Αφηρημένο

Διπλή χρωμοσώματα λεπτό είναι κυτταρογενετική εκδηλώσεις της ενίσχυσης του γονιδίου δει συχνά σε καρκινικά κύτταρα. Γονίδια ενισχύθηκαν σε χρωμοσώματα διπλό λεπτό περιλαμβάνουν ογκογονίδια και πολυανθεκτικά γονίδια. Αυτά τα γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες οι οποίες συμβάλλουν στο σχηματισμό του καρκίνου, την εξέλιξη του καρκίνου και την ανάπτυξη αντοχής σε φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία του καρκίνου. Εξάλειψη των χρωμοσωμάτων διπλό λεπτά, και ως εκ τούτου τα γονίδια ενισχύονται σε αυτά, είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για να μειωθεί η κακοήθεια των καρκινικών κυττάρων. Ερευνήσαμε την αποτελεσματικότητα ενός αντικαρκινικού φαρμάκου, γεμσιταβίνη, σχετικά με την απώλεια χρωμοσωμάτων διπλό λεπτά από την ωοθηκική καρκινική κυτταρική σειρά UACC-1598. Η γεμσιταβίνη είναι σε θέση να μειώσει τον αριθμό των χρωμοσωμάτων διπλό λεπτά σε κύτταρα σε 7500X χαμηλότερη συγκέντρωση από το συνήθως χρησιμοποιούμενο υδροξυουρία φάρμακο για τον καρκίνο. Τα ενισχυμένα γονίδια υπάρχουν επί των χρωμοσωμάτων διπλό λεπτά μειώθηκε στο επίπεδο του DNA κατά την κατεργασία gemcitabine. Η γεμσιταβίνη, ακόμα και σε χαμηλή συγκέντρωση νανομοριακή, είναι σε θέση να προκαλέσει βλάβη DNA. Η επιλεκτική ενσωμάτωση της διπλής σήματα λεπτά χρωματίνης και γ-H2AX σε μικροπυρήνων παρέχει μια ισχυρή σύνδεση μεταξύ της βλάβης του DNA και την απώλεια χρωμοσωμάτων διπλά πόδια από κύτταρα επεξεργασμένα γεμσιταβίνη. Κύτταρα κατεργασμένα με γεμκιταβίνη επίσης παρουσίασαν μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων, σχηματισμό αποικιών, και εισβολή. Μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η γεμσιταμπίνη είναι αποτελεσματική στη μείωση χρωμοσώματα διπλό λεπτό και αυτό επηρεάζει τη βιολογία των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Παράθεση:. Yu L, Zhao Υ, Quan C, Ji W, Zhu J, Huang Υ, et al. (2013) Γεμσιταβίνη Εξαλείφει Διπλό χρωμοσώματα στιγμής από ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (8): e71988. doi: 10.1371 /journal.pone.0071988

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 του Μάρτη του 2013? Αποδεκτές: 5 Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Διεθνές Επιστημονικό & amp? Πρόγραμμα τεχνολογικής συνεργασίας της Κίνας (2013DFA31610 να SF), το Πρόγραμμα για Changjiang μελετητές και τα καινοτόμα ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου (IRT1230 να YJ), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31000626 και 31271347 για να WS, 81201761 για να LY), και το Νέο Πρόγραμμα αιώνα Υποστήριξη για την εξαιρετική Scholar, Υπουργείο Παιδείας της Κίνας (NCET-10-0149 για να WS, NCET-11 – 0954 έως ΥΥ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η γονιδιακή ενίσχυση είναι μια μορφή της γονιδιωματικής αστάθειας που συχνά παρατηρείται σε καρκίνους, και μπορεί να εκδηλωθεί κυτταρογενετικά ως ομοιογενώς χρώση περιοχές (Οι HSR) ή χρωμοσώματα διπλό λεπτό (DMS) [1], [2], [3 ], [4]. DMS είναι αυτόνομα αντιγραφόμενη, άκεντρων, και atelometric κυκλικό DNA που κυμαίνονται από εκατοντάδες χιλιοβάσεων σε λίγες μεγαβάσεων σε μέγεθος [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Σε μετάφαση επάλειψη βάφονται με χρωστική δέσμευσης DNA, DMS μπορεί να δει στο μικροσκόπιο ως μονά ή ζεύγη λεπτά χρωματίνη πολύ μικρότερη από ό, τι στα χρωμοσώματα.

ως εξωχρωμοσωμικό όχημα για τις ενισχύσεις των γονιδιωματικών αλληλουχιών DNA, DMS συμβάλλουν στην σχηματισμό και την εξέλιξη, επειδή ογκογονίδια και γονίδια αντοχής σε πολλαπλά φάρμακα είναι συχνά παρούσα στις ενισχυμένες αλληλουχίες και οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν καρκίνος είναι συχνά υπερεκφράζεται [11]. Παραδείγματα γονιδίων ενισχύθηκαν σε DMS περιλαμβάνουν

MYCN

σε νευροβλάστωμα [12],

C-MYC

σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [13],

EGFR

στα γλοιώματα [14], και

eIF-5A2

σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [15], και τα οποία όταν χάνεται μέσω DMS συμβάλλει στην αντιστροφή του φαινοτύπου του καρκίνου [12], [13], [14], [16]. Εξάλειψη ενισχύσεις των ογκογονιδίων σε DMS έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, κυτταρική διαφοροποίηση, και την κυτταρική γήρανση [13], [17], [18].

Πολλές μελέτες έχουν συμβάλει στην κατανόησή μας της μηχανισμός της απώλειας της DMS από τα καρκινικά κύτταρα. Η απώλεια της DMS έχει αποδειχθεί σε πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [12], [13], [17], [19], [20], [21], [22]. Μη θανατηφόρος χαμηλές συγκεντρώσεις υδροξυουρίας (HU), έχει πρώτα βρεθεί ότι αυξάνει την απώλεια της DMS από κύτταρα ποντικού περιέχουν ενισχυμένα DHFR [23], και αργότερα βρέθηκε να έχει την ίδια επίδραση σε καρκινικά κύτταρα θηλαστικών [13], [24] . Η απώλεια της DMS από χαμηλές συγκεντρώσεις του HU μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία φαρμάκου [24] και να μειώσει ογκογονικότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου [13]. Το πιο σημαντικό, η απώλεια της DMS είχε συμβάλει στην εγκλωβισμό τους σε μικροπυρήνων (ΜΝ) [13] και αυτό παγίδευση μπορεί επίσης να ενισχυθεί με χαμηλές συγκεντρώσεις HU [25], [26].

Υπάρχουν δύο μοντέλα σχηματισμού MN: εκβλάστηση /πυρήνων σε μεσόφαση και μετα-μιτωτικούς σχηματισμός [27]. υπάρχουν περιορισμένα στοιχεία για τη συμβολή της HU στο σχηματισμό MN από τους εκκολαπτόμενους /φύτρων [25]. Μια λεπτομερής μελέτη δείχνει HU μπορεί να προκαλέσει το σχηματισμό MN μέσω του μοντέλου μετα-μιτωτικής [28]. Σε αυτό το μοντέλο, HU επάγει την απόσπαση της DMS από μιτωτικών χρωμοσώματα έτσι ώστε τα συσσωματώματα του DMS που σχηματίζεται μετά τη μίτωση στην επόμενη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Μετά τα κύτταρα εισέρχονται στην S φάση, τα συσσωματώματα DMS που περιβάλλεται από πρωτεΐνη λαμίνη να παράγει ένα αναπαραγόμενο κυτταροπλασματική MN [28]. Ο μοριακός μηχανισμός της HU στο σχηματισμό MN έχει ερευνηθεί εντατικά σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που περιέχουν DMS [26]. Χαμηλές συγκεντρώσεις HU προκαλεί βλάβη στο DNA σε πυρήνα του κυττάρου σε φάση S, ανιχνεύσιμη ως γ-H2AX εστίες, αλλά τα σήματα δεν επικαλύπτονται σημαντικά με DMS χρωματίνης. Καθώς η ζημιά επισκευάστηκε και κύτταρα πρόοδος μέσω του κυτταρικού κύκλου, τα περισσότερα σήματα γ-H2AX έχασε από μετάφαση, ενώ κάθε σήμα που παραμένουν επικάλυψη με DMS χρωματίνης. DMS με γ-Η2ΑΧ σήματος βρέθηκαν να αποκολληθούν από χρωμοσώματα ανάφαση και σχηματίζουν MN στην επόμενη φάση G1 [26].

HU είναι ένας αναστολέας που αναστέλλει ειδικά την αναγωγάση ριβονουκλεοτιδίου (RNR). RNR είναι ένα σημαντικό ένζυμο που απαιτείται για την

de novo σύνθεση των

τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοζιτών (dNTP) σε κύτταρα με τη μετατροπή ριβονουκλεοτίδια σε δεοξυριβονουκλεοτίδια [29], [30], [31]. Αναγωγάσης ριβονουκλεοτιδίου κωδικοποιείται από δύο γονίδια

RRM1

και

RRM2

, που αντιστοιχεί στο μεγάλο R1 και R2 μικρό υπομονάδα του ενζύμου, αντίστοιχα. HU είναι ένα σημαντικό αναστολέας αυτού του ενζύμου, αναστέλλοντας ειδικά την υπομονάδα R2. RNR δεν είναι σημαντική μόνο για τη διατήρηση των προμηθειών dNTP που απαιτούνται για την αντιγραφή του DNA, αλλά παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος [32].

Γεμσιταβίνη (2 ‘, 2’-διφθοροδεοξυκυτιδίνη, GEM) είναι μια νεότερη αντικαρκινικό φάρμακο και αναστέλλει το R1 υπομονάδα της RNR. Έχει δύο λειτουργικές ιδιότητες. Το ένα είναι η άμεση αλληλεπίδραση με το R1 υπομονάδα RNR που μειώνει τη λειτουργία RNR και ως εκ τούτου μειώνει το επίπεδο dNTPs στα κύτταρα. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι

RRM1

επίπεδο έκφρασης καθορίζει την ευαισθησία του GEM ή αντίστασης [33], [34], [35], [36], [37]. Δεδομένου GEM είναι ένα ανάλογο δεοξυκυτιδίνη, η δεύτερη ιδιότητα του GEM είναι ότι μπορεί να τροποποιηθεί από κυτταρικά ένζυμα για να παράγουν dFdCTP (2 ‘, 2′-διφθοροδεοξυκυτιδίνη-5’-triphsophate) το οποίο μπορεί να ενσωματωθεί σε πρόσφατα αναπαραχθεί DNA με αποτέλεσμα τον τερματισμό αλύσου [38]. GEM χρησιμοποιείται για τη θεραπεία διαφόρων μορφών καρκίνου, όπως η μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), καρκίνο του παγκρέατος, καρκίνο της ουροδόχου κύστης, ο καρκίνος του μαστού και του καρκίνου των ωοθηκών [39], [40], [41], [42], [43] .

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια από τις κορυφαίες γυναικολογικές κακοήθειες. Παρά τις πρόσφατες προόδους στη θεραπεία αυτού του καρκίνου, περισσότερο από το ήμισυ των ασθενών με προχωρημένο ασθένεια αναπτύσσουν αντίσταση σε θεραπεία, την εμπειρία υποτροπή της νόσου, και τελικά πεθαίνουν εξαιτίας αυτών των ιδιοτήτων [44]. Η τυπική θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών είναι η χειρουργική επέμβαση που ακολουθείται από carboplatin συν θεραπεία με paclitaxel, ωστόσο πολλοί ασθενείς αναπτύσσουν υποτροπιάζουσα νόσο με την αντίσταση στη θεραπεία με πλατίνα [45]. Μετά την έγκριση της χρήσης του GEM στη θεραπεία των καρκίνων των ωοθηκών στην Ευρώπη, τις ΗΠΑ και άλλες χώρες τα τελευταία χρόνια, GEM γίνεται ένα πολλά υποσχόμενο νέο φάρμακο στη θεραπεία των καρκίνων των ωοθηκών. Πρόσφατα GEM έχει δειχθεί ότι είναι αποτελεσματική στη θεραπεία των καρκίνων των ωοθηκών ειδικά στην ανθεκτική υποκατηγορία πλατίνα, είτε χρησιμοποιούνται μόνοι τους ή σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα [1], [40], [44], [45], [46].

DMS βρέθηκαν να είναι παρούσα σε δείγματα πρωτογενούς καρκινώματος των ωοθηκών και ασκίτη από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, και σε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών [15], [47], [48], [49], [50] . Μια μελέτη διαπίστωσε ότι σε ασθενείς η συχνότητα καρκίνου των ωοθηκών με DMS είναι τόσο υψηλό όπως 88% [51]. Μια μελέτη διαπίστωσε ότι για τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με χαμηλές συγκεντρώσεις HU, ο αριθμός των DMS μειώθηκε σε καρκινικά κύτταρα από αυτούς τους ασθενείς [52]. Αν και HU μπορεί να λαμβάνεται από το στόμα ή ενδοφλέβια ένεση, είναι ένας ασθενής αναστολέας της RNR με μισή ζωή του μόνο 3,4 ώρες πριν να αποβάλλονται μέσω των νεφρών [53]. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε αν GEM μπορεί να μειώσει επιλεκτικά ορισμένες ενισχύσεις γονιδίων μέσω DMS, τους μηχανισμούς της DMS μείωση, και ποια αξία έχει στην αγωγή του καρκίνου των ωοθηκών. GEM θα μπορούσε να μειώσει τον αριθμό των DMS σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, καθώς και γονίδια που ενισχύθηκαν με τις συγκεκριμένες DMS σε συγκέντρωση χαμηλότερη από 7500X HU. Με την προσθήκη του GEM, ο αριθμός των ΜΝ αυξήθηκε, και τα γονίδια μεταφέρονται με DMS επιλεκτικά ενσωματώνονται σε αυτά τα ΜΝ. Ακόμα και χαμηλές συγκεντρώσεις του GEM θα μπορούσαν να προκαλέσουν βλάβη του DNA στα κύτταρα, και αυτά τα κατεστραμμένα DNA είναι επίσης εκλεκτικά ενσωματώνεται σε ΜΝ. Προτείνουμε ότι GEM μπορεί να προκαλέσει βλάβες στο DNA σε DMS, το οποίο όταν δεν επιδιορθωθεί, επιλεκτικά ενσωματωθεί ΜΝ και χάνονται από τα κύτταρα. Αυτό με τη σειρά του επηρεάζει τη βιολογία των καρκινικών κυττάρων, έτσι ώστε τα κύτταρα παρουσιάζουν μειωμένη ανάπτυξη, μειωμένο σχηματισμό αποικιών, και μειωμένη εισβολή.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

Η ωοθηκική κυτταρική σειρά καρκίνου UACC-1598 ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Σιν-Yuan Guan (Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ) [15]. Η UACC-1598-4 κυτταρική γραμμή ήταν ένας κλώνος UACC-1598 που επιλέγονται για την σταθερή διατήρηση ενός υψηλού αριθμού DMS. Κατέστη με την μέθοδο διαδοχικής αραίωσης. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) μέσα (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 και περνιούνται κάθε 2 με 3 ημέρες, όταν αυξήθηκαν σε συρροή.

2. Φαρμακευτική αγωγή και Ανάπτυξης Ανάλυση

HU και GEM αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Saint Louis, ΜΙ, USA) και Lilly France (Γαλλία), αντίστοιχα, και παρασκευάζονται σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Το μητρικό διάλυμα HU έγινε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και το διάλυμα απόθεμα GEM έγινε σε 0.9% NaCl. Οι συγκεντρώσεις των HU χρησιμοποιούνται σε πειράματα ήταν 100 και 150 μΜ ακόλουθες δημοσιευμένες συγκεντρώσεις [23], [24], [26]. Οι συγκεντρώσεις του GEM που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 10 και 20 ηΜ, οι οποίες ήταν διαφορετικές αραιώσεις ημιμέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση της (IC

50) στις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Η συγκέντρωση της γεμσιταβίνης που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν 3-6 φορές μικρότερη από ό, τι το πρότυπο

in vivo

δόση χορηγείται σε ασθενείς (Lilly France). Οι συγκεντρώσεις 10 και 20 nM του GEM αντιστοιχεί σε 0,01 IC

50 και 0,02 IC

50 του GEM στην UACC-1.598 έως 4 κυτταρική γραμμή. Οι ίδιες συγκεντρώσεις αντιστοιχούν σε 0.032, και 0.064 IC

50 του GEM στην UACC-1598 κυτταρική γραμμή. Τα κύτταρα περάστηκαν κάθε 2 έως 3 ημέρες και προστέθηκαν φρέσκο ​​ενώσεις. Το IC

50 του GEM υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Assay Kit από την Promega (Madison, WI, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

3. MTS, Colony Σχηματισμός, και εισβολή Δοκιμασίες

Εν συντομία, οι βιολογικές δοκιμασίες κυττάρου διεξάγεται ως ακολούθως. Για τη δοκιμασία MTS, 2000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 96 φρεατίων. Τα κύτταρα είτε αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μόνα μέσα ή μέσα που περιέχουν 150 μΜ HU ή 20 ηΜ GEM. Η OD της κάθε φρεάτιο διαβάστηκε κάθε ημέρα μετά την CellTiter 96 AQ

ueous πρωτόκολλα One Solution κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απεικονίζονται. Για τον σχηματισμό αποικιών, 2000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων είτε με την παρουσία ή απουσία ενώσεων. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 14 ημέρες πριν να εκπλυθεί με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), στερέωση αιθανόλη, και χρώση Giemsa. Ελήφθησαν εικόνες για κάθε φρεάτιο και οι αποικίες μετρήθηκαν με το χέρι με το λογισμικό ImageJ. Τρεις επαναλήψεις έγιναν για κάθε κατάσταση. Για κύτταρο εισβολή, εξήντα χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν σε BD Biocoat Matrigel εισβολής Chambers (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), και αφέθηκε να εισβάλει μέσω μιας μεμβράνης Matrigel. Μετά από 72 ώρες, μετρήθηκε ο αριθμός των κυττάρων τα οποία εισέβαλαν μέσω της μεμβράνης. Τρεις επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν για κάθε ένωση κατάσταση.

4. Μεταφάσης Spread

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κολσεμίδη (Sigma) επί 1,5 ώρα, επεξεργασία με θρυψίνη, και πλύθηκαν σε PBS πριν την προετοιμασία για επάλειψη μετάφαση. Τα κύτταρα πρώτα διογκώθηκε σε 9 ml προθερμασμένο 0.075 Μ KCl για 14 λεπτά, στους 37 ° C. Μετά τη διόγκωση, τα κύτταρα προ-σταθεροποιήθηκαν με 1 ml πρόσφατα κατασκευασμένο μονιμοποιητικού διαλύματος (μίγμα 3 μεθανόλη: 1 οξικό οξύ) και αμέσως φυγοκεντρήθηκε. Τα κύτταρα στη συνέχεια καθορίζεται και φυγοκεντρείται δύο φορές με 10 mls του στερεωτικού διαλύματος. Κυττάρων σφαιρίδια από την τελευταία φυγοκέντρηση επαναιωρήθηκαν σε 0.5 ml μονιμοποιητικού, και μια μικρή ποσότητα λήφθηκε σε μία πιπέτα Pasteur και έπεσε σε καθαρό γυάλινα πλακίδια. Μιτωτικά χρωμοσώματα παρατηρήθηκαν με χρώση των διαφανειών με Giemsa και φωτογραφίζεται με τον Όλυμπο BX41 μικροσκόπιο (Olympus America Inc., Melville, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) συνδεδεμένο με ένα χρώμα βιντεοκάμερα JVC TK-C75U (JVC, Ιαπωνία) σε 1000Χ. Ο αριθμός των DMS που υπάρχει σε κάθε κύτταρο μετρήθηκε με το χέρι. Ο αριθμός των κυττάρων που μετρήθηκαν κυμαίνεται από 60 έως 100 για κάθε δείγμα.

5. Απομόνωση Γονιδιωματικό DNA και PCR πραγματικού χρόνου

Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν και γονιδιωματικό DNA παρασκευάστηκε με την QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του μείγματος SYBR Προμίγματα Ex Taq II (Takara Βιοτεχνολογίας (Dalian) Co, Ltd, Κίνα) στην LightCycler 480 (Roche Applied Science, Γερμανία) το σύστημα PCR Πραγματικού χρόνου ανίχνευση. Το επίπεδο ενίσχυσης των

MYCN

,

EIF5A2

, και

MCL1

εντοπίστηκαν και

ACTB

χρησίμευσε ως εσωτερικό έλεγχο. Οι μέσες ± τυπική απόκλιση (SD) τριών επαναλήψεων παραστάθηκε γραφικά για κάθε σύνολο των συγκρίσεων μεταξύ των κυττάρων θεραπείας και ελέγχου. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως ακολούθως:

EIF5A2

, 5′-TACTTGGCAGAGATTAAACAGG-3 ‘(F), 5′-CAAAGTATTTGCACCTTGAAG-3’ (R)?

MYCN

, 5′-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3 ‘(F), 5′-GCAACGGCATTCTCTCAG-3’ (R)?

MCL1

, 5′-CTGGAGATTATCTCTCGGTAC-3 ‘(F), 5′-CTGACTCGTTTCGGTTTC-3’ (R)?

ACTB

, 5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3 ‘(F), 5′-AAGCAAATAGAACCTGCAGAG-3’ (R).

6. Fluorescent

in situ

Hybridization (FISH)

μεταφάσης επάλειψη αρχικά παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και FISH Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε με το ακόλουθο πρωτόκολλο. Βακτηριακές τεχνητή χρωμοσώματος (BAC) κλώνος RP11-654K19 για

EIF5A2

, BAC κλώνος RP11-355H10 για

MYCN

, και BAC κλώνος RP11-54A4 για

MCL1

επιλέχθηκαν για ανιχνευτές FISH επισημαίνονται με κυανίνη 3 (Cy3), ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη (FITC), ή κυανίνης 5 (Cy5). Τα πλακίδια στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν με 4, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) και φωτογραφίες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο Leica DM5000B (Leica Microsystems, Γερμανία) σε 1000Χ μεγέθυνση. Ο αριθμός των κυττάρων που αναλύθηκαν κυμαίνεται από 180 να 280 για κάθε δείγμα.

Το πλήρες σήμα του πυρήνα του κυττάρου που παρατηρήσαμε ορίζεται σε 100%. Τα κύτταρα ομαδοποιήθηκαν σε 3 κατηγορίες για την ανάλυση της διανομής σήματος: Ομάδα 1 περιλαμβάνει κύτταρα με & lt? 30% του σήματος, ομάδα 2 περιλαμβάνει κύτταρα με σήμα 30-60%, και η Ομάδα 3 περιλαμβάνει κύτταρα με & gt? Σήματος 60%. Ο βαθμός του σήματος ποσοτικοποιείται χρησιμοποιώντας λογισμικό MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) για την ανάλυση της σχετικής περιοχής του σήματος στην περιοχή του πυρήνα του κυττάρου. Ένα μικροπυρήνων (MN) ορίζεται ως οποιαδήποτε βάφτηκαν περιοχή DAPI λιγότερο φωτεινό από την λεκιασμένη πυρήνα DAPI και με έκταση μικρότερη από το ένα τρίτο του πυρήνα του κυττάρου. Κύτταρα με δύο ή περισσότερα μικροπυρήνων δεν μετρήθηκαν για την εξάλειψη των τεχνημάτων. Τα κύτταρα επίσης ομαδοποιούνται με βάση την κατάσταση MN: Ομάδα Α περιλαμβάνει κύτταρα χωρίς MN, Ομάδα Β περιλαμβάνει κύτταρα με ΜΝ, αλλά ο MN δεν περιέχει σήμα, και Ομάδα Γ περιλαμβάνει κύτταρα με ΜΝ σήμα που περιέχουν

7.. Ανοσοφθορισμός

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες σε πλάκες έξι φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις διάφορες ενώσεις για τους υποδεικνυόμενους χρόνους πριν την εκτέλεση ανοσοφθορισμού. Εν συντομία, τα κύτταρα σε καλυπτρίδες πλύθηκαν 3 χ 10 λεπτά σε PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και επανυδατώθηκαν 3 χ 10 λεπτά, με PBS. Τα κύτταρα διαπερατά και αποκλείστηκαν σε ρυθμιστικό KCM (120 mM ΚΟΙ, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1% Triton Χ-100, 2% αλβουμίνη βόειου ορού, και 10% σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος) για 6 ώρες στους 4 ° C και επωάστηκαν με αντι-φωσφο-Η2ΑΧ (Ser139) αντίσωμα (κλώνος JBW301, Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα KCM (1:500) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν 3 χ 10 λεπτά σε PBS, επωάστηκαν με CF555 κατσίκα αντι-ποντικού IgG (H + L) (Biotium, Hayward, CA, USA) αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα KCM (1:1000) επί 1,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και πλένονται και πάλι τρεις φορές 10 λεπτά η κάθε με PBS. DNA οπτικοποιήθηκε με αντικηλίδωση των κυττάρων με ϋΑΡΙ και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια. Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Leica DM5000B. Να αναλύσει την έκταση της βλάβης του DNA μέσα στα κύτταρα, τα κύτταρα ομαδοποιούνται ανάλογα με τα σήματα γ-H2AX τους ανεξάρτητα από την κατάσταση ΜΝ. Τα κύτταρα ομαδοποιούνται σε πέντε κατηγορίες, συμπεριλαμβανομένων αριθ σήματος, & lt? 30% σήμα, 30-60% σήμα, & gt? 60% του σήματος, και την πλήρη σήμα από το λογισμικό MetaMorph. Για βαθμολόγηση των ΜΝ σε κύτταρα που απελευθερώνεται από τις ενώσεις, τα κύτταρα ομαδοποιήθηκαν σε τέσσερις κατηγορίες: Ομάδα 1 περιέχει κύτταρα χωρίς ΜΝ, ομάδα 2 περιέχει κύτταρα με ΜΝ και το MN δεν περιέχει σήμα, Ομάδα 3 περιλαμβάνει κύτταρα με σήμα που περιέχουν MN, Ομάδα 4 περιλαμβάνει κύτταρα με 1 ή 2 ισχυρό κηλίδες σήματος εντός του πυρήνα του κυττάρου κοντά στην περιφέρεια του πυρήνα.

8. Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα σε δεδομένα DMS και σε πραγματικό χρόνο δεδομένα PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μη ζευγαρωμένο t-test με εξαίρεση τα δεδομένα DMS σε UACC-1598 με 4, οι οποίες υπολογίστηκαν με ανάλυση της διακύμανσης (

ANOVA

), ακολουθούμενη από τη σύγκριση των υστέρων τεστ πολλαπλών Dunnett. Η στατιστική σημασία των σημάτων FISH, γ-H2AX εναντίον καθόλου δεδομένα σήματος και δεδομένων ΜΝ αναλύθηκαν με

exact test

Fisher. Σημασία της MTS και του σχηματισμού αποικιών δεδομένα υπολογίστηκε με

ANOVA

. Η στατιστική σημαντικότητα των κυττάρων εισβολής υπολογίστηκε με το

Chi-τετράγωνο τεστ

. Η στατιστική σημαντικότητα σε όλα τα δεδομένα να υποδηλώνονται ως εξής: * υποδηλώνει μια

P

αξία από 0,01 έως 0,05, ** σημαίνει μία

P

αξία από 0,001 έως 0,01, και *** σημαίνει μία

P

αξία των & lt?. 0.001

Αποτελέσματα

1. GEM μειώνει τον αριθμό των DMS στον καρκίνο των ωοθηκών Κυτταρική Γραμμή UACC-1598 και ο κλώνος UACC-1598-4

UACC-1598 είναι μια ωοθηκική κυτταρική σειρά καρκίνου που αποτελείται από γονιδιακής ενίσχυσης με τη μορφή της DMS. UACC-1598-4 δημιουργήθηκε με τη μέθοδο σειριακή αραίωση με σπορά και απομόνωση μονών κυττάρων από την γονική κυτταρική γραμμή UACC-1598 και την προετοιμασία μετάφασης εξαπλώνεται για να προσδιοριστεί ο αριθμός των DMS ένας κλώνος περιέχει. Αυτός ο κλώνος βρέθηκε να έχει μια αύξηση στον αριθμό των DMS σε σύγκριση με την γονική κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1Α). Ενώ η κυτταρική σειρά UACC-1598 περιείχε κατά μέσο όρο 34.61 DMS ανά κύτταρο, UACC-1.598-4 είχαν κατά μέσο όρο 76.16 DMS ανά κύτταρο το οποίο είναι περισσότερο από το διπλάσιο της αξίας για την γονική κυτταρική σειρά. Η διαφορά μεταξύ του αριθμού των DMS στο UACC-1598 και τον κλώνο UACC-1598 – 4 βρέθηκαν να είναι στατιστικά σημαντική με

