Αφηρημένο

Μυθιστόρημα αναλύσεις βιοδεικτών και αναβαθμισμένο αναλυτικά εργαλεία χρειάζονται επειγόντως να διακρίνουν με ακρίβεια καλοήθους υπερτροφίας του προστάτη (ΚΥΠ) από καρκίνο του προστάτη ( Καπάκι). Για την αντιμετώπιση αυτού ανεκπλήρωτες κλινική ανάγκη, αναφέρουμε a /δοκιμασία μαγνητικό σφαιρίδιο που βασίζεται piezeoelectric για να ποσοτικοποιηθεί το ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA? Ελεύθερο και ολικό), φωσφατάση προστατικού οξέος, ανθρακική ανυδράση 1 (CA1), οστεονεκτίνη, IL-6 διαλυτός υποδοχέας (IL -6sr), και spondin-2. Χρησιμοποιήσαμε τον αισθητήρα για τη μέτρηση αυτών επτά πρωτεϊνών σε δείγματα ορού από 120 ασθενείς καλοήθη υπερτροφία του προστάτη και 100 Gleason στείλει 6 και 7 CaP χρησιμοποιώντας δείγματα ορού είχαν συλλεχθεί και κλίση. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το χειριστή του δέκτη ανάλυση χαρακτηριστική καμπύλη. Υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και των ασθενών CaP στην PSA, CA1, και προσδιορισμούς spondin-2. Η υψηλότερη AUC διακρίσεις επιτεύχθηκε με spondin-2 ή την ελεύθερη /συνολικό PSA λειτουργία-περιοχή κάτω από την καμπύλη ήταν 0,84 με p τιμή κάτω από 10

-6. Μερικά από αυτά τα δεδομένα φαίνεται να έρχονται σε αντίθεση με προηγούμενες εκθέσεις και να τονίσει τη σημασία της επιλογής του δείγματος και τη σωστή κτίριο δοκιμασία για την ανάπτυξη των συστημάτων μέτρησης βιοδείκτη. Αυτό το σύστημα με βάση σφαιρίδια προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα σε κτίριο δοκιμασία συμπεριλαμβανομένων των χαμηλού κόστους, υψηλής απόδοσης, καθώς και την ταχεία αναγνώριση ενός βέλτιστου ζεύγος αντισώματος

Παράθεση:. Jokerst JV, Chen Ζ, Xu L, Nolley R, Τσανγκ Ε , Mitchell B, et al. (2015) μαγνητικό σφαιρίδιο-Based αισθητήρα για την ποσοτικοποίηση του Καρκίνου του Προστάτη Πολλαπλές Biomarkers. PLoS ONE 10 (9): e0139484. doi: 10.1371 /journal.pone.0139484

Επιμέλεια: Chandan Kumar-Sinha, το Πανεπιστήμιο του Michigan, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 22 Γενάρη 2015? Αποδεκτές: 13η Σεπτεμβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 30 Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Jokerst et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τις ΗΠΑ Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου Grant U01 CA152737, R25-T CA118681 και των Καναρίων Ιδρύματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (ΚΓΠ) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ άνδρες, αλλά αποτελεσματικά εργαλεία ελέγχου και πρόγνωση παρέμειναν ασαφείς λόγω της μη ειδικής δοκιμασίες και βιοδείκτες [1]. Ενώ ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) είναι ο χρυσός κανόνας για τη μέτρηση των πρωτεϊνών του ορού, πάσχει από μακρά δοκιμασία φορές ανάπτυξη νέων βιολογικών δεικτών, μεγάλους όγκους δείγματος και απαιτεί πολλά πολύπλοκα στάδια λειτουργίας. ELISA, επίσης, μπορεί να υποφέρουν από υψηλό υπόβαθρο και μη ειδικές παρεμβολές επειδή χρησιμοποιεί ένα σύστημα οπτικής βάση αναφοράς.

Για να λυθεί αυτό, έχουν πολλές ανταγωνιστικές τεχνολογίες έχουν προταθεί συμπεριλαμβανομένων chemiluminescent-, microfluidic- [2], νανοτεχνολογία [3], και μαγνητική βάση [4] προσεγγίσεις. Ωστόσο, πολλές από αυτές τις προσεγγίσεις υποφέρουν από υψηλό κόστος, χαμηλή απόδοση, μεγάλους χρόνους κατασκευής δοκιμασίας, και την ανάγκη για ένα έμπειρο χειριστή. Έτσι, ένα ισχυρό αλλά απλό πλατφόρμα ανάλυσης με καθολική χρησιμότητα για μια ευρεία ποικιλία των πρωτεϊνικών βιοδεικτών δεν έχει ακόμη αναφερθεί. Ειδικότερα, η βιοδεικτών κοινότητα θα είναι καλά εξυπηρετείται από αναλυτικά εργαλεία για πάνελ των βιοδεικτών.

Μάλιστα, αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι πίνακες των βιοδεικτών μπορεί να είναι πιο αποτελεσματικό στο έγκαιρο εντοπισμό του καρκίνου και ταξινόμηση της επιθετικότητας της νόσου από το ειδικό αντιγόνο του προστάτη [5] ή άλλους προσδιορισμούς ενιαίο σημείο [6, 7]. Πράγματι, λόγω της βαθιάς βιολογικής πολυπλοκότητα του καρκίνου, φαίνεται λογικό ότι δοκιμασία για περισσότερα από ένα βιοδείκτη θα ήταν επωφελής σε ακριβή πρόγνωση ή ανίχνευση της νόσου στον υψηλότερο αριθμό των ασθενών. Οι πινακίδες αυτές περιλαμβάνουν διαμεμβρανικές πρωτεΐνες [8], οι μεταβολίτες [9], αυτοαντισώματα [10], μη-κωδικοποίησης RNA, όπως

PCA3

[11], συγχωνεύσεις γονιδίων συμπεριλαμβανομένων των

TMPRSS2-ERG

[12], κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων [13, 14], τα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA [15], γονίδιο προφίλ [16], εξωσώματα /προστασώματα [17], και πολλοί άλλοι [18].

Εδώ, περιγράφουμε ένα πιεζοηλεκτρικό προσέγγιση που βασίζονται σε μεμβράνες που χρησιμοποιεί ειδικές αλληλεπιδράσεις με μαγνητικά σφαιρίδια για την ποσοτικοποίηση βιοδείκτες του καρκίνου του προστάτη με πολλά πλεονεκτήματα για την κατασκευή δοκιμασία: 1) η προσέγγιση αυτή είναι σχεδόν χωρίς μήτρα επειδή χρησιμοποιεί μαγνητικά και πιεζοηλεκτρική με βάση τα συστήματα ποσοτικοποίηση και όχι οπτική? 2) Το σύστημα μπορεί γρήγορα ( δείτε S1 Βίντεο). Αυτό το σύστημα αποτελείται από ένα αναλυτή πάγκου και φυσίγγιο αντιδραστηρίου διαθέσιμου ικανά να αναλύουν 288 δειγμάτων και προτύπων ανά εκτέλεση. Ο αναλυτής έχει ενσωματωμένο χειρισμό υγρών, η διάθεση αποβλήτων, καθώς και τις δυνατότητες χειρισμού δεδομένων [33, 35]. Σήμα αναφέρεται σε σχετικές μονάδες μέσω ενσωματωμένου λογισμικού και είναι ανάλογη με τον αριθμό των σφαιριδίων ακινητοποιείται επί της μεμβράνης και έτσι αναλύτη συγκέντρωση. τον έλεγχο του υλικού και την ανάλυση των δεδομένων έγινε με Bioscale εμπορικό λογισμικό (Vibe έκδοση 0.7.3).

Το σύστημα αυτό αποτελείται από ένα αναλώσιμο φυσίγγιο 8-κανάλι συνδέεται με ρευστή ρομποτική χειρισμό και μια ηλεκτρικά ελεγχόμενη μαγνήτη. Τα δείγματα και τα πρότυπα παρασκευάστηκαν σε 1: 10-1: 1000 συντελεστής αραίωσης και επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων μαζί με χάντρες και φθορίζοντος αντισώματος. Τα δείγματα παρασκευάστηκαν με ανάμιξη 80 μL δείγματος ή προτύπου με 20 μL σφαιριδίων επικαλυμμένων με c.Ab (900.000 σφαιρίδια /mL) και 20 μί φλουορεσκεΐνη-επισημασμένου d.Ab (1200 ng /mL). Αυτά τα αντιδραστήρια σχηματίζουν ένα ανοσοσύμπλοκο σάντουιτς με την παρουσία του αντιγόνου βιοδεικτών (Σχήμα 1Α).

A. Η c.Ab. είναι ομοιοπολικά δεσμευμένο σε ένα μαγνητικό σφαιρίδιο που επωάζεται με το δείγμα και φθορεσκεΐνη-tagged d.Ab. Αυτό το δείγμα εισάγεται σε ένα κύτταρο ροής καλυμμένο με μια μεμβράνη πιεζοηλεκτρική επικαλυμμένη με ένα αντίσωμα αντι-φλουορεσκεΐνης. Ένας ηλεκτρομαγνήτης πάνω από τη μεμβράνη ελέγχεται με ενσωματωμένο λογισμικό. B. Κατά μαγνητική διαταραχή, όλες οι χάντρες (μαύροι κύκλοι) κινηθεί προς τη μεμβράνη (Bi), και χάντρες με ένα ολοκληρωμένο ανοσοσυμπλόκου (μαύροι κύκλοι επικαλυμμένα με κόκκινες κουκίδες) συνδέονται με το αντίσωμα αντι-φλουορεσκεΐνης (ΒΙΙ). Μετά το πεδίο αφαιρείται και η ροή αποκαταστάθηκε, μόνο χάντρες με ένα ολοκληρωμένο ανοσοσυμπλόκου παραμένουν δεσμευμένα (ΒΙΙΙ). Αυτά τα σφαιρίδια μεταβάλλουν την ταλάντωση της μεμβράνης (αντιπροσωπεύεται ως πορτοκαλί ημιτονοειδής καμπύλη), η οποία ερμηνεύεται ως σήμα σε αυθαίρετες μονάδες [36]. Δείτε S1 βίντεο. Στην Β, η στερεά μπλε γραμμή με την ένδειξη Pos αναφέρεται σφαιρίδια παρουσία του αντιγόνου, και η διακεκομμένη κόκκινη γραμμή επισημασμένη Neg αναφέρεται σφαιρίδια εν απουσία αντιγόνου.

Η

Έως 100 μL αυτού του μίγματος απαιτήθηκε για μαγνητική διαλογή και ανάλυση. Το μίγμα αυτό επωάστηκε με ανακίνηση για 4 ώρες. Το διάλυμα σε κάθε στήλη της πλάκας (όλα τα φρεάτια 8) στη συνέχεια αυτόματη πιπέττα σε μεμονωμένα κανάλια ροής εντός του φυσιγγίου 8 καναλιών. Αφού το διάλυμα φορτώθηκε μέσα στον θάλαμο, ένα μαγνητικό πεδίο εφαρμόσθηκε και όλα τα σφαιρίδια έλκεται προς το αντι-φλουορεσκεΐνη IgG επικαλυμμένα μεμβράνη πιεζοηλεκτρικών μπροστά από το μαγνητικό πεδίο. Ροή και παράγοντες αραίωσης ρυθμίζεται έτσι ώστε ο αριθμός των ακινητοποιημένων σφαιριδίων ήταν μεταξύ 2000-3000.

Καθώς αυτά τα σφαιρίδια έρχονται σε επαφή με αυτή την μεμβράνη πιεζοηλεκτρικό, η συχνότητα ταλάντωσης μεταβάλλεται και καταγράφεται (Σχήμα 1Β). Το μαγνητικό πεδίο διατηρείται για να επιτρέψει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ σφαιριδίων με πλήρη ανοσοσυμπλόκων και της μεμβράνης-φθορεσκεΐνης ετικέτας στη d.Ab διευκόλυνε σύνδεση του ανοσοσυμπλόκου σε ένα αντι-φλουορεσκεΐνη IgG επί της μεμβράνης πιεζοηλεκτρικά. Το πεδίο κατόπιν διακόπηκε και η ροή συνεχίζεται προς απομάκρυνση μη ειδικά συνδεδεμένου σφαιρίδια. Η αλλαγή στη συχνότητα πιεζοηλεκτρικών στη συνέχεια καταγράφεται ως ένα μέτρο του αριθμού των δεσμευμένων χάντρες και συγκέντρωση έτσι αντιγόνο που συμπληρώνει το ανοσοσύμπλοκο (Εικόνα 1Β).

Δείγματα

αποθηκευμένα δείγματα ορού είχαν συλλεχθεί πάνω 20 χρόνια με εν επιγνώσει συναίνεση από το Τμήμα Ουρολογίας στο Πανεπιστήμιο του Στάνφορντ. Χρησιμοποιήσαμε ορό επειδή έχει αφαιρεθεί παράγοντες πήξης, η οποία μπορεί να παράγει μη-ειδικό σήμα και το υπόβαθρο σε προσδιορισμούς πρωτεϊνών του πλάσματος. Η διάγνωση επιβεβαιώθηκε με 10- ή 12-core βιοψίες κατά τη στιγμή της συλλογής των δειγμάτων. Το Διοικητικό Συμβούλιο Εσωτερική αναθεώρηση του Πανεπιστημίου του Στάνφορντ ενέκρινε αυτή τη μελέτη και το σχεδιασμό της εν επιγνώσει συναίνεση. Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση κατά τη στιγμή της συλλογής δειγμάτων και έντυπα συγκατάθεσης συμμετέχοντα είχαν επιμεληθεί μαζί με τα δείγματα στο Τμήμα Στάνφορντ της Ουρολογίας. Αυτά τα δείγματα αποψύχθηκαν, de-εντοπίστηκαν, αραιωμένο σε PBS, και κλασματοποιήθηκε για δοκιμές. Μελετήσαμε 240 δείγματα που επιλέγονται τυχαία από μια τράπεζα των ~ 2.200 δείγματα επιμέλεια στο Stanford Ακτινολογίας. Ο μέσος όρος ηλικίας των ελέγχων ΚΥΠ ήταν 65,9 ± 9,2 (30-87), και ο μέσος όρος ηλικίας για τους ασθενείς ΚΓΠ 62,6 ± 6,4 (46 – 77)? υπήρξε μια στατιστικά σημαντική διαφορά ηλικίας μεταξύ των δύο ομάδων (p = 0,002). Έχουμε συμπεριλάβει αυτές τις πληροφορίες στο κείμενο. Υπήρχαν 120 δείγματα καλοήθη υπερπλασία του προστάτη και 100 περιπτώσεις επιβεβαιωμένης καρκίνου του προστάτη επιλεγεί? Όλα τα δείγματα είχαν τιμές PSA μεταξύ 2-20 ng /mL. Των δειγμάτων καπάκι, 32 είχαν Gleason σκορ 6 και 68 ήταν Gleason σκοράρει 7. Ως μάρτυρας, υπήρχαν επίσης 20 δείγματα από άνδρες με καπάκι που συλλέγονται μετά από ριζική προστατεκτομή. παράγοντες αραίωσης βελτιστοποιήθηκαν εμπειρικά για να δώσουν ένα ανάκτηση ακίδα 100% ± 10%. Το συγκεντρωμένο φυσιολογικό θηλυκό ορού αγοράστηκε από την Ατλάντα Biologicals.

Ερμηνεία των δεδομένων και στατιστικών

μονάδες σήματος των αγνώστων μετατράπηκαν σε μονάδες συγκέντρωσης χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο σιγμοειδή καμπύλη με το λογισμικό Bioscale (Vibe έκδοση 0.7.3 ). Το εύρος ανίχνευσης ορίστηκε ως εκείνα τα σημεία βαθμονόμησης που θα μπορούσαν να διακριθούν από το επόμενο πλησιέστερο σημεία βαθμονόμησης τους. εύρη αναφοράς που λαμβάνονται από τις κλινικές κατευθυντήριες γραμμές ή η βιβλιογραφία ανάλογα με την κατάσταση των βιοδεικτών. Κάναμε τεστ t του 2-tailed του Student για να συγκριθούν τα αποτελέσματα της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και δείγματα CaP στο Excel 2010. Οι καμπύλες AUC και ROC και συναφείς στατιστικές που παρασκευάζονται με GraphPad Prism 6.04.

Αποτελέσματα

Προσδιορισμός των Συμφωνήθηκε ζεύγος

Θα έπρεπε πρώτα να προσδιορίσει το βέλτιστο ζεύγος αντισώματος, και η επόμενη ενότητα περιγράφει αυτή την προσέγγιση με τη χρήση PAP ως ένα παράδειγμα, τα αποτελέσματα για τις άλλες αναλύσεις παρουσιάζονται στον πίνακα 1. το Σχήμα 2 παρουσιάζει αντιπροσωπευτικά στοιχεία για το πώς αυτό επιτεύχθηκε για την βιοδεικτών PAP με το λεγόμενο «δοκιμασία σκακιέρας». Εδώ, τέσσερα διαφορετικά αντισώματα ΡΑΡ, καθώς και ένας μάρτυρας ισοτύπου χρησιμοποιήθηκαν ως τόσο του c.Ab και d.Ab. Και τα τέσσερα αντισώματα και ένας μάρτυρας ισοτύπου χρησιμοποιήθηκε σε αντιγόνο συγκεντρώσεις 0 και 1 ng /mL. Σχήμα 2Α απεικονίζει την διαφορά σήματος μεταξύ αυτών των δύο συγκεντρώσεις. Για PAP το υψηλότερο σήμα ήταν με το COS 1 d.Ab και cos2 c.Ab με ένα σήμα των 0,65 Α.υ. (Σχήμα 2Α). Αντιστρέφοντας τη σειρά, δηλαδή cos2 d.Ab και COS 1 c.Ab είχε τιμή των 0,43 Α.υ. Το ζευγάρι από την R COS 1 d.Ab. Ζεύγος 2: RDPo c.Ab .; RDMo. επάλειψη. Οι κόκκινες μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση τουλάχιστον τριών όμοιων μετρήσεων. Γ) Επαναληψιμότητα από μέρα σε μέρα είναι & lt? 8%. Δ) Η προσέγγιση πιεζοηλεκτρική βασίζεται παρουσιάζει βελτίωση 3 παραγγελίες log in αναλυτική ευαισθησία έναντι άμεση ELISA όταν τα ίδια ζεύγη αντισώματος που χρησιμοποιείται (COