Αφηρημένο

Παρά την πρόοδο στην τοποπεριοχική και συστηματικές θεραπείες, η επιβίωση των ασθενών από καρκίνο του πνεύμονα παραμένει μια πρόκληση. Οι κινάσες τυροσίνης υποδοχέα συχνά εμπλέκονται στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα, και μερικές στρατηγικές αναστολής κινάσης τυροσίνης υπήρξαν αποτελεσματικά κλινικά. Η κινάση τυροσίνης υποδοχέα EphB4 εμφανίστηκε πρόσφατα ως ένας πιθανός στόχος σε διάφορες άλλες μορφές καρκίνου. Επιδιώξαμε να μελετήσει συστηματικά το ρόλο των EphB4 στον καρκίνο του πνεύμονα. Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι EphB4 υπερεκφράζεται 3-φορές σε όγκους του πνεύμονα σε σύγκριση με ζεύγη φυσιολογικούς ιστούς και συχνά εμφανίζει τον αριθμό αντιγράφων του γονιδίου αυξήσεις στον καρκίνο του πνεύμονα. Δείχνουμε επίσης ότι η υπερέκφραση του EphB4 προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, σχηματισμό αποικιών, και κινητικότητα, ενώ EphB4 αναστολή μειώνει την κυτταρική βιωσιμότητα

in vitro

, σταματά την ανάπτυξη των εγκατεστημένων όγκων σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού όταν χρησιμοποιείται ως στρατηγική single-στόχος , και προκαλεί σχεδόν πλήρη υποχώρηση των εγκατεστημένων όγκων όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με πακλιταξέλη. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ένα σημαντικό ρόλο για EphB4 ως δυνητικό νέο θεραπευτικό στόχο στον καρκίνο του πνεύμονα. Οι κλινικές δοκιμές ερευνούν την αποτελεσματικότητα των αντι-EphB4 θεραπείες, καθώς και συνδυαστική θεραπεία περιλαμβάνει αναστολή EphB4 μπορεί να δικαιολογείται

Παράθεση:. Ferguson BD, Liu R, Rolle CE, Tan Υ-HC, Krasnoperov V, Kanteti R, et al. (2013) Η EphB4 υποδοχέων τυροσινικής κινάσης Προωθεί πνεύμονα ανάπτυξης καρκίνου: Μια πιθανή νέα θεραπευτική Target. PLoS ONE 8 (7): e67668. doi: 10.1371 /journal.pone.0067668

Συντάκτης: Todd W. Miller, Dartmouth, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Φλεβάρη, 2013? Αποδεκτές: 21η Μάη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιούλη, 2013

Copyright: © 2013 Ferguson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα έχει υποστηριχθεί εν μέρει από ΝΙΗ /NICHD T32HD009007, «μεταπτυχιακή εκπαίδευση στην ανάπτυξη και την Ανάπτυξη» (BDF), Βραβείο ASCO Μεταγραφική (EEV), ΝΙΗ /NCI R01 CA 129 501 05 (RS), και Janice Lamb McArdle Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο (RS ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. PSG είναι ο συν-ιδρυτής και διευθυντής του Vasgene Therapeutics, Inc. VK είναι ένα υπάλληλος της Vasgene Therapeutics, Inc. υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας και τα προϊόντα στην ανάπτυξη, αλλά δεν διατίθενται στην αγορά προϊόντα που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς. Οι υπόλοιποι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Αν και έχουν πολλές στόχοι των ναρκωτικών έχουν μελετηθεί εκτενώς, η συνολική επιβίωση του καρκίνου του πνεύμονα έχει βελτιωθεί ελάχιστα κατά τη διάρκεια των τελευταίων τεσσάρων δεκαετιών [1 ]. Ένα συχνό χαρακτηριστικό του καρκίνου του πνεύμονα είναι μια εκτροπή στην οποία ένα ή περισσότερα κινάσες τυροσίνης υποδοχέα (RTKs), όπως ΜΕΤ, EGFR, και ALK, συνήθως υπερεκφράζονται, ενισχύεται, ή μεταλλαγμένο [2] – [4]. Η οικογένεια Eph είναι η μεγαλύτερη οικογένεια των RTKs, η οποία περιλαμβάνει δεκατέσσερα υποδοχείς θηλαστικών που αλληλεπιδρούν με οκτώ συνδετήρες θηλαστικού, ή εφρινών. Οι Eph υποδοχείς και συνδέτες εφρίνης οργανωμένη λειτουργικά και δομικά σε Α και Β τάξεις [5]. Εφ υποδοχείς είναι σχετικά παρόμοια σε όλες τις κατηγορίες? Ωστόσο, οι δεσμευμένες σε μεμβράνη συνδέτες εφρίνης-Β είναι μοναδικό στο ότι διαθέτουν εξωκυτταρικές περιοχές που ενεργοποιούν τους υποδοχείς καθώς και ενδοκυτταρικές περιοχές που πιστεύεται ότι σηματοδοτούν κατάντη εντός ενός γειτονικού κυττάρου [6]. Υπάρχει κάποια ασυδοσία μεταξύ των αλληλεπιδράσεων υποδοχέα και συνδέτη? μία από τις πλέον ειδικές αλληλεπιδράσεις υποδοχέα-συνδετήρα, όμως, είναι μεταξύ EphB4 και εφρίνης-Β2 [7].

Κλασικά, Eph υποδοχείς έχουν σημαντικούς παράγοντες στην αναπτυξιακή βιολογία δεδομένους ρόλους τους στην καθοδήγηση άξονα, αγγειογένεση, και ανάπτυξη του νευρικού συστήματος [8]. Ωστόσο, πολλά μέλη της οικογένειας υποδοχέα Eph έχουν επίσης δειχθεί να παίζει ένα ρόλο στον καρκίνο. Δείξαμε πρόσφατα ότι η EphA2 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του πνεύμονα και φιλοξενεί ένα σημείο μετάλλαξης κέρδος-of-λειτουργίας σε ορισμένα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, και αναστολή EphA2 επιπροσθέτως ραπαμυκίνης έκθεση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα μειώνεται τους πολλαπλασιασμό

in vitro

[9]. EphB4 έχει επίσης αναφερθεί να διαδραματίσουν ογκογόνο ρόλο σε καρκίνους της κεφαλής και του τραχήλου [10], [11], του προστάτη [12], [13], εκτός ουροποιογεννητικού όργανα [14] – [19], του μαστού [20], mesothelium [21], του οισοφάγου [22], το δέρμα [23], και παχέος εντέρου [24], [25]. μεταλλάξεις EphB4 έχουν επίσης πρόσφατα αναφερθεί στον καρκίνο του πνεύμονα [26], [27], αν και η σημασία τους είναι προς το παρόν άγνωστη. Ωστόσο, δεν έχει μελετηθεί συστηματικά στον καρκίνο του πνεύμονα και συνεπώς εν δυνάμει ρόλο της σε αυτή την ασθένεια παραμένει ένα σημαντικό ζήτημα.

Εδώ, δείχνουμε ότι EphB4 είναι ένας σημαντικός θεραπευτικός στόχος στον καρκίνο του πνεύμονα, καθώς υπερεκφράζεται και συχνά επιδεικνύει αυξημένη αριθμούς αντιγράφων του γονιδίου. Επιπλέον, knockdown ή την αναστολή της EphB4 εξασθενεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

και

in vivo

, ενώ εισαγωγή του άγριου τύπου EphB4 παρέχει ένα κέρδος της λειτουργίας σε κύτταρα όγκου. Στο σύνολό τους, τα δεδομένα αυτά προσδιορίζουν EphB4 ως εν δυνάμει σημαντικό παράγοντα στην παθογένεια του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

ιστούς όγκων τεκμηριώνονται μαζί με τα χαρακτηριστικά των ασθενών όταν θα είναι διαθέσιμα με τη γραπτή συγκατάθεση και, σύμφωνα με το Πανεπιστήμιο του Σικάγο Institutional Review Board-εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Όλες οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας και εκτελούνται σύμφωνα με τους κανονισμούς της Πράξης καλή μεταχείριση των ζώων.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer3Plus [28] και αγοράστηκε από την Ολοκληρωμένη DNA Technologies (Coralville ΙΑ). Αντι-EphB4 αντισώματα (# 265 για IB και # 131 για IHC), αντίσωμα αντι-εφρίνης-B2 (# 2B5), και ανθρώπινο ορό αλβουμίνης συζευγμένα με διαλυτά EphB4 (sEphB4-HSA), είχαν γενναιόδωρα παρέχονται από το Εργαστήριο Gill, Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας. Ephrin-B2 /Ρο χιμαιρική πρωτεΐνη αγοράστηκε από την R & amp? D (Minneapolis ΜΝ). Αντι-SS-ακτίνης αντίσωμα αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis ΜΟ). AZ12489875-002 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από την AstraZeneca. SN-38 αγοράστηκε από Tocris Βιοεπιστημών (Bristol UK).

Cell Culture

Α549, Η358, Η522, H661, H1703, H1993, H2170, SW1573, BEAS-2B, Η69, Η82 , H184, Η249, Η345, Η446, H526, H2171, και κυτταρικές PC3 σειρές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas νΑ. οι κυτταρικές γραμμές επικυρώνονται από ATCC και συνήθως ελέγχονται για την παρουσία μυκοπλάσματος. Όλες οι κυτταρικές γραμμές ήταν διατηρείται στους 37 ° C και 5% CO2 σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 2% διττανθρακικό νάτριο, 1% πυροσταφυλικό νάτριο, 1% ρυθμιστικό διάλυμα HEPES, και 1% L-γλουταμίνη .

ιστός Προμηθειών

Ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα ασθενής αρχειακό ιστοί ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο του Σικάγο Ανθρωπίνων ιστών Resource Center.

η ανοσοϊστοχημεία

Παραφίνη καρκίνο του πνεύμονα ιστό τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης διαλύματα αιθανόλης σε απεσταγμένο νερό, και πλένονται σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS). αντιγόνου ανάκτηση διεξήχθη με τμήματα θέρμανση σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6) για 15 λεπτά σε φούρνο μικροκυμάτων. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με επώαση σε 3% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 5 λεπτά. Μη ειδικές θέσεις σύνδεσης αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας Πρωτεΐνη Block (Dako, Carpinteria CA) για 20 λεπτά. Οι τομές επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με αντι-EphB4 πρωτογενές αντίσωμα (αντι-ποντικού? # 131) σε συγκέντρωση 40 μg /mL, στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά με κατσίκας αντι-ποντικού IgG συζευγμένο σε ένα HRP-σημασμένο πολυμερές (Bio SB, Santa Barbara CA). Τα πλακίδια στη συνέχεια αναπτύχθηκαν για 5 λεπτά με 3-3′-διαμινοβενζιδίνη χρωμογόνο, αντίθετα με αιματοξυλίνη, και καλυπτρίδα. Οι αρνητικοί έλεγχοι διεξήχθησαν με υποκατάσταση πρωτογενούς αντισώματος με μη-άνοσο ανοσοσφαιρίνες ποντικού. Καρκίνος του παχέος εντέρου και εγκεφαλικού ιστού τομές χρησίμευσαν ως θετικοί μάρτυρες για χρώση EphB4 [25], [29].

έκφραση ιστού για κάθε δείγμα ποσοτικοποιήθηκε με χειροκίνητη βαθμολογίας ενός 0/1 + /2 + /3 + κλίμακα , καθώς και από ένα αυτοματοποιημένο σύστημα απεικόνισης Cellular (ACIS? Clarient, Aliso Viejo CA), η οποία ποσοτικοποιεί ένταση χρώσης με βάση την αναλογία του καφέ έως μπλε pixels ανά μονάδα επιφάνειας. λογισμικό ACIS υπολογίζει τη μέση ένταση για κάθε περιοχή αναλύονται και υπολογίζει την ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (IOD), η οποία είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωση των μορίων EphB4 αντισώματος δεσμευμένο σύμφωνα με την Beer-Lambert νόμου [30]. Ως εκ τούτου, IOD είναι ένα υποκατάστατο για το περιεχόμενο αντιγόνο, και ομαλοποιήθηκε σε όλη την μετρούμενη περιοχή από τον υπολογισμό IOD /10 μm

2. Συνολικά, οδηγίες βαθμολόγησης και την ανάλυση ACIS χρησιμοποιήθηκαν ως παράλληλων μεθόδων ποσοτικοποίησης της έκφρασης και βρέθηκαν να έχουν μια συσχέτιση r

2 = 0,75 (Spearman συσχέτιση, σ & lt? 0,0001? Σχήμα S1). Καθώς οι τάσεις της έκφρασης ήταν παρόμοια με τις δύο μεθόδους, είναι κατά κύριο λόγο τα στοιχεία ACIS εδώ αναφερθεί. προτύπων έκφρασης χρησιμοποιώντας το ίδιο αντι-EphB4 αντισωμάτων ήταν παρόμοια σε κατεψυγμένα δείγματα ιστού (Εικόνα S2).

Ανοσοαποτύπωσης

λύματα ολόκληρων κυττάρων συλλέχθηκαν με χρήση Μ-PER αντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεϊνών θηλαστικών (Pierce , Rockford IL) συμπληρωμένο με 1.8 × αναστολέα πρωτεάσης (Pierce) και 1,8 αναστολέα φωσφατάσης × Halt (Pierce). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Nanodrop (Thermo, Wilmington DE), και 100 μα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε ένα πήκτωμα 7,5% και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE σε 80-120V για 1-2 ώρες. Οι πρωτείνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο σε μία συσκευή ημι-ξηράς μεταφορά στα 25 V για 1 ώρα, πλύθηκαν σύντομα, και οι μεμβράνες αποκλείσθηκαν με λευκωματίνη 5% βόειου ορού (BSA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από μία πλύση 5 λεπτών, οι μεμβράνες εκτέθηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε αντι-EphB4 πρωτογενές αντίσωμα (αντι-ποντικού? # 265) ή αντι-εφρίνης-B2 πρωτογενές αντίσωμα (αντι-ποντικού? # 2B5) σε συγκέντρωση 0,5 μg /mL σε 2.5% BSA /0.05% Tween-20. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές για 10 λεπτά και επωάστηκαν όπως παραπάνω σε δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση (HRP) σε μια αραίωση 1:5000 για 1 ώρα. Μετά μία άλλη πλύση, οι μεμβράνες επωάστηκαν σε διάλυμα ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Bio-Rad, Hercules CA) και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης Bio-Rad QuantityOne. β-ακτίνη επεσημάνθη παρομοίως ως έλεγχος φόρτωσης. Ο καρκίνος του προστάτη PC3 κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για έκφραση EphB4 [19].

Κυτταρομετρία Ροής

Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με PBS /0,2% ΕϋΤΑ στους 37 ° C για περίπου 5 λεπτά. Μετά εξουδετέρωση του EDTA με μέσα καλλιέργειας, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 rpm για 5 λεπτά. Τα κύτταρα μετά πλύθηκαν με ψυχρό PBS /0.5% BSA, και ακολούθησε επώαση με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε πάγο για 30 m, και στη συνέχεια με πρωτεύοντα αντισώματα αραιωμένα σε φυσιολογικό ορό κατσίκας σε πάγο για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με ψυχρό PBS και επωάστηκαν με συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα δευτερογενή αντισώματα σε πάγο για 30 λεπτά. Μετά από μία τελική πλύση με ψυχρό PBS, οι πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και αναλύθηκαν με ένα κυτταρόμετρο ροής (LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes NJ).