P

αξία των & lt?. 0.001

Α. Εκπρόσωπος εικόνες της μετάφαση εξάπλωση της UACC-1598 και UACC-1598 έως 4 κύτταρα. Τα βέλη δείχνουν DMS. Ο αριθμός των DMS σε κάθε κύτταρο μετάφασης μετρήθηκε και καταρτίστηκε σε διάγραμμα. *** Δεικνύει

P

& lt? 0.001. B. μεταφάσης αλείμματα παρασκευάστηκαν για κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων είτε HU ή GEM για 1 εβδομάδα ή 2 εβδομάδες. μετρήθηκε ο αριθμός των DMS σε κάθε κύτταρο μετάφασης. Οι κόκκινες γραμμές αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο και οι μαύρες γραμμές αντιπροσωπεύουν το SEM. * Υποδηλώνει μια

P

τιμή από 0,01 έως 0,05 και ** υποδηλώνει

P

αξίας 0,001 έως 0,01.

Η

Πρέπει πρώτα ελεγχθεί αν η διαφορά στο αριθμός των DMS μεταξύ UACC-1598 και UACC-1598-4 επηρεάζει την ευαισθησία να GEM. Αξιοποιήσαμε τη μέθοδο MTS για τον υπολογισμό της IC

50 του GEM στις δύο κυτταρικές σειρές και διαπίστωσε ότι υπήρχε μια διαφορά. Το IC

50 του GEM ήταν 310 nm σε UACC-1598 και 970 nM σε UACC1598-4 (δεδομένα που παρουσιάζονται τώρα), και η διαφορά είναι πιθανό να οφείλεται στην πιο DMS να απευθύνονται και να εξαλειφθούν από UACC1598-4. Επειδή επελέγη ο κλώνος UACC1598-4 για την παραγωγή και τη διατήρηση ενός μεγάλου αριθμού DMS της, χρησιμοποιήσαμε πρώτα αυτή την κυτταρική γραμμή για να καθοριστεί εάν GEM μπορεί να προκαλέσει απώλεια της DMS, διότι υποθέσαμε ότι μπορεί να είναι ευκολότερο να ανιχνεύσει μια διαφορά στον αριθμός των DMS. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μέσα που περιέχουν 10 ηΜ (0,01 × IC

50) του GEM για δύο εβδομάδες πριν παρασκευάστηκαν επάλειψη μετάφαση. πείραμα μας έδειξαν ότι η προσθήκη χαμηλών συγκεντρώσεων GEM μπορεί να μειώσει τον αριθμό των DMS σε UACC-1598-4 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, παρόμοια με την προσθήκη HU (Σχήμα S1A). Ο μέσος αριθμός των DMS έπεσε 76,16 έως 25,23 σε 150 μΜ HU. Επιπλέον, ο μέσος αριθμός των DMS μειώθηκε σε 48,99 σε 10 ηΜ του GEM.

συνέχεια προσδιορίζεται αν GEM μπορεί να μειώσει τον αριθμό των DMS στο πατρικό UACC-1598 κυτταρική γραμμή. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μέσα που περιέχουν 10 ηΜ (0.032 × IC

50) και 20 ηΜ (0.064 × IC

50) του GEM πριν παρασκευάστηκαν επάλειψη μετάφαση. Βρήκαμε ότι GEM στα 10 ηΜ δεν ήταν αποτελεσματικό σε αυτή την κυτταρική γραμμή. Μετά την επώαση UACC-1598 κύτταρα σε 20 ηΜ του GEM, παρατηρήσαμε μια στατιστικά σημαντική μείωση του αριθμού των DMS στα δύο 1 εβδομάδα και 2 εβδομάδες μετά τα κύτταρα συνεχώς αναπτύσσονται σε μέσα που περιέχουν GEM (Σχήμα 1Β). Ο μέσος αριθμός των DMS μειώθηκε από 37,00 να 24,83 μετά από 1 εβδομάδα ανάπτυξης υπό την παρουσία GEM, και μειώθηκε από 31,84 να 21,59 μετά από 2 εβδομάδες ανάπτυξης σε GEM. Από HU διαλύθηκε σε DMSO, θα εξαλειφθεί η επίδραση της DMSO στα πειράματά μας με σύγκριση HU επεξεργασμένα κύτταρα στο DMSO κατεργασμένα κύτταρα. Ο μέσος αριθμός των DMS μειώθηκε από 29,37 σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε μέσα που περιέχουν DMSO να 20.77 σε κύτταρα που αναπτύσσονται σε μέσα που περιέχουν 150 μΜ HU για 2 εβδομάδες. Μπορούμε επίσης συγκριτικά κύτταρα ελέγχου να DMSO επεξεργασμένα κύτταρα και διαπίστωσε ότι η διαφορά μεταξύ των δύο δεν ήταν στατιστικά σημαντική (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι DMSO σε συγκέντρωση χρησιμοποιήσαμε ως το όχημα για το HU δεν επηρεάζει σημαντικά πειραματικά αποτελέσματα μας. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι GEM είναι αποτελεσματική στην μείωση DMS από άλλες κυτταρικές γραμμές όπως επίσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται HU σε συγκέντρωση 150 μΜ και GEM σε συγκέντρωση 20 ηΜ για όλες ακόλουθα πειράματα μας.

2. GEM Μεσολαβεί της απώλειας της DMS ενισχυμένα γονίδια

EIF5A2

και

MCL1

Η

Μόλις διαπιστώσαμε ότι GEM μπορεί να μειώσει τον αριθμό των DMS τόσο UACC-1598 και UACC-1598- 4, το επόμενο ερώτημα που τίθεται είναι κατά πόσο τα γονίδια ενισχύθηκαν στα DMS είναι επίσης μειωμένη. Είναι γνωστό ότι ογκογονίδια

EIF5A2

και

MYCN

είναι δύο γονίδια που ενισχύονται σε UACC-1598 [15], [16], και

MCL1

επίσης βρέθηκε να ενισχύεται σε αυτή την κυτταρική σειρά (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Πρέπει πρώτα διαπιστώσει ότι αυτά τα τρία γονίδια που αναλύονται είναι παρούσα στην DMS με πειράματα FISH (Εικόνα 2Α). Στη συνέχεια διαχωρίζονται τα κύτταρα καλλιεργούνται σε HU ή GEM σε 3 ομάδες ανάλογα με το επίπεδο του

EIF5A2, MYCN,

και

MCL1

σήματα (Σχήμα 2Β). Ομάδα 1 περιλαμβάνει κύτταρα με & lt? 30% σήμα, το οποίο αντιστοιχεί σε κύτταρα με λιγότερα σήματα από

EIF5A2

,

MYCN

, και

MCL1

, και είναι ένας δείκτης των κυττάρων με λιγότερο αριθμό των DMS? ομάδα 2 περιλαμβάνει κύτταρα με σήμα 30-60%? και η ομάδα 3 περιλαμβάνει κύτταρα με & gt? 60% σήμα, το οποίο είναι ένας δείκτης των κυττάρων με περισσότερο DMS. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε ομάδα απεικονίζονται. Το ποσοστό των κυττάρων στην ομάδα 3, η οποία περιέχει κύτταρα με περισσότερο από 60% σήματα, μειωμένη παρουσία είτε HU (από 11% σε 6%) ή GEM (από 16% σε 7%). Επιπλέον, το ποσοστό των κυττάρων της ομάδας 2, μειώθηκε από 33% σε 24% για HU κατεργασμένα κύτταρα και 37% έως 25% σε κύτταρα κατεργασμένα GEM. Σε αντίθεση με την μείωση των ποσοστών των κυττάρων της ομάδας 2 και 3, το ποσοστό των κυττάρων στην ομάδα 1 αυξήθηκε 14 έως 21% σε κύτταρα κατεργασμένα με HU (από 56% έως 70%) ή GEM (από 47% έως 68% ). Η αύξηση του ποσοστού των κυττάρων στην ομάδα 1 στην HU ή κύτταρα επεξεργασμένα GEM δείχνει κύτταρα έχουν άρχισαν να χάνουν DMS τους. Επιπλέον, ενοποιούνται ομάδων 2 και 3 σε μία μεγάλη ομάδα, και στατιστική ανάλυση έδειξε ότι οι διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ DMSO και HU ή ελέγχου και κύτταρα επεξεργασμένα GEM είναι στατιστικά σημαντική (Σχήμα 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το σήμα των ενισχυμένων γονιδίων

MYCN

,

EIF5A2

, και

MCL1

για DMS σε UACC-1598 κύτταρα μειώθηκε με την παρουσία και των δύο HU και GEM . Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε για GEM κατά την ανάλυση

MYCN

και

EIF5A2

σε UACC-1598-4 κύτταρα (Σχήμα S1B).

Α. Γονίδια

EIF5A2

,

MYCN

, και

MCL1

είναι παρούσα στην DMS σε UACC-1598 κύτταρα. Μετάφαση εξάπλωση της UACC-1598 κύτταρα ανιχνεύθηκαν με ανιχνευτή DNA για

EIF5A2

,

MYCN

, και

MCL1.

Για τις επικαλυπτόμενες εικόνες,

EIF5A2

και

οι MCL1

σήματα εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα, και

MYCN

σήμα εμφανίζεται με πράσινο χρώμα. Επικαλύπτονται

EIF5A2

/

MYCN

και

MCL1

/

MYCN

εμφανίζονται με κίτρινο χρώμα. Β Εκπρόσωπος φωτογραφίες του

EIF5A2

/

MYCN

και

MCL1

/

MYCN

σήματα FISH στην μεσόφαση κύτταρα του UACC-1598 και πώς τα μεμονωμένα κύτταρα είναι χωρίζονται σε διαφορετικές ομάδες.

MYCN

σήμα εμφανίζεται με πράσινο χρώμα,

EIF5A2

και

MCL1

εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα, και η επικάλυψη εμφανίζεται με κίτρινο χρώμα. Το ποσοστό των κυττάρων στις Ομάδες 1, 2, και 3 βασίζεται στο

EIF5A2

/

MYCN

και

MCL1

/

MYCN

σήματα FISH. Η στατιστική ανάλυση έδειξε τις διαφορές των κυττάρων στην ομάδα 1 και Ομάδα 2/3 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. * Υποδηλώνει μια

P

τιμή από 0,01 έως 0,05 και ** υποδηλώνει

P

αξίας 0,001 έως 0,01.

Η

Επιπλέον, επιβεβαίωσε επίσης τα αποτελέσματα μας εκτέλεση πραγματικού χρόνου PCR για να αναλυθεί η ενίσχυση του

EIF5A2, MYCN,

και

MCL1

σε κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία του HU ή GEM (Σχήμα 3). Είδαμε μια στατιστικά σημαντική μείωση στην ενίσχυση του

EIF5A2

και

MCL1

γονίδια όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε παρουσία είτε HU ή GEM. Για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με HU, μια μείωση στην σχετικό επίπεδο ενίσχυσης DNA των 1.151 ± 0,213 να 0,658 ± 0,092 παρατηρήθηκε για

EIF5A2

, και μια μείωση στο επίπεδο ενίσχυσης 0,860 ± 0,122 να 0,422 ± 0,106 παρατηρήθηκε για

MCL1

. Για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με GEM, μια μείωση στο επίπεδο της ενίσχυσης 0,930 ± 0,094 να 0,383 ± 0,005 παρατηρήθηκε για

EIF5A2

, και μια μείωση στο επίπεδο της ενίσχυσης 1,242 ± 0,343 να 0,388 ± 0,048 παρατηρήθηκε για

MCL1

. Ωστόσο, εμείς δεν ανιχνεύσει μια στατιστικά σημαντική μείωση στην ενίσχυση του

MYCN

είτε HU ή κύτταρα αντιμετωπίζονται GEM. Παρόμοια αποτελέσματα αποκτήθηκαν για UACC-1.598-4 κύτταρα, αν και με σκοτεινές αλλαγή του

MCL1

(Σχήμα S1c).

Το επίπεδο ενίσχυσης των γονιδίων

EIF5A2

,

MCL1

, και

MYCN

αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Το επίπεδο ενίσχυσης του κάθε γονιδίου σε κύτταρα ένωση αγωγή συγκρίνεται με κύτταρα μάρτυρες (DMSO για HU αντιμετωπίζεται, και Ctrl. Για GEM αγωγή), και η μέση στάθμη σχετική ενίσχυση ± SD απεικονίζεται γραφικά. * Υποδηλώνει μια

P

τιμή από 0,01 έως 0,05 και ** υποδηλώνει ένα

P

αξίας 0,001 έως 0,01, *** δηλώνει

P

& lt?. 0,001

3. Εγκλωβισμός DMS ενισχυμένα γονίδια σε Μικροπυρήνες

Ένας τρόπος με τον οποίο πιστεύεται DMS να εξαλειφθούν από τα κύτταρα είναι με την ενσωμάτωση σε μικροπυρήνων. Με ενισχυμένα γονίδια ως ιχνηλάτες, παρατηρήσαμε κάποιες κυττάρων με ΜΝ περιέχει ιχνηθέτες, ενώ άλλοι δεν έχουν MN περιέχουν τα ανιχνευτές (Σχήμα 4). Έχουμε καθορίζεται το ποσοστό του σχηματισμού ΜΝ σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με HU ή GEM, και παρατηρήθηκαν επίσης κατά πόσον αυτές οι μικροπυρήνων που περιέχονται

EIF5A2, MYCN

και

MCL1

σήματα (Πίνακας 1). κύτταρα κατεργασμένα όχημα DMSO έχουν συχνότητα σχηματισμό ΜΝ του 13,87 × 10

-2 ενώ HU επεξεργασμένα κύτταρα έχουν μια συχνότητα σχηματισμό ΜΝ του 30,61 × 10

-2, υποδεικνύοντας HU είναι αποτελεσματική στην επαγωγή σχηματισμού ΜΝ. Επιπλέον, GEM είναι επίσης αποτελεσματική στην επαγωγή σχηματισμού ΜΝ. Κύτταρα κατεργασμένα με 20 ηΜ GEM έχουν συχνότητα σχηματισμό ΜΝ του 21,82 × 10

-2 συγκριτικά με 13,98 × 10

-2 στα κύτταρα ελέγχου. Κατά την εξέταση

EIF5A2, MYCN,

και

MCL

σήματα στο MN, παρατηρήσαμε επίσης μια αύξηση της συχνότητας των ΜΝ η οποία περιέχει

EIF5A2, MYCN,

και

MCL

σήματα, ορίζεται ΜΝ (

EIF5A2

+

MYCN

+

MCL +

) ή ΜΝ (+) για συντομία, για τα κύτταρα στην Ουγγαρία και τη θεραπεία GEM ομάδες. Μια 2,57 και 1,81 φορές αύξηση στο ΜΝ (+) η συχνότητα παρατηρήθηκε για HU και GEM επεξεργασμένα κύτταρα αντίστοιχα. Μαζί, τα αποτελέσματα FISH μας δείχνουν ότι η DMS ενισχυμένα γονίδια

EIF5A2, MYCN,

και

MCL

χάνονται από τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με είτε HU ή GEM με επιλεκτικά εγκλωβισμένα σε ΜΝ. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με UACC-1598-4 κύτταρα (Πίνακας S1).

Τα άφησε δύο πίνακες είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων που δείχνουν ΜΝ χωρίς σήμα και τα σωστά δύο πλαίσια είναι αντιπροσωπευτικά εικόνες των κυττάρων που δείχνουν ΜΝ με

EIF5A2

/

MYCN

ή

MCL1

/

MYCN

σήμα.

MYCN

σήμα εμφανίζεται με πράσινο χρώμα,

EIF5A2

και

MCL1

εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα, και η επικάλυψη εμφανίζεται με κίτρινο χρώμα. Τα βέλη δείχνουν MN.

Η

4. Χαμηλές συγκεντρώσεις GEM προκαλεί βλάβη στο DNA σε κύτταρα παρόμοια με τα χαμηλές συγκεντρώσεις HU

έχουν χαμηλές συγκεντρώσεις HU έχει βρεθεί ότι προκαλούν βλάβη στο DNA ανιχνεύσιμο ως γ-Η2ΑΧ εστίες στα κύτταρα. Εμείς καθοριστεί αν GEM μπορεί επίσης να προκαλέσει βλάβη του DNA. Εμείς αντιμετωπίζεται UACC-1598 κύτταρα με HU ή GEM για 24 ώρες και πραγματοποιείται ανοσοφθορισμού για να καθορίσει το ποσό της γ-H2AX εστίες σε μεμονωμένα κύτταρα.