμετέχει κυρίως σε όψιμα στάδια της αναδίπλωσης, πιθανώς με την αναγνώριση εκτεθειμένες υδρόφοβες επιφάνειες σε μερικώς αναδιπλωμένες πρωτεΐνες. Ο βασικός μηχανισμός της Hsp90 που προκαλείται αναδίπλωση πρωτεϊνών εμπλέκει διαμορφωτική αλλαγή μεταξύ ανοικτής και κλειστής διαμορφώσεων που ρυθμίζεται από υδρόλυση ΑΤΡ [2]. Οι τιμές του Hsp90 υδρόλυση ΑΤΡ που ελέγχονται με τη σειρά από την ένωση της με διάφορες cochaperones.

Αν και ο αριθμός των πρωτεϊνών που είναι γνωστό ότι απαιτούν Hsp90 για σωστή αναδίπλωση συνεχίζει να αυξάνεται, Hsp90 είναι σαφώς επιλεκτική για ένα υποσύνολο των κυτταρικών πρωτεϊνών. Αυτά περιλαμβάνουν έναν αριθμό πρωτεϊνών με γνωστή ογκογόνο δραστηριότητα, συμπεριλαμβανομένης Her2, Raf1 και Cdk4 [3]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, Hsp90 δείχνει προτιμησιακή σύνδεσης με την μετάλλαξη, ογκογονικές μορφές πρωτεϊνών? Αυτό έχει αποδειχθεί τόσο για Src κινάση και ο υποδοχέας EGF [4] – [6]. Hsp90 δείχνει επίσης μία αυξημένη συσχέτιση με cochaperones και υψηλότερη δραστικότητα ΑΤΡάσης στα καρκινικά κύτταρα, τόσο

in vitro

και

in vivo

[7]. Για τους λόγους αυτούς υπάρχει σημαντικό ενδιαφέρον για την Hsp90 ως στόχος για θεραπεία του καρκίνου.

Γκελνταναμυκίνη και ραδισικόλη είναι δύο συντακτικώς άσχετα φυσικά προϊόντα που δεσμεύονται με την θέση δέσμευσης ΑΤΡ του Hsp90, μπλοκάροντας το διαμορφωτικό ποδηλασίας που είναι απαραίτητη για του δραστηριότητα συνοδού. Αυτές οι ενώσεις εμφανίζουν καλή εκλεκτικότητα για Hsp90, αν και επίσης συνδέονται προς τον Hsp90 ενδοπλασματικό δίκτυο παράλογο Grp94 και το Hsp90 μιτοχονδριακό παράλογο Trap1 σε υψηλότερες συγκεντρώσεις [8] – [10]. Ενώ αυτές οι ενώσεις καθορίσει κατ ‘αρχήν ότι Hsp90 είναι ένα «druggable» στόχος από την άποψη της φαρμακολογίας, η κακή διαλυτότητα και η μη ειδική τοξικότητα καθιστούν ακατάλληλα για χρήση σε ανθρώπους. Οι εκδόσεις του παραγωγοποιημένου γκελνταναμυκίνη έχουν παραχθεί τα οποία έχουν βελτιωμένες φαρμακολογικές ιδιότητες, αν και εξακολουθούν να έχουν κάποιοι από τους περιορισμούς της μητρικής ένωσης [11]. Παρά το γεγονός αυτό, υπάρχουν αποδεικτικά στοιχεία από ορισμένες δοκιμές ότι η αναστολή Hsp90 είναι επιτεύξιμη, με βάση την ανάλυση βιοδείκτη σε λεμφοκύτταρα ασθενών [12], [13] και δείγματα όγκου [14]. Υπάρχει επίσης κάποια απόδειξη για αντικαρκινική δράση [15]. Πρόσφατα νέοι αναστολείς Hsp90 έχουν αναπτυχθεί που δεν έχουν τους περιορισμούς των προηγούμενων ενώσεων, και αυτά εισέρχονται τώρα κλινικές δοκιμές [11]. Με αυτές τις εξελίξεις στη φαρμακολογία της αναστολής της Hsp90, ένα κρίσιμο νέο χώρο της έρευνας θα είναι η ταυτοποίηση των υποομάδων των ασθενών με καρκίνο που είναι πιο πιθανό να επωφεληθούν από την αναστολή Hsp90.

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η μεγαλύτερη αιτία των θανάτων από καρκίνο παγκόσμιος. Περίπου το 15% των καρκίνων του πνεύμονα είναι του υποτύπου γνωστή ως μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Ο καρκίνος αυτός συνήθως παρουσιάζεται ως μεταστατική νόσο και συνήθως δεν αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση. Μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα ανταποκρίνεται γενικά πολύ καλά σε ακτινοβολία και χημειοθεραπεία αρχικά, αλλά η πλειοψηφία των ασθενών υποτροπιάζουν με ανθεκτική νόσο και πεθαίνουν μέσα σε δύο χρόνια [16]. Η πλειονότητα των μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα έχουν νευροενδοκρινείς ιδιότητες και εκκρίνουν ενεργώς πολυπεπτιδικές ορμόνες [17]. Αυτά τα εκκρινόμενα ορμόνες προκαλούν ένα φάσμα παρανεοπλασματικά σύνδρομα που είναι κοινά επιπλοκές του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα.

Εδώ ερευνήσαμε την απόκριση των καρκινικών κυττάρων μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα σε αναστολή Hsp90. Μια προηγούμενη μελέτη είχε δείξει ότι οι αναστολείς της HSP90 διεγείρει θάνατο κυττάρου σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων μέσω ενεργοποίησης του ενδογενούς οδού της απόπτωσης [18]. Τα ευρήματά μας συνάδουν με αυτό, αλλά παρατηρήσαμε ότι ο θάνατος κυττάρων συμβαίνει μόνο σε συγκεντρώσεις πολύ υψηλότερες από εκείνες που απαιτούνται για την αναστολή της κυτοσολικής Hsp90. Παρατηρούμε ότι η κατεργασία του μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα τα καρκινικά κύτταρα με αναστολείς Hsp90 σε συγκεντρώσεις που επαρκούν για την αναστολή της κυτοσολικής Hsp90 προκαλεί πρόωρη γήρανση παρά τον κυτταρικό θάνατο.

Αποτελέσματα

απόκριση ανθρώπινων μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές για αναστολή της HSP90

Το ανθρώπινο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου Η69 έδειξε μια διφασική ανταπόκριση στη θεραπεία με ένα εύρος συγκεντρώσεων γκελνταναμυκίνη (Σχήμα 1Α). Σε μια δοκιμασία ΜΤΤ, ένα 48 h έκθεση των κυττάρων σε 0,1 μΜ γκελνταναμυκίνη μειώθηκε αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων κατά περίπου 40%. Η αύξηση της συγκέντρωσης του γκελνταναμυκίνη έως και 3 μΜ δεν προκάλεσε περαιτέρω μείωση αριθμού των βιώσιμων κυττάρων. Με συγκεντρώσεις γκελνταναμυκίνη & gt? 4 μΜ, οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων Η69 μειώθηκε σε ουσιαστικά μηδέν. Radicicol, ένα δεύτερο αναστολέα Hsp90 που είναι δομικά άσχετο με γκελνταναμυκίνη, έδωσε επίσης μια διφασική καμπύλη δόσης απόκρισης με Η69 κύτταρα, αν και με λιγότερο διακριτή φάση σταθεροποίησης (Εικόνα 1Β). Δύο άλλες μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών (H187 και H889) δείχνουν επίσης μια διφασική απόκριση σε γκελνταναμυκίνη (Σχήμα 1 C και D)? Ωστόσο, η κυτταρική σειρά U87MG γλοιοβλαστώματος έδειξε μόνο την πρώτη φάση αυτής της απόκρισης (

δηλαδή

. η φάση δει σε χαμηλές συγκεντρώσεις γελδαναμυκίνης) (Σχήμα 1 Ε).

Α, ανάλυση ΜΤΤ των Η69 κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με γκελνταναμυκίνη για 48 ώρες? Β, ΜΤΤ δοκιμασία του Η69 κύτταρα κατεργασμένα με ραδισικόλη για 48 ώρες? C, ΜΤΤ δοκιμασία του H187 μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων με γκελνταναμυκίνη για 12, 36 και 60 ώρες? D, ΜΤΤ δοκιμασία των κυττάρων H889 σε επεξεργασία με γκελνταναμυκίνη για 48 ώρες? Ε, ΜΤΤ δοκιμασία των κυττάρων γλοιοβλαστώματος U87MG σε επεξεργασία με γκελνταναμυκίνη για 48 ώρες? F, κύτταρα Η69 κατεργάζεται με γκελνταναμυκίνη για 48 ώρες και προσδιορίστηκαν για βιώσιμη (○) και η συνολική (•) μετρήσεις κυττάρων με χρήση αναλυτή κυτταρικής βιωσιμότητας Vi-κυττάρου XR. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν την μέση τιμή ± SE από τρεις επαναλήψεις.

Η Καθώς η πρώτη φάση μπορεί να είναι δυνητικά οφείλονται είτε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή επιλεκτική θανάτωση ενός υποσυνόλου SCLC κυττάρων, περαιτέρω δοκιμασίες διεξήχθησαν

για τη διάκριση μεταξύ αυτών των δυνατοτήτων. Η απόκριση των κυττάρων Η69 σε θεραπεία με ένα φάσμα συγκεντρώσεων γκελνταναμυκίνη δοκιμάστηκε με μέτρηση των κυττάρων, χρησιμοποιώντας αποκλεισμό trypan blue να διακρίνει ζωντανά κύτταρα από τα νεκρά κύτταρα (Σχήμα 1 F). Τα ζωντανά μετρήσεις κυττάρων έδειξαν επίσης μια διφασική απόκριση όταν δοκιμάστηκαν με αυτή τη μέθοδο. Σύνολο μετρήσεις κυττάρων ήταν παρόμοια για να ζήσουν μετρήσεις κυττάρων κατά την πρώτη φάση της καμπύλης διφασική απόκριση αλλά αποκλίνει κατά τη δεύτερη φάση. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι γκελνταναμυκίνη επάγει πρωτίστως σύλληψης πολλαπλασιασμό σε κύτταρα Η69 σε χαμηλές συγκεντρώσεις αλλά επάγει κυτταρικό θάνατο σε υψηλές συγκεντρώσεις. Τα δεδομένα στο Σχήμα 1 C, τα οποία δείχνουν προσδιορισμούς ΜΤΤ σε κύτταρα H187 αγωγή για διαφορετικές χρονικές περιόδους (12, 36 και 60 ώρες) με γκελνταναμυκίνη, είναι συνεπείς με το συμπέρασμα αυτό, καθώς η πρώτη φάση είναι εμφανής μόνο με μακρύτερες θεραπείες όπου υπάρχει χρόνος για σημαντικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων να λαμβάνει χώρα στον έλεγχο. Αυτό δείχνει επίσης ότι ο κυτταρικός θάνατος σε υψηλές συγκεντρώσεις γελδαναμυκίνης συμβεί σχετικά γρήγορα (

δηλαδή

σε λιγότερο από 12 ώρες).

