Αφηρημένο

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η μικροχλωρίδα του εντέρου επηρεάζει παχέος την ανάπτυξη του καρκίνου, αλλά και προηγούμενες μελέτες έχουν μεταβληθεί σε πληθυσμό, τεχνικές μεθόδους, και τις ενώσεις με τον καρκίνο. Η κατανόηση αυτών των μεταβολών είναι απαραίτητη για συγκρίσεις και για τους πιθανούς συγκέντρωση σε όλες τις μελέτες. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε αλληλουχίας καραμπίνα ολόκληρου του γονιδιώματος σε δείγματα κοπράνων από 52 προ-επεξεργασία του παχέος περιπτώσεων καρκίνου και 52 μάρτυρες από την Ουάσιγκτον, DC. Συγκρίναμε τα ευρήματα από μια προηγουμένως δημοσιευμένη μελέτη 16S rRNA στη μεταγονιδιωματική που προέρχονται ταξινομία εντός του ίδιου πληθυσμού. Επιπλέον, τα γονίδια μεταγονιδίωμα-προβλέψει, ενότητες, και τα μονοπάτια της Washington, DC περιπτώσεις και ελέγχους συγκρίθηκαν με τις περιπτώσεις και τους ελέγχους που προσλαμβάνονται στη Γαλλία των οποίων δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας την ίδια πλατφόρμα. Σύλλογοι μεταξύ της παρουσίας των κοπράνων Fusobacteria,

Fusobacterium

, και

Porphyromonas

με καρκίνο του παχέος εντέρου εντοπιστεί από 16S rRNA είχαν αναπαραχθεί από μεταγονιδιωματική, ενώ υψηλότερη σχετική αφθονία των Clostridia σε περιπτώσεις καρκίνου βασίζεται στην 16S rRNA ήταν μόνο οριακά με βάση μεταγονιδιωματικών. Αυτό έδειξε ότι μέσα στο ίδιο σύνολο του δείγματος, οι περισσότεροι, αλλά όχι όλοι οι ταξινομικές ενώσεις παρατηρήθηκαν και με τις δύο μεθόδους. Λαμβάνοντας υπόψη σημαντικές συσχετίσεις του καρκίνου με τη σχετική αφθονία των γονιδίων, των μονάδων και μονοπάτια σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη γαλλική μεταγονιδιωματική σύνολο δεδομένων, στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις στην Ουάσιγκτον, DC πληθυσμού ανιχνεύθηκαν για τέσσερα από τα 10 γονίδια, τα τρία από τα εννέα ενότητες, και επτά από της 17ης μονοπάτια. Συνολικά, ορθοκολικό καρκίνο κατάσταση στη μελέτη Washington, DC συσχετίστηκε με 39% των μεταγονιδίωμα-προέβλεψε γονίδια, modules, και οδούς που εντοπίστηκαν στη γαλλική μελέτη. Περισσότερες εντός και μεταξύ των συγκρίσεων πληθυσμού απαιτούνται για τον εντοπισμό των πηγών διακύμανσης και η νόσος ενώσεις που μπορούν να αναπαραχθούν παρά τις διακυμάνσεις. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να έχουν μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων ή δεδομένα πισίνα σε όλες τις μελέτες να έχουν επαρκή ισχύ για την ανίχνευση ενώσεων που έχουν αναπαραχθεί και σημαντική μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές

Παράθεση:. Vogtmann E, Hua X, Zeller G, Sunagawa S, Voigt AY, Hercog R, et al. (2016) καρκίνο του παχέος εντέρου και του ανθρώπινου microbiome Gut: Επαναληψιμότητα με ολόκληρο το γονιδίωμα κυνηγετικό όπλο αλληλουχίας. PLoS ONE 11 (5): e0155362. doi: 10.1371 /journal.pone.0155362

Συντάκτης: John Parkinson, Νοσοκομείο Παίδων, Καναδάς

Ελήφθη: 17, Νοεμβρίου, 2015? Αποδεκτές: 27 Απρ 2016? Δημοσιεύθηκε: 12 Μαΐου 2016

Αυτό είναι ένα ανοικτό άρθρο πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Τα δεδομένα κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική αλληλουχίας είναι διαθέσιμη στην ευρωπαϊκή βάση δεδομένων νουκλεοτιδικής Αρχείο με αριθμό ένταξης PRJEB12449 (https://www.ebi.ac .uk /ΕΝΑ /data /view /PRJEB12449). Λόγω περιορισμών προστασίας της ιδιωτικής ζωής, η πλήρης μεταδεδομένα μπορούν να τεθούν στη διάθεση ειδικευμένων ερευνητών, επικοινωνώντας με τον Δρ Rashmi Sinha ([email protected])

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του National Cancer Ινστιτούτο. GZ, SS, AYV, RH, και PB έλαβε χρηματοδότηση μέσω του έργου CancerBiome (Ευρωπαϊκό Συμβούλιο Έρευνας αναφοράς του έργου 268985)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

συντομογραφίες: ΔΜΣ, δείκτης μάζας σώματος? CRC, ο καρκίνος του παχέος εντέρου? DC, Περιφέρεια της Κολούμπια? HMP, Ανθρώπινα microbiome έργου? motu, μεταγονιδιωματική επιχειρησιακή ταξινομική μονάδα? OTU, Επιχειρησιακό ταξινομική μονάδα? WGSS, Οροφοδιαμέρισμα, η ακολουθία του γονιδιώματος κυνηγετικό όπλο

Εισαγωγή

Το ανθρώπινο microbiome αποτελεί το αντικείμενο ενός αυξανόμενου τομέα της έρευνας, δεδομένου ότι είναι πιθανό που σχετίζονται με την ανθρώπινη υγεία και την ασθένεια. Υπάρχουν συσσωρευμένα στοιχεία ότι ο microbiome παίζει ένα ρόλο σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) ανάπτυξη ή την πρόοδο, πιθανώς μέσω φλεγμονωδών μονοπατιών ή καρκινογόνες μικροβιακοί μεταβολίτες [1], και οι ενώσεις μικροβιακή με CRC έχουν προταθεί σε διάφορες μελέτες [2-9] . Για παράδειγμα, με αλληλούχιση επόμενη γενιά της καθολικής βακτηριακού γονιδίου 16S rRNA στο DNA που εξάγεται από τα περιττώματα, η ομάδα μας έχει δείξει ότι, σε σύγκριση με μάρτυρες, CRC περιπτώσεις έχουν χαμηλότερη κοινότητα ποικιλομορφία, σεμνά χαμηλότερη σχετική αφθονία των Clostridia, και υψηλότερη παρουσία

Fusobacterium

και

Porphyromonas

[2]. Της προηγούμενης microbiome και μελέτες CRC, κάποια χρησιμοποιείται 16S rRNA αλληλουχίας του γονιδίου [2, 4, 5, 7, 9], ενώ άλλοι χρησιμοποιούνται σε ολόκληρο το γονιδίωμα κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματικής αλληλουχίας /κυνηγετικό όπλο (WGSS? [3, 6, 8]). WGSS δίνει όχι μόνο τα προφίλ των βακτηριακών σύνθεση και ποικιλομορφία, αλλά εκτιμά επίσης τη λειτουργική δυνατότητα της microbiome [10].

Πραγματοποιήσαμε κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική αλληλουχίας των δειγμάτων κοπράνων από μια μελέτη CRC-μαρτύρων που διεξάγονται στη δεκαετία του 1980 σε Washington, DC που είχαν προηγουμένως αναλυθεί με αλληλούχιση του γονιδίου 16S rRNA [2]. Υποβάλλοντας τα ίδια δείγματα σε διαφορετική μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας, ήμασταν σε θέση να συγκρίνουν τις ήδη παρατηρούμενες συσχετίσεις 16S rRNA με δεδομένα από κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική αλληλουχίας. Επιπλέον, με τη χρήση αυτής της τεχνολογίας, ήμασταν σε θέση να διερευνήσει πιθανές συσχετίσεις μικροβιακών γονιδίων-επίπεδο με CRC που δεν ήταν δυνατό στα δεδομένα αλληλουχίας του γονιδίου 16S rRNA, και συγκρίναμε τις ενώσεις γονίδιο επιπέδου με εκείνα που ανιχνεύθηκαν σε προηγούμενη γαλλική ασθενών-μαρτύρων μελέτη η οποία εφαρμόζεται ο αγωγός ίδια εξόρυξη μεταγονιδιωματικής DNA και πλατφόρμα αλληλουχίας και της βιοπληροφορικής [8].

Υλικά και Μέθοδοι

Πρωτοβάθμια πληθυσμό της μελέτης

Τα δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν σε ένα CRC μελέτη ελέγχου που έχει προηγουμένως περιγραφεί λεπτομερώς [11] και την περιγραφή της ανάλυσης της αντίστοιχης μελέτης προσδιορισμού αλληλουχίας 16S rRNA γονίδιο στο παρελθόν ήταν δημοσιευμένο [2]. Εν συντομία, περιπτώσεις CRC και τη συχνότητα μάρτυρες οι οποίοι περίμεναν την επέμβαση για μη-ογκολογικών και μη-γαστρεντερικές παθήσεις προσλήφθηκαν 1985-1987 στην Ουάσιγκτον, Ηνωμένες Πολιτείες. Πριν από την χειρουργική επέμβαση ή άλλη επεξεργασία, οι συμμετέχοντες συλλέγονται όλα τα κόπρανα για μια περίοδο δύο ημέρα και αποθηκεύεται τους σε ξηρό πάγο. Στο εργαστήριο, τα δείγματα ξηράνθηκαν με ψύξη, ενώνονται, και συνεχώς αποθηκευμένα στην συνέχεια στους -40 ° C. Για την τρέχουσα κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική μελέτη, επιλεγμένα δείγματα από 52 περιπτώσεις και 52 ελέγχους (πληθυσμός WGSS DC). Οι περιπτώσεις και οι έλεγχοι είχαν συνδυαστεί με το φύλο και ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ? & Lt? 20 kg /m

2 ή ≥ 20 kg /m

2). Ενώσεις στην ανάλυση WGSS DC συγκρίθηκαν με εκείνες του προηγούμενου 16S rRNA μελέτη αλληλουχιών γονιδίων (πληθυσμός 16S DC), η οποία περιελάμβανε 47 περιπτώσεις CRC και 94 άτομα ελέγχου από την ίδια μητρική μελέτη. Όλα τα 47 CRC περιπτώσεις από 16S DC περιλήφθηκαν στο WGSS DC και οι 52 έλεγχοι σε WGSS DC περιελήφθησαν στις 94 ελέγχους από 16S DC. Οι συμμετέχοντες με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση και η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Γραφείο για τα Ανθρώπινα Θέματα έρευνας στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας.

