Αφηρημένο

Ιστορικό

διϋδροαρτεμισινίνης (DHA), ένα ημι -συνθετικές παράγωγο της αρτεμισινίνης, έχει δείξει πρόσφατα αντικαρκινική δράση σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. συνδέτη Apo2 ή νέκρωσης όγκου συνδέτη που επάγει απόπτωση παράγοντα που σχετίζονται με (Apo2L /TRAIL) θεωρείται ως μια πολλά υποσχόμενη αντικαρκινικός παράγοντας, αλλά χημειοαντίσταση επηρεάζει την αποτελεσματικότητα του ως στρατηγική θεραπείας. Απόπτωση που προκαλείται από το συνδυασμό DHA και Apo2L /TRAIL δεν έχει τεκμηριωθεί καλά, και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται παραμένουν ασαφείς.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Εδώ, αναφέρουμε ότι το DHA ενισχύει την αποτελεσματικότητα της Apo2L /TRAIL για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. Βρήκαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία με τη χρήση DHA και Apo2L /TRAIL ενισχύεται σημαντικά απόπτωση σε BxPC-3 και PANC-1 κυττάρων σε σύγκριση με τη θεραπεία με μονοθεραπεία

in vitro

. Η επίδραση του DHA ήταν διαμεσολαβείται μέσω της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου, η επαγωγή του υποδοχέα θανάτου 5 (DR5) και η διαμόρφωση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση. Ωστόσο, η Ν-ακετυλο κυστεΐνη μείωσε σημαντικά την ενισχυμένη απόπτωση που παρατηρείται με το συνδυασμό του DHA και Apo2L /TRAIL. Επιπλέον, knockdown του DR5 από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA επίσης μείωσε σημαντικά την ποσότητα της απόπτωσης που επάγεται από το DHA και Apo2L /TRAIL.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το DHA ενισχύει Apo2L /ρυμουλκουμένων απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μέσω αντιδραστικού οξυγόνου είδη μεσολάβηση πάνω ρύθμιση του DR5

Παράθεση:. Kong R, Jia G, Cheng Ζχ, Wang YW, Mu Μ, Wang Sj, et al. (2012) διϋδροαρτεμισινίνη Βελτιώνει Apo2L /TRAIL-απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μέσω ROS-Mediated Up-κανονισμός του Θανάτου Receptor 5. PLoS ONE 7 (5): e37222. doi: 10.1371 /journal.pone.0037222

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Ιουλίου του 2011? Αποδεκτές: 15 Απρ 2012? Δημοσιεύθηκε: May 30, 2012 |

Copyright: © 2012 Κονγκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα της First Affiliated Νοσοκομείο Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστήμιο (2011BS007), το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών για μεταδιδακτορικούς επιστήμονες της Κίνας (20.110.491.109), και το Ίδρυμα Ερευνών της Εκπαίδευσης Γραφείο της επαρχίας Heilongjiang, Κίνα ( 12511246). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια από τις πιο θανατηφόρες κακοήθειες του πεπτικού συστήματος και έχει πολύ φτωχή πρόγνωση [1], [2]. Συμβατική χημειοθεραπεία έχει δείξει περιορισμένη όφελος επιβίωσης όταν συνδυάζεται με χειρουργική εκτομή [3]. Έτσι, μια αποτελεσματική στρατηγική θεραπεία για τον καρκίνο του παγκρέατος χρειάζεται επειγόντως.

αρτεμισινίνη (η δραστική ουσία του κινεζικού φαρμακευτικό φυτό, Artemisia annua [4], [5]) και τα παράγωγά του είναι εξαιρετικά αποτελεσματικά ανθελονοσιακά φάρμακα με λίγες ανεπιθύμητες παρενέργειες [6]. Διϋδροαρτεμισινίνη (DHA), ένα παράγωγο της αρτεμισινίνης, είναι μια πιο υδατοδιαλυτή και αποτελεσματική ανθελονοσιακά από αρτεμισινίνη [7]. Πρόσφατα, έχει καταδειχθεί ότι το DHA σκοτώνει αποτελεσματικά διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων [8] – [13]. Επιπλέον, έχουμε διαπιστώσει ότι το DHA μπορεί να αναστείλει σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος σε δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο αλλά είναι ουσιαστικά μη τοξικές για τα φυσιολογικά κύτταρα [9]. Σε προηγούμενες μελέτες, Agtmael [14] και O’Neill ΡΜ [5] κατέδειξε ότι αρτεμισινίνη περιέχει μια γέφυρα ενδοϋπεροξειδίου, η οποία είναι απαραίτητη για την αντίδραση με το σίδηρο για να σχηματίσει αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα προσλαμβάνουν αυξημένη ποσότητες σιδήρου να παράγει υψηλότερα επίπεδα της ενδοκυτταρικής ROS από βρίσκονται στα κανονικά κύτταρα [15]. Έτσι, είναι πιθανό ότι η δραστικότητα του DHA εναντίον καρκινικών κυττάρων σχετίζεται με την παραγωγή ROS [16], αλλά η πραγματική μηχανισμός δράσης DHA είναι ελάχιστα κατανοητή.

συνδέτη ή νέκρωσης όγκου απόπτωση παράγοντα που σχετίζονται Apo2 -inducing συνδέτη (Apo2L /TRAIL) είναι ένα μέλος της υπεροικογένειας TNF, το οποίο χρησιμεύει ως αποτελεσματικός αντικαρκινικός παράγοντας, λόγω των καρκινικών κυττάρων ειδικότητα του και ισχυρή αντικαρκινική δράση. Apo2L /TRAIL επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα μέσω αλληλεπιδράσεων με τον υποδοχέα θανάτου 4 (DR4) και DR5, τα οποία αποτελούν το σύνθετο σήμα που επάγει θάνατο (DISC) με σύνδεση με ΡΑϋϋ και κασπάσης-8 ή κασπάσης-10 [17] – [19] . Ο δίσκος στη συνέχεια με τη σειρά του ενεργοποιεί έναν καταρράκτη πρωτεάση, η οποία ενεργοποιεί κατάντη κασπάσες ενέργειας, συμπεριλαμβανομένης της κασπάσης-3. Επιπλέον, πολλές απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες καθοδικά των υποδοχέων θανάτου, όπως κασπάση-6, caspase-7 και κασπάσης-9, συμμετέχουν σε Apo2L /TRAIL-επαγώμενη απόπτωση [20]. Ένας αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι τερπενοειδή μπορεί πλειορύθμιση της έκφρασης του DR4 και /ή DR5 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [12], [20], [21]. Έτσι, παράγοντες που μπορούν να ρυθμίζουν τους υποδοχείς Apo2L /TRAIL και ρυθμίζουν προς τα κάτω αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών έχουν τη δυνατότητα να ενισχύσει τα αποπτωτικά αποτελέσματα του Apo2L /TRAIL. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η επίδραση του DHA στην Apo2L /TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το DHA μπορεί να ενισχύσει τις αποπτωτικά αποτελέσματα Apo2L /TRAIL μέσω προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης DR5 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

Αποτελέσματα

DHA και Apo2L /TRAIL συνεργιστικά αναστέλλουν την ανάπτυξη του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

για να προσδιοριστεί κατά πόσον το DHA και Apo2L πράξη /TRAIL συνεργικά για να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, μετρήσαμε τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε κυτταρικές σειρές PANC-1 BxPC-3 και σε απόκριση σε διαφορετικές θεραπευτικές αγωγές. Παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης όταν BxPC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με DHA (0-100 μmol /L) ή Apo2L /TRAIL (0-200 ng /ml) μόνο (Σχήμα 1Α αριστερά). Ωστόσο, η θεραπεία με υψηλότερες δόσεις DHA και Apo2L /TRAIL σε συνδυασμό (50 μmol /L και 100 ng /ml, αντίστοιχα, και 6 μmol /L και 200 ​​ng /ml, αντίστοιχα) είχαν ως αποτέλεσμα περισσότερο ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης από τη θεραπεία είτε με την ένωση μόνο του (Σχήμα 1Α αριστερά). Να καθορίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια τις επιδράσεις της θεραπείας συνδυασμού, τα δεδομένα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μέση ανάλυση αποτέλεσμα να προσδιορίσει το είδος των αλληλεπιδράσεων που συνέβη, δηλαδή ο ανταγωνισμός (CI & gt? 1), προσθετικότητα (CI = 1) ή συνέργεια (CI & lt? 1). Η συνεργιστική δράση (CI & lt? 1) παρατηρήθηκε στη συνδυαστική θεραπεία (Σχήμα 1Α δεξιά). Ομοίως, μια υποδηλώνουν συνεργική δράση των DHA και Apo2L /TRAIL στην κυτταρική ανάπτυξη παρατηρήθηκε σε PANC-1 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με DHA μόνο, Apo2L /TRAIL μόνο του ή μια συνδυασμός των δύο παραγόντων και επωάζονται στους 37 ° C για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ΜΤΤ. δείκτη συνδυασμού (CI) έναντι κλάσματος που επηρεάζεται (Fa) οικόπεδα λαμβάνονται από την ανάλυση διάμεσης τιμής-δράσης των Chou-Talalay. Μια CI & gt? 1 δείχνει ανταγωνισμό, = 1 υποδηλώνει προσθετικότητα, και & lt? 1 δείχνει συνέργεια. (Β) Η κλωνογονική δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DHA (50 μmol /L) μόνο, Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) μόνο ή ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων επί 24 ώρες και πλένονται με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για επιπλέον 7 ημέρες και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. (Γ) κλωνογονιδιακή επιβίωση παρουσιάζεται ως το ποσοστό των επιζώντων αποικιών που σχηματίστηκαν σε κύτταρα υπό θεραπεία με φάρμακο σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια κλωνογονική δοκιμασία για να προσδιοριστεί εάν DHA ενισχύει την επίδραση του Apo2L /TRAIL στο σχηματισμό μακροχρόνιας αποικίας. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DHA (50 μmol /L) και Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) είτε μόνο του ή σε συνδυασμό για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, επωάζονται σε φρέσκο ​​μέσο και, επτά ημέρες αργότερα, βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Η κλωνογονική δοκιμασία έδειξε ότι ο αριθμός των αποικιών που επιβιώνουν στην ομάδα που έλαβε τον συνδυασμό των DHA και Apo2L /TRAIL ήταν δραματικά χαμηλότερο από ό, τι στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με DHA ή Apo2L /TRAIL και μόνο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία με DHA και Apo2L /TRAIL μείωσε σημαντικά τον αριθμό των αναπαραγωγικών κυττάρων (Σχήμα 1Β και 1C).

DHA ενισχύει Apo2L /TRAIL-επαγώμενη απόπτωση εξαρτάται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου

για να καθοριστεί αν η ικανότητα του DHA για την ενίσχυση της κυτταροτοξικότητας του Apo2L /TRAIL επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση ROS-επαγόμενη απόπτωση, χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής και συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης με λέιζερ για τη μέτρηση του ποσοστού της απόπτωσης και ενδοκυτταρικών ROS σε BxPC-3 και PANC- 1 κύτταρα.

BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DHA (50 μmol /L) ή /και Apo2L /TRAIL (100 ng /ml). Μετά από 72 ώρες αγωγής, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής και θεωρείται από λέιζερ συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης για τη μέτρηση του ποσοστού της απόπτωσης. Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα από την κυτταρομετρία ροής πειράματα δείχνουν ότι τα ποσοστά της απόπτωσης του ελέγχου BxPC-3 κύτταρα και κύτταρα επεξεργασμένα με DHA, Apo2L /TRAIL ή το συνδυασμό των δύο ήταν 5,1%, 29,4%, 15,5% και 47,8%, αντίστοιχα (Σχήμα 2Α ). Όσον αφορά στα κύτταρα PANC-1, τα ποσοστά απόπτωσης ήταν 6,7%, 18,6%, 11,9% και 45,8%, αντίστοιχα. Έτσι, η θεραπεία με DHA ή Apo2L /TRAIL μόνον αύξησε σημαντικά την ταχύτητα της απόπτωσης των BxPC 3-κυττάρων σε σύγκριση με τους ελέγχους (τόσο

P

& lt? 0,05). Επιπλέον, η θεραπεία με το συνδυασμό του DHA και Apo2L /TRAIL οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση του ποσοστού της απόπτωσης σε σύγκριση με τη θεραπεία μόνο με DHA ή Apo2L /TRAIL (αμφότερα

P

& lt? 0,01). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα PANC-1. Η έκταση της απόπτωσης, όπως ανιχνεύεται από την επισήμανση αννεξίνης V, προσεγγίζει την μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά από θεραπεία με DHA, Apo2L /TRAIL ή ο συνδυασμός και των δύο, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι λογαριασμοί απόπτωση για το μεγαλύτερο μέρος της παρατηρούμενης κυτταροτοξικότητας. Ωστόσο, προκατεργασία με Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC, 10 mM) ήταν σε θέση να μειώσει σημαντικά την ποσότητα της απόπτωσης που προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία του DHA και Apo2L /TRAIL σε BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα (και τα δύο

P

& lt? 0,01). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ROS διαμεσολαβεί την ικανότητα του DHA για την ενίσχυση της Apo2L /TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Η χρήση της σάρωσης με λέιζερ συνεστιακή μικροσκοπία επιβεβαίωσε την αυξημένη απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως φαίνεται στα αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες (Σχήμα 2Β). BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με DHA και Apo2L /TRAIL που εμφανίζεται πιο πολυάριθμες πρώιμου και όψιμου σταδίου αποπτωτικά κύτταρα από τους ελέγχους, η οποία είχε πολύ λίγοι πρώιμου σταδίου αποπτωτικά κύτταρα.

(Α) Apoptosis παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DHA (50 μmol /L) και Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) όπως υποδεικνύεται. Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε η μέτρηση των ποσοστών απόπτωση (%). Μια σημαντική αύξηση του ποσοστού απόπτωσης συγκριτικά με τον έλεγχο συμβολίζεται με «*» (

P

& lt? 0,05), μία σημαντική αύξηση σε σύγκριση με DHA- ή Apo2L κύτταρα /TRAIL επεξεργασμένο συμβολίζεται με «†» (

P

& lt? 0,01), και μία σημαντική μείωση σε σύγκριση με DHA + κύτταρα Apo2L /TRAIL επεξεργασμένο συμβολίζεται με «‡» (

P

& lt? 0,01). Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα από cytometrically αναλύθηκαν BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα κατεργασμένα με τον έλεγχο, DHA, Apo2L /TRAIL, το DHA + Apo2L /TRAIL ή NAC (10 mM). (Β) σάρωση με λέιζερ συνεστιακή μικροσκοπία των κυττάρων. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες ελήφθησαν από τον έλεγχο BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1 και του BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα κατεργασμένα με DHA + Apo2L /TRAIL και DHA + Apo2L /TRAIL + NAC. (Γ) επίπεδα ενδοκυτταρικού ROS μετρηθεί in vitro. BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DHA (50 μmol /L), Apo2L /TRAIL (100 ng /ml), το DHA + Apo2L /TRAIL, ή προκατεργασμένο με NAC (10 mM) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DHA + Apo2L /TRAIL για 6 ώρες. Μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησίμευσαν ως μάρτυρας. Τα κύτταρα επωάστηκαν με DCFHDA και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής για τη μέτρηση των επιπέδων των ενδοκυτταρικών ROS, όπως αντιπροσωπεύεται από φθορισμό DCF. Μια σημαντική αύξηση σε φθορισμό DCF σύγκριση με τον έλεγχο συμβολίζεται με «*» (

P

& lt? 0,05), μία πολύ σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο συμβολίζεται με «**» (

P

& lt? 0,01), και μία σημαντική μείωση σε σύγκριση με τη θεραπεία DHA + Apo2L /TRAIL συμβολίζεται με «†» (

P

& lt? 0,05). (δ) Εκπρόσωπος φωτογραφίες εμφανίζονται για DCFHDA-χρωματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν με τη χρήση σάρωσης με λέιζερ ομοεστιακό μικροσκόπιο. Το πράσινο φθορισμό αντιπροσωπεύει ενδοκυτταρική ROS. (Ε) Η μέση ένταση φθορισμού μετρήθηκε για τη DCFHDA-χρωματισμένα κύτταρα, και οι αντίστοιχες 3-διαστάσεων οριζόντιο επίπεδο εικόνες παρήχθησαν με σάρωση με λέιζερ συνεστιακή μικροσκοπία. Μια σημαντική διαφορά από τον έλεγχο συμβολίζεται με «*» (

P

& lt? 0,01), και μια σημαντική διαφορά από τη θεραπεία /TRAIL DHA + Apo2L συμβολίζεται με «†» (

P

& lt?. 0.05)

η

BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα επωάστηκαν με DHA (50 μmol /L), Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) ή ο συνδυασμός και των δύο για 12 h, και DCF φθορισμός καταγράφηκε ως ένα μέτρο της ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ, τα επίπεδα της ενδοκυτταρικής ROS ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,01) υψηλότερες σε κύτταρα που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με DHA και το συνδυασμό του DHA και Apo2L /TRAIL σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Ωστόσο, το Apo2L θεραπεία /TRAIL μόνο είχε μικρή επίδραση επί των επιπέδων ενδοκυτταρικής ROS σε BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1. Για να επιβεβαιωθεί ότι η παραγωγή ROS είναι υπεύθυνη για την ενίσχυση της Apo2L /TRAIL απόπτωση, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 mM NAC, ένα πολύ γνωστό αναστολέα της παραγωγής ROS, για 6 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με το συνδυασμό DHA και Apo2L /TRAIL. Laser αποτελέσματα σάρωσης δείχνουν ότι η προθεραπεία με NAC σημαντικά (

P

& lt? 0,05) μείωσε το επίπεδο της ενδοκυτταρικής ROS σε όλους τους τύπους κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με DHA και Apo2L /TRAIL και μόνο. Ομοεστιακό μικροσκόπιο σε συνδυασμό με χρώση DCFHDA, όπου το πράσινο φθορισμό αντιπροσωπεύει την ενδοκυτταρική ROS (Εικόνα 2D), αποκάλυψε ότι η ενδοκυτταρική ROS ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,01) υψηλότερες σε DHA-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ωστόσο, η προκατεργασία με NAC σημαντικά (

P

& lt? 0,05). Μείωσε την μέση ένταση φθορισμού στα οποία ενέχουν το DHA και Apo2L /TRAIL κυττάρων-αγωγή (Σχήμα 2Ε)

DHA ρυθμίζει απόπτωση γονιδιακή έκφραση

Στη συνέχεια, αναλύσαμε την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση που διαμεσολαβείται από ROS μετά από κατεργασία με DHA. BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του DHA (0, 25, 50 και 100 μmοl /L) ή προκατεργάστηκαν με NAC (10 mM) ακολουθούμενη από την προσθήκη του DHA (100 μmol /L) για 72 ώρες , και τα επίπεδα έκφρασης του Bcl-2, Βαχ, επιζών, κασπάσης-3, κασπάσης-8 και κασπάσης-9 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Σε απάντηση προς DHA, τα επίπεδα έκφρασης του Βαχ, κασπάσης-3, κασπάσης-8 και κασπάσης-9 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα, ενώ η έκφραση Bcl-2 μειώθηκαν με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, και η έκφραση της survivin παρέμεινε αμετάβλητη στην BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η προθεραπεία με NAC (10 mM) μπλοκάρει την ικανότητα του DHA την πλειορύθμιση της έκφρασης της κασπάσης-8, Bax, κασπάσης-9 και κασπάσης-3. Διαπιστώθηκε επίσης ότι το DHA ενισχυθεί σημαντικά Apo2L /TRAIL-μεσολαβούμενη απόπτωση σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, και αυτό συσχετίζεται με αυξημένη ενεργοποίηση της κασπάσης-8, Bax, κασπάσης-9 και κασπάσης-3 (Σχήμα 3).

BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του DHA (0, 25, 50, 100 μmοl /L) και προκατεργάστηκαν με NAC ακολουθούμενη από DHA (100 μmol /L) για 72 ώρες. Ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι Bcl-2, Βαχ, επιζών, κασπάσης-3, κασπάσης-8, και της κασπάσης-9. DHA σημαντικά επάνω ρυθμισμένη την έκφραση Bax, κασπάσης-3, κασπάσης-8 και κασπάσης-9, και κάτω ρυθμισμένα την έκφραση της Bcl-2. Ωστόσο, DHA είχαν μικρή επίδραση στην έκφραση του survivin. DHA με NAC (10 mM) προεπεξεργασία δεν πλειορύθμιση της έκφρασης της κασπάσης-8, Bax, κασπάσης-9, και της κασπάσης-3. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

DHA επαγόμενη ανοδική ρύθμιση του DR5 εξαρτάται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου

επόμενο εξετάστηκε αν ROS συμμετείχε σε DHA επαγόμενη DR5 έκφραση. BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του DHA για 48 ώρες, εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και η έκφραση της πρωτείνης DR5 εξετάστηκε. Βρήκαμε ότι το DHA είχαν δοσοεξαρτώμενο επιδράσεις στην έκφραση του DR5 (Σχήμα 4Α). Έτσι, επιδιώξαμε να καθοριστεί αν η παραγωγή ROS συνδέεται άμεσα με την ικανότητα των DHA να επάγει την έκφραση του DR5. ανίχνευση FACS έδειξαν ότι η θεραπεία του BxPC-3 και PANC-1 με DHA αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, και το DHA-επαγόμενη αύξηση στα επίπεδα ROS ήταν σημαντικά δεσμεύεται δια προκατεργασίας με 10 mM NAC (Σχήμα 4Β). Είναι σημαντικό ότι, η προθεραπεία με NAC παρεμπόδισε σημαντικά το DHA που προκαλείται ανοδική ρύθμιση της έκφρασης DR5 (Σχήμα 4Α).

(Α) BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες δόσεις DHA για 48 ώρες . Ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για έκφραση DR5 χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. DHA είχαν δοσοεξαρτώμενο επιδράσεις στην έκφραση του DR5. Το DHA επαγόμενη αύξηση στα επίπεδα DR5 παρεμποδίστηκε σημαντικά με προκατεργασία με 10 mM NAC. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Μια σταδιακή αύξηση του φθορισμού παρατηρήθηκε σε κύτταρα υπό θεραπεία με 25, 50 και 100 μmol /L DHA, αντιστοίχως, υποδεικνύοντας μία δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην παραγωγή ROS σε απόκριση σε θεραπεία DHA στις δύο κυτταρικές σειρές. Η παραγωγή των ROS ανεστάλη έντονα με προκατεργασία των κυττάρων με NAC (10 mM). (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DHA (50 μmol /L) μόνο, Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) μόνο ή ένας συνδυασμός των δύο παραγόντων. Τα κύτταρα υπέστησαν επίσης αγωγή με NAC (10 mM) μόνη ή σε προεπεξεργασία με NAC και επωάστηκαν στους 37 ° C για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ΜΤΤ και ο δείκτης βιωσιμότητας (%) υπολογίστηκε. Σημαντικές διαφορές σημειώνονται με «*» (

P

& lt? 0,01).

Η

επόμενο εξέτασε κατά πόσον σάρωσης των ROS θα μπορούσε να εξασθενήσει την /τον κυτταρικό θάνατο TRAIL επαγόμενη Apo2L ενισχύεται από DHA . Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, DHA αξιοσημείωτα ενισχυμένη Apo2L /TRAIL-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο σε BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1. Ωστόσο, προκατεργασία με NAC μείωσε σημαντικά την ικανότητα του DHA να επάγει κυτταρικό θάνατο από 63% έως 14% σε BxPC-3 κύτταρα και από 31% σε 17% σε κύτταρα PANC-1. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η ROS μεσολάβηση πάνω ρύθμιση του DR5 είναι κρίσιμη για την παρατηρούμενη αύξηση της DHA Apo2L /TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης.

Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται διαμεσολαβείται από DHA ρυθμιζόμενων DR5 έκφραση

Διερευνήσαμε επίσης κατά πόσον DHA μεσολάβηση έκφραση του DR5 απαιτούνται για Apo2L /TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Για τον προσδιορισμό του ρόλου του DR5 σε Apo2L /TRAIL απόπτωση, χρησιμοποιήσαμε siRNAs προς τα κάτω-ρύθμιση της έκφρασης DR5. Είμαστε δίπλα εξέτασε κατά πόσον η καταστολή της DR5 από siRNA μπορεί να καταργεί τις ευαισθητοποίηση επίδραση του DHA στην Apo2L /TRAIL θάνατο των κυττάρων που προκαλείται. Η επιμόλυνση των κυττάρων με DR5 siRNA αύξησε την βιωσιμότητα του BxPC-3 κύτταρα κατά 47% (

P

& lt? 0,01) και η βιωσιμότητα των κυττάρων PANC-1 κατά 42% (τα δεδομένα δεν φαίνονται), σε σύγκριση με το συνδυασμό αγωγή μόνο του (Σχήμα 5)? κατεργασία με siRNA ελέγχου δεν είχε καμία επίδραση (Σχήμα 5). Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν, ως εκ τούτου, ότι η επίδραση του DHA στην Apo2L /TRAIL απόπτωση που επάγεται είχε καταργηθεί αποτελεσματικά στα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με DR5 siRNA, υποδηλώνοντας ότι DR5 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής του Apo2L /TRAIL-επαγώμενη απόπτωση.

BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με DR5 siRNA και ελέγχου siRNA, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μmol /L DHA για 24 ώρες, και ολόκληρα κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για την ανίχνευση της έκφρασης του DR5. Η επιμόλυνση των κυττάρων με siRNA που στοχεύει DR5 σιγήσει ειδικά την έκφραση του DR5. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια διαφάνεια θάλαμο και επιμολυσμένα με τα siRNA. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μmol /L DHA, 100 ng /mL Apo2L /TRAIL, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, και επωάζονται στους 37 ° C για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ΜΤΤ, και ο δείκτης βιωσιμότητας (%) υπολογίστηκε. Αποσιώπηση του DR5 με siRNA μείωσε την κυτταροτοξική δράση του συνδυασμού του ΟΗΑ και Apo2L /TRAIL αλλά όχι του DHA μόνο. Σημαντικές διαφορές σημειώνονται με «*» (

P

& lt? 0,01).

Η

DHA και Apo2L /TRAIL αναστέλλουν σημαντικά την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

in vivo

για να διερευνηθεί η επίδραση του DHA και /ή Apo2L /TRAIL στην κυτταρική ανάπτυξη

in vivo

, BxPC-3 κύτταρα υποδορίως ξενομόσχευμα σε γυμνούς ποντικούς. Ούτε το DHA ούτε οι ομάδες Apo2L /TRAIL κατέδειξαν μία σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05). Ωστόσο, τα ποντίκια που έλαβαν το συνδυασμό του DHA και Apo2L /TRAIL είχαν όγκους που όχι μόνο ήταν σημαντικά μικρότερη από τον έλεγχο (

P

& lt? 0,01), αλλά ήταν επίσης μικρότερες από εκείνες που έλαβαν θεραπεία με είτε μόνο του παράγοντα (

P

& lt? 0,05), επιδεικνύοντας υψηλότερη καταστολή στην ανάπτυξη του όγκου

in vivo

(Σχήμα 6Α και Β). Η ανάλυση στυπώματος Western των προϊόντων λύσης καρκινικού ιστού αποκάλυψε επίσης ότι τα επίπεδα έκφρασης του DR5, κασπάσης-3 και κασπάσης-8 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στην ομάδα που έλαβαν θεραπεία συνδυασμού και σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι οι ομάδες που έλαβαν θεραπεία με είτε DHA ή Apo2L /TRAIL μόνο του (Σχήμα 6C). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με το

in vitro

μελέτες μας, παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη ότι το DHA μπορεί να ενισχύσει την δραστικότητα κατά του όγκου του Apo2L /TRAIL

in vivo

.

(Α) BxPC- 3 όγκοι εγκατεστημένος υποδορίως σε ποντικούς. Όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου 120 mm

3 σε όγκο, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε έλεγχο, DHA, Apo2L /TRAIL, ή ομάδες DHA + Apo2L /TRAIL και κατεργάστηκε όπως περιγράφεται στο τμήμα των μεθόδων. Τα μεγέθη (διαστάσεις σε mm

3) των όγκων παρακολουθήθηκαν και καταγράφηκαν. Μια σημαντική διαφορά στον όγκο του όγκου από τον έλεγχο συμβολίζεται με «*» (

P

& lt? 0,05), και μία σημαντική μείωση σε σύγκριση με το DHA και /ή όγκους Apo2L TRAIL επεξεργασμένο συμβολίζεται με «**» (

P

& lt? 0,01). Τα (Β) αντιπροσωπευτικά ζώα και οι όγκοι παρουσιάζονται για κάθε ομάδα. (Γ) Οι όγκοι από ποντικούς ελέγχου και από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με DHA, Apo2L /TRAIL, και DHA + Apo2L /TRAIL ομογενοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος western για την ανίχνευση της έκφρασης της κασπάσης-3 και κασπάσης-8. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Δ) ανάλυση των PCNA δείκτη πολλαπλασιασμού από ανοσοϊστοχημεία και αποπτωτικά κατάσταση των κυττάρων όγκου με in situ δοκιμασία TUNEL. PCNA θετικό (Ε) και TUNEL-θετικά κύτταρα (F) μετρήθηκαν επίσης κάτω από μικροσκόπιο για τον υπολογισμό του δείκτη πολλαπλασιασμού και αποπτωτικό δείκτη, αντίστοιχα. «*»:

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο. «**»:

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με το μοναδικό παράγοντα

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων PCNA δείκτη και κυτταρική απόπτωση εξετάστηκαν περαιτέρω

in situ

στον όγκο. δείγματα από τις τέσσερις ομάδες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6D και Ε, DHA ή ομάδες Apo2L αγωγή /TRAIL είχαν μειωμένη έκφραση PCNA σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

P

& lt? 0,05). Ενώ τα ποντίκια που έλαβαν το συνδυασμό του DHA και Apo2L /TRAIL είχαν έκφραση του PCNA που δεν ήταν μόνο χαμηλότερη από την ελέγχου (

P

& lt? 0,01), αλλά ήταν επίσης χαμηλότερο από τον κάθε παράγοντα αντιμετωπίζεται μόνο (

P

& lt? 0,05). Mono-θεραπεία είτε με DHA ή Apo2L /TRAIL παράγεται σημαντικά υψηλότερο από ό, τι την απόπτωση ελέγχου (

P

& lt? 0,05), ενώ η συνδυασμένη θεραπεία που παράγεται ακόμη πιο απόπτωση όχι μόνο από τον έλεγχο (

P

& lt ? 0,01), αλλά και από τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με μοναδικό παράγοντα (

P

& lt?. 0.05, Σχήμα 6D και F)

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι το DHA, ένα ημισυνθετικό παράγωγο της αρτεμισινίνης, μπορεί να ενισχύσει την αποπτωτικό αποτέλεσμα Apo2L /TRAIL κατά καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. DHA δρα συνεργικά με Apo2L /TRAIL να αναστέλλουν πολλαπλασιασμό και διεγείρουν απόπτωση μέσω του ROS μεσολάβηση ανοδική ρύθμιση του DR5 σε αμφότερες BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι το DHA μπορεί να ευαισθητοποιήσει παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα να Apo2L θεραπεία /TRAIL

in vivo

.

Διαλυτό Apo2L /TRAIL, η οποία εμφανίζεται ως μια ελκυστική αντικαρκινικός παράγοντας, έχει αξιολογηθεί σε αρκετές κλινικές δοκιμές. Ωστόσο, πολλές εκθέσεις δείχνουν ότι η πλειοψηφία των παγκρεατικών κυτταρικές γραμμές καρκινώματος είναι ανθεκτικές σε Apo2L /TRAIL [22] – [25]. Καρκίνος κύτταρο ανθεκτικότητα σε Apo2L /TRAIL είναι ένα από τα μεγαλύτερα εμπόδια για την περαιτέρω αξιοποίηση αυτής της θεραπείας. Έτσι, παράγοντες που μπορούν είτε να ενισχύσουν το αποτέλεσμα των Apo2L /TRAIL ή ξεπεράσει την αντίσταση χρειάζονται επειγόντως [26]. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν ο συνδυασμός DHA με Apo2L /TRAIL μπορούσε να προωθήσει συνεργική δράση κατά των όγκων και να κατανοήσουν την ακριβή μηχανισμό με τον οποίο η θεραπεία συνδυασμού με χρήση αυτών των παραγόντων προκαλεί παγκρεατική θάνατο των καρκινικών κυττάρων

in vitro

και

in vivo

.

Παρά το γεγονός ότι πολλές νεοπλασίες εμφανίζουν κάποια αντίσταση στην Apo2L /TRAIL σε κλινικές δοκιμές, ένα αυξανόμενο σώμα των στοιχείων δείχνει ότι το Apo2L /TRAIL μπορεί να σκοτώσει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα χωρίς να βλάπτουν τα φυσιολογικά κύτταρα, τα οποία θα μπορούσε να ανακουφίσει πολλές παρενέργειες του συμβατική χημειοθεραπεία. Αξίζει να σημειωθεί ότι, πολλές εκθέσεις έχουν δείξει ότι ορισμένα φυτικά εκχυλίσματα και χημειοθεραπευτικών παραγόντων μπορεί να ευαισθητοποιήσει τα καρκινικά κύτταρα να Apo2L /κυτταρικό θάνατο TRAIL-επαγόμενης [17], [26] – [29], υποδεικνύοντας ότι η αντίσταση Apo2L /TRAIL μπορούν να ξεπεραστούν με τη χρήση του αποτελεσματική ευαισθητοποιητές. Πρόσφατα, DHA έχει αποδειχθεί ότι παράγουν ισχυρά αποτελέσματα κατά του όγκου είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες με ελάχιστη τοξικότητα του ξενιστή έναντι διαφόρων ειδών καρκινώματος

in vitro

και

in vivo

[8] – [ ,,,0],10], [30] – [32]. Εν τω μεταξύ, η επίδραση του DHA κατά του καρκίνου του παγκρέατος έχει επιβεβαιωθεί σε προηγούμενες μελέτες μας [9], [30]. Ωστόσο, είναι άγνωστο αν DHA και Apo2L /TRAIL δρουν συνεργιστικώς έναντι του καρκίνου του παγκρέατος. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι ο συνδυασμός του DHA και Apo2L /TRAIL είχαν ως αποτέλεσμα σημαντικά μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης του BxPC-3 και PANC-1 κύτταρα

in vitro

ό, τι όταν είτε παράγοντας χρησιμοποιείται μόνο του. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το DHA μπορεί να ενισχύσει συνεργιστικά Apo2L /TRAIL-μεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα και ευαισθητοποιούν τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές για Apo2L /TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης.

Πολλές αναφορές έχουν δείξει ότι η παραγωγή ROS εμπλέκεται σε Apo2L /TRAIL-μεσολαβούμενη απόπτωση [33], [34]. ROS είναι επίσης γενικά αποδεκτό ότι σχετίζονται με ογκογένεση και μετάσταση, αν και αυτή η συσχέτιση είναι συχνά πολύπλοκη και αντιφατική [35]. Στην πραγματικότητα, τα περισσότερα αντι-νεοπλασματικών παραγόντων έχουν καθιερωμένη μηχανισμούς δράσης που αφορούν την παραγωγή των ROS [36]. Στα καρκινικά κύτταρα, το φάρμακο που προκαλείται από οξειδωτικό στρες υπερθέτει τις εγγενείς οξειδωτικό στρες, με αποτέλεσμα ένα ισχυρό ROS διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξική απόκριση που σκοτώνει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα ή αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό τους [37]. Μια γέφυρα ενδοϋπεροξειδίου σε αρτεμισινίνη αντιδρά με ενδοκυτταρικό σίδηρο για να παράγουν ελεύθερες ρίζες, οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε μακρομοριακό βλάβη και κυτταρικό θάνατο [38], [39]. DHA, ένα παράγωγο της αρτεμισινίνης, έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί τον θάνατο του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν μέσω επαγωγής οξειδωτικό στρες που οδηγεί στην παραγωγή ROS [8]. Πρόσφατες εργασίες έχουν επίσης αποδείξει ότι καλλιεργημένα ανθρώπινα μεταστατικά κύτταρα μελανώματος είναι ευαίσθητα σε DHA επαγόμενη απόπτωση και εμφανίζουν ανοδική ρύθμιση του κυτταρικού οξειδωτικού στρες, φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερίκευσης και διάσπαση procaspase-3 [40]. Στη μελέτη μας, βρήκαμε ότι τα επίπεδα των ενδοκυτταρικών ROS αυξήθηκε σημαντικά με επεξεργασία DHA υπό την παρουσία και απουσία του Apo2L /TRAIL, ενώ η αγωγή με Apo2L /TRAIL μόνη είχε μικρή επίδραση επί των ενδοκυτταρικών ROS στα BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1. Βρήκαμε επίσης ότι η ικανότητα του DHA για την ενίσχυση της Apo2L /TRAIL-επαγώμενη απόπτωση μπορούν να εξασθενήσουν με προεπεξεργασία με NAC. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας παρέχουν ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο DHA μπορεί να δράσει συνεργιστικά με Apo2L /TRAIL να ασκήσει συνδυασμένη προ-αποπτωτικά αποτελέσματα τους στον καρκίνο του παγκρέατος, τουλάχιστον εν μέρει μέσω γενεά ROS. Σε καρκινικά κύτταρα κόλου, απόπτωση που επάγεται από Apo2L /TRAIL μόνος ρυθμίζεται επίσης από την παραγωγή ROS [41]

Δύο κύριες οδοί γνωστό να κινήσει κυτταρική απόπτωση:. Το θάνατο του υποδοχέα που επάγεται, εξωγενής οδός και η ενδογενή, μιτοχονδριακό μονοπάτι [42], [43]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι το DHA θα μπορούσε να προκαλέσει την μιτοχονδριακή μονοπάτι για να επάγει απόπτωση με τη ρύθμιση της έκφρασης Bcl-2 και Bax, που οδηγεί στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια και ενεργοποιεί το κατάντη εκκινητής κασπάσης-9, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του τελεστή κασπάσες και η επαγωγή της απόπτωσης [44]. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν απεικονισθεί ότι η αντίσταση Apo2L /TRAIL σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου περιλαμβάνει την έκφραση του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη c-FLIP και κάτω ρύθμιση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη κασπάση-8 [20], [27], [45 ]. Ορισμένοι χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων zerumbone [20] και γκαρσινόλης [27], μπορεί σημαντικά ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση του c-FLIP ή /και ρυθμίζουν την έκφραση της κασπάσης-8 μέσω της ROS να αυξηθεί η ευαισθησία των κυττάρων σε Apo2L /TRAIL . Αναγνωρίζεται ότι κασπάσης-8 είναι μία άμεση προς τα κάτω στόχος του DR5, και προ-κασπάσης-8 στρατολογεί DISC για την ενεργοποίηση της κασπάσης-8, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του κατάντη κασπάσες ενέργειας [46]. Στη μελέτη μας, DHA up-ρυθμίζει κασπάσης-8 έκφραση σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο να ξεκινήσει την κυτταρική απόπτωση. Δείχνουμε επίσης ότι το DHA ρυθμίζει την έκφραση του DR5 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και ότι η αυξημένη έκφραση του DR5 συνδέεται με τις παρατηρούμενες αλλαγές στο οξειδωτικό στρες. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ROS είναι ένα από τα ανάντη ρυθμιστές υπεύθυνος για την DHA-μεσολαβούμενη επαγωγή του DR5 και ότι το DHA μπορεί να ενισχύσει Apo2L /TRAIL-επαγόμενης κυτταρικής απόπτωσης μέσω των οδών εξωγενή θανάτου-υποδοχέα. Αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με εκείνα που αναφέρθηκαν σε προηγούμενη μελέτη [20]. Η αλληλοπαρεμβολές μεταξύ αυτών των δύο μονοπατιών είναι πιθανό να οφείλεται στην κασπάση-8 μεσολαβούμενη διάσπαση της προσφοράς και την επακόλουθη μετατόπιση του στα μιτοχόνδρια όπου εκκινεί την εγγενή απόπτωση μονοπάτι [28]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι, εκτός από τις μιτοχονδριακές μεσολάβηση αποπτωτικά μονοπάτια, DHA-εξαρτώμενη παραγωγή ROS παίζει επίσης καθοριστικό ρόλο στην συνεργιστική ενίσχυση της Apo2L /TRAIL-επαγόμενης απόπτωσης μέσω των οδών εξωγενή θανάτου υποδοχέα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα .

Εδώ, έχουμε χρησιμοποιήσει με επιτυχία την οδοκαθαριστής ROS, NAC, να αναστέλλουν το οξειδωτικό στρες.