Αφηρημένο

Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι embelin, ένα ενεργό συστατικό του

Embelia Ribes

, προκαλεί απόπτωση στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, αλλά οι λεπτομερείς μηχανισμοί είναι ακόμα ασαφής. Εδώ, ερευνήσαμε την επίδραση του embelin επί της ανάπτυξης ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Embelin έντονα ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων, ιδίως σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, συμπεριλαμβανομένης PC3, DU145, LNCaP-Ln3 και φυσιολογικό επιθηλιακό κύτταρο προστάτη, RWPE-1 σε σύγκριση με τον καρκίνο του μαστού (MDA-MB-231, MCF-7, και Τ47ϋ), ηπάτωμα (HepG2, Hep3B και ΗυΗ-7), ή χοριοκαρκίνωμα (JEG-3). Παρατηρήσαμε ότι επάγεται embelin απόπτωση κυττάρων PC3 σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο συσχετίζεται με μειωμένη έκφραση του Bcl-2, Bcl-xL, και Mcl-1, αυξημένη μετατόπιση του Βαχ σε μιτοχόνδρια, και η μείωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Επιπλέον, embelin επαγόμενης τάσης που εξαρτώνται από ανιόντων κανάλι (VDAC) 1 έκφρασης και ολιγομερισμό, η οποία μπορεί να προάγει το κυτόχρωμα

γ

και την απελευθέρωση του ΟΕΕ. Επειδή embelin ήταν σε θέση να αναστείλουν την ενεργοποίηση Akt και έκφραση της κυκλοοξυγενάσης-2, προσδιορίστηκαν οι συνέπειες για σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης. Embelin ενεργοποιείται κινάση συνθάση γλυκογόνου (GSK) -3β εμποδίζοντας φωσφορυλίωση και κατέστειλαν έκφραση β-κατενίνης. Εξασθένηση της β-κατενίνης με μεσολάβηση δραστικότητας TCF μεταγραφική και τη μεταγραφή γονιδίων, όπως η κυκλίνη D1, c-myc, και μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) -7, δείχθηκε σε κύτταρα embelin φάρμακο. Οι αλλαγές στα επίπεδα β-κατενίνης σε απόκριση embelin είχαν μπλοκαριστεί από χλωριούχο λίθιο, έναν αναστολέα GSK-3, που δείχνει ότι μπορεί να μειώσει embelin έκφραση β-κατενίνης μέσω ενεργοποίησης GSK-3β. Περαιτέρω, η έκθεση των κυττάρων PC3 να embelin είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Συμπερασματικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αναστολή της Akt σηματοδότηση και η ενεργοποίηση της GSK-3β συμβάλλει μερικώς στην προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα embelin στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Παράθεση:. Πάρκο Ν, Μπεκ ΕΣ, Chun YJ (2015 ) Embelin απόπτωση των ανθρώπινων κυττάρων του καρκίνου του προστάτη επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση Διαφοροποίηση των Akt και β-κατενίνης σηματοδοτήσεως. PLoS ONE 10 (8): e0134760. doi: 10.1371 /journal.pone.0134760

Επιμέλεια: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 4 Μάρ 2015? Αποδεκτές: 13 Ιουλίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 7, Αυγούστου, 2015

Copyright: © 2015 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF) επιχορήγηση που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MSIP) (Αρ 2015R1A5A1008958). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Embelin (2, 5-διυδροξυ-3-ενδεκυλ-1, 4- βενζοκινόνη), που απομονώθηκε ως το δραστικό συστατικό του καρπού του

Embelia Ribes

Burm (Myrsinaceae), έχει χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του πυρετού και αποδειχθεί ότι έχουν αντι-φλεγμονώδη, αντι-καρκινογόνες [1], αντι-οξειδωτικό [2], αντι-σπασμωδική [3], και αντι-βακτηριακή δραστηριότητα [4,5]. Embelin είναι γνωστό ότι είναι ένας ισχυρός αναστολέας μικρό μόριο του αναστολέα Χ-συνδεδεμένη πρωτεΐνη απόπτωσης (ΧΙΑΡ), που καταργεί την σύνδεση του ΧΙΑΡ να procaspase-9 [1]. Embelin δρα ως ισχυρός αναστολέας του ΝΡ

κ

B [6,7] και δείχνει κυτταροτοξικά αποτελέσματα σε μια ποικιλία καρκινικών κυτταρικών σειρών [8]. Αν και embelin είναι γνωστό ότι καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διεγείρουν απόπτωση σε πολλά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, οι μοριακοί μηχανισμοί αυτών των επιδράσεων παραμένουν ασαφείς. Η απόπτωση παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής ακεραιότητας και είναι αυστηρά ρυθμιζόμενη. Οι δύο κύριες διακριτές αποπτωτικά μονοπάτια έχουν αναπτυχθεί, οι ενδογενείς και εξωγενείς οδούς. Τα σήματα έναρξης για την ενδογενή οδό που δημιουργείται από αναπτυξιακές νύξεις ή κυτταρική βλάβη που προκαλεί την απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και την απελευθέρωση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών [9, 10]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί με τους οποίους apoptogenic εμπνευστές διασχίζουν την εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη (OMM) δεν έχουν ακόμη επιλυθεί πλήρως. Τάση-εξαρτώμενο κανάλι ανιόντων (VDAC) 1 που βρίσκεται στην OMM έχει προταθεί ως ένα σημαντικό συστατικό της μετάβασης διαπερατότητας πόρου (PTP), η οποία οδηγεί στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και την απόπτωση παράγοντα επαγωγής (ΟΕΕ) [11,12]. Ο ολιγομερισμός του VDAC1 να σχηματίσει μια μεγάλη δομή πόρου σε απόκριση σε διάφορες προ-αποπτωτικών σημάτων μπορεί να απαιτείται για την απελευθέρωση κυτοχρώματος c [13]. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση του VDAC1 με Βαχ, ένα προ-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένειας πρωτεϊνών μπορούν να σχηματίσουν μεγαλύτερα περίπλοκη από μόνη της ή VDAC1 Bax μόνο και προωθεί το άνοιγμα της ΡΤΡ [14]. Ωστόσο, αντι-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών όπως Bcl-2, Bcl-xL, ή Mcl-1 εμποδίζει το άνοιγμα PTP και σχετίζονται με την αντίσταση θεραπεία και την εξέλιξη σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [15]. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, Mcl-1 είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής της απόπτωσης και της διαφοροποίησης και υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [16]. Chen et al. ανέφεραν μία νέα οδό, η οποία αποτελείται από Akt, κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2), και Mcl-1, για επίκτητη αντοχή σε απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [17]. Akt ρυθμίζει κυψελοειδή δίκτυα σηματοδότησης που εμπλέκονται στις διαδικασίες που συνδέονται με την κυτταρικό πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, και μεταβολισμό και ενεργοποιεί ένα COX-2 με τη μεσολάβηση αντι-αποπτωτικό μονοπάτι που εμπλέκει Mcl-1 [18,19]. Η φωσφορυλίωση από Akt στο υπόλειμμα της GSK-3β Ser 9 οδηγεί σε απενεργοποίηση της [20, 21], με αποτέλεσμα την σταθεροποίηση του β-κατενίνης, η οποία συσχετίζεται με αυξημένη μεταγραφή των γονιδίων στόχων κατάντη [22]. Επιπλέον, η αναστολή της φωσφορυλίωσης GSK-3β καταστέλλει καθαρά την έκφραση β-κατενίνης και αντοχή σε απόπτωση. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι embelin επάγει μιτοχονδριακής εξαρτώμενη απόπτωση και καταστολή της έκφρασης β-κατενίνης μέσω αναστολής Akt και ενεργοποίηση GSK-3β σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

ανθρώπινα προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές PC3, DU145, και LNCaP-Ln3, ανθρώπινου προστάτη επιθηλιακή κυτταρική γραμμή RWPE-1, ανθρώπινου ήπατος κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος HepG2, Hep3B και ΗυΗ- 7 ή ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών μαστού γραμμή MDA- ΜΒ-231, MCF-7, και T47D κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) αδρανοποιημένο με θερμότητα ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Η χοριοκαρκινώματος ανθρώπινη κυτταρική σειρά JEG-3 αγοράστηκε από την Κορέας γραμμή Τράπεζας Κυττάρων και καλλιεργήθηκε σε μέσο DMEM με 10% (ν /ν) θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Αντιδραστήρια

Embelin αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Ένα 100 mM διάλυμα embelin παρασκευάστηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο, αποθηκεύεται ως μικρές ποσότητες στους -20 ° C και στη συνέχεια αραιώθηκε όπως απαιτείται σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Ένα διάλυμα 8Μ χλωριούχου λιθίου ελήφθη από την Sigma-Aldrich και αραιώνεται, όπως απαιτείται σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. FBS και RPMI 1640 αγοράστηκαν από την HyClone (Logan, UT). Το σύστημα διαμόλυνσης νέον, JC-1 κιτ προσδιορισμού και COX-4 αντίσωμα ήταν από την Life Technologies (Carlsbad, CA). Το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης δικιγχονινικού οξέος (BCA) και κιτ ECL ήταν από Thermo Scientific (Rockford, IL). Αντισώματα έναντι φωσφο-Ακί (Ser 473), GSK-3β, φωσφο-GSK-3β, ή Bcl-2 ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι Σύνολο-Ακί, VDAC1, Bcl-xL, Bax, β-κατενίνης, η κυκλίνη D1, GAPDH ή κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-Texas Red και Ultra Cruz μέσο στερέωσης ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2), Mcl-1, κυτόχρωμα

γ

, ΟΕΕ, β-κατενίνης, c-myc ή ιστόνης Η1 αντισώματα ήταν από την Millipore Οο (Bedford, ΜΑ). Όλα τα άλλα χημικά ήταν της υψηλότερης καθαρότητας ή βαθμό μοριακής βιολογίας και ελήφθησαν από εμπορικές πηγές.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Κύτταρα (1 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) προστέθηκαν σε ένα 96-φρεατίων με στρογγυλό πυθμένα μικροπλάκα και επωάστηκαν για την καθορισμένη ώρα στους 37 ° C. Μετά τη θεραπεία για την καθορισμένη ώρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μι EZ-CyTox (DAEIL Lab Service, Κορέα) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 2 ώρες επώασης στους 37 ° C, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας GENIOS Pro ανάγνωσης μικροπλάκας (TECAN, Ελβετία).

αννεξίνης V /PI δοκιμασία απόπτωσης

Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν σε 1200 rpm και πλύθηκαν μία φορά με 1 κ.εκ. αλατόνερου ρυθμισμένου με παγωμένο φωσφορικό άλας (PBS). Το προκύπτον σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης 1 ×. Το προκύπτον μίγμα διατηρήθηκε επί πάγου για 60 λεπτά, μετά την οποία τα κύτταρα διαπερατά με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 50 μg /mL αννεξίνη V-FITC και /mL ιωδιούχου προπιδίου 50 μg σε 1 ×. Τα δείγματα διατηρήθηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά και αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας ένα BD FACScan κυτταρόμετρο ροής (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Μέτρηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δ

ψ

m)

κύτταρα αναπτύσσονται σε πολυ-ά-λυσίνη καλυπτρίδες υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με embelin σε μέσο ανάπτυξης, πλύθηκε ταχέως με PBS, και στη συνέχεια επισημάνθηκαν με 2 μΜ JC-1 για 30 λεπτά στους 37 ° C σε 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Μετά την έκπλυση αρκετές φορές με PBS, οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινα πλακίδια χρησιμοποιώντας Ultra μέσο στερέωσης Cruz. σήματα φθορισμού αναλύθηκαν με LSM 510 META Συνεστιακό Laser Scanning μικροσκόπιο (Zeiss, Jena, Germany).

παροδική επιμόλυνση

Για παροδική επιμόλυνση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ρΕΟΕ myr-Ακί ή ανθρώπινο COX -2 υποκινητή κατασκευάσματα λουσιφεράση και φορείς pRL-Renilla (Promega) χρησιμοποιώντας το σύστημα διαμόλυνσης νέον όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, περίπου 5 × 10

5 κύτταρα ανά πλάκα 60-mm σπάρθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και μετά επαναιωρήθηκαν σε Opti-ΜΕΜ μέσου χωρίς ορό. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε με 2 μg πλασμιδικού DNA για 5 ώρες στους 37 ° C. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI που περιέχει 10% FBS για 48 ώρες.

Υποκυτταρική κλασματοποίηση

Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με παγωμένο PBS. Υποκυτταρική κλασματοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης μιτοχόνδρια για καλλιεργημένα κύτταρα και ΝΕ-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Extraction Kit από την Thermo Scientific. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντισωμάτων κατά των ακόλουθων πρωτεΐνες δείκτες ελέγχου:. GAPDH για την κυτοσολικό κλάσμα, η COX-4 για την μιτοχονδριακό κλάσμα ή ιστόνης-H1for το πυρηνικό κλάσμα

Western ανάλυση κηλίδος

τα κύτταρα διαλυτοποιήθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (ρΗ 7.4) που περιέχει 25 mM HEPES, 1% Triton Χ-100, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, και 1 μg /mL λευπεπτίνη. Οι εκχυλισμένες πρωτεΐνες (30 μg) διαχωρίστηκαν με δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 10%, και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% (w /v) σκόνη άπαχου αποξηραμένου γάλακτος σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα για 2 ώρες στους 4 ° C και στη συνέχεια επωάστηκαν για μια νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα σε αραίωση 1: 1000 σε 5% (w /v) Τρις- ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.1% Tween-20. Μετά την επώαση με δευτερογενές αντίσωμα για 2 ώρες, οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με ECL και η ένταση ζώνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα πυκνόμετρο ChemiDoc XRS και ποσοτικά με Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad, Richmond, CA). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης εκτιμήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου BCA σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή, χρησιμοποιώντας αλβουμίνη βόειου ορού σαν πρότυπο.

ανοσοφθορισμού

κύτταρα αναπτύσσονται σε πολυ d-λυσίνη καλυπτρίδες υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με embelin σε μέσο αύξησης, πλύθηκαν ταχέως με PBS, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μέσο ανάπτυξης συμπεριλαμβανομένων 100 ηΜ Mitotracker ανιχνευτές (Invitrogen). Μετά από 1 ώρα, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 3,7% (β /ο) παραφορμαλδεΰδη σε PBS, ρΗ 7,4, για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα αποκλείστηκαν για 15 λεπτά σε PBS που περιέχει 5% ορό κατσίκας και 0.2% Triton Χ-100, στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (1: 1000) για 1 ώρα, πλύθηκαν εκτενώς, και χρωματίστηκαν για 1 ώρα με κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-Texas Red (1: 500). Μετά από περαιτέρω πλύσεις, οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε γυάλινα πλακίδια χρησιμοποιώντας Ultra μέσο στερέωσης Cruz. σήματα φθορισμού αναλύθηκαν με τη χρήση ενός LSM 510 META Συνεστιακό Μικροσκόπιο Σάρωσης Λέιζερ (Carl Zeiss, Germany).

Εγκάρσια σύνδεση VDAC

Μετά από θεραπεία με embelin, σουλφο-EGS σε DMSO προστέθηκε

σε μία τελική συγκέντρωση 250 μΜ. Μετά από 25 λεπτών επώαση στους 30 ° C, το σταυρωτής σύνδεσης σβήστηκε με την προσθήκη 1Μ Tris-HCl (ρΗ 7.5) σε τελική συγκέντρωση 20 mM. Τα δείγματα στη συνέχεια διαλυτοποιήθηκαν σε 1% ΝΡ-40 και επεξεργασία με υπερήχους για 7 s πέντε φορές με ένα παλμό 30% χρησιμοποιώντας συσκευή υπερήχων Vibra-Cell (Sonics and Materials, Newtown, CT).

DNA κατακερματισμό δοκιμασία

θραύσματα DNA εκχυλίστηκαν με την Exgene κυττάρων SV σύστημα καθαρισμού γονιδιωματικού DNA (GeneAll, Κορέα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα θραύσματα DNA διαχωρίστηκαν με χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής επί πηκτής αγαρόζης 1%. Φορτωμένο DNA οπτικοποιήθηκε με ChemiDoc XRS (Bio Rad).

Διπλή δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης

Κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) συν-επιμολύνθηκαν με 2 μg ανθρώπινης COX- κατασκευάσματα 2 υποκινητή λουσιφεράση και pRL-Renilla (Promega) φορείς ή 2 μg TOPFlash φορέων λουσιφεράσης με τις θέσεις άγριου τύπου TCF δεσμευτική και φορέα λουσιφεράσης FOPFlash με το μεταλλαγμένο TCF θέσεις σύνδεσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με χρήση του συστήματος διαμόλυνσης νέον. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 30 μΜ embelin για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, και λύθηκαν με παθητική ρυθμιστικό λύσης, και οι δραστηριότητες της λουσιφεράσης μετρήθηκαν διαδοχικά χρησιμοποιώντας το σύστημα διπλής Δοκιμασίας Λουσιφεράσης (Promega) με έναν αναγνώστη μικροπλάκας FilterMax F3 (Molecular Devices, CA) .

πληγών επούλωσης δοκιμασία

κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 6 φρεατίων. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν μέχρι συρροής σε μέσο RPMI1640 που περιείχε 10% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 25 μg /mL μιτομυκίνης C για 30 λεπτά. A1-mm κλίμακα μηδέν έγινε σε όλη την κυτταρική στοιβάδα χρησιμοποιώντας ένα στείρο ρύγχος πιπέτας. Οι πλάκες φωτογραφήθηκαν μετά τον υποδεικνυόμενο χρόνο.

δοκιμασία Invasion

κυττάρων εισβολή μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας κυτταρικής εισβολής (Chemicon, Temecula, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα ένθετο θάλαμο εισβολή περιέχει μία μεμβράνη πολυανθρακικού μεγέθους πόρων 8 μm επικαλυμμένα με ένα λεπτό στρώμα πολυμερισμένου κολλαγόνου. Εισβάλλοντα κύτταρα στο κάτω μέρος του ένθετου μεμβράνης χρωματίστηκαν και φωτογραφήθηκαν.

ζυμογραφία ζελατίνης

ρυθμισμένα μέσα αναλύθηκαν για ζελατινάσες με ζυμογραφία ζελατίνης. Για ζελατινάσες, τα δείγματα διαχωρίστηκαν κάτω από μη-αναγωγικές συνθήκες σε 10% πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου SDS που ενσωματώνει 0,1% ζελατίνη. Μετά SDS-PAGE, η πηκτή επωάστηκε με ρυθμιστικό αναδιάταξης για 15 λεπτά τρεις φορές. Στη συνέχεια, τα πήγματα αντικαταστάθηκαν σε ρυθμιστικό ανάπτυξη στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Τα πηκτώματα πλύθηκαν και φωτογραφήθηκαν μετά από χρώση με 0,5% μπλε διάλυμα Coomassie για 30 λεπτά.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μονόδρομης ανάλυσης της διακύμανσης, ακολουθούμενη από ζεύγη πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett t-test με λογισμικό GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA), όταν απαιτείται. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε *

σ

& lt? 0.05.

Αποτελέσματα

Embelin αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου προστάτη

Διάφορες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη κύτταρα (PC3, DU145 και LNCaP-Ln3), ανθρώπινη προστάτη επιθηλιακό κύτταρο (RWPE-1), κύτταρα καρκίνου του μαστού (MDA-MB-231, MCF-7, και Τ47ϋ), κύτταρα ηπατώματος (HepG2, Hep3B και ΗυΗ-7), και τα κύτταρα χοριοκαρκινώματος (JEG-3) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις embelin να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του embelin επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1). Embelin ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε σύγκριση με τα αποτελέσματά της σε άλλα καρκινικά κύτταρα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε κατά embelin σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη και κυτταρικές επιθηλιακών προστάτη συμπεριλαμβανομένων PC3, DU145, LNCaP-Ln3 και RWPE-1 με IC

50 τιμές των 23,6 μΜ, 11,0 μΜ, 32,0 μΜ, και πάνω από 200 μΜ αντίστοιχα όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες (Εικ 1Ε). καρκινικές κυτταρικές γραμμές του προστάτη ήταν σαφώς αναστέλλεται από embelin, αλλά κύτταρο φυσιολογικό προστάτη δεν επηρεάστηκε από embelin σε χαμηλή συγκέντρωση για 24 ώρες. Για περαιτέρω μελέτες, επελέγη 30 μΜ συγκέντρωση του embelin για τη θεραπεία των κυττάρων PC3.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με embelin σε διάφορες συγκεντρώσεις για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με CCK. σχηματισμός φορμαζάνης ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία στα 450 nm. Το ποσοστό των κυττάρων που επιβιώνουν σε κάθε ομάδα σε σχέση με τον έλεγχο υπολογίστηκε. (Α) PC3 κυττάρων. (Β) DU145 κυττάρων. (C) LNCaP-Ln3 κύτταρο. (D) RWPE-1 κυττάρων. (Ε) IC

50 τιμές των embelin σε διάφορες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου. Τα IC

50 τιμές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. *, Διαφέρει σημαντικά από τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (

σ

& lt? 0,05).

Η

Η επαγωγή της απόπτωσης από embelin

Για να διαλευκανθεί αν embelin επάγει την απόπτωση σε PC3 κύτταρα, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με αννεξίνη V- και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) -stained κύτταρα. Η θεραπεία με 30 μΜ embelin για μέχρι 48 ώρες προκάλεσε έντονη αύξηση του ποσοστού της απόπτωσης. Κύτταρα κατεργασμένα με 30 μΜ embelin για 12 ώρες και 24 ώρες έδειξε μια 15,6-φορές και 17.2 φορές αύξηση στην απόπτωση σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ 2Α). Μετά από 48 ώρες επώασης, μία σημαντική αύξηση στην νέκρωση παρατηρήθηκε σε κύτταρα embelin φάρμακο. Η θεραπεία με embelin επάγεται επίσης χρωμοσωμικό κατάτμηση του DNA σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β). Επειδή το μιτοχονδριακό μετάβαση διαπερατότητα μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση, προσδιορίσαμε την επίδραση της embelin στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δ

ψ

m). Σχήμα 2C έδειξε ότι embelin μειώθηκε έντονα Δ

ψ

m, υποδεικνύεται ως το κόκκινο λόγος /πράσινο φθορισμό σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι embelin είναι ικανό να επάγει απόπτωση, αλλάζοντας τη διαπερατότητα μιτοχονδριακής μεμβράνης.

(Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα με embelin (30 μΜ), και χρωματίστηκαν με ανεξίνη V-FITC και ΡΙ . Η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι κυτταρικοί πληθυσμοί υπέστησαν διακρίσεις σε κάθε τεταρτημόριο ως βιώσιμα κύτταρα στην κάτω αριστερή (αννεξίνη V αρνητική /ΡΙ αρνητικό), πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων στο άνω αριστερό (Αννεξίνη V θετική /ΡΙ αρνητικό), αργά αποπτωτικών κυττάρων στην πάνω δεξιά (αννεξίνη V θετική /ΡΙ θετικά), και νεκρωτικών κυττάρων στην κάτω δεξιά τεταρτημόριο (αννεξίνη V αρνητική /ΡΙ θετικό). (Β) Διέγερση κλασμάτωσης ϋΝΑ σε κύτταρα PC3 με embelin. Τα κύτταρα επωάστηκαν για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα με embelin. Χρωμοσωμικό DNA απομονώθηκε και κατάτμηση του DNA προσδιορίστηκε. Μ, δείκτης DNA? Ρ, πακλιταξέλη (1 μΜ). (Γ) Μετά από κύτταρα PC3 επωάσθηκαν με embelin για χρονικές περιόδους, τα κύτταρα επισημάνθηκαν με 2 Μ JC-1 για 30 λεπτά και Δ

ψ

m προσδιορίστηκε με συνεστιακή μικροσκόπηση. Η αναλογία της JC-1 αδρανών (κόκκινο) στο μονομερές (πράσινο) Ένταση υπολογίστηκε με το λογισμικό J Image. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. *, Διαφέρει σημαντικά από τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (

σ

& lt? 0,05).

Η

Για να προσδιορίσετε αν embelin επηρεάζει τα επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση στα μιτοχόνδρια, μετρήθηκε η ποσότητα του Βαχ (προ-αποπτωτικών), Bcl-2, Bcl-xL, και Mcl-1 (αντι-αποπτωτική). Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α και 3Β, διαπιστώσαμε ότι embelin (30 μΜ) προκάλεσε έντονα μετατόπιση του Bax από το κυτοσόλιο στη μιτοχόνδρια. Τα επίπεδα έκφρασης του αντι-αποπτωτικών Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών όπως Bcl-2, Bcl-xL, και Mcl-1 ήταν σημαντικά μειώθηκαν κατά embelin. Στις 24 ώρες μετά την αγωγή embelin, τα επίπεδα της Bcl-2, Bcl-xL, και Mcl-1 ήταν 15%, 58% και 28% του επιπέδου ελέγχου, αντίστοιχα. Απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

από μιτοχόνδρια προς κυτοσόλιο ενισχύθηκε επίσης με την παρουσία embelin (Σχήμα 3C). Στις 24 ώρες μετά την αγωγή embelin, το κυτόχρωμα

γ

επίπεδο μειώθηκε στο 45% στα μιτοχόνδρια, αλλά στο κυτταρόπλασμα κυτόχρωμα

γ

επίπεδο αυξήθηκε σε 1,8 φορές του επιπέδου ελέγχου. Συνεστιακή μικροσκοπική ανάλυση έδειξε επίσης ότι embelin ενισχύει Bax μετατόπιση στα μιτοχόνδρια και κυτόχρωμα

γ

την ελευθέρωσή του στο κυτταρόπλασμα (Σχήμα 3Β και 3D). Βρήκαμε επίσης ότι embelin επάγει μετατόπιση του παράγοντα επαγωγής απόπτωσης (AIF) από τα μιτοχόνδρια, μέσα από το κυτοσόλιο, και τελικά προς τον πυρήνα (Σχήμα 3Ε). Συνεστιακή μικροσκοπική ανάλυση έδειξε ότι η θεραπεία με embelin ενισχύει ΟΕΕ μετατόπιση προς τον πυρήνα (Σχήμα 3F). Για να προσδιορίσετε αν embelin προκαλεί ολιγομερισμό VDAC να προωθήσει αλλαγές στην Δ

ψ

m, και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

και ΟΕΕ, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σουλφο-EGS για να δημιουργήσει διασταυρούμενη συνδέοντας μεταξύ VDAC, και ολιγομερισμού VDAC προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-VDAC1. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με embelin (30 μΜ) για μέχρι 24 ώρες, embelin επαγόμενη σαφώς έκφραση και διμερισμό του VDAC1 σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3G). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι VDAC1 θα μπορούσε να είναι ένας μεσολαβητής του embelin επαγόμενη απόπτωση και ότι ολιγομερισμός VDAC επάγεται από embelin θα μπορούσε δυνητικά να καθοριστεί η δυνατότητα πύλης του για την εκροή των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών, όπως το κυτόχρωμα

γ

και ΟΕΕ.

(Α), (γ), (Ε) μετατόπιση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη (Βαχ), κυτόχρωμα

γ

, ΟΕΕ, και το επίπεδο των αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bcl-2, Bcl-xL , Mcl-1) αναλύθηκαν με western αποτύπωση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με embelin για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Μετά την επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η κυτοσολικά και μιτοχονδριακή κλάσματα ήταν απομονωμένος. Εκχυλίσματα πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (10%) και ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη. επίπεδο GAPDH προσδιορίστηκε ως μάρτυρες φόρτωσης για κυτταρόπλασμα και το συνολικό λύματα. COX-4 επίπεδο προσδιορίστηκε ως έλεγχος φόρτωσης για μιτοχόνδρια. επίπεδο Η1 ιστονών προσδιορίστηκε ως μάρτυρας φόρτωσης για πυρηνικό κλάσμα. C, κυτοσολικό κλάσμα, Μ, μιτοχονδριακό κλάσμα, Ν, πυρηνικό κλάσμα. Οι αριθμοί μεταξύ των κηλίδων είναι οι αναλογίες της έντασης των ζωνών μετά κανονικοποιημένη με τον έλεγχο. (Β), (D), (F) μετατόπιση του Βαχ (Β), κυτόχρωμα

γ

(D), και AIF (F). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μικροσκοπικές διαφάνειες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με embelin για 24 ώρες. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, κατέστησαν διαπερατά, και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με χρήση ειδικών αντισωμάτων. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με το Texas Red-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα. Ο φθορισμός προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. G, έκφραση της VDAC1 και ολιγομερισμό των VDAC1. Embelin επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και κατόπιν επωάστηκαν με σουλφο-EGS (250 μΜ) για 25 λεπτά στους 30 ° C. Μετά πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE (8%), VDAC1 πρωτεΐνες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Μια μπάντα 33 kDa αντιπροσωπεύει VDAC1 μονομερή, ενώ μια ζώνη στα 65 kDa αντιπροσωπεύει το διμερές VDAC1. Μιτοχονδριακό κλάσμα απομονώθηκε και αναλύθηκαν με SDS-PAGE (12%) και ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη. COX-4 επίπεδο προσδιορίστηκε ως μάρτυρας φόρτωσης για μιτοχόνδρια.

Η

Αναστολή από embelin της Akt ενεργοποίησης και της β-κατενίνης οδού

Προηγουμένως Chen et al. ανέφεραν μία νέα οδό, που αποτελείται από Akt, και COX-2 για επίκτητη αντοχή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα [17]. Επειδή βρήκαμε ότι embelin καταστέλλει προσδιορίστηκαν Akt φωσφορυλίωση και έκφραση COX-2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 30 μΜ embelin για 6, 12, ή 24 ώρες και τα επίπεδα της φωσφο-Ακί (Ser 473), ολική Akt, και COX-2 μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, φωσφορυλίωση της Akt σε Ser 473 και έκφραση της COX-2 ήταν σημαντικά μειώθηκαν κατά embelin, αν και τα επίπεδα της ολικής Akt δεν μεταβλήθηκε σημαντικά. Στις 24 ώρες μετά την αγωγή embelin, τα επίπεδα φωσφο-Ακί και COX-2 μειώθηκαν κατά 99% και 52%, αντίστοιχα, από το επίπεδο των κυττάρων ελέγχου. Ταυτοχρόνως, αξιολογήσαμε αναστολή της ενεργοποίησης Akt σε κύτταρα PC3, φωσφορυλίωση της Akt και βιωσιμότητα κυττάρου μειώθηκε κατά αναστολέα Akt IV (0,3 μΜ) (Εικόνα 4Β). Όταν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με pECE-Myr-Akt πλασμίδιο για έκφραση μόνιμα ενεργών Akt, embelin μεσολάβηση μείωση της φωσφορυλίωσης Akt σε Ser 473 (σχήμα 4Γ). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η embelin μεσολάβηση μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων παρεμποδίστηκε με μυριστοϋλιωμένης Akt έκφρασης. Embelin ανέστειλε επίσης την δραστικότητα προωθητή της COX-2, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία λουσιφεράσης, υποδεικνύοντας ότι η embelin μπορεί να αναστέλλει την έκφραση Mcl-1 μέσω δέσμευσης των Akt-COX-Mcl-1 μονοπάτι.

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 30 μΜ embelin για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα, και προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου παρασκευάσθηκαν και εκχυλίζεται πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE (10%) και ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας φωσφο-Ακί, ολική Akt, και COX-2 αντισώματα διεξήχθη. Οι αριθμοί μεταξύ των κηλίδων είναι οι αναλογίες της έντασης των ζωνών μετά κανονικοποιημένη με τον έλεγχο. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με Myr-Ακί πλασμιδίου και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 30 μΜ του embelin για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με CCK. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών. *, Σημαντικά διαφορετικό από τα μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (

ρ

& lt? 0,01) και **, διαφέρει σημαντικά από την embelin μόνο επεξεργασμένα κύτταρα (

ρ

& lt? 0.001). Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα της ολικής Akt και φωσφο-Ακί προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. (Γ) αναστολέα ΑΚΤ IV κατεργάζεται κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και εκχυλίζεται πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE (10%) και ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας φώσφορο-Ακί, ολική Akt, και αντισώματα GAPDH διεξήχθη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,312 μΜ του ΑΚΤ IV αναστολέα για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με CCK. σχηματισμός φορμαζάνης ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία στα 450 nm. Το ποσοστό των κυττάρων που επιβιώνουν σε κάθε ομάδα σε σχέση με τον έλεγχο υπολογίστηκε. (D) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με COX-2 φορέα λουσιφεράσης και φορέα λουσιφεράσης Renilla για 48 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης. Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας, ομαλοποιήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla, δείχνεται. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών *, διαφέρει σημαντικά από την χωρίς θεραπεία ελέγχου (

σ

& lt? 0,05)..

Η

Προηγούμενη έκθεση δείχνει ότι η β-κατενίνης διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη πολλαπλά σήματα ανάπτυξης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη [23]. Για να προσδιοριστεί η επίδραση του στην έκφραση embelin β-κατενίνης, τα κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με embelin (30 μΜ) για μέχρι 24 ώρες και κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε. Σχήμα 5Α έδειξαν ότι embelin είναι σε θέση να μειώνουν το επίπεδο β-κατενίνης σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Στις 24 ώρες μετά την αγωγή embelin, το επίπεδο της β-κατενίνης μειώθηκε κατά 40% από το επίπεδο στα κύτταρα ελέγχου. Έχουμε καθορίζεται TOP δραστηριότητα flash λουσιφεράσης για να μετρηθεί το επίπεδο της β-κατενίνης πυρηνική μετατόπιση και ενεργοποίηση της μεταγραφής TCF. Embelin (30 μΜ) ανέστειλε σημαντικά δραστηριότητα TOPflash έως 19% του ελέγχου στις 24 ώρες της θεραπείας (Σχήμα 5Β). Ομοεστιακή μικροσκοπική ανάλυση επιβεβαίωσε επίσης ότι η θεραπεία με embelin μειώθηκε σαφώς το επίπεδο της β-κατενίνης σε κύτταρα PC3 (Εικόνα 5C). Η μεταγραφή των γονιδίων στόχων του β-κατενίνης, όπως κυκλίνη D1, c-myc, ή ΜΜΡ-7 επίσης κατέστειλε σημαντικά από embelin (Σχήμα 5D). Είναι ενδιαφέρον, το mRNA μεταγραφή του MMP-7 ήταν σχεδόν πλήρως αποκλεισμένη μετά από 12 ώρες θεραπείας με embelin. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε επίσης ότι embelin μειώθηκε έντονα κυκλίνη D1, c-Myc, και ΜΜΡ-7 επίπεδα πρωτεΐνης (Εικ 5D).

(Α) Ολόκληρα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και εκχυλίζεται πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE (10%) και ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας β-κατενίνης, φωσφο-β-κατενίνης, ή GSK-3β αντισώματα διεξήχθη. Οι αριθμοί μεταξύ των κηλίδων είναι οι αναλογίες της έντασης των ζωνών μετά κανονικοποιημένη με τον έλεγχο. (Β) δοκιμασία λουσιφεράσης. TOPFlash ή FOPFlash-επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με embelin. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε και η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας, ομαλοποιήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla, δείχνεται. (C) Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδα για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 30 μΜ embelin έως 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα β-κατενίνης και ο φθορισμός προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. (D) έκφραση της κυκλίνης D1, c-Myc και ΜΜΡ-7 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR και ανάλυση στυπώματος Western. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών *,

#

§, διαφέρει σημαντικά από το μη επεξεργασμένο έλεγχο (

σ

& lt? 0,05).. Οι αριθμοί μεταξύ των κηλίδες είναι οι αναλογίες της έντασης των ζωνών μετά κανονικοποιούνται με τον έλεγχο.

Η

Προηγούμενη έκθεση προτείνει ότι η GSK-3β διαμορφώνει τα επίπεδα της β-κατενίνης με φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser 33/37 και Thr 41 [24]. Εξετάσαμε αν embelin είναι σε θέση να ενισχύσει τη σταθερότητα GSK-3β και δραστηριότητα. Όπως φαίνεται στο Σχ 6Α, βρήκαμε ότι embelin εμπόδισε έντονα την φωσφορυλίωση της GSK-3β επί Ser 9 με ενεργοποίηση Akt. Embelin επαγόμενη έντονα φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε Ser 33/37 /Thr 41 και μπορεί να προωθήσει την υποβάθμιση β-κατενίνης. Υποθέσαμε ότι η embelin μεσολάβηση αύξηση στην φωσφορυλίωση της β-κατενίνης μπορεί να προκληθεί από την ενεργοποίηση GSK-3β, επειδή το μειωμένο επίπεδο β-κατενίνης με κατεργασία embelin ήταν σχεδόν πλήρως ανακτήθηκε με επεξεργασία με LiCl (20 mM), έναν αναστολέα GSK-3β . LiCl επίσης μείωσε τον embelin μεσολάβηση επαγωγή της φωσφορυλίωσης β-κατενίνης. Επειδή η θεραπεία με LiCl δεν ανέκτησε embelin μεσολάβηση μείωση στην GSK-3β φωσφορυλίωση, LiCl μπορεί να αναστέλλει δραστικότητα της GSK-3β αλλά δεν θα αλλάξει GSK-3β φωσφορυλίωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο Mcl-1 αυξήθηκε 1,4-φορές με επεξεργασία LiCl και μειωμένο επίπεδο Mcl-1by embelin σημαντικά ανακτήθηκε με LiCl (Σχήμα 6Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Mcl-1 έκφραση διαμορφώνεται από δραστηριότητα GSK-3β. Maurer et al. ανέφεραν ότι η αναστολή της GSK-3β μέσω Akt ενεργοποιήσεως που επάγεται Mcl-1 έκφραση [25]. Τα δεδομένα μας επιβεβαίωσε επίσης ότι η ενεργοποίηση της GSK-3β με embelin μεσολάβηση αναστολή Akt καταστέλλει έκφραση Mcl-1. Επιπλέον, LiCI επαγόμενη δραστικότητα TOPFlash 2,5 φορές του ελέγχου και embelin ανέστειλαν την μεταγραφική ενεργοποίηση TCF που προκαλείται από το LiCl προκαλούμενη αύξηση στην β-κατενίνης (Σχήμα 6Β). Ομοεστιακή μικροσκοπική ανάλυση έδειξε ότι η θεραπεία με embelin σχεδόν πλήρως ανέστειλε έκφραση β-κατενίνης (Σχήμα 6C). Η θεραπεία με LiCl ανακτηθεί embelin μεσολάβηση μείωση στην έκφραση β-κατενίνης.