Απόκριση Η69 κυττάρων μετά την απόσυρση της Hsp90 αναστολή

σύλληψη του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από τα φάρμακα μπορεί να είναι αναστρέψιμες ή μη αναστρέψιμες (

δηλαδή

γήρανση-όπως). Για να γίνει διάκριση μεταξύ αυτών των πιθανοτήτων, Η69 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις γκελνταναμυκίνη για δύο ημέρες. Drug στη συνέχεια απομακρύνθηκε και μετρήσεις βιώσιμων κυττάρων παρακολουθήθηκαν. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων που ανακτώνται από τη θεραπεία με συγκεντρώσεις γκελνταναμυκίνη 50 ηΜ ή λιγότερο. Ωστόσο, μετά από θεραπεία με 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη, ένας πληθυσμός των βιώσιμων κυττάρων παρέμειναν οι οποίες δεν αυξάνουν σε μία χρονική περίοδο μεγαλύτερη από τριάντα ημέρες μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου (Σχήμα 2Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τις μικρές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα H187 και H889 (Εικόνα 2Β και Σχήμα S1A), και Η69 κύτταρα επεξεργασμένα με την κλινικά σχετική Hsp90 αναστολέα 17-AAG (Σχήμα 2C). κύτταρα Η69 απαιτείται ένα ελάχιστο από 24 ώρες έκθεσης σε γκελνταναμυκίνη να επάγει μη αναστρέψιμη σύλληψη πολλαπλασιασμό (Σχήμα 2D) και την επαγωγή της μη αναστρέψιμης σύλληψης πολλαπλασιασμού ήταν ανεπηρέαστη από την αναστολή της κασπάσης (Σχήμα 2Ε). Για σύγκριση το ίδιο πείραμα εκτελέστηκε στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος U87MG (Εικόνα 2F). Αυτά τα κύτταρα ανακτούν την ανάπτυξη μετά από επεξεργασία με 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη και επίσης να ανακτήσει από μια θεραπεία με μια δέκα-φορές υψηλότερη συγκέντρωση γκελνταναμυκίνη. Συνεπώς, η παρατεταμένη σύλληψη πολλαπλασιασμός που επάγεται από γκελνταναμυκίνη δεν είναι μια καθολική απόκριση των καρκινικών κυττάρων, αλλά μάλλον είναι ο καρκίνος σε κύτταρα συγκεκριμένο τύπο.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του αναστολέα, η οποία στη συνέχεια απομακρύνθηκε. Βιώσιμες μετρήσεις κυττάρων προσδιορίζεται στη συνέχεια στους χρόνους που υποδεικνύονται μετά την απομάκρυνση αναστολέα. Α, κύτταρα Η69 αντιμετωπίζονται με γελδαναμυκίνη? Β, κύτταρα H187 αντιμετωπίζονται με γελδαναμυκίνη? C, τα κύτταρα Η69 κατεργάζεται με 17-AAG. D, κύτταρα Η69 σε επεξεργασία με 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη για 4, 12 ή 24 ώρες. Ε, κύτταρα Η69 υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη απουσία ή παρουσία 100 μΜ Ζ-VAD-FMK, γενική αναστολέα κασπάσης. θεραπεία Z-VAD-FMK άρχισε 1 ώρα πριν από την προσθήκη του γκελνταναμυκίνη. F, κύτταρα U87MG σε επεξεργασία με γκελνταναμυκίνη.

Η

Για να επιβεβαιωθεί η παρατεταμένη διακοπή αύξησης με μία δεύτερη μέθοδο, η ενσωμάτωση BrdU σε Η69 κύτταρα που είχαν εκτεθεί σε 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη επίσης εκτιμήθηκε. Συνεπής με βιώσιμες μετρήσεις κυττάρων, η δοκιμασία αυτή έδειξε ότι Η69 κύτταρα απέτυχαν να ανακτήσει την ικανότητα πολλαπλασιασμού τους μετά την απομάκρυνση γκελνταναμυκίνη (Σχήμα 3Α).

A. κύτταρα Η69 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη. Γκελνταναμυκίνη στη συνέχεια απομακρύνθηκε. Έξι ή οκτώ ημέρες μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου, 25.000 κύτταρα κατεργασμένα (GA) ανά φρεάτιο απλώθηκαν σε ενενήντα έξι φρεατίων μαζί με τον ίδιο αριθμό των μη επεξεργασμένων κυττάρων Η69 για σύγκριση (όχι GA). Τα κύτταρα αφέθηκαν να πρόσληψη BrdU για 16 ώρες και BrdU ενσωμάτωση στη συνέχεια αναλύθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν προς τις τιμές για μη κατεργασμένα κύτταρα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SD από έξι επαναλήψεις. Β κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με γκελνταναμυκίνη. Σύνολο κυτταρολύματα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα προς τις δεικνυόμενες πρωτεΐνες. Το κάτω πάνελ δείχνει μία κηλίδα χρωματίστηκαν για συνολική πρωτεΐνη με αμιδο μαύρο πριν από την επώαση αντισωμάτων. Ίσες ποσότητες DMSO προστέθηκαν σε κύτταρα για κάθε επεξεργασία, εκτός από την πιο αριστερή λωρίδα, όπου παραλείφθηκε DMSO.

Η

Αλλαγές στη πρωτεΐνες πελάτη Hsp90 και πρωτεΐνες θερμικού σοκ σε απόκριση προς την αναστολή Hsp90

Οι επιδράσεις των διαφορετικών συγκεντρώσεων των γκελνταναμυκίνη σε γνωστά στους πελάτες Hsp90 αξιολογήθηκαν επίσης σε Η69 κύτταρα (Εικόνα 3Β, δεξιά τέσσερις λωρίδες blot). Ουσιαστική εξάντληση της Hsp90 πρωτεΐνες πελάτη CDK4 και Raf1 παρατηρήθηκαν σε γκελνταναμυκίνη συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 50 ηΜ. Μία δεύτερη καλά περιγραφεί απόκριση των κυττάρων στην αναστολή της HSP90 είναι η επαγωγή άλλων πρωτεϊνών θερμικού σοκ που λαμβάνει χώρα μέσω ενεργοποίησης του Hsf1 [19]. Όπως και με τις απαντήσεις πρωτεΐνη πελάτη, οι συγκεντρώσεις γκελνταναμυκίνη τόσο χαμηλά όσο 50 ηΜ προκάλεσε αυξήσεις στις Hsp70, Hsp27 και Hsp90α /β. Αυτές γκελνταναμυκίνη συγκεντρώσεις ανάλογες με αυτές που προκαλούν τη σύλληψη πολλαπλασιασμό, αλλά είναι περίπου 100 φορές μικρότερη από τις συγκεντρώσεις που προκαλούν σημαντικές κυτταρικό θάνατο.

U87MG και κύτταρα Η69 έδειξαν πολύ παρόμοιες ευαισθησίες να γκελνταναμυκίνη · σε σχέση με την πρωτεΐνη πελάτη μειώνεται και θερμικού σοκ πρωτεΐνη αυξήσεις (Σχήμα 3Β). Αυτό δείχνει ότι η διαφορά στη συμπεριφορά μεταξύ των κυττάρων Η69 και U87MG μετά την απομάκρυνση του γκελνταναμυκίνη δεν είναι συνέπεια των διαφορών στο μεταβολισμό των φαρμάκων (

π.χ.

πολυφαρμάκου μεταφορέας δραστηριότητα δραστηριότητα ή διαφοράση, δύο από τα οποία επηρεάζουν τη δράση γκελνταναμυκίνη [20], [21]). Μάλλον φαίνεται ότι οι διαφορετικές αποκρίσεις αυτών των κυττάρων μετά την απόσυρση της γκελνταναμυκίνη οφείλονται σε διαφορές που είναι κατάντη της αναστολής Hsp90. ανάλυση Western blot επιβεβαίωσε ότι Η69 κύτταρα δεν είχε ανιχνεύσιμη p53 (Σχήμα 3Β), σε συμφωνία με Smith

et al

., ο οποίος έδειξε ότι υπάρχει μια μετάλλαξη στάση στο

P53

εξόνιο 5 σε αυτό το κελί γραμμής [22]. p16INK4a ήταν παρούσα σε Η69 κύτταρα και τα επίπεδα της δεν επηρεάστηκαν από τη θεραπεία με γελδαναμυκίνης για 48 ώρες (Εικόνα 3Β).

δείκτες γήρανσης σε ανάπτυξη συνελήφθη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκινικά κύτταρα

Η μη αναστρέψιμη σύλληψη του πολλαπλασιασμού που προκαλείται από αναστολή της HSP90 σε μικρά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα πρότειναν ότι αυτά τα κύτταρα είχαν γηράσκουν. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω το θέμα, αξιολογήθηκαν επιπλέον δείκτες της γήρανσης. Το Σχήμα 4Α δείχνει τη μορφολογία των καλλιέργειες εναιωρήματος των μη επεξεργασμένων κυττάρων Η69 οκτώ ημέρες μετά την απομάκρυνση γκελνταναμυκίνη. Επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν κάποια διεύρυνση και αυξημένη κυτταροπλασματική αναλυτικότητα, χαρακτηριστικά των γηρασμένων κυττάρων. Ένα άλλο κοινό χαρακτηριστικό των γηρασμένων κυττάρων είναι η παρουσία του γηρασμού που σχετίζεται ετεροχρωματίνη εστιών (SAHF) [23]. Συνεπής με επαγωγή γήρανση, η αναστολή της Hsp90 με γκελνταναμυκίνη οδήγησε στο σχηματισμό του SAHF σε κύτταρα Η69 όπως αποδεικνύεται από DAPI χρώση (Σχήμα 4Β). SAHF διατηρήθηκαν μετά την απομάκρυνση των γκελνταναμυκίνη, όπως αναμενόταν για έναν δείκτη γήρανση και εμπλουτίσθηκαν σε ιστόνης Η3 τριμεθυλιωμένη επί λυσίνη 9, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες (Σχήμα S1B) [24]. Η ενεργοποίηση μιας απόκρισης βλάβης του DNA είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό και των δύο αντιγραφικής και πρόωρη γήρανση που συμβάλλει στην φαινότυπο διακοπή της ανάπτυξης των γηρασμένων κυττάρων [25]. Ένα κεντρικό χαρακτηριστικό της απόκρισης βλάβη του DNA είναι η παραγωγή φωσφορυλιωμένη ιστόνης H2AX (γH2AX) σε περιοχές που γειτνιάζουν με βλάβες στο DNA. Και οι δύο θεραπείες γκελνταναμυκίνη και ραδισικόλη αυξημένα επίπεδα γH2AX σε Η69 κύτταρα (Σχήμα S1c). επίπεδα γH2AX παρέμειναν αυξημένα μέχρι και έξι ημέρες μετά την αφαίρεση γκελνταναμυκίνη, το μεγαλύτερο χρονικό σημείο που αξιολογείται (Σχήμα 4C). Αυτό είναι σύμφωνο με αναφορές ότι γηρασμένα κύτταρα διατηρηθεί ένας ενεργοποιημένος απόκριση βλάβης DNA για μια εκτεταμένη περίοδο μετά την επαγωγή του γηρασμού [25], [26].

A. κύτταρα Η69 υπέστησαν αγωγή μόνο με DMSO ή 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη για 48 ώρες. Γκελνταναμυκίνη στη συνέχεια απομακρύνθηκε. Οκτώ ημέρες αργότερα τα κύτταρα αφέθηκαν να κατακαθίσουν επάνω σε πολυ-L-λυσίνη καλυπτρίδων, σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη και φωτογραφήθηκαν υπό αντίθεση φάσης με χρήση 63X αντικειμενικό φακό. σχηματισμός Β SAHF μετά την επεξεργασία των κυττάρων με αναστολείς Hsp90. κύτταρα Η69 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού. κύτταρα C. Η69 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (έλεγχος) ή 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη. DMSO και geldnamycin κατόπιν απομακρύνθηκαν την Ημέρα 0. Συνολική κυτταρολύματα συλλέχτηκαν στις υποδεικνυόμενες ημέρες μετά την απομάκρυνση γκελνταναμυκίνη και αναλύθηκαν για τα επίπεδα γH2AX και Η2ΑΧ με κηλίδωση Western. Το γράφημα δείχνει πυκνομετρία για αναλύσεις Western blot τριών βιολογικών επαναλήψεις. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με τα κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα και εμφανίζονται ως μέσος όρος ± SE.

Η

Απομόνωση παραλλαγής Η69 κύτταρα που παρακάμπτουν γκελνταναμυκίνη επαγόμενη γηρασμό

Ενώ Η69 κύτταρα διατηρούνται μια διάδοση συνελήφθη κατάσταση για περισσότερο από τριάντα ημέρες μετά την απομάκρυνση του γελδαναμυκίνη, μετά από σαράντα περίπου ημέρες πληθυσμός κυττάρων έκανε αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται σε ένα πείραμα. Έχουμε ορίσει τον πληθυσμό αυτό ως Η69 /41δ κύτταρα. Η69 /41δ κύτταρα έχουν μια διακριτή μορφολογία: ενώ Η69 κύτταρα είναι μη προσκολλητικά κύτταρα που σχηματίζουν συσσωματώματα τραχύς, η παραλλαγή κύτταρα, ενώ επίσης μη προσκολλημένα, σχηματίζουν σφιχτά σφαίρες θυμίζουν εκείνα που παρατηρήθηκαν με βλαστοκυττάρων πληθυσμούς (Σχήμα 5Α). Με τον επανέλεγχο, αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ακόμη σύλληψη πολλαπλασιασμό σε απόκριση σε 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη, αλλά ήταν σε θέση να ανακτήσει πολλαπλασιαστική ικανότητα κατά την απομάκρυνση του φαρμάκου, παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος (Σχήμα 5Β). Η69 /41δ κύτταρα ήταν επίσης σε θέση να ανακτήσει πολλαπλασιαστική ικανότητα μετά την αγωγή με τον αναστολέα ραδισικόλη Hsp90 (Σχήμα 5C). Σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή γονέα Η69, Η69 /41δ κύτταρα έδειξαν παρόμοιες αποκρίσεις προς αναστολή της HSP90 σε σχέση με την αναστολή του πολλαπλασιασμού με την παρουσία του φαρμάκου, αν και ο κυτταρικός θάνατος έτεινε να συμβεί σε ελαφρώς χαμηλότερες συγκεντρώσεις από παρατηρείται με Η69 κύτταρα (Σχήμα 5D). Η αποδόμηση των πρωτεϊνών πελατών και επαγωγή άλλων πρωτεϊνών θερμικού σοκ ήταν επίσης παρόμοια στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 6Α). Όπως και παραπάνω, αυτό αποκλείει τις διαφορές στην επεξεργασία των ναρκωτικών μεταξύ των δύο κυτταρικών πληθυσμών, και δείχνει ότι οι διαφορές οφείλονται σε γεγονότα κατάντη της αναστολής Hsp90 που επηρεάζουν ειδικά αν τα κύτταρα υφίστανται αναστρέψιμες ή μη αναστρέψιμες σύλληψη του πολλαπλασιασμού. σχηματισμός SAHF επίσης μειωμένη σε Η69 /41δ κύτταρα (Σχήμα 6Β). Σε Η69 κύτταρα, SAHF ανιχνεύθηκαν μέγιστο σε περίπου 35% των κυττάρων (Σχήμα 6C). Σε αντίθεση, η θεραπεία γελδαναμυκίνης προκάλεσε μόνο μία μέτρια αύξηση SAHF σε Η69 /41δ κύτταρα και SAHF ανιχνεύθηκαν στο 4,5% των κυττάρων μέγιστο (Σχήμα 6C).

Α. Οι φωτογραφίες του Η69 και Η69 /41d κύτταρα υπό μικροσκοπία φάσης, σε χαμηλή (επάνω πάνελ) και υψηλή (κάτω πάνελ) μεγέθυνση? Β Η69 και Η69 /41d κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ηΜ γκελνταναμυκίνη για 48 ώρες. Γκελνταναμυκίνη στη συνέχεια απομακρύνθηκε και οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου. C. Η69 και Η69 /41d κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ ραδισικόλη για 48 ώρες. Radicicol στη συνέχεια απομακρύνθηκε και οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου. Δ ΜΤΤ δοκιμασία του Η69 /41δ κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία για 48 ώρες με γελδαναμυκίνης.

Η

Η69 και Η69 41δ κύτταρα /υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με γελδαναμυκίνης ή DMSO ως έλεγχο του οχήματος. Προϊόντα λύσης Α Σύνολο κυττάρων συλλέχθηκαν μετά από αγωγή 48 ώρες και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western όπως στο Σχήμα 3. κύτταρα Β DMSO-αγωγή χρωματίστηκαν για SAHF 2 ημέρες μετά την απομάκρυνση του DMSO. κύτταρα Γκελνταναμυκίνη επεξεργασμένα χρωματίστηκαν για SAHF 2, 4 και 6 ημέρες μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου. Αντιπροσωπευτικές εικόνες μικροσκοπία φθορισμού των Η69 και Η69 /41d κυτταρικών πυρήνων, έξι ημέρες μετά την απομάκρυνση των γκελνταναμυκίνη, φαίνονται. Γ SAHF σε Η69 (ανοιχτό γκρι) και Η69 /41d κύτταρα (σκούρο γκρι) μετρήθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό των πυρήνων που είναι SAHF θετικές. Μπαρ δείχνουν το μέσο ποσοστό ± SE. D. Συνολική κυτταρικά εκχυλίσματα των μη επεξεργασμένων Η69 και Η69 κύτταρα /41δ αναλύθηκαν για έκφραση της πρωτεΐνης ρ21 με κηλίδωση Western.

Η

Για να εκτιμηθεί άμεσα την γενετική σχέση των Η69 κυττάρων με Η69 /41d κύτταρα, το DNA ήταν απομονώθηκε από δύο κυτταρικές σειρές και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Affymetrix Genome-Wide Ανθρώπινα SNP Array 6.0 chips, τα οποία περιέχουν ανιχνευτές για 900.000 πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου και παρόμοιο αριθμό ανιχνευτών για την αξιολόγηση αντίγραφο παραλλαγή αριθμό. Το σχήμα S2 δείχνει καρυότυποι από τις δύο κυτταρικές σειρές ανακατασκευάστηκε από αυτά τα δεδομένα (κάθε συγκρίνεται με ένα καρυότυπο αναφορά Affymetrix). κύτταρα Η69 δείχνουν εκτεταμένη χρωμοσωμικών ανωμαλιών όπως αναμενόταν για τα καρκινικά κύτταρα. Αυτές οι απώλειες, τα κέρδη και οι περιφέρειες της ενίσχυσης /μεταβολής αριθμού αντιγράφων είναι πολύ παρόμοια μεταξύ Η69 και Η69 κύτταρα /41δ, δείχνει σαφώς ότι έχουν κλωνική σχέση. Μερικές διαφορές ήταν εμφανείς μεταξύ των δυο κυτταρικών γραμμών. Αυτές περιλαμβάνουν ένα Mbp διαγραφή 4,8 στο μοναδικό αντίγραφο του χρωμοσώματος 2 που περιέχει περίπου δεκαεννέα γονίδια και Mbp διαγραφή 9,6 σε ένα αντίγραφο του χρωμοσώματος 11 που περιέχει περίπου 83 γονίδια. Υπάρχει επίσης ένα κέρδος του μακρού βραχίονα του χρωμοσώματος 3 και απώλεια της μερικής μακρύ βραχίονα του χρωμοσώματος 15. Εντούτοις, η ανάλυση αριθμός SNP /αντιγραφή δεν αναφέρει ούτε μία ορίζεται γενετικό τόπο που θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί Η69 /41δ κύτταρα είναι είναι σε θέση να αποφύγει Hsp90 αναστολέας που προκαλείται από τη γήρανση. Ως δεύτερη προσέγγιση για τον προσδιορισμό της μηχανισμός με τον οποίο αυτά τα κύτταρα διαφεύγουν Hsp90 αναστολέα προκαλούμενη γήρανση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε διαλογή για έναν αριθμό πρωτεϊνών που έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι έχουν σημαντικούς ρόλους στη γήρανση. p21 (CDKN1A, p21WAF1 /Cip1) είναι ένα τέτοιο πρωτεΐνη που έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, δεδομένου ότι έχει αποδειχθεί ότι επάγει γήρανση σε καρκινικά κύτταρα που στερούνται της ρ53 [27]. ρ21 εκφράζεται σε Η69 κύτταρα αλλά δεν ανιχνεύεται στο Η69 /41δ κύτταρα (Σχήμα 6D). Δεδομένου γνωστό ρόλο της στην εισαγωγή και διατήρηση της γήρανση [26], η απώλεια της έκφρασης p21 παρέχει μια εύλογη εξήγηση για την αποτυχία του Η69 /41δ κύτταρα να υποστούν γήρανση σε απάντηση αναστολείς Hsp90.

Συζήτηση

σε προηγούμενες μελέτες, η πιο συχνά περιγράφεται απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε αναστολή της HSP90 έχει διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Αυτή η διακοπή του κυτταρικού κύκλου έχει γενικά υποτίθεται ότι είναι αναστρέψιμες στη φύση, αν και οι περισσότερες μελέτες δεν ασχολήθηκε με αυτό άμεσα. Ανάπτυξη σύλληψης μπορεί να συμβεί είτε στην G1 /S ή G2 /M μετάπτωσης [28], [29] και είναι πιθανό να είναι μια συνέπεια της εξάρτησης από Hsp90 πρωτεϊνών όπως CDK4, cdc2 και πόλο-όπως κινάση [30] – [ ,,,0],32]. Σε ένα υποσύνολο τύπους καρκινικών κυττάρων, οι αναστολείς Hsp90 έχει δειχθεί ότι επάγει απόπτωση. Αυτές περιλαμβάνουν μικρά καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και κυττάρων πολλαπλού μυελώματος που [18], [33].

Εκτός από παροδική διακοπή του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο, μια τρίτη κυτταρική μοίρα για τα καρκινικά κύτταρα είναι γήρανση. Για τα καρκινικά κύτταρα, αυτό μερικές φορές αναφέρεται ως «πρόωρη» ή «ταχεία» κυτταρική γήρανση για να ξεχωρίζει από την αντιγραφική γήρανση που φυσιολογικά κύτταρα υφίστανται φτάνοντας όριο Hayflick τους [34], [35]. Γήρανση στον καρκίνο έχει μελετηθεί σε δύο πλαίσια: το πρώτο από αυτά είναι διεγειρόμενου από γηρασμό εμφανίζονται σε απόκριση προς την ενεργοποίηση ογκογονιδίου, όπου μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην προστασία των οργανισμών από την ανάπτυξη καρκίνου? το δεύτερο από αυτά είναι ως απάντηση σε θεραπευτικά μέσα του καρκίνου [36]. παράγοντες χημειοθεραπείας που βλάπτουν το DNA φαίνεται να επάγουν γήρανση σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι παράγοντες που στοχεύουν μικροσωληνίσκους [37]. Αυτό είναι πιο πιθανό να συμβεί με την έκθεση σε χαμηλότερες δόσεις του φαρμάκου, με υψηλότερες δόσεις που προκαλούν απόπτωση. Η χημειοθεραπεία που προκαλείται από γηρασμό έχει παρατηρηθεί τόσο σε κυτταρική καλλιέργεια και σε μοντέλα ζώων [38].

Το κλειδί, καθοριστικά χαρακτηριστικά των γηρασμένων κυττάρων είναι ότι παραμένουν μεταβολικά ενεργός, αλλά υποβάλλονται σε παρατεταμένη απόσυρση από τον κυτταρικό κύκλο η οποία είναι δεν αντιστρέφονται μέσω τυπικών μιτογόνα ερεθίσματα. Μετά παροδική έκθεση σε χαμηλές συγκεντρώσεις γκελνταναμυκίνη, μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα τα καρκινικά κύτταρα παρέμειναν ζωντανοί και μεταβολικά ενεργοί (όπως υποδεικνύεται με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου και προσδιορισμούς ΜΤΤ). Ωστόσο, αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μια σύλληψη πολλαπλασιασμός που διατηρήθηκε για περισσότερο από τριάντα ημερών, παρά την τακτική προσθήκη φρέσκου μέσου που περιέχει ορό εμβρύου μόσχου, μια πλούσια πηγή μιτογόνα. Η σύλληψη του πολλαπλασιασμού ήταν εμφανής τόσο από ζωντανές μετρήσεις κυττάρων και από δοκιμασίες ενσωμάτωσης BrdU.

Εκτός από τη μόνιμη σύλληψη του πολλαπλασιασμού, έχουν επιπλέον δείκτες γήρανσης έχουν αναπτυχθεί, αν και κανένα από αυτά θεωρείται σήμερα ως ένας οριστικός δείκτης της η γηρασμένα κατάσταση [39]. Μια χαρακτηριστική σειρά μορφολογικών αλλαγών έχουν περιγραφεί για γηρασμένα κύτταρα που περιλαμβάνουν διόγκωση των κυττάρων και αυξημένη αναλυτικότητα του κυτταροπλάσματος [40]. Τα χαρακτηριστικά αυτά ήταν εμφανή σε Η69 μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα τα κύτταρα στα οποία υπέστησαν σύλληψη πολλαπλασιασμός είχε προκληθεί από αναστολείς Hsp90. (Δεν δείχνουν την ισοπέδωση περιγράφεται για προσκολλημένα κύτταρα, όπως τα μικρά πνεύμονα καρκινικά κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη μεγαλώνουν σε εναιώρημα.) SAHF είναι ένας άλλος δείκτης που παρατηρείται συνήθως σε κύτταρα σε γήρανση και που πιστεύεται ότι έχει ένα ρόλο στη διατήρηση της γηρασμένα φαινότυπο. SAHF υπήρχαν σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα στα οποία υπέστησαν σύλληψη πολλαπλασιασμός είχε προκληθεί από αναστολείς Hsp90. Η έκφραση του SAHF διατηρήθηκε για μέχρι και έξι ημέρες μετά την αφαίρεση του αναστολέα Hsp90 (το μακρύτερο χρονικό σημείο που εξετάστηκαν) και τη χρονική πορεία για την εμφάνισή τους ήταν παρόμοια με προηγούμενες μελέτες σχετικά με την επαγωγή της πρόωρης γήρανση από διάφορους παράγοντες [41], [42] . Η ενεργοποίηση της απόκρισης βλάβη του DNA είναι επίσης παρατηρείται συνήθως σε γήρανση, όπου έχει ένα ρόλο τόσο στην έναρξη και διατήρηση του γηρασμένου φαινοτύπου [25], [26]. αναστολείς της HSP90 (τόσο γελδαναμυκίνης και ραδισικόλη) ενεργοποιείται μια απάντηση βλάβη στο DNA που διατηρήθηκε μετά την απομάκρυνση αναστολέα. Αυτό το εύρημα είναι επίσης συνεπής με φαινότυπο γήρανση και παρέχει έναν μηχανισμό με τον οποίο αυτοί οι αναστολείς ενεργοποιούν γήρανσης.