ποσοτική PCR

Για να προσδιοριστεί αριθμό αντιγράφων του γονιδίου EphB4 στο DNA του ιστού, σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο Applied Biosystems StepOne Plus (Foster City CA). Τα μίγματα αντίδρασης περιείχαν Fast SYBR Green Master Mix (2Χ? Applied Biosystems), γονιδιωματικό DNA, εμπρός και όπισθεν qPCR εκκινητές (φαίνονται στον Πίνακα S1), και της βιολογίας-βαθμού ύδωρ μοριακών με το σύνολο των 25 μL ανά αντίδραση. qPCR χρησιμοποιώντας LINE-1 εκκινητές διεξήχθη παράλληλα για να χρησιμεύσει ως αριθμός αντιγράφου γονιδίου αναφοράς για την ομαλοποίηση των πρώτων τιμών φθορισμού, και οι αντιδράσεις που περιέχουν διάφορες αραιώσεις του ελέγχου γονιδιωματικού DNA (Promega, Madison WI) χρησιμοποιήθηκαν για να κατασκευαστεί μια πρότυπη καμπύλη για να προεκτείνουν οι συγκεντρώσεις DNA ιστού και βεβαιωθείτε ότι οι συγκεντρώσεις αυτές εμπίπτουν στο γραμμικό εύρος ανίχνευσης του οργάνου.

siRNA Νοκ ντάουν

Για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυτταρικές σειρές, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιβιοτικά -δωρεάν μέσου σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 2,0 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο (για τις δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας? οκτώ ή περισσότερα αντίγραφα ανά πείραμα) ή τρυβλία 6 φρεατίων σε πυκνότητα 5,0 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο (για συλλογή προϊόντος λύσης ολικού κυττάρου) και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 30-50% συρροή. Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Oligofectamine αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Life Technologies, Carlsbad CA) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο της. FBS προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 10% μετά από 4 ώρες. Τα μη επιμολυσμένα και επιμολυσμένα κύτταρα mock χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Πρωτεΐνη knockdown επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα (Σχήμα S3).

Για μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) κυτταρικές σειρές, κύτταρα τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας Opti-ΜΕΜ σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο (τρεις επαναλήψεις ανά κατάσταση). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ μη-στόχευσης ελέγχου siRNA ή EphB4 στόχευση siRNA (Santa Cruz) χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Oligofectamine σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο της. Μετά την επώαση όλη την νύχτα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο. Mock-επιμολυσμένα κύτταρα και ελέγχου siRNA επιμολυσμένα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Πρωτεΐνη knockdown επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα.

Έκφραση EphB4 κατασκευάσματα σε Κυτταρικές Γραμμές

Α άγριου τύπου κλώνο cDNA EphB4 στον φορέα pCMV6-XL6 (ΟηΟεηε, Rockville MD) χρησιμοποιήθηκε ως θηλαστικού φορέα έκφρασης. Για παροδική επιμόλυνση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε αντιβιοτικό μέσο ελεύθερο είτε 96 φρεατίων σε πυκνότητα 2,0 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο (για τις δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας? Οκτώ επαναλήψεις ανά πείραμα) ή 10-cm πιάτα στο ένα πυκνότητα του 3,0 × 10

6 κύτταρα ανά πλάκα (για συλλογή προϊόντος λύσης ολικού κυττάρου) και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε περίπου 50-75% συρροή (για να επιτρέψει την εκθετική αύξηση κατά τη διάρκεια των ακόλουθων 72 ωρών). Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Life Technologies) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο της. Συγκροτήματα αφαιρέθηκαν μετά από 4-6 ώρες και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​ελεύθερο από αντιβιοτικά μέσο μετά από έκπλυση με PBS. Τα μη επιμολυσμένα και ψευδο-μορφομετατραπέντα (μόνο αντιδραστήριο επιμόλυνσης) κύτταρα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. έκφραση της πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση (Σχήμα S4)

Ίδρυση Σταθερό EphB4 εκφράζουν κυτταρικές γραμμές

άγριου τύπου πλήρους μήκους cDNA EphB4 (αριθμός πρόσβασης GenBank NM_004444? ΟηΟεηε, Rockville MD). κλωνοποιήθηκε σε pcDNA3.1 με ένα C-τερματικό tag Myc εντός πλαισίου. Αυτός ο φορέας και το pcDNA3.1 ελέγχου κενός φορέας μεμονωμένα διαμολύνθηκαν σε κύτταρα H661 χρησιμοποιώντας Biot (Bioland, Paramount CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά την επιμόλυνση, το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε στο τελικό μέσο ανάπτυξης (RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS) που περιέχει 300 μg /mL G418. Μία εβδομάδα αργότερα, επιζώντα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με κλιμακούμενες αραιώσεις. Η συγκέντρωση του G418 στο μέσο καλλιέργειας μειώθηκε σε 200 μg /mL από αυτό το σημείο. Απλές αποικίες εμφανίστηκαν δύο εβδομάδες αργότερα και υποβλήθηκαν σε διαλογή με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-Μγο (κλώνος 9Ε10, ATCC). Οι αποικίες με εξωγενή έκφραση EphB4-Myc στη συνέχεια επεκτάθηκαν.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασίες

Για κυτταρικές γραμμές NSCLC, μετά την επιμόλυνση του siRNA ή πλασμιδίων σε κύτταρα ή επεξεργασία των κυττάρων με sEphB4-HSA σε 96- φρεατίων όπως περιγράφεται παραπάνω, τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν μέχρι το επιθυμητό χρονικό σημείο, οπότε απομακρύνθηκε το μέσο, ​​τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS, και 100 μι μέσου ανάπτυξης φρέσκο ​​προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά την προσθήκη 5 μL ενός διαλύματος άλατος νατρίου ρεζαζουρίνης 0,028% (βάρος /όγκο? Sigma), οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C προστατευμένο από το φως για 2-5 ώρες και ο φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού (530 /590nm διέγερσης /εκπομπής). Για εφρίνης-B2 /δοκιμασίες διέγερσης Fc, 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων, λιμοκτονούν επί μία νύκτα και διεγέρθηκαν με 1 μg /ml εφρίνης-B2 /Fc για 0, 24, 48 ή 72 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με 1 χ PBS, χρωματίστηκαν με Trypan μπλε διάλυμα (0,4%? Sigma)., Και με το χέρι μετρήθηκαν με μικροσκοπία φωτός

Για κυτταρικές σειρές SCLC, κύτταρα τοποθετήθηκαν εις τριπλούν σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,5 μg /ml του εφρίνης-B2 /Fc ή τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις AZ12489875-002. Για κύτταρα siRNA επιμολυσμένα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο, ​​επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο, και αφεθεί χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 200 ηΜ του SN-38 για 72 ώρες στους 37 ° C. Για εφρίνης-B2 /δοκιμασίες διέγερσης Fc, 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων, λιμοκτονούν επί μία νύκτα και διεγέρθηκαν με 0.5 μg /ml εφρίνης-B2 /Fc για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με την προσθήκη 10 μL 5ng /ml ΜΤΤ (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου? Sigma) για τις τελικές 2-4 ώρες καλλιέργειας. Τα αδιάλυτα άλατα φορμαζάνης διαλύθηκαν με την προσθήκη 50 μL ενός διαλύματος οξινισμένου ισοπροπανόλη. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 570 nm εντός 15 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης χρησιμοποιώντας αναγνώστη απορρόφησης πλάκας.

Η τοποϊσομεράση Ι Δραστηριότητα Δοκιμασία

Η446 και τα κύτταρα H526 αφέθηκαν μη διεγερμένα ή διεγερμένα για 15 λεπτά με 50 ng /ml από HGF ή εφρίνης-B2 /Fc, μετά πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν μία φορά με παγωμένο TEMP (10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 1 mM EDTA, 4 mM MgCl

2, 0.5 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF)). Τα κύτταρα στη συνέχεια εναιωρήθηκαν σε 1 ml ψυχρού TEMP για 10 λεπτά και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στα 1500 χ

g

για 10 λεπτά. Πυρηνική ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 20 μι ΤΕΡ (10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF) συν 20 μί 1 Μ NaCl, τοποθετήθηκαν επί πάγου επί τουλάχιστον 30 m, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 15,000 χ

g

για 15 λεπτά.

Top1

ενζυματική δραστικότητα σε πυρηνικά εκχυλίσματα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία χαλάρωσης DNA (TopoGen, Port Orange FL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 100 ng του υπερελικωμένου πλασμιδιακού DNA σε 20 μΐ μίγματος αντίδρασης (με 10 mM Tris-HCl (ρΗ 7,9), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,1 mM σπερμιδίνη, 5% γλυκερίνη) επωάστηκε στους 37 ° C ° C για 30 λεπτά με σκέτο και αραιώνονται σειριακά (1:04) πυρηνικών εκχυλισμάτων, καθαρισμένη ανασυνδυασμένη ανθρώπινη

Top1

(θετικός έλεγχος), ή αραιωτικό μέσο δοκιμασίας (αρνητικός έλεγχος). Οι αντιδράσεις τερματίστηκαν με την προσθήκη 5 μΐ 5 χ ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (5% SDS, 0,3% βρωμοφαινόλη μπλε). Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1% και απεικονίστηκαν ως ανωτέρω.

αποικίας μαλακού άγαρ Δοκιμασία Σχηματισμού

Για να αξιολογηθεί η ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων EphB4 φυσικού τύπου, 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα ανά φρεάτιο απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ σε πλάκες 6 φρεατίων. Εν συντομία, το στρώμα βάσης έγινε με ανάμιξη ίσων όγκων στείρου άγαρ 1,2% (ψύχεται στους 40 ° C) και 2 μεσαίου × RPMI1640 να ληφθεί ένα τελικό διάλυμα 0.6% άγαρ σε 1 × μέσο RPMI1640. Για το κορυφαίο στρώμα, το άγαρ αραιώθηκε σε 0,8% σε απεσταγμένο νερό, ψύχεται στους 40 ° C, και στη συνέχεια αναμιγνύεται σε ίσες αναλογίες με 2 × μέσο RPMI1640. Τα κύτταρα αμέσως προστίθεται στο μίγμα για να δώσει ένα τελικό διάλυμα 0.4% άγαρ σε 1 × μέσο RPMI1640. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 4 εβδομάδες στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2, στο οποίο φωτογραφήθηκαν σημείο βιώσιμων αποικιών και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ.

Επούλωση Δοκιμασίες

H661 empty-φορέα και φυσικού τύπου EphB4 σταθερός κλώνος κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν μέχρι 100% συρροή, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 μg /ml εφρίνης-B2 /Fc. Μια ευθεία μηδέν έγινε σε όλη τη στιβάδα κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 1-mL. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν απαλά με 1 χ PBS για την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων, και το μέσο αντικαταστάθηκε. Ελήφθησαν φωτογραφίες της περιοχής του τραύματος σε 0, 4, 7, 23, και 28 ώρες και αναλύθηκαν με λογισμικό TScratch (CSELab, ΕΤΗ Zurich, Switzerland).

