Αφηρημένο

Ταυτοποίηση των νέων πρωτεϊνών που μπορούν ενδεχομένως να συμβάλουν στην καρκινογένεση είναι ένα απαιτούμενο εγχείρημα. Στο παρόν, αναφέρουμε την πρώτη βιοχημικός χαρακτηρισμός του μυθιστορήματος F-box και WD40 που περιέχουν πρωτεΐνη, FBXW4. Έχουμε εντοπίσει αλληλεπιδρούν συνεργάτες πρωτεΐνης και απέδειξαν ότι FBXW4 είναι μέρος ενός συμπλόκου ουβικιτίνης λιγάση. Επιπλέον, η θέση Fbxw4 είναι μια κοινή θέση εισαγωγής προϊικού σε μια ποικιλία ρετροϊικών παρεμβαλλόμενης μεταλλαξογένεσης μοντέλα καρκίνου του ποντικού και Fbxw4 mRNA εκφράζεται έντονα στο involuting μαστικό αδένα ποντικού. Να αρχίσουν να χαρακτηρίζουν τη βιοχημική λειτουργία του Fbxw4, χρησιμοποιήσαμε πρωτεομική ανάλυση για να αποδείξει ότι Fbxw4 αλληλεπιδρά με Skp1 (SKP1), Cullin1 (CUL1), Ring-box1 (RBX1) και όλων των συνιστωσών της σηματοσώματος COP9. Όλες αυτές οι αλληλεπιδράσεις εξαρτώνται από ένα ανέπαφο πεδίο F-box του Fbxw4. Επιπλέον, Fbxw4 είναι ικανή να αλληλεπιδρά με ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες στο εσωτερικό των κυττάρων σε ένα F-box εξαρτώμενο τρόπο. Τέλος, αποδεικνύουμε ότι FBXW4 είναι μεταλλαγμένο, χάνεται και υπο-εκφράζεται σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και κλινικά δείγματα ασθενών. Είναι σημαντικό ότι, η έκφραση του FBXW4 συσχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Στο σύνολό τους, προτείνουμε ότι FBXW4 μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα ογκοκατασταλτικό που ρυθμίζει σημαντικές κυτταρικές διεργασίες

Παράθεση:. Lockwood WW, Chandel SK, Stewart GL, Erdjument-Bromage Η Beverly LJ (2013) Το μυθιστόρημα Ουμπικουϊτίνη Λιγάσης Complex, SCF

Fbxw4, αλληλεπιδρά με τα COP9 σηματοσώματος σε ένα τρόπο που εξαρτάται από F-Box, είναι μεταλλαγμένο, Lost και Under-εκφράζεται σε καρκίνους του ανθρώπου. PLoS ONE 8 (5): e63610. doi: 10.1371 /journal.pone.0063610

Επιμέλεια: Deanna Μ Koepp, Πανεπιστήμιο της Μινεσότα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21η Φεβρουαρίου 2013? Αποδεκτές: πέμπτης Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Μαΐου 2013

Copyright: © 2013 Lockwood et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH), μοριακούς στόχους COBRE, 8P20GM103482-10 (σε LJB), Wendy Will υπόθεση Ταμείου Καρκίνου, GB220413 (σε LJB), το βραβείο Kosair παιδικού καρκίνου Ερευνητικό Πρόγραμμα (σε LJB). Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το NCI Κέντρο Καρκίνου επιχορήγηση υποστήριξη Ρ30 CA08748 να Microchemistry και Πρωτεϊνωματική κεντρικό εργαστήριο (σε HEB), Memorial Sloan-Kettering,. Η εργασία αυτή υποστηρίζεται επίσης, εν μέρει, από το ΝΙΗ Grant P01 CA94060 και PO1 CA129243-01 (με Harold Varmus) και από ΝΙΗ εντός των τειχών NCI και τα ταμεία NHGRI (με Harold Varmus). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ουμπικουϊτίνη λιγάση συγκροτήματα καταλύουν τη σύζευξη της ουβικιτίνης σε πρωτεΐνες υποστρώματος [1]. Ουβικιτινίωση πρωτεΐνες μπορεί να έχει μια ποικιλία αποτελεσμάτων επί της λειτουργίας της πρωτεΐνης με το καλύτερο καλά μελετηθεί είναι η ρύθμιση της πρωτεϊνικής σταθερότητας [2]. Ουμπικιτίνη λιγάση σύμπλοκα (που ονομάζεται επίσης Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης) αλληλεπιδρά με ένα Ε1 (ένζυμο ενεργοποίησης της ουβικιτίνης), και ένα Ε2 (σύζευξης ουμπικουϊτίνης ένζυμο) [1]. Τα ένζυμα Ε1 και Ε2 γενικά μοιράζεται μεταξύ πολλών λιγάσες Ε3 και το συστατικό Ε3 είναι ο παράγοντας ειδικότητα που αλληλεπιδρά άμεσα με πρωτεΐνες υπόστρωμα. Ένας τύπος Ε3 συγκρότημα ουβικιτίνης λιγάση, το συγκρότημα λιγάσης ουβικιτίνη SCF, περιέχει Skp1, Cullin1, δαχτυλίδι-Box1 και κάθε ένα από περισσότερα από εβδομήντα F-κουτί που περιέχει πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται στα γονιδιώματα των ανώτερων ευκαρυωτικών [3], [4]. Η περιοχή F-box είναι υπεύθυνο για την άμεση αλληλεπίδραση με Skp1, ενώ οι άλλες περιοχές που περιέχονται μέσα στην πρωτεΐνη είναι υπεύθυνες για την αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες και φέρνοντας υπόστρωμα σε εγγύτητα της ουμπικουϊτίνης λιγάσης [5]. Σημαντικά, πρωτεΐνες που περιέχουν πολλαπλές συσκευασίας F είναι καλά χαρακτηρισμένες για να παίξει απευθείας ρόλους στην γένεση των καρκίνων του ανθρώπου [6], [7], [8], [9], [10]. Για παράδειγμα, οι μεταλλάξεις που οδηγούν σε απώλεια της λειτουργίας του FBXW7 ή BTRCP οδηγήσει στη σταθεροποίηση των συγγενών πρωτεϊνών υποστρώματος τους, Notch, MYC και κυκλίνη ή Beta Catenin, αντίστοιχα, όλα εκ των οποίων είναι γνωστά ογκογονίδια [6], [9] , [11], [12], [13], [14], [15].

Η σηματοσώματος COP9 είναι ένα μέγα-Dalton μεγέθους συγκρότημα που αποτελείται από τουλάχιστον οκτώ πρωτεΐνες αρχικά προσδιορίζονται μέσω μιας γενετικής οθόνη Arabidopsis [16], [17]. Το συγκρότημα COP9 είναι γνωστό ότι ρυθμίζει μία ποικιλία ουμπικουϊτίνης συμπλοκών λιγάση. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο COP9 ρυθμίζει τη λειτουργία του ουβικιτίνης συμπλοκών λιγάσης δεν είναι πλήρως κατανοητή, αλλά έχει προταθεί για τη ρύθμιση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών f-box και Skp1 ρυθμίζοντας την σύζευξη της μικρής πρωτεΐνης Nedd8 να Cullin1 [18], [19 ]. Ο κύκλος των neddylation /de-neddylation διευκολύνει την ουμπικιτίνη αλληλεπίδραση λιγάσης-υποστρώματος και η επακόλουθη στροφή πάνω από το υπόστρωμα. Έτσι, η δραστικότητα πολλών από αυτές τις ουμπικουϊτίνης λιγάσης συμπλοκών έχει δειχθεί να απαιτούν την αλληλεπίδραση με το σηματοσώματος COP9 για τη σωστή λειτουργία. Είναι ενδιαφέρον ότι, πολλαπλά συστατικά του σηματοσώματος COP9 γνωστό ότι έχουν COP9-ανεξάρτητες λειτουργίες και έχουν δειχθεί ότι συμβάλλουν στον καρκίνο [20], [21], [22].

Ο τόπος FBXW4 αρχικά χαρτογραφήθηκε ως ο περιοχή στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 10 που ήταν η αιτιώδης θέση στη διαταραχή των άκρων δυσπλασίας διάσπαση χέρι και το πόδι 3 (SHFM3) [23], [24], [25], [26]. SHFM3 είναι ένα ελάττωμα στην ανάπτυξη της κορυφαίας εξωδερμικής κορυφογραμμή κατά το σχηματισμό των άκρων που προκαλεί απλασία των κεντρικών ψηφίων που οδηγούν σε αυτά, στις πιο σοβαρές περιπτώσεις, μόνο δύο ψηφία ανά σκέλος [27], [28]. Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε επίσης ότι Fbxw4 ήταν επίσης η θέση υπεύθυνη για ένα αναπτυξιακό ελάττωμα αυθόρμητης ποντίκι που έμοιαζε SHFM3 σε ανθρώπους [29]. Μια σειρά από δημοσιεύσεις ισχυρίζονται ότι η μεταβολή στο FBXW4 είναι υπεύθυνος για τις ατέλειες, που ακολουθείται από τις δημοσιεύσεις που υποδηλώνουν την ανάντη θέση που κωδικοποιεί FGF8 μπορεί να είναι ο ένοχος [30], [31]. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει ικανοποιητική δεδομένων έχει επισκιαστεί το θέμα.

Ανεξάρτητα από το αν FBXW4 συμβάλλει αιτιολογικά με SHFM3, μέχρι σήμερα δεν μοριακή ή βιοχημική λειτουργία έχει αποδοθεί σε FBXW4. Με το συνδυασμό εξόρυξη δεδομένων, μελέτες έκφρασης, πρωτεομική και βιοχημείας έχουμε αρχίσει να επεκτείνουν τις γνώσεις μας για FBXW4. Έχουμε αποδείξει ότι Fbxw4 είναι μέρος ενός ουβικιτίνης συγκρότημα λιγάσης που περιέχει Skp1, Cullin1, Rbx1 και το σηματοσώματος COP9. Συναρμολόγηση αυτού του συγκροτήματος εξαρτάται από την περιοχή F-box της Fbxw4. Είναι σημαντικό ότι, δείχνουμε ότι FBXW4 locus συνήθως διαγράφονται, υπό-εκφράζεται και σωματικώς μεταλλαγμένα σε καρκίνους του ανθρώπου. Επιπλέον μειωμένη έκφραση FBXW4 συσχετίζεται με κακή επιβίωση του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα ασθενών κυττάρων. Στο σύνολό τους, υποθέτουμε ότι FBXW4 μπορεί να είναι μια παραγνωρισμένη ογκοκατασταλτικών σε ανθρώπινες κακοήθειες λόγω της ικανότητάς της να ρυθμίζει την λειτουργία των κρίσιμων σηματοδοτικών μονοπατιών.

Υλικά και Μέθοδοι

RT-PCR ανάλυση του Fbxw4 έκφραση

QRT-PCR διεξήχθη στο «φυσιολογικό ιστό qPCR πίνακα Ι ποντικού» από ΟηΟεηε γάτα. # MNRT101 (Rockville, MD, USA) χρησιμοποιώντας SYBR Green από την Applied Biosystmes (Foster City, CA, USA) με τις παρεχόμενες oligos GAPDH και «3 mus Fbxw4 RT ‘5’-GTCCTCATCATGCCCAGAGAAGAC-3′ με« 5 mus Fbxw4 ΑΤG ‘5 «-ATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATGC-3» ή «5 mus Fbxw4 rt ‘5’-GTCCTGTG GTTATGACACCTATG-3» και «3 mus Fbxw4 καμία στάση« 5′-TGGGTTCTGA AAGTCTAAGACGTG-3′.

πλασμίδιο κατασκευάζει

Fbxw4 και Fbxo46 κατασκευάσματα αγοράστηκαν από ΟηΟεηε (Rockville, MD, USA) και χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρες PCR. (. Fbxw4 cat # MMM1013-7512491? Fbxo46 γάτα # MMM98477851.). Fbxo46 ενισχύθηκε με τους ακόλουθους oligos χρησιμοποιώντας Vent DNA πολυμεράση (NEBL, Ipswich, MA, USA): mus Fbxo46 ATG RI, 5′- GCGCGAATTCACCATGGACAGGGGCAGCCTCCTGCCC-3 ‘? mus Fbxo46 δεν σταματούν SalI, 5’-GCGCGTCGACCCTCCCCTCTTCCCGGCCAGC-3 ‘. PCR ενισχυμένα θραύσματα κλωνοποιήθηκαν σε ΤΟΡΟ αμβλύ κιτ κλωνοποίησης (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το πλήρους μήκους Fbxo46 στη συνέχεια υπέστη πέψη με EcoRI και SalI και κλωνοποιήθηκε σε φορέα ρΒΑΒΕ-FLAG, πέψη EcoRI και XhoI, που περιέχει μια ετικέτα επιτόπου 3 ‘FLAG κάτω ρεύμα και σε πλαίσιο από την θέση Xhol, το επιτόπιο FLAG στη συνέχεια ακολουθείται από κωδικόνια τερματισμού και μία θέση SalI. Fbxo46 με μια ετικέτα FLAG 3 ‘εντός πλαισίου μετά υποβλήθηκε σε πέψη από ρΒΑΒΕ με EcoRI και SalI και κλωνοποιήθηκε στην θέση EcoRI και XhoI του ρετροϊικού φορέα MIGRX.

Fbxw4 ενισχύθηκε από τον κλώνο ΟηΟεηε με Vent DNA πολυμεράση με τα ακόλουθα ολιγονουκλεοτίδια: mus Fbxw4 ATG RI, 5′- GCGCGAATTCACCATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATG-3 ‘? mus Fbxw4 σημαία σταματήσει XhoI, 5’-GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG-3 ‘. PCR ενισχυμένα θραύσματα κλωνοποιήθηκαν στο ΤΟΡΟ αμβλύ. Πλήρους μήκους Fbxw4 περιέχει ένα εντός πλαισίου ετικέτα 3 ‘FLAG στη συνέχεια ανακτήθηκε με πέψη EcoRI και XhoI. Αυτό το θραύσμα στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων EcoRI και XhoI του MIGRX

Fbxw4

-fbox ενισχύθηκε από το πλήρους μήκους Fbxw4 ΤΟΡΟ κλώνου χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ολίγο:. Fbxw4 σημαία σταματήσει XhoI, 5′-GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG -3 ‘, mus Fbxw4 -fbox EcoRI, 5-GCGCGAATTCACCATGGCCCGGGCCTCGCTCAACACC-3’. Το ενισχυμένο με PCR θραύσμα κλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων EcoRI και XhoI του MIGRX.

ρΚΚ5-HA-Ουμπικουϊτίνη Addgene # 17608 κατατεθεί από τον Ted Dawson [32].

Κυτταρική καλλιέργεια

293 Τ αποκτήθηκαν από την ATCC (Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. επιμολύνσεις DNA σε κύτταρα 293 Τ έγιναν χρησιμοποιώντας ΡΕΙ, σε αναλογία 2,5 μικρογραμμάρια ΡΕΙ /μικρογραμμάριο DNA. Όλες οι κυτταρικές εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν μετά τη συγκομιδή απόξεσης 293 κυττάρων Τ με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως CHAPS (1% CHAPS απορρυπαντικό, 150 mM NaCl, 50 mM Tris ρΗ 7, 5 mM EDTA). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας BCA αντιδραστηρίου ανάλυσης πρωτεΐνης από Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) cat # 23225. 30 μg ολικής πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε για πρότυπη διαδικασία στυπώματος Western. Χημειοφωταύγειας ανίχνευση διεξήχθη χρησιμοποιώντας SuperSignal WestFemto από Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ανοσοκαθιζήσεις

200 μg πρωτεΐνης επωάστηκε σε 400 μΙ συνολικού CHAPS ρυθμιστικό διάλυμα και επωάστηκαν με 15 ul μήτρας συγγένειας που αναφέρεται για μία ώρα στους 4 βαθμούς Κελσίου. Μετά την επώαση, η μήτρα πλύθηκε τρεις φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα CHAPS και στη συνέχεια ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS προστέθηκε απευθείας σε πλυμένα μήτρα, βραστά, και φορτώνεται απευθείας σε φρεάτια ενός πηκτώματος PAGE. φαρμακευτικές αγωγές έγιναν όπως περιγράφεται στο κείμενο, χρησιμοποιώντας 25 μΜ MG132.

Αντισώματα

τουμπουλίνης # B512, χάντρες συζευγμένο αγαρόζης FLAG Μ2, ΣΗΜΑΙΑ πολυ-κλωνική # F7425 (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA)? μήτρα συγγενείας ΗΑ και ΗΑ # 3F10 (Roche, Indianapolis, ΙΝ)? Ουμπικιτίνη # 3933 (Cell Signaling Technologies, Beverly, ΜΑ, USA)? SKP1 γάτα. # Ab10546 και COPS2 /TRIP15 γάτα. # Ab4537 (Abcam, Cambridge, MA, USA)? COPS5 /JAB1 γάτα. # Sc-9074 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

Ανοσοκαταβύθιση και Ταυτοποίηση πρωτεϊνών με νανο-Liquid χρωματογραφία ζευγάρι να Tandem Φασματομετρίας Μάζας (LC-MS /Μ)

πλάκες 10-150 mm των κυττάρων 293 t επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας Fugene6, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Roche, Indianapolis, ΙΝ). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση στο κρύο. CHAPS προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν και ποσοτικά όπως περιγράφεται παραπάνω. 50 mg του συνολικού προϊόντος λύσης επωάστηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης συζευγμένα FLAG (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) για όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς με ήπια ανακίνηση. Σφαιρίδια αγαρόζης προστέθηκαν σε μια στήλη και πλένεται με 10 φορές τον όγκο της στήλης με ροή βαρύτητας. Στήλη πωματίστηκε και 1 χάντρα όγκο κλίνης πεπτίδιο FLAG (διαλυμένο σε PBS σε μια συγκέντρωση 5 mg /ml και κατόπιν αραιώνεται 1:10 σε ρυθμιστικό CHAPS) προστέθηκε στη στήλη και επωάζονται για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς. Το πώμα απομακρύνθηκε και ~ 100 υΙ κλάσματα συλλέχθηκαν ως η έκλουση έρεε με την βαρύτητα. 50% του κάθε κλάσματος (~ 5 κλάσματα) ήταν δυτικό αποτύπωμα με αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Τυπικά το πρώτο κλάσμα εστερείτο της πρωτεΐνης-στόχου και είτε το κλάσμα 2 ή 3 είχαν το μεγαλύτερο μέρος της πρωτεΐνης στόχου. ~ 40% του κλάσματος που περιέχει το μεγαλύτερο μέρος της FLAG-tag καθαρισμένη πρωτεΐνη μερικώς επιλυθεί χρησιμοποιώντας SDS-πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής? τα μίγματα συγκεντρώνονται σε ένα ενιαίο, 3-mm πλάτος «στοίβα» με ηλεκτροφόρηση μέσω SDS «στοίβαγμα τζελ» μέχρι την είσοδο της «γέλη διαχωρισμού», που ακολουθείται από σύντομη χρώση με Coomassie Μπλε και εκτομή του στοιβάζονται πρωτεϊνική ζώνη. Η προετοιμασία των δειγμάτων και φασματομετρία μάζας πραγματοποιήθηκε ακριβώς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33].

ικριωμάτων (Proteome Software Inc., Portland, OR), έκδοση 3_6_1 χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω επικύρωση και cross-συνοψίζω το MS /MS με βάση πεπτιδίων και πρωτεϊνών ταυτοποιήσεις. Πρωτεϊνών και πεπτιδίων πιθανότητα καθορίστηκε σε 95% με μια ελάχιστη απαίτηση πεπτίδιο ενός.

Αποτελέσματα

Fbxw4 είναι ένα κοινό χώρο της εισαγωγής προϊικού και εκφράζεται ποικιλοτρόπως στην κανονική ποντικού ιστούς

Η ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό νέων γονιδίων και γονιδιακών προϊόντων έχει οδηγήσει σε ένα συντριπτικό ποσό των διαθέσιμων στο κοινό δεδομένων και σύνολα δεδομένων. Αναρωτηθήκαμε εάν η εξόρυξη αυτών των διαθέσιμων συνόλων δεδομένων θα μπορούσε να παράγει παρατηρήσεις υπόθεση που δημιουργούν γύρω δυνητικά ενδιαφέροντα γονίδια. Μια τέτοια βάση δεδομένων είναι η «ρετροϊικός βάση δεδομένων tagged γονίδιο του καρκίνου», η οποία είναι μια αποθήκη του προϊικού θέσεις εισαγωγής κλώνοι από διάφορους ερευνητές ψάχνουν για νέα γονίδια τα οποία μπορούν να συμβάλουν στην λευχαιμογένεση (και πιο πρόσφατα transposon μεσολάβηση μελέτες μεταλλαξογένεσης σε αιμοποιητικά και στερεές κακοήθειες). Κοινό θέσεις ενσωμάτωσης προϊού είναι τόποι που παρέχουν ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα στα κύτταρα με disregulating την έκφραση κυτταρικών γονιδίων. Όπως υποστήριξη, οι περισσότερες από τις συχνότερες θέσεις εισαγωγής προϊικού είναι καλόπιστος ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων. Εμείς ερωτηθούν αυτή τη βάση δεδομένων και διαπίστωσε ότι η θέση του γονιδίου Fbxw4 ήταν ο μόνος τόπος στον 30 συνηθέστερα προσδιορίζονται τόπους εισαγωγής που δεν έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στον καρκίνο ή έχουν χαρακτηριστεί βιοχημικά. Υπήρξαν, μέχρι σήμερα, 13 θέσεις εισαγωγής κλωνοποιήθηκε μέσα από το κωδικοποιημένο γονίδιο Fbxw4 και έχουν ενθέσεις κλωνοποιηθεί σε τόσο προς τα εμπρός και ανάστροφο προσανατολισμό (Σχήμα 1Α). Αυτά τα δεδομένα μπορεί να υποδηλώνουν ότι η εισαγωγή προϊικού εντός του τόπου μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της λειτουργίας Fbxw4.

A. Εξέταση του UCSC γονιδίωμα του προγράμματος περιήγησης (genome.ucsc.edu) και της βάσης δεδομένων ρετροϊικοί Tagged Cancer Gene (https://variation.osu.edu/rtcgd/index.html) δείχνει ότι έχουν πολλαπλές ρετροϊικοί εισαγωγές έχουν κλωνοποιηθεί μέσα από το μεταγραφεί Fbxw4 τόπος. Τα βέλη υποδεικνύουν την κατευθυντικότητα των εισαχθέντων προϊό. Τα εξόνια υποδεικνύονται στο κάτω μέρος και η θέση και η κλίμακα του χρωμοσώματος ποντικού 19 δείχνεται στην κορυφή. Τα ονόματα που δίδονται στους κλωνοποιημένα προϊικό ενθέσεις υποδεικνύεται στα αριστερά. θέσεις εισαγωγής που αρχίζει με «ΜΜΤ« κλωνοποιήθηκαν από μαστικού ιού όγκου ποντικού που προκαλείται από καρκινώματα του μαστού. θέσεις εισαγωγής αρχίζει με «DKM», «248» και «Β5» κλωνοποιήθηκαν από λευχαιμίες από μυϊκό ιό λευχαιμίας επιταχυνόμενη καρκίνους αιματοποιητικών. B. FBXW4 είναι μεταβλητά εκφράζεται σε φυσιολογικούς ιστούς ποντικού. Ολίγα ειδικά για μυϊκό Fbxw4 είχαν χρησιμοποιηθεί για την εκτέλεση ποσοτικής RT-PCR για την «ποντίκι κανονική συστοιχία cDNA TissueScan». Τιμές ομαλοποιήθηκαν σε ποσοτική RT-PCR για GAPDH. Γ Σχηματική της πρωτεΐνης Fbxw4. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τα αμινοξέα της πρωτεΐνης. Οι τομείς που περιέχεται εντός Fbxw4 υποδεικνύεται.

Η

Το γεγονός ότι Fbxw4 ουδέποτε χαρακτηριζόμενη μας ώθησε να εξετάσουμε την έκφραση αυτού του τόπου με περισσότερες λεπτομέρειες. Πρώτα προσδιορίζεται ποια είναι η μορφή έκφρασης του mRNA Fbxw4 είναι απέναντι φυσιολογικό ποντικού ιστούς. Χρησιμοποιώντας cDNA που παρασκευάσθηκε από διάφορους ιστούς ποντικού παρατηρήσαμε μια εντυπωσιακή επίπεδο έκφρασης ειδικά στον αδένα involuting μαστικό (Σχήμα 1Β). Αυτό υποδηλώνει την πιθανότητα ότι η έκφραση Fbxw4 αυξάνεται και μπορεί να συμβάλει κατά τη διάρκεια μιας αποπτωτική διαδικασία.

Fbxw4 αλληλεπιδρά με τα συστατικά ενός Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης και την COP9 σηματοσώματος

Ένας αλγόριθμος πρωτεΐνη μοτίβο δείχνει ότι η Fbxw4 πρωτεΐνη περιέχει ένα πεδίο F-box, ένα μοτίβο που συνήθως εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις με τον ουμπικουϊτίνης συγκρότημα λιγάση Ε3 και πέντε WD-40 μοτίβα, τα οποία είναι γνωστές ενότητες αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (Εικόνα 1 C). Παρά τη γενετική εργασίες στον τόπο Fbxw4, δεν έχουν υπάρξει μελέτες που εξετάζουν την βιοχημική λειτουργία του Fbxw4. Ως μια πρώτη προσπάθεια να κατανοήσουν την πιθανή λειτουργία των Fbxw4 πραγματοποιήσαμε ανοσοκατακρήμνιση σε FLAG-tagged Fbxw4 ακολουθείται από φασματομετρία μάζας για τον εντοπισμό, κατά τρόπο αμερόληπτο, Fbxw4 πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν (Εικόνα 2Α). Δύο έλεγχοι διεξήχθησαν για να βοηθήσουν στην ερμηνεία των δεδομένων? ανοσοκατακρήμνιση των προϊόντων λύσης κυττάρου που εκφράζει μόνο την ετικέτα FLAG επιτόπου (συν.) ή ανοσοκατακρήμνιση των προϊόντων λύσης κυττάρου που εκφράζει μια FLAG-tagged F-box «μόνο» έγιναν περιέχει πρωτεΐνη (Fbxo46). Τα δεδομένα από αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι Fbxw4, και όχι έλεγχο, ανοσοκατακρημνίστηκαν συστατικά μιας Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης (SKP1 και CUL1) και τα συστατικά του σηματοσώματος COP9, ενώ και τα δύο F-κουτί που περιέχει πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με SKP1. Είναι ενδιαφέρον, ένα πεπτίδιο που αντιστοιχεί σε RBX1 ταυτοποιήθηκε επίσης στην FLAG-ανοσοκαταβύθιση από τα προϊόντα λύσης που εκφράζουν Fbxw4 και όχι από τις άλλες κυτταρολύματα (δεν φαίνεται)

A. Πίνακας που αντιπροσωπεύει τον αριθμό των μοναδικών πεπτιδίων που προσδιορίζονται από πείραμα φασματομετρία μάζας έναν αντιπρόσωπο ακόλουθες FLAG ανοσοκαθίζηση από κυτταρολύματα κυττάρων ελέγχου που εκφράζουν FLAG μόνο «εισφ.», Ή κύτταρα που εκφράζουν FLAG-Fbxw4 ή FLAG-Fbxo46. Στήλη στα αριστερά δείχνει το μέγεθος της πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης, σε kilo-daltons (kDa). Τα ονόματα γονιδίων των πρωτεϊνών που περιέχουν τα πεπτίδια που προσδιορίζονται φαίνονται στη δεξιά στήλη. Τα συστατικά μιας ουμπικουϊτίνης συγκρότημα λιγάση Ε3 σκιασμένες σε ανοιχτό γκρι? Τα συστατικά του σηματοσώματος COP9 σκιασμένο σκούρο γκρι. Β Επικύρωση δεδομένων φασματομετρίας μάζας δεδομένων με ανοσοκατακρήμνιση ακολουθούμενη από κηλίδα western. Κύτταρα 293 Τ μορφομετατράπηκαν με πλασμίδια που περιέχουν FLAG- Fbxw4, FLAG-Fbxo46 ή κενό φορέα (V). 48 ώρες κυτταρολύματα μετά την επιμόλυνση παρασκευάστηκαν και ανοσοκαταβυθίσεις πραγματοποιήθηκαν με αντισώματα αντι-FLAG μονο-κλωνικών (Μ2) (να ανοσοκαθιζάνει Fbxw4- ή Fbxo46 αλληλεπιδρώντα συμπλέγματα). Κηλίδες Western διεξήχθησαν για την ανίχνευση Fbxw4 ή Fbxo46 (FLAG rb? Πολύκλωνο αντίσωμα ΣΗΜΑΙΑ? Πάνελ κορυφή), SKP1, COPS5, ή COPS2. C. Έκφραση του Fbxw4 μεταβάλλει τη μετανάστευση των ενδογενών SKP1 με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Κύτταρα 293 Τ μορφομετατράπηκαν με ένα άδειο φορέα (αριστερά πάνελ) ή ένα cplasmid περιέχει FLAG-Fbxw4 (δεξιά πάνελ). 48 ώρες κυτταρολύματα μετά την επιμόλυνση παρασκευάστηκαν και διαχωρίστηκαν σε μία στήλη διήθησης πηκτής superpose6. Κηλίδες Western διεξήχθησαν σε κάθε άλλο κλάσμα για την ανίχνευση Fbxw4 (άνω πάνελ) ή SKP1 (κάτω πάνελ). Σε περίπτωση απουσίας του Fbxw4 SKP1 εκλούεται με κορυφή στο κλάσμα 23, ενώ όταν εκφράζεται Fbxw4 υπάρχει συν-έκλουση των Fbxw4 με κορυφές στα κλάσμα 15 και στον κενό όγκο. Τα πρότυπα μέγεθος που εκλούονται από δεδομένη κλάσματα δείξει.

Η

Για να επικυρώσετε τα δεδομένα από τη φασματομετρία μάζας πραγματοποιήσαμε ανοσοκαταβυθίσεις ακολουθείται από κηλίδες Western με αντισώματα ειδικά για τις προσδιοριζόμενες πρωτεΐνες. Νέα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν που εκφράζεται είτε FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxo46, ή FLAG μόνο μάρτυρα (Σχήμα 2Β). Τα δεδομένα που λαμβάνονται δείχνουν ότι τόσο Fbxw4 και Fbxo46 αλληλεπιδρούν με SKP1, αλλά μόνο Fbxw4 αλληλεπιδρά με συστατικά του σηματοσώματος COP9.

Για να ενισχυθεί περαιτέρω η διαπίστωση ότι Fbxw4 μπορεί να αλληλεπιδράσει με ενδογενή SKP1 εκτελέσαμε χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε λύματα κυττάρων επιμολυσμένων με ένα άδειο vecotor ή φορέα έκφρασης FLAG-Fbxw4 (Σχήμα 2C). Τα κλάσματα που λαμβάνονται από τη χρωματογραφία ήταν στύπωμα Western με αντι-SKP1 αντίσωμα. Κύτταρα που δεν εκφράζουν εξωγενή Fbxw4 περιέχουν SKP1 που εκλούεται σε ένα κλάσμα που αντιστοιχεί σε λιγότερο από 67 kDa, ενώ η έκφραση του Fbxw4 οδηγεί σε συν-έκλουση των SKP1 με Fbxw4 σε δύο νέα συγκροτήματα άνω των 200 kDa και ένα συγκρότημα που εκλούεται στο κενό . Η αλλαγμένη μετανάστευση SKP1 σε δύο νέα κλάσματα που συν-εκλούονται με Fbxw4 υποστηρίζει την εύρεση της Fbxw4 αλληλεπιδρά με τα συστατικά ενός συμπλέγματος λιγκάσης Ε3.

Fbxw4 αλληλεπιδρά με SKP1 και το σηματοσώματος COP9 σε ένα F-box με τρόπο που εξαρτάται

για να αρχίσει να καθορίσει την ακριβή βιοχημική λειτουργία του Fbxw4, θα θέλαμε να γνωρίζουμε ποια αλληλεπιδράσεων εξαρτάται από την περιοχή F-box. Για το σκοπό αυτό, έχουμε σχεδιάσει ένα κατασκεύασμα FBXW4 που στερείται τα πρώτα 71 αμινοξέα, που ονομάζονται Fbxw4

-fbox (Σχήμα 3Α). Και πάλι, ανοσοκαταβύθιση ακολουθούμενη από φασματομετρία μάζας εκτελέστηκε από προϊόντα λύσης κυττάρου που εκφράζει FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox, ή FLAG μόνο, να καθορίσει ποια πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τις αντίστοιχες πρωτεΐνες. Δεν πεπτίδια που αντιστοιχούν στα συστατικά της ουβικιτίνης λιγάσης ή στοιχεία του σηματοσώματος COP9 Ε3 προσδιορίστηκαν με Fbxw4

-fbox, ενώ αυτές οι πρωτεΐνες ήταν για άλλη μια φορά βρέθηκε να αλληλεπιδρά με Fbxw4 (Εικόνα 3Β). Για την επικύρωση των δεδομένων από την φασματομετρία μάζας πραγματοποιήσαμε ανοσοκαταβυθίσεις ακολουθείται από κηλίδες Western με αντισώματα ειδικά για τις προσδιοριζόμενες πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν Fbxw4. Παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης που εκφράζεται είτε FLAG-FBXW4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46, ή ΣΗΜΑΙΑ μόνο ελέγχου. Τα δεδομένα δείχνουν ότι Fbxw4 και Fbxo46, αλλά δεν Fbxw4

-fbox αλληλεπιδρούν με SKP1 (Σχήμα 3C).

Α. Σχηματική της Fbxw4

πρωτεΐνη -fbox. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν τα αμινοξέα της πρωτεΐνης. Τα πεδία που περιέχονται σε Fbxw4

-fbox ενδείκνυται. B. Ο πίνακας που αντιπροσωπεύει τον αριθμό των μοναδικών πεπτιδίων που προσδιορίζονται από πείραμα φασματομετρία μάζας έναν εκπρόσωπο παρακάτω ΣΗΜΑΙΑ ανοσοκαθίζηση από προϊόντα λύσης των κυττάρων ελέγχου που εκφράζουν FLAG μόνο «εισφ.», Ή κύτταρα που εκφράζουν FLAG- Fbxw4 ή FLAG- Fbxw4

-fbox. Στήλη στα αριστερά δείχνει το μέγεθος της πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης, σε kilo-daltons (kDa). Τα ονόματα γονιδίων των πρωτεϊνών που περιέχουν τα πεπτίδια που προσδιορίζονται φαίνονται στη δεξιά στήλη. Τα συστατικά μιας ουμπικουϊτίνης συγκρότημα λιγάση Ε3 σκιασμένες σε ανοιχτό γκρι? Τα συστατικά του σηματοσώματος COP9 σκιασμένο σκούρο γκρι. Γ Επικύρωση δεδομένων φασματομετρίας μάζας δεδομένων με ανοσοκατακρήμνιση ακολουθούμενη από κηλίδα western. Κύτταρα 293 Τ μορφομετατράπηκαν με πλασμίδια που περιέχουν FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 ή κενό φορέα (V). 48 ώρες κυτταρολύματα μετά την επιμόλυνση παρασκευάστηκαν και ανοσοκαταβυθίσεις πραγματοποιήθηκαν με αντισώματα αντι-FLAG μονο-κλωνικών (Μ2) (να ανοσοκαθιζάνει Fbxw4-, Fbxw4

-fbox-, ή Fbxo46-αλληλεπιδρούν σύμπλοκα). Κηλίδες Western διεξήχθησαν για την ανίχνευση Fbxw4, Fbxw4

-fbox ή Fbxo46 (FLAG rb? Πολύκλωνο αντίσωμα ΣΗΜΑΙΑ? Επάνω πίνακα). Ή SKP1

Η

FBXW4 αλληλεπιδρά με ουβικιτινιωμένες κυτταρικές πρωτεΐνες

Έχουμε πειστικό τρόπο ότι Fbxw4 αλληλεπιδρά με ουμπικουϊτίνης συγκρότημα λιγάση Ε3 και το σηματοσώματος COP9. Εμείς έθεσε ευθέως ότι Fbxw4 θα αλληλεπιδρούν με ubqiuitinated πρωτεΐνες μέσα στο κύτταρο. Είναι γνωστό ότι για πολλά υποστρώματα του Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης, ουβικιτινίωση της πρωτεΐνης υποστρώματος οδηγεί σε ταχεία απελευθέρωση από το συγκρότημα. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι η αναστολή του πρωτεασώματος θα οδηγούσε σε συσσώρευση αυτών των κυτταρικών πρωτεϊνών ουβικουιτινωμένης από το συγκρότημα λιγάση Fbxw4. Έτσι, η συσσώρευση των πρωτεϊνών ουβικουιτινωμένης, με τη σειρά, οδηγούν σε εμπλουτισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ Fbxw4 και ουβικιτινιωμένες υποστρώματα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα άδειο φορέα (ν), ΗΑ-ουμπικιτίνη, ή ΗΑ-ουμπικουϊτίνης και FLAG-Fbxw4. 36 ώρες τα κύτταρα μετά την επιμόλυνση υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον αναστολέα πρωτεασώματος, MG132, επί έξι ώρες. Κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και ανοσοκαταβυθίζονται με αντίσωμα αντι-ΗΑ που ακολουθείται από κηλίδα western για Fbxw4 (Σχήμα 4Α, άνω πλαίσιο). Μια αυξημένη ποσότητα Fbxw4 βρέθηκε να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες ουβικουιτινωμένης μετά τη θεραπεία MG132. Αυτό Fbxw4 φάνηκε να είναι το κανονικό μοριακό βάρος που υποδηλώνει αυξημένη συσχέτιση των FBXW4 με ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες και όχι στην αύξηση της ubiquitated Fbxw4. Επιπλέον, η αυξημένη ποσότητα Fbxw4 που ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ΗΑ antiobody δεν οφειλόταν σε αύξηση της συνολικής ποσότητας Fbxw4 αφού υπήρξε μια μικρή μείωση στο συνολικό ποσό των Fbxw4 μετά από αγωγή MG132 (Σχήμα 4Α, κάτω πάνελ). Ως περαιτέρω υποστήριξη της έννοιας αυτής, υπήρξε μια αύξηση των συνολικών επιπέδων ουβικουιτινωμένης πρωτεϊνών και την αύξηση της ποσότητας του ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες που ανοσοκαταβυθίστηκαν με Fbxw4 εξής ανοσοκαταβύθιση Fbxw4 από τα ίδια προϊόντα λύσης μετά από τη θεραπεία MG132 (Σχήμα 4Α, μεσαίο πάνελ).

Α. Fbxw4 μπορεί να ανοσοκαταβυθίζεται από ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες και Fbxw4 να ανοσοκαθιζάνουν ουβικιτινιωμένες πρωτεΐνες. Κύτταρα 293 Τ μορφομετατράπηκαν με κενό φορέα (V), ΗΑ-ουμπικιτίνη, ή ΗΑ-ουμπικουϊτίνης και FLAG-Fbxw4. 36 ώρες τα κύτταρα μετά την επιμόλυνση υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (+) ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (-) για έξι ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και ανοσοκαταβυθίσεις πραγματοποιήθηκαν με είτε αντι-ΗΑ αντισώματα (δύο πινάκια κορυφής) ή μονο-κλωνικά αντισώματα αντι-FLAG (Μ2) (κάτω δύο πίνακες). Κηλίδες Western διεξήχθησαν επί αμφοτέρων των ανοσοκαταβυθίσεις με αντισώματα αντι-ΡΕΑΟ και αντι-ΗΑ. Β FBXW4 συνεργάτες με κυτταρικές πρωτεΐνες που είναι ενδογενώς ουβικουιτινωμένης. Κύτταρα 293 Τ μορφομετατράπηκαν με πλασμίδια που περιέχουν FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46 ή ένα κενό φορέα (V). 36 ώρες τα κύτταρα μετά την επιμόλυνση υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (+) ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (-) για έξι ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και ανοσοκαταβυθίσεις πραγματοποιήθηκαν με αντισώματα αντι-FLAG μονο-κλωνικών (Μ2) (να ανοσοκαθιζάνει Fbxw4-, Fbxw4

-fbox-, ή FBXO46-αλληλεπιδρούν σύμπλοκα). Κηλίδες Western διεξήχθησαν για την ανίχνευση Fbxw4, Fbxw4

-fbox ή Fbxo46 (FLAG rb? Πολύκλωνο αντίσωμα ΣΗΜΑΙΑ? Επάνω πίνακα). Ή Ουμπικουϊτίνη

Η

Θα ήθελα να ξέρω αν παρόμοια αποτελέσματα θα ληφθούν ψάχνετε σε ενδογενείς ουβικιτίνης, σε αντίθεση με υπερ-εκφράζεται HA-ουμπικιτίνη. Επιπλέον, θέλαμε να προσδιορίσει αν οι προηγουμένως παρατηρήθηκαν αποτελέσματα ήταν εξαρτάται από ένα άθικτο τομέα F-box. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα επιμολυσμένα με FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4

-fbox, FLAG-Fbxo46, ή ΣΗΜΑΙΑ ελέγχουν μόνο φορέα (v). Τα κύτταρα είτε σε επεξεργασία με όχημα ή MG132 για έξι ώρες και τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν. Ανοσοκαταβύθιση με αντισώματα αντι-FLAG διεξήχθησαν και στυπώματα Western για την ανίχνευση ενδογενούς ουβικιτίνης ή FLAG-tagged πρωτεΐνες. Παρατηρήσαμε μια δραματική αύξηση στην ποσότητα του ουβικιτίνης που σχετίζονται με Fbxw4. Αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν απλά λόγω της υπερ-έκφραση Fbxw4 δεδομένου ότι ούτε Fbxw4

-fbox ή Fbxo46, οι οποίες εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα, έδειξε μια αυξημένη αλληλεπίδραση με ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες μετά MG132 που προκαλείται από την αναστολή του πρωτεασώματος. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ένα ανέπαφο πεδίο F-box απαιτείται για σύνδεση των Fbxw4 με ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες και δεν είναι όλα F-box που περιέχει πρωτεΐνες είναι ικανές τέτοια δραματική αύξηση της αλληλεπιδράσεις με ουβικιτινιωμένες κυτταρικές πρωτεΐνες μετά την αναστολή του πρωτεασώματος. Παρά το γεγονός ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ Fbxw4 και κυτταρικών ουβικιτινιωμένες πρωτεΐνες εξαρτάται από ένα στη διακριτικότητα f-box τομέα απαιτείται περισσότερη δουλειά για να καθοριστεί εάν αυτές οι πρωτεΐνες είναι καλόπιστος υποστρώματα του συγκροτήματος ουβικιτίνης λιγάση SCFFbxw4 ή απλά πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με το συγκρότημα μέσω εναλλακτικών μηχανισμών.

FBXW4 είναι μεταλλαγμένο, έχασε και υπο-εκφράζεται σε ανθρώπινους καρκίνους

για να ξεκινήσετε να αντιμετωπίσει το ενδεχόμενο ότι FBXW4 είναι σημαντικό σε ανθρώπινα καρκινικά εξετάσαμε κατά πόσο το γονίδιο μεταλλάσσεται σε ανθρώπινους καρκίνους. Με την αναζήτηση διαθέσιμων δημόσιων βάσεων δεδομένων (Το έργο Cancer Genome Atlas (TCGA) και ο Κατάλογος των σωματικών μεταλλάξεων στον Καρκίνο (COSMIC) από το Ινστιτούτο Sanger) βρήκαμε ότι FBXW4 είναι σωματικώς μεταλλαγμένα σε επτά από ~470 όγκων που έχουν ακολουθία, μέχρι στιγμής (Σχήμα 5Α). Δύο από τις μεταλλάξεις είναι σιωπηλός και δεν οδηγούν σε μεταβολές στην αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης, αλλά κατά τρόπο ενδιαφέροντα, οι τέσσερις μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος (R96, G106, R145 και R367) είναι εξελικτικά συντηρημένη σε όλη τη διαδρομή προς ορισμένα είδη Drosophila. Στην πραγματικότητα, R96L, G106W και R367C είχαν προβλεφθεί να διαταράξει τη λειτουργία της πρωτεΐνης με πολύ υψηλό σημασία (ρ = & lt? 0,0003) χρησιμοποιώντας αλγόριθμο ProPhylER. Εκτός από αυτές τις προβλεπόμενες επιζήμια μεταλλάξεων, μία μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου, E245fs *, παρατηρήθηκε σε έναν ασθενή καρκίνωμα του μαστού που θα οδηγούσε στην παραγωγή μιας πρωτεΐνης FBXW4 που λείπει τα τελευταία τρία WD-40 μοτίβα (Σχήμα 5Α). Η διαπίστωση ότι οι σωματικές μεταλλάξεις βρέθηκαν σε ανθρώπινους καρκίνους προβλέπεται να διαταράξουν κρίσιμες πτυχές της λειτουργίας FBXW4 ενισχύει την πιθανότητα ότι FBXW4 ρυθμίζει σημαντικές ομοιοστατική διαδικασίες.

Α. FBXW4 είναι σωματικώς μεταλλαγμένα σε καρκίνους του ανθρώπου. Το έργο Cancer Genome Atlas (TCGA) και ο Κατάλογος των σωματικών μεταλλάξεων στον Καρκίνο (COSMIC) από το Ινστιτούτο Sanger είχαν ερωτηθεί για τις σωματικές μεταλλάξεις στο FBXW4. Από ~470 όγκους που αναλύθηκαν για μετάλλαξη σε FBXW4, πέντε σωματικές μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν στα αμινοξέα που αναγράφεται στο σχηματικό. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι τέσσερις ενιαίο αμινοξέα που είναι στόχοι των μεταλλάξεων (R96, G106, R145 και R367) είναι εξελικτικά συντηρημένες στη Drosophila. R96L, G106W και R367C προβλέπεται να διαταράξουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης (σημαντικότητα ρ = & lt? 0,0003, χρησιμοποιώντας αλγόριθμο ProPhylER) και το E245fs * μετάλλαξη παράγει μια πρωτεΐνη που στερείται του δύο τελευταίες και ένα μισό WD-49 μοτίβα. Β FBXW4 συχνά χάνεται σε ανθρώπινους καρκίνους. Η συχνότητα της απώλειας αριθμού αντιγράφων DNA /διαγραφής απέναντι 719 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές που αντιπροσωπεύουν διάφορους ιστούς προέλευσης από το Cancer Γονιδιώματος Sanger Ινστιτούτα παρουσιάζονται μαζί με την συχνότητα στις μεμονωμένες τύπους καρκίνου με n ≥ 5. C. FBXW4 υποεκφράζεται σε καρκίνο κυτταρικές σειρές με την απώλεια αριθμό αντιγράφων. Τα οικόπεδα πλαίσιο το οποίο απεικονίζει τα επίπεδα έκφρασης του mRNA για τις κυτταρικές γραμμές με την απώλεια /διαγραφή και εκείνων χωρίς απώλεια /διαγραφή για όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές από Β με αντίστοιχο γονίδιο προφίλ μικροσυστοιχιών έκφραση παρουσιάζονται μαζί με την έκφραση στους τέσσερις επιμέρους τύπους καρκίνου με την υψηλότερη συχνότητα απώλεια /διαγραφή (δέρμα, του μαστού, του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και τον καρκίνο του πνεύμονα). Τα επίπεδα έκφρασης συγκρίθηκαν μεταξύ των δύο ομάδων με τη χρήση της Mann-Whitney U-test και ρ & lt? 0,01 θεωρήθηκε σημαντική. Μουστάκια αντιπροσωπεύουν τις 10-90 εκατοστημόρια με κουκκίδες εμφανίζει τις ακραίες τιμές. Δ FBXW4 χάνεται και υπο-εκφράζεται σε κλινικές όγκους πνευμονικού αδενοκαρκινώματος από το έργο TCGA.