βλάβη του DNA, είτε τελομερή ή μη τελομερείς, είναι η πιο ευρέως χαρακτηρισμένο επαγωγέας του γηρασμού. Εκτός του ότι είναι ένας δείκτης γήρανση, η ενεργοποίηση της απόκρισης βλάβης του DNA από αναστολείς Hsp90 παρέχει επίσης ένα μηχανισμό με τον οποίο αυτοί επάγουν γήρανση σε μικρά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα. Προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης επισημάνει σε μια σύνδεση μεταξύ της Hsp90 και βλάβες στο DNA:. Τόσο τελομεράσης και η αναιμία DNA μονοπάτι απάντηση βλάβη Fanconi εξαρτώνται από την Hsp90 για τη δραστηριότητά τους [43], [44]

Γήρανση σχετίζεται με β- γαλακτοσιδάσης (SAβgal) έχει επίσης χρησιμοποιηθεί ευρέως ως ένας δείκτης γήρανση [35]. SAβgal δραστηριότητα ανιχνεύεται ως συνέπεια της επέκτασης του λυσοσωμιακό διαμέρισμα σε κύτταρα σε γήρανση, αλλά δεν απαιτείται για επαγωγή γηρασμός ή συντήρηση [45]. Μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς της Hsp90 δεν ήταν θετικά για SAβgal. Αδριαμυκίνη επίσης δεν προκάλεσε SAβgal σε μικρά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, όταν χρησιμοποιούνται σε συγκεντρώσεις που επάγεται αυτόν τον δείκτη σε άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων. Αυτό υποδηλώνει ότι SAβgal δεν μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης της γήρανσης σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι αυτά τα κύτταρα έχουν ελάχιστα κυτταρόπλασμα και είναι εξειδικευμένα εκκριτικά κύτταρα τα οποία μπορεί να έχουν ένα σχετικά μικρό λυσοσωμιακό διαμέρισμα.

Στο σύνολό τους, τα παραπάνω στοιχεία δείχνουν ότι οι αναστολείς της HSP90 διεγείρει μια παρατεταμένη σύλληψη πολλαπλασιασμού που έχει χαρακτηριστικά συνεπή με πρόωρη γήρανση. Αυτή η πρόωρη γήρανση συνέβη σε συγκεντρώσεις γκελνταναμυκίνη που συσχετίζονται στενά με τις συγκεντρώσεις που απαιτούνται για την επαγωγή της αποδόμησης των καθιερωμένων πρωτεΐνες πελάτη Hsp90 και να επάγει την έκφραση άλλων πρωτεϊνών θερμικού σοκ (ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη αναστολή της HSP90). Πρόωρη γήρανση επίσης επάγεται από 17-AAG (tanespimycin? 17-αλλυλαμινο-17-δεμεθοξυγελδαναμυκίνη), ένα παράγωγο γκελνταναμυκίνης που έχει δοκιμαστεί σε κλινικές δοκιμές [46]. 17-AAG που προκαλείται από γηρασμό σε συγκέντρωση η οποία είναι παρόμοια με τις συγκεντρώσεις που επιτυγχάνονται στο πλάσμα των ασθενών που αντιμετωπίστηκαν με τη μέγιστη ανεκτή δόση αυτής της ένωσης [12], υποδηλώνοντας ότι αυτή η απόκριση είναι κλινικά σημαντική. επαγωγή Γήρανση από τους αναστολείς Hsp90 δεν απαιτεί ούτε ρ53 ούτε Rb, καθώς και οι δύο από αυτούς τους καταστολείς όγκων είναι γνωστό ότι μεταλλάσσεται στην κυτταρική γραμμή Η69 χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή.

Σε μερικά πειράματα, πληθυσμούς κυττάρων άρχισε να αυξάνεται μετά από μακροχρόνια καλλιέργεια των γηρασμένων κυττάρων Η69. Ένα από αυτά τα κυτταρικών πληθυσμών, που ορίζεται Η69 /41d, χαρακτηρίστηκε με λεπτομέρεια. SNP και ο αριθμός αντιγράφων ανάλυση αυτών των κυττάρων δείχνει ότι ενώ αυτοί προέρχονται σαφώς από Η69 κύτταρα έχουν ένα διακριτό σύνολο γενετικών αλλαγών. Αυτά τα κύτταρα εμφανίζουν παρόμοιες αποκρίσεις προς αναστολή της HSP90 ως μητρική Η69 κυττάρων σε σχέση με την αναστολή του πολλαπλασιασμού με την παρουσία του φαρμάκου και διέγερση θανάτου κυττάρου σε υψηλές συγκεντρώσεις γκελνταναμυκίνη. Ωστόσο υφίστανται μία αναστρέψιμη, αντί μη αναστρέψιμη σύλληψη πολλαπλασιασμό σε απόκριση προς αναστολή της HSP90. Η69 /41δ κύτταρα εμφανίζουν επίσης όμοια απαντήσεις στην γονική κυτταρική σειρά σε σχέση με την αποδόμηση των πρωτεϊνών πελατών Hsp90 και επαγωγή άλλων πρωτεϊνών θερμικού σοκ. Έτσι αυτή η μορφή «αντίσταση» στην αναστολή Hsp90 είναι σαφώς διακριτή από εκείνη που περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες, όπου η αντίσταση οφείλεται σε μεταβολές στα ένζυμα που μεταβολίζουν φάρμακα και αντανακλάται στην απαίτηση για υψηλότερες δόσεις για να δούμε κυτταρικές επιδράσεις [47]. Η απομόνωση αυτών των κυττάρων καταδεικνύει ότι, κατ ‘αρχήν, μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων με επιπλέον γενετικές αλλαγές μπορεί να αποφύγει Hsp90 που προκαλείται πρόωρη γήρανση. p21 (CDKN1A) έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής του γηρασμού, μια ιδιότητα που φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από ανασταλτική δράση της κατά των εξαρτώμενων από κυκλίνη κινασών [48]. ρ21 ρυθμίζεται από δύο ρ53 και ρ53-ανεξάρτητοι μηχανισμοί και μπορεί να προκαλέσει sensescence σε κύτταρα που έχουν έλλειψη ρ53 (όπως είναι η περίπτωση για Η69 κύτταρα) [27].