In vivo

Tumor Growth

2 × 10

6 Α549 ή H1993 ή 4 × 10

6 Η446 κύτταρα εγχέονται στα πλευρά του 10-12 εβδομάδων αρσενικά Balb C αθυμικά ποντίκια /(Harlan Laboratories, CA Πλακεντίας ) και αφέθηκε να καθιερώσει πρωτογενείς όγκους περίπου 75 mm

3 κατ ‘όγκο. ενέσεις πλευρό επιλέχθηκαν πάνω από ένα ορθοτοπικό μοντέλο λόγω καθιερωμένη χρήση τους σε μελέτες για τον καρκίνο του πνεύμονα, καθώς και την ευκολία των μετρήσεων μη επεμβατική όγκου [32]. Η ανάπτυξη των όγκων μετρήθηκε τρεις φορές την εβδομάδα, και ο όγκος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας 0,52 × ένα × β

2 (που προέρχεται από τον υπολογισμό του όγκου ενός σφαιροειδές, V = 4/3 · π · α

2 · β, όπου α η ακτίνα του μικρού άξονα και το b είναι η ακτίνα του κύριου άξονα?. Ref 33), όπου α είναι η μακρύτερη διάσταση και b είναι η μικρότερη διάσταση του ψηλαφητή μάζα. Έξι ημέρες μετά την εμφύτευση, τα ποντίκια με ξενομοσχεύματα Α549 διαιρέθηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (έξι ποντικοί ανά ομάδα), και η θεραπεία ξεκίνησε: PBS (έλεγχος), πακλιταξέλη (20 mg /kg εβδομαδιαίως), sEphB4-HSA (20 mg /kg τρεις φορές ανά εβδομάδα), ή πακλιταξέλη συν sEphB4-HSA. Τα ποντίκια με H1993 ή Η446 ξενομοσχεύματα χωρίστηκαν σε δύο ομάδες (έξι ποντικοί ανά ομάδα), και ξεκίνησε θεραπεία: PBS (έλεγχος) ή sEphB4-HSA (50 mg /kg τρεις φορές την εβδομάδα). Ολες οι αγωγές χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς. Τα ζώα τελικά θυσιάστηκαν και οι όγκοι συλλέχθηκαν στο τέλος του πειράματος.

ανοσοφθορισμού

Ιστοί συλλέχθηκαν από ξενομοσχεύματα Α549 ποντίκι ήταν θραύση κατεψυγμένα και ενσωματωμένα σε ένωση OCT. 5-10 μm τομές σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη, πλύθηκαν σε PBS, και επωάζονται σε πρωτογενή αντι-Ki-67 (BD Biosciences), αντι-CD31 (BD Biosciences), αντι-φωσφορυλιωμένο S6 (S235 /S236? Cell Signaling, Danvers ΜΑ), αντι-φωσφορυλιωμένο Akt [S473 (Αναφ 34).? Cell Signaling], ή αντι-φωσφορυλιωμένης Src (Y416? Cell Signaling) αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Για ανοσοφθορισμού, τα τμήματα πλύθηκαν σε PBS και επωάστηκαν με Alexa Fluor-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Life Technologies). Μία δοκιμασία TdT μεσολάβηση dUTP nick-άκρο επισήμανση (TUNEL) (Promega, Madison WI) διεξήχθη επίσης να αξιολογηθεί απόπτωση. DAPI χρησιμοποιήθηκε ως ένα πυρηνικό αντιχρώση και χρησίμευσε ως έλεγχος έναντι του οποίου ομαλοποιήθηκαν κυτταρική εντάσεις δείκτη. Εικόνες συνελήφθησαν με μια Nikon Eclipse μικροσκόπιο φθορισμού 80i και το σύστημα σειράς απεικόνισης Meta Morph. Για ανοσοϊστοχημεία, οι τομές επωάστηκαν πρώτα σε δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με βιοτίνη, που ακολουθείται από συζευγμένο με HRP αβιδίνη, τότε 3,3′-διαμινοβενζιδίνη αντιδραστήριο (Vector Labs, Burlingame CA). Αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα πυρηνικό αντιχρωστική. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus BX51 και το Image-Pro Plus 6.0 σύστημα.

Στατιστικά

Για τις αναλύσεις ανοσοϊστοχημική χρώση, συνδεθείτε

10 τιμές ACIS για όγκο σε σχέση με συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων ήταν σε σύγκριση με τη χρήση ενός δίπλευρη paired t-test για τη συνολική κοόρτη ασθενούς καθώς επίσης και στο πλαίσιο των επιμέρους υποτύπους. Κάθε ACIS σκορ ένταση αντιπροσωπεύει το μέσο έως τρεις επαναλήψεις για ένα δεδομένο ασθενή προσδιορίζεται με τη χρήση χωριστών τεμαχίων των ιστών εντός της ίδιας μικροσυστοιχίας όγκου. Η ομοιότητα μεταξύ των ΕΔΣ και χειροκίνητη παθολογική βαθμολόγησης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα δύο-ουρά Spearman συσχέτιση. Τα δεδομένα επιβίωσης αποδίδεται με καμπύλες Kaplan-Meier βασίζονται σε ανοσοϊστοχημικές βαθμολόγησης έντασης (υψηλή έναντι χαμηλή χρησιμοποιώντας ένα σκορ αποκοπής 500 για ACIS, η οποία αντιπροσωπεύει την διάμεση συνολική ένταση) και στο χαρακτηρισμό αγώνα.

Για δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας, αναπαράγουν σημεία δεδομένων υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο και συγκρίθηκαν είτε να ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα χρόνου αντιστοίχιση (για κύτταρα siRNA επιμολυσμένα) ή σε κύτταρα ελέγχου χρόνου αντιστοίχιση (για sEphB4-HSA-κατεργασμένα κύτταρα). Για να συγκρίνετε θεραπείες κατά ζεύγη, χρησιμοποιήθηκε t δοκιμή ενός μαθητή. Άλλες συγκρίσεις δύο ομάδες έγιναν χρησιμοποιώντας t-test ενός σπουδαστή, και εκείνων των τριών ή περισσοτέρων ομάδων έγιναν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA. Για να εκτιμηθεί η μεταβλητότητα μεταξύ ενός συνόλου συνθηκών επεξεργασίας με πολλαπλά χρονικά σημεία, αμφίδρομη ΑΝΟνΑ χρησιμοποιήθηκε. Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, γραμμές σφάλματος που χρησιμοποιείται στην απεικόνιση δεδομένων κυτταρικής βιωσιμότητας αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης κανονικοποιημένης ως προς τοις εκατό διαφορά έναντι των τιμών ελέγχου. Για

in vivo

δοκιμασίες ανάπτυξης, η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών στην καρκινική ανάπτυξη σε κάθε χρονικό σημείο για κάθε συνθήκη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t test είτε του φοιτητή για ασύζευκτα δείγματα ή μονόδρομη ANOVA για δείγματα μεταξύ των τεσσάρων ομάδων θεραπείας. Για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας μιας αλλαγής σε μέσο όγκο του όγκου για ένα μεμονωμένο σκέλος θεραπείας, χρησιμοποιήθηκε t test ενός σπουδαστή. Όλες οι στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Prism (GraphPad, La Jolla CA) ή το στατιστικό πακέτο SAS (Cary NC).

Αποτελέσματα

EphB4 υπερεκφράζεται και έχει αύξηση του αριθμού αντιγράφων γονιδίου στον καρκίνο του πνεύμονα

κατά ζεύγη αναλύσεις των 89 συμφωνημένα φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, βρήκαμε EphB4 να είναι σημαντικά υπερεκφράζεται σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς αντιστοιχισμένο σε αδενοκαρκίνωμα (n = 41? 4,3-πλάσια μέση διαφορά), καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (n = 15? 2,9-πλάσια μέση διαφορά), καρκίνωμα μικρών κυττάρων (η = 13? 2,4-πλάσια μέση διαφορά), και πλακώδες καρκίνωμα (n = 10? 2,7-πλάσια μέση διαφορά) υποτύπους. Συνολικά, οι όγκοι βρέθηκαν να εκφράζουν EphB4 3,2 φορές πιο ισχυρά από ζευγαρωμένα φυσιολογικούς ιστούς (Εικόνα 1). EphB4 σε γειτονικό φυσιολογικό πνευμονικό ιστό φαίνεται στο Σχήμα S5.

A

. Εκπρόσωπος εικόνες ανοσοϊστοχημεία της έκφρασης EphB4 σε πολλαπλούς υποτύπους του καρκίνου του πνεύμονα. Παθολογική βαθμολόγησης αναφέρεται ανωτέρω στήλες? δεξιά πίνακας είναι μια υπερκείμενη προβολή ισχύος των αντίστοιχων 3+ εικόνες εμφανίζοντας υποκυτταρικών χρώσης. Σημείωση προφέρεται μεμβρανώδης χρώση σε καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου.

Β

. EphB4 πρότυπα έκφρασης σε διάφορους υποτύπους του καρκίνου του πνεύμονα με τη φυλή και τη διανομή στάδιο. Μεμονωμένα σημεία αντιπροσωπεύουν μέσες βαθμολογίες ACIS σε έναν ασθενή για την αντίστοιχη φυσιολογικών και καρκινικών ιστών. Ο συνολικός αριθμός των ασθενών σε κάθε ανάλυση εμφανίζεται κάτω από τα γραφήματα. Μόνο οι ασθενείς με ζευγαρωμένα όγκου και φυσιολογικούς ιστούς συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις. Οριζόντιες μπάρες αντιπροσωπεύουν μέσες βαθμολογίες ACIS απέναντι όλους τους ασθενείς σε ένα δεδομένο σύνολο. Οι αγώνα και κλινικό στάδιο κατανομές για κάθε υπότυπο και τη συνολική σύνολο που εμφανίζεται κάτω από κάθε γράφημα.

Η

Θα καθοριστεί επίσης NSCLC κυτταρική γραμμή έκφραση EphB4 πρωτεΐνης μέσω ανάλυσης ανοσοαποτύπωσης (Εικόνα 2Α). Έξι από οκτώ NSCLC κυτταρικών σειρών (Α549, Η358, Η522, H1703, H1993, SW1573) που εκφράζεται EphB4 σε σημαντικό βαθμό, ένα (H661) έδειξαν χαμηλή έκφραση EphB4, και μία (H2170) έλειπε EphB4 έκφρασης. Ο συνδέτης EphB4 ephrin-Β2 εκφράστηκε σε σταθερά χαμηλά επίπεδα σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Έκφραση EphB4 σε ένα πάνελ οκτώ SCLC κυτταρικών γραμμών εξετάστηκε με ανοσοκηλίδωση (Εικόνα 2Β) και κυτταρομετρία ροής (Σχήμα 2C). Τέσσερις SCLC κυτταρικές σειρές (Η82, Η249, Η446, H2171) εξέφρασε EphB4 με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης, ενώ Η69 και H526 κύτταρα δεν εκφράζουν EphB4. Επιφανειακή έκφραση EphB4 με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής επικυρώνονται σε μεγάλο βαθμό τα ευρήματα ανοσοαποτύπωση.

Α-Β

. έκφραση της πρωτεΐνης EphB4 στο πάνελ του NSCLC και SCLC κυτταρικές σειρές από ανοσοαποτύπωση. έκφραση Ephrin-B2 αξιολογήθηκε επίσης σε κυτταρικές σειρές NSCLC. BEAS-2Β είναι μία αθανατοποιημένη, μη-καρκινικές πνεύμονα κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται εδώ ως μάρτυρας? ο καρκίνος του προστάτη PC3 κυτταρική γραμμή συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος. Β-ακτίνη και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης.

C

. έκφραση EphB4 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών SCLC αξιολογείται με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αντίσωμα EphB4-ειδική (κόκκινο). Κανονική IgG ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (μπλε). EphB4 θετικότητα εκφράζεται ως ποσοστό των συνολικών κυττάρων εμφανίζεται στα δεξιά του κάθε πίνακα.

Η

Για να καθορίσετε τον αριθμό αντιγράφων του γονιδίου EphB4 σε δείγματα ιστών, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις qPCR και διαπίστωσε ότι πολλές ιστούς έδειξε αυξημένη γονίδιο EphB4 αριθμό αντιγράφων. Έξι, εννέα, και 23 τοις εκατό του αδενοκαρκινώματος, μικροκυτταρικό καρκίνωμα, και οι ιστοί πλακώδες καρκίνωμα, αντίστοιχα, βρέθηκαν να περιέχουν περισσότερα από τρία αντίγραφα του γονιδίου EphB4, με το 14% των ιστών καρκίνωμα πλακωδών που έχουν περισσότερα από 10 αντίγραφα (Σχήμα S6) . Δεν κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν βρέθηκαν να επιδεικνύουν αριθμού αντιγράφων γονιδίου κέρδη.

EphB4 Έκφραση και πρόγνωση καρκίνου του πνεύμονα σε

Μια περίληψη των κλινικών χαρακτηριστικών των ιστών του ασθενούς που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζεται στον Πίνακα S2. επιβίωση των ασθενών ήταν έντονα θετικά με την έκφραση του όγκου του EphB4, όπως εκείνες με υψηλή έκφραση EphB4 έχουν μια μέση επιβίωση τριπλή περισσότερο από εκείνους με χαμηλή έκφραση (51 μήνες έναντι 17 μηνών, p = 0,021? Σχήμα 3Α). Καυκάσιοι ασθενείς βρέθηκαν επίσης να εκφράσουν EphB4 σημαντικά πιο έντονα από ό, τι οι ασθενείς Αφρικής και της Αμερικής (ρ = 0,019? Δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? Ωστόσο, αυτό δεν μεταφράζεται σε διαφορά στην επιβίωση στρωματοποιημένη κατά γένος (ρ = 0,92? Σχήμα 3Β). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση EphB4 και άλλα χαρακτηριστικά των ασθενών, όπως το φύλο, το κάπνισμα και η ηλικία κατά τη διάγνωση, είτε στη συνολική ομάδα των ασθενών ή όταν στρωματοποιημένη από τον υπότυπο του καρκίνου του πνεύμονα.

Ο άξονας των τεταγμένων σε κάθε γράφημα αντιπροσωπεύει το κλάσμα της ζωής των ασθενών.

Μια

. Επιβίωση στρωματοποιημένη από EphB4 έκφρασης. βαθμολογίες ACIS πάνω και κάτω από 500 επελέγησαν για στρωμάτωση που βασίζεται στη μέση βαθμολογία της συνολικής ομάδας. Τα βέλη αντιπροσωπεύουν μέση επιβίωση (50% των ασθενών που ζουν) σε μήνες.

Β

. Επιβίωση στρωματοποιημένη από τη φυλή.

Η

EphB4 Modulation επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων

in vitro

Η

Ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με EphB4-σκηνοθεσία siRNA ή έχει υποστεί επεξεργασία με sEphB4-HSA στον πολιτισμό για να καθορίσει αν θα επηρεαστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. sEphB4-HSA είναι ένα μονομερές πρωτεϊνικό θραύσμα που περιλαμβάνει την εξωκυτταρική περιοχή του EphB4 και συζευγμένο με ανθρώπινη λευκωματίνη ορού, η οποία μπορεί να δεσμεύσει συνδέτη εφρίνης-B2 και επομένως ανταγωνίζονται την ενεργοποίηση του υποδοχέα EphB4 μέσω διακοπής της αλληλεπίδρασης μεταξύ του υποδοχέα EphB4 και συνδέτη εφρίνης-Β2 [35], [36]. Στο Α549 κυτταρική γραμμή, η βιωσιμότητα μετά την έκθεση σε sEphB4-HSA μειώθηκε κατά περίπου 17% με τη χαμηλότερη συγκέντρωση και κατά 40% με τις υψηλότερες συγκεντρώσεις του sEphB4-HSA μετά από 96 ώρες (Εικόνα 4Α). Στην κυτταρική γραμμή Η522, ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε υψηλότερη δόση μετά από 96 ώρες (μείωση ~58%), ενώ οι χαμηλότερες δύο συγκεντρώσεις μειώνεται αρχικά βιωσιμότητα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, αλλά είχε μια μειωμένη επίδραση σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (Εικόνα 4Α) .

Μια

.

Β

.

Β

. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SD.

Β

.

Β

.