Ανεξάρτητα πληθυσμού επικύρωση

Εμείς περιλαμβάνονται δεδομένα από μια προηγουμένως δημοσιευμένη μελέτη (πληθυσμός F ) ως ανεξάρτητο σύνολο επικύρωση [8]. Εν συντομία, CRC περιπτώσεις και τυχαία επιλεγμένων ελέγχων προσλήφθηκαν 2004-2006 στο Παρίσι, Γαλλία. Πριν από την κολονοσκόπηση, ένα φρέσκο ​​δείγμα κοπράνων συλλέχθηκε και καταψύχθηκε στους -20 ° C εντός τεσσάρων ωρών από τη συλλογή. Πληθυσμός F περιλαμβάνονται 53 περιπτώσεις CRC, 15 μεγάλες περιπτώσεις αδενώματος, 27 μικρά περιπτώσεις αδενώματος, και 61 φυσιολογικούς μάρτυρες. Δεδομένου ότι οι έλεγχοι από την Ουάσιγκτον μπορεί να έχει συμπεριληφθεί επίσης αδιάγνωστες μικρά αδενώματα, η σύγκριση ασθενών-μαρτύρων που από τον πληθυσμό F περιλαμβάνονται 53 περιπτώσεις CRC και 88 ελέγχους (δηλαδή, 27 μικρά αδενώματα και 61 φυσιολογικούς μάρτυρες) και εξαιρούνται τα δεδομένα από τα 15 μεγάλα αδενώματα .

Έχουμε περιλαμβάνονται επίσης στη διάθεση του κοινού κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική στοιχεία από 292 συμμετέχοντες MetaHIT [12, 13], οι συμμετέχοντες και 94 του Ανθρώπου microbiome Έργου (HMP) Φάση Ι [14] για τη σύγκριση της συνολικής ποικιλομορφία, πλούτο, και την ομοιομορφία με μας δείγματα.

εξαγωγή DNA και ολόκληρου του γονιδιώματος αλληλουχίας κυνηγετικό όπλο

Οι λυοφιλιωμένο δείγματα κοπράνων από WGSS DC είχαν αποψυχθεί, επαναιωρείται σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και ένα δείγμα εστάλη στο Genomics πυρήνα εγκατάσταση, το Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας στη Χαϊδελβέργη, Γερμανία σε ξηρό πάγο. Οι μέθοδοι για την εκχύλιση του DNA, την προετοιμασία βιβλιοθήκη, και αλληλούχιση καραμπίνα ολόκληρου γονιδιώματος έχουν περιγραφεί λεπτομερώς [8] και ήταν τα ίδια για τον πληθυσμό WGSS DC και πληθυσμός F. Εν συντομία, το DNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα κοπράνων με τη χρήση της απομόνωσης του DNA GNOME Kit (MP Biomedicals) με μικρές τροποποιήσεις. Ολόκληρο-γονιδίωμα κυνηγετικό όπλο αλληλουχίας του DNA εξάγεται διεξήχθη με τη χρήση της Illumina HiSeq 2000/2500 (Illumina, San Diego, USA). Τα δείγματα αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία με 100 bp μήκους ανάγνωσης για ζεύγη τέλος ακολουθίες στην Εγκατάσταση Genomics πυρήνα, Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας, Χαϊδελβέργη, Γερμανία με μια στοχευμένη βάθος αλληλουχίας των 5 GBP.

Βιοπληροφορική

η γενική στρατηγική για την βιοπληροφορικής επεξεργασία των δεδομένων αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος έχει περιγραφεί προηγουμένως λεπτομερώς [8] και ήταν η ίδια και για τις δύο WGSS DC και πληθυσμός προφίλ αφθονίας F. ταξινομική συνοψίζονται στο NCBI ταξινομική βαθμίδα που κυμαίνεται από είδος σε συνομοταξία και μεταγονιδιωματική λειτουργικές ταξινομικές μονάδες (motu) [15, 16] δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας MOCAT [17]. MOCAT χρησιμοποιήθηκε επίσης για να σχολιάσετε λειτουργικά γονίδια που προέρχονται από μεταγονιδιωματική συνελεύσεις στη βάση δεδομένων KEGG (έκδοση 62) [18]. Οικολογική δείκτες (Shannon πολυμορφία, τον πλούτο των ειδών, και της κοινότητας ομαλότητα) υπολογίστηκαν με βάση motu σχετικές αφθονίες και μείωση της δειγματοληψίας σε 2000 ένθετα χρησιμοποιώντας το vegan πακέτο λογισμικού R [19]. Ένας συμμετέχων από τον πληθυσμό WGSS DC και τέσσερις συμμετέχοντες από τον πληθυσμό F αποκλείστηκαν λόγω της χαμηλότερης κάλυψης ανάγνωσης.

Η στατιστική ανάλυση

σύγκριση ποικιλομορφία Shannon, τον πλούτο, και ομαλότητα για τον πληθυσμό WGSS DC, ο πληθυσμός F , δείγματα MetaHIT, και HMP Φάση Ι και δοκιμάζονται οι διαφορές περίπτωση ελέγχου του πληθυσμού WGSS DC και του πληθυσμού F χρησιμοποιώντας το τεστ Kruskal Wallis. Στη συνέχεια, τόσο για τον πληθυσμό πρωτογενούς μελέτης (πληθυσμός WGSS DC: 52 περιπτώσεις έναντι 52 ελέγχους) και η ανεξάρτητη πληθυσμού επικύρωση (πληθυσμός F: 53 περιπτώσεις έναντι 88 ελέγχους), ελέγξαμε τις συσχετίσεις μεταξύ κατάστασης υπόθεση /έλεγχος και οι δύο την σχετική αφθονία και η παρουσία /απουσία των διαφορετικών ταξινομικών επίπεδα και κατηγορίες γονίδιο (δηλαδή, τα γονίδια, των μονάδων και οδών). Ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης με ρύθμιση για την ηλικία, το φύλο, και δείκτη μάζας σώματος (ΒΜΙ) χρησιμοποιήθηκε και οι τιμές ρ υπολογίστηκαν με βάση τη δοκιμή Wald (S1 πίνακα). Τρεις CRC περιπτώσεις από τον πληθυσμό WGSS DC έλειπαν δεδομένα ΔΜΣ έτσι συμπεριλάβαμε αυτές τις τιμές χρησιμοποιώντας το φύλο μέσα από τις περιπτώσεις CRC. Για συγκρισιμότητα με τη μελέτη 16S DC, υπολογίσαμε επίσης μια αδιόρθωτη μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης για δύο όψεων τεστ chi-τετράγωνο Wald και δύο όψεων μη παραμετρική δοκιμασία Wilcoxon για την παρουσία /απουσία και σχετική αφθονία συγκεκριμένων taxa, αντίστοιχα. Εμείς παράγεται QQ οικόπεδα της-log (παρατηρείται σ αξία) έναντι του-log (p τιμές κάτω από μια κανονική κατανομή) εντός WGSS DC και του πληθυσμού F για όλα τα ταξινομικά επίπεδα και τις κατηγορίες γονίδιο να εξακριβώσει ενδεχομένως στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μετά από διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις. Για τα δεδομένα της κατηγορίας του γονιδίου στον πληθυσμό F, χρησιμοποιήσαμε Bonferroni διόρθωση του τιμή p για τον προσδιορισμό στατιστική σημαντικότητα (δηλαδή, σ & lt? 0,05 /αριθμός δοκιμών) και θεωρείται μια τιμή ρ & lt? 0,05 για να είναι στατιστικά σημαντική για τις αναλύσεις επαναληψιμότητα σε WGSS DC. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση R (έκδοση 3.0.0).

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά των 52 περιπτώσεων CRC και 52 μάρτυρες από τον πληθυσμό WGSS DC παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Είχαν καλά συμφωνημένα κατά φύλο και BMI. Ωστόσο, CRC περιπτώσεις είχαν υψηλότερο ποσοστό των μη-ισπανόφωνοι μαύροι (23,1% των περιπτώσεων και 5,8% στην ομάδα ελέγχου), χαμηλότερο επίπεδο εκπαίδευσης (15,4% των περιπτώσεων και 3,8% της ομάδας ελέγχου είχαν λιγότερο από ένα υψηλό σχολική εκπαίδευση), και περισσότερο ρεύμα καπνιστές (13,5% των περιπτώσεων και 3,8% των ελέγχων). Εντός των περιπτώσεων CRC, 28,8% των περιπτώσεων είχε καρκίνο στο δεξιό κόλον και 34.6% είχε καρκίνο στον αριστερό κόλον. Η πλειοψηφία των CRCs ήταν επεμβατική, χωρίς γνωστή μεταστάσεις (40,4%), αλλά 34,6% ήταν μεταστατικό.

Η

παχέος ενώσεις καρκίνο στο WGSS DC έναντι 16S DC

Στο προηγούμενο 16S ανάλυση αλληλουχιών γονιδίων rRNA σε αυτόν τον πληθυσμό (16S DC), η παρουσία των 4 taxa και η σχετική αφθονία 3 taxa συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με CRC κατάσταση συμβαίνει με ψευδή ανακάλυψη ποσοστό προσαρμοσμένο τιμές ρ μικρότερες από 0.05. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, θα αναπαραχθεί μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του φύλα Fusobacteria και την κατάσταση περίπτωση CRC (p = 0,003), συγκεκριμένα ότι 76,9% των περιπτώσεων και 48,1% των ελέγχων είχαν ανιχνεύσιμη Fusobacteria. Αυτό αναπαράγει τη σύνδεση των Fusobacteria με την ιδιότητα περίπτωση κατά την ανάλυση 16S DC? αν και η ανίχνευση ήταν χαμηλότερη (36,2% των περιπτώσεων και 16,0% των ελέγχων, Πίνακας 2). Σε σύγκριση με το 16S DC, ο WGSS είχαν επίσης υψηλότερα διαδεδομένη ποσοστό ανίχνευσης για άλλα taxa, και αναπαράγεται μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του

Fusobacterium

(p = 0.006) και

Porphyromonas

(p = 0,032) με την ιδιότητα περίπτωση CRC. Η συσχέτιση μεταξύ

Atopobium

και CRC από το 16S DC δεν περιελήφθη στην WGSS (Πίνακας 2). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, δεν είχαμε αναπαράγουν τις ενώσεις μεταξύ της σχετικής αφθονίας ειδικών taxa και το καθεστώς περίπτωση CRC, αν και η συσχέτιση μεταξύ της σχετικής αφθονίας των Clostridia έτειναν να είναι χαμηλότερα σε περιπτώσεις (p = 0.092). Αξίζει να σημειωθεί ότι, σχετική αφθονία Clostridia εκτιμάται στο WGSS ήταν δύο φορές μικρότερη για τις δύο περιπτώσεις και ελέγχους σε σύγκριση με ότι στη μελέτη 16S DC. Του πληθυσμού WGSS DC, η τάξη με υψηλότερη σχετική αφθονία ήταν Bacteroidia, η οποία είχε μια σχετική αφθονία του 53,2% στις περιπτώσεις και 50,9% σε ελέγχους (S1 πίνακα).

Η

παχέος ενώσεις του καρκίνου στην WGSS DC σε σχέση με τον πληθυσμό F

σε πληθυσμού WGSS DC, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των περιπτώσεων CRC και ελέγχων για την ποικιλομορφία Σάνον, τον πλούτο ή την ομαλότητα με βάση Motus, αν και σε γενικές γραμμές οι έλεγχοι είχαν ελαφρώς μεγαλύτερη ποικιλότητα άλφα σε σύγκριση με τις περιπτώσεις (Σχήμα 1). Shannon πολυμορφία, τον πλούτο και την ομαλότητα ήταν παρόμοια για τον πληθυσμό WGSS DC, ο πληθυσμός F, και τα δείγματα MetaHIT, ενώ τα δείγματα HMP έτειναν να έχουν ελαφρώς χαμηλότερη ποικιλομορφία Shannon, τον πλούτο και την ομαλότητα.

Οι στατιστικές διαφορές μεταξύ καρκίνου του παχέος εντέρου περιπτώσεις και ελέγχου εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Kruskal-Wallis.

η

CRC κατάσταση περίπτωση του πληθυσμού F [8] συνδέθηκε έντονα με τη σχετική αφθονία των πολλών μεταγονιδίωμα που προέρχονται από γονίδια KEGG, modules, και τα μονοπάτια ( όπως φαίνεται από την ισχυρή απόκλιση από την γραμμή 45 ° μοιρών στην Εικόνα 2), αλλά αυτό δεν παρατηρήθηκε στον πληθυσμό WGSS DC. Για την παρουσία των γονιδίων KEGG, modules, και τα μονοπάτια, λίγα ήταν τα στοιχεία για μία ή περισσότερες ενώσεις με την ιδιότητα περίπτωση CRC σε κάθε πληθυσμό της μελέτης (Σχήμα 2). Από τις ενώσεις ανιχνεύθηκαν για τη σχετική αφθονία των δεδομένων γονιδιακής επίπεδο μόνο σε πληθυσμό F, προσπαθήσαμε να αναπαραγάγει στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μετά τη διόρθωση Bonferroni σε πληθυσμό F με τα δεδομένα WGSS DC χωρίς διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις.

Η

σε αντίθεση με τη συνολική εκτίμηση (Σχήμα 2), όταν θεωρούνται οι σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της σχετικής αφθονίας των γονιδίων KEGG (p & lt? 0,05 /8028), ενότητες (p & lt? 0.05 /485), και μονοπάτια (p & lt ? 0.05 /318) εντός του πληθυσμού F, οι ενώσεις του καρκίνου είχαν αναπαραχθεί (p & lt? 0,05) στο WGSS DC για τέσσερα από τα 10 γονίδια: aminomethyltransferase (K00605), tryptophanase (K01667), πεπτίδιο μεθειονίνη σουλφοξείδιο αναγωγάσης msrA /msrB (K12267) , και υποθετική πρωτεΐνη μεμβράνης (K01421) (Πίνακας 4). Ομοίως, η WGSS DC αναπαράγεται ενώσεις καρκίνου για τρεις από εννέα ενότητες: λευκίνη υποβάθμιση, λευκίνη = & gt? ακετοξικό + ακετυλο-CoA (M00036), κιτρικό κύκλο, δεύτερη οξείδωση του άνθρακα, 2-οξογλουταρικό = & gt? οξαλοξικό (M00011), και μεθειονίνη βιοσύνθεση, apartate = & gt? ομοσερίνης = & gt? μεθειονίνη (M00017) (Πίνακας 5). Από τις 17 στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μονοπάτι του πληθυσμού F, η WGSS DC αναπαράγεται ενώσεις με επτά οδούς: κιτρικό κύκλου (ko00020), ο μεταβολισμός λιποϊκό οξύ (ko00785), βαλίνη, λευκίνη, και η υποβάθμιση ισολευκίνη (ko00280), αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση (ko05014 ), βιοσύνθεση λυσίνης (ko00300), την υποβάθμιση γερανιόλη (ko00281), και το μεταβολισμό του αζώτου (ko00910) (Πίνακας 6). Δεν υπάρχουν πρόσθετες σημαντικές συσχετίσεις με CRC βρέθηκαν στο WGSS DC

Η

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη είχε δύο βασικούς στόχους:. 1) για να συγκρίνουν τα προηγουμένως παρατηρηθεί 16S rRNA ενώσεις γονίδιο με δεδομένα από ολόκληρο το γονιδίωμα καραμπίνα μεταγονιδιωματική αλληλουχίας? και 2) για να διερευνήσει πιθανές συσχετίσεις γονίδιο-επίπεδο μικροβιακής με CRC σε διαφορετικούς πληθυσμούς. Για τον πρώτο στόχο, η προσέγγιση της μεταγονιδιωματικής αναπαράγονται μερικά από τα παλαιότερα παρατηρηθεί ενώσεων στην ανάλυση του γονιδίου 16S rRNA, κυρίως μεγαλύτερη πιθανότητα ανίχνευσης taxa στο φύλο Fusobacteria και

Fusobacterium

γένους μεταξύ CRC περιπτώσεις. Μια μεγάλη διαφορά μεταξύ των δύο μελετών ήταν η ευαισθησία για ανίχνευση taxa. Για παράδειγμα, το φύλα Fusobacteria ανιχνεύθηκε στο 36.2% των περιπτώσεων και 16,0% των ελέγχων στη μελέτη γονίδιο 16S rRNA, αλλά χρησιμοποιώντας μεταγονιδιωματικής καραμπίνα ολόκληρου του γονιδιώματος, Fusobacteria ανιχνεύθηκε στο 76.9% των περιπτώσεων και 48,1% των ελέγχων . Δεν είναι σαφές τι μπορεί να προκαλέσει τις διαφορές μεταξύ των 16S rRNA και WGSS αποτελέσματα, αλλά αυτό μπορεί να οφείλεται στο γονίδιο μεταβλητής περιοχής 16S rRNA αλληλουχία, το βάθος της αλληλουχίας, της βιοπληροφορικής εκχώρηση ταξινομίας, ή τεχνικές διαφορές. Αυτές οι διακυμάνσεις στην ανίχνευση της παρουσίας και τη σχετική αφθονία των taxa καταδεικνύουν μια σημαντική διαφορά κατά τη σύγκριση 16S rRNA αλληλουχίας σε ολόκληρο το γονιδίωμα κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική μελέτες και θα πρέπει να μελετηθεί με μεγαλύτερη λεπτομέρεια στο μέλλον.

Για δεύτερο στόχο μας, ο WGSS DC έκανε αναπαράγουν ορισμένες από τις ειδικές, στατιστικά σημαντική γονίδια, modules, και τα μονοπάτια ανιχνεύεται σε πληθυσμό F με την κατάσταση περίπτωση CRC [8]. Δύο σχετικές ενότητες και οδοί αναγνωρίσθηκαν στην ανεξάρτητη μοντέλα: M00011 (κύκλος κιτρικού, δεύτερη οξείδωση του άνθρακα, 2-οξογλουταρικό = & gt? Οξαλοξικό) και ko00020 (κιτρικό κύκλο /κύκλο TCA)? και M00036 (υποβάθμιση λευκίνη, λευκίνη = & gt? ακετοξικό + ακετυλο-CoA) και ko00280 (βαλίνη, λευκίνη, ισολευκίνη και την υποβάθμιση). Είναι πιθανό ότι αυτά, και οι άλλες λειτουργικές ικανότητες που σχετίζονται με την CRC, αλλά απαιτούνται περαιτέρω μελέτες. Shannon πολυμορφία, τον πλούτο και την ομαλότητα με βάση μεταγονιδιωματικής καραμπίνα σε ολόκληρο το γονιδίωμα δεν συνδέθηκαν με την ιδιότητα περίπτωση CRC στην WGSS DC, αλλά οι εκτιμήσεις αυτές ήταν παρόμοια με εκείνα MetaHIT και πληθυσμό F.

επαναληψιμότητα μας στατιστικά σημαντική ενώσεις από μια προηγούμενη μελέτη [8] παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη μελλοντική συγκέντρωση δεδομένων με δεδομένες τις μεγάλες διαφορές μεταξύ αυτών των δύο συνόλων δεδομένων. δείγματα μας συλλέχθηκαν στη δεκαετία του 1980 στις Ηνωμένες Πολιτείες, ενώ τα δείγματα για τον πληθυσμό F συλλέχθηκαν στη δεκαετία του 2000 στη Γαλλία. Υπάρχουν κάποιες ενδείξεις ότι η αποθήκευση των δειγμάτων κοπράνων σε χαμηλές θερμοκρασίες διατηρεί τη μικροβιακή κοινότητα δομή [20, 21], ωστόσο, στη γνώση μας, αυτό δεν έχει δοκιμαστεί για τα δείγματα αποθηκεύονται για σχεδόν 30 χρόνια. Και δεδομένης της προηγούμενης εργασίας που να δείχνει ότι η μικροβιακή ενώσεις με διαβήτη τύπου 2 μπορεί να διαφέρει από τον πληθυσμό [22, 23], αν και οι διαφορές αυτές μπορεί να οδηγείται από τη μετφορμίνη χρήση [24], είναι ενθαρρυντικό το γεγονός ότι ορισμένες από τις ενώσεις ήταν ισχυρή μεταξύ των πληθυσμών στην Ηνωμένες Πολιτείες και τη Γαλλία από διαφορετικά έτη. Επιπλέον, οι δείγματα κοπράνων στη μελέτη μας συλλέχθηκαν πριν από την εισαγωγή σε νοσοκομείο και τη θεραπεία από όλες τις κινήσεις του εντέρου κατά τη διάρκεια των δύο ημέρες και έπειτα λυοφιλοποιείται. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τις μεθόδους για τον πληθυσμό F, όπου τα δείγματα συλλέχθηκαν 2 εβδομάδες έως 3 ημέρες πριν την κολονοσκόπηση, αλλά πάντα πριν από εντέρου καθαρισμού, και ήταν ένα κλάσμα από μία κίνηση του εντέρου η οποία είχε παγώσει μέσα σε τέσσερις ώρες. Πάγωμα ξήρανση των δειγμάτων κοπράνων έχει βρεθεί σε δυνητικά επηρεάζουν τις σχετικές ποσότητες των διαφόρων taxa για βρέφη δείγματα κοπράνων [25], έτσι ώστε να είναι καθησυχαστικό να αναπαράγουν τα ευρήματα μεταξύ των διαφόρων μεθόδων αποθήκευσης. Επιπλέον, τα δείγματα WGSS φάνηκε να έχει παρόμοια μέτρα ποικιλομορφία σε σύγκριση με ένα άλλο όπλο μεταγονιδιωματική μελέτη, MetaHIT, η οποία περιελάμβανε επίσης ένα διαφορετικό πληθυσμό και συλλογές. Όπως έχει παρατηρηθεί σε μελέτες συσχέτισης ανθρώπινο γονιδίωμα-ευρεία, τα μεγάλα μεγέθη δείγματος που απαιτούνται για την ανίχνευση ενώσεων που επιβιώνουν διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές. Με αυτές τις διαφορές στη χρονική περίοδο της συλλογής, τον πληθυσμό, και τη συλλογή του δείγματος, οι ομοιότητες με τις ενώσεις μεταξύ της μικροβιακής ταξινομική και γονιδιακών επίπεδο των δεδομένων με την ιδιότητα περίπτωση CRC παρέχει κάποια υποστήριξη για τη συγκέντρωση των στοιχείων σε ετερογενείς μελέτες. Πρόσθετες εργασίες έχουν διεξαχθεί για να αξιολογήσουν τις ιδανικές μεθόδους συλλογής για τις μελλοντικές συλλογές κοπράνων [26-30] και το αποτέλεσμα των διαδικασιών χειρισμού εργαστηριακών και βιοπληροφορικής επεξεργασία των δεδομένων [31] που μπορεί να παρέχει πρόσθετες πληροφορίες για τους μεταγενέστερους συγκέντρωση δεδομένων ή μετα-ανάλυσης.

Άλλες προηγούμενες μελέτες έχουν διερευνήσει τις ενώσεις μεταξύ των κοπράνων microbiome και CRC [32]. Παρόμοια με τα ευρήματά μας, μια σειρά από μελέτες δεν εντόπισε μια γενική διαφορά μεταξύ των περιπτώσεων CRC και τους ελέγχους για τα μέτρα της κοινότητας ποικιλομορφία [4, 5, 9]. Ωστόσο, μια μελέτη παρατηρήθηκε ότι οι περιπτώσεις CRC είχε αυξηθεί γονιδίων και του γένους πλούτο σε σύγκριση με ελέγχους [3], ενώ μια άλλη μελέτη που εντοπίστηκαν μειωμένη γονιδιακή πλούτο και την ποικιλομορφία του γονιδίου άλφα σε περιπτώσεις CRC σε σύγκριση με τους μάρτυρες, αν και η συσχέτιση δεν ήταν στατιστικά σημαντική μετά την προσαρμογή για κοπράνων συλλογής δειγμάτων μετά την κολονοσκόπηση [6]. Σε συμφωνία με τα ευρήματά μας, οι περισσότερες προηγούμενες μελέτες διαπιστώθηκε ότι οι περιπτώσεις CRC ήταν πιο πιθανό να έχουν ανιχνεύσιμα ή υψηλότερα επίπεδα

Fusobacterium

σύγκριση με τους μάρτυρες [3, 5-7, 9], ενώ μόνο μερικές μελέτες ανιχνεύονται τα υψηλότερα επίπεδα ή ανίχνευση του

Porphyromonas

σε περιπτώσεις CRC σύγκριση με τους ελέγχους [3, 5, 7]. Σε προηγούμενη ολόκληρου γονιδιώματος κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική μελέτη, ο M00036 μονάδα και KEGG τις οδούς ko00280 και ko00910 βρέθηκαν να εμπλουτίζεται σημαντικά στις περιπτώσεις CRC σε σύγκριση με ελέγχους [6] παρόμοιο με αυτό που ανιχνεύτηκε σε αυτή τη μελέτη. Στο άλλο προηγούμενο σε ολόκληρο το γονιδίωμα κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική μελέτη, τα ευρήματά μας για KEGG τις οδούς ko00020, ko00280, ko00281, ko00300, ko00785 επιβεβαιώθηκαν, αλλά μια ένωση για KEGG οδό ko00910 ήταν προς την αντίθετη κατεύθυνση από ό, τι παρατηρήσαμε [3]. Εν ολίγοις, έχουμε επιβεβαιώσει κάποιες ενώσεις που παρατηρήθηκαν σε προηγούμενες έρευνες, αλλά όλες οι προηγούμενες μελέτες (16S και αλληλουχίας καραμπίνα ολόκληρου του γονιδιώματος) είχαν χαμηλή ισχύ. Επιπλέον, αυτές οι προηγούμενες μελέτες μπορεί να μην ήταν σε θέση να προσαρμόσει επαρκώς για διάφορους παράγοντες, που θα μπορούσε να εξηγήσει μερικές από τις μεταβλητότητα μεταξύ των μελετών. Λόγω των πολλαπλών συγκρίσεων σε αναλύσεις microbiome, συγκέντρωση δεδομένων θα είναι κρίσιμης σημασίας για την αντιμετώπιση της περιορισμένης ισχύος σε αυτές τις αναλύσεις.

Η παρούσα μελέτη δεν είναι χωρίς περιορισμούς. Πρώτα, όλα τα δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν σε εγκάρσια τομή, έτσι ώστε δεν είναι δυνατόν να προσδιοριστεί αν οι μικροβιακές αλλαγές που σημειώθηκαν πριν από την ανάπτυξη καρκίνου ή αν ήταν λόγω της ανάπτυξης του καρκίνου. Επιπλέον, η μελέτη αυτή είχε ένα σχετικά μικρό μέγεθος του δείγματος και, ως εκ τούτου, θα ήταν underpowered να ανιχνεύσει πολλά στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές. Τέλος, υγιείς μάρτυρες μας ήταν στο νοσοκομείο με βάση τους ελέγχους περιμένουν εκλεκτική χειρουργική επέμβαση και μπορεί να μην αντιπροσωπεύουν το γενικό πληθυσμό εκείνη τη στιγμή. Ωστόσο, η μελέτη μας έχει επίσης δυνατά. Ήμασταν σε θέση να αξιοποιήσουν τις υπάρχουσες δείγμα πόρους που συλλέχθηκαν πάνω από 30 χρόνια και να αναπαράγουν τις ενώσεις με CRC από μια τρέχουσα μελέτη. κοπράνων δείγμα μας ήταν από δύο συλλογή ημέρα, η οποία μπορεί να είναι πιο αντιπροσωπευτικό του τυπικού microbiome έντερο. Έχουμε, επίσης, ήταν σε θέση να χρησιμοποιήσουν άλλες υπάρχουσες πηγές δεδομένων για σύγκριση.

Σε αυτή τη μελέτη, ήμασταν σε θέση να χρησιμοποιούν ολόκληρο το γονιδίωμα κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική αλληλουχίας να αναπαράγει μια σειρά από σημαντικά ευρήματα στον ίδιο πληθυσμό που αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας 16S αλληλουχίας γονιδίων rRNA [2]. Η παρούσα μελέτη αναπαράγονται επίσης ορισμένες σημαντικές συσχετίσεις γονιδίων-επίπεδο με CRC από ένα προηγούμενο σε ολόκληρο το γονιδίωμα κυνηγετικό όπλο μεταγονιδιωματική μελέτη των ασθενών στη Γαλλία [8]. Μελλοντικές μελέτες συγκέντρωση δεδομένων στο πέρασμα του χρόνου, του πληθυσμού, και η μέθοδος συλλογής δειγμάτων θα βοηθήσει να ξεπεραστούν μερικά από τα ζητήματα στατιστικής ισχύος που αντιμετωπίζουν επιδημιολογικές μελέτες του microbiome και θα είναι το κλειδί για τον εντοπισμό σημαντικών ενώσεων που μπορούν να συμμετέχουν στην ανίχνευση ή την πρόληψη CRC. Επιπλέον, δεδομένου ότι όλες οι τρέχουσες μελέτες είναι διατομής, είναι επιτακτική η ανάγκη προοπτικές μελέτες κοόρτης περιλαμβάνουν κοπράνων συλλογής δείγματος, προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της ανθρώπινης microbiome έντερο για τις ανεπιθύμητες εκβάσεις της υγείας, όπως CRC.

Υποστήριξη πληροφορίες

Πίνακας S1. Μέση σχετική αφθονία ή την ανίχνευση των ταξινομική εργασίες (π.χ., φύλο, τάξη, τάξη, οικογένεια, γένος, είδος, συγγραφή, Motu) και τις κατηγορίες γονίδιο (δηλαδή, γονίδιο, ενότητα, και οδός) για τον πληθυσμό WGSS DC και του πληθυσμού F.

Κάθε καρτέλα αντιπροσωπεύει ένα συγκεκριμένο ταξινομικό επίπεδο ή εκχώρηση γονίδιο. Η μέση σχετική αφθονία ή μέσο ανίχνευσης (παρουσία /απουσία) παρουσιάζεται για τις περιπτώσεις και τους ελέγχους, και παρέχεται η τιμή p από δοκιμασία Wald προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο και ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ)

doi:. 10.1371 /περιοδικό .pone.0155362.s001

(XLS)

Ευχαριστίες

το έργο υποστηρίχθηκε από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου. Ένα τμήμα της ανάλυσης δεδομένων διεξάγει με τη χρήση των υπολογιστικών πόρων από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας συμπλέγματος HPC Biowulf (https://hpc.nih.gov). GZ, SS, AYV, RH, και PB έλαβε χρηματοδότηση μέσω του έργου CancerBiome (Ευρωπαϊκό Συμβούλιο Έρευνας αναφοράς του έργου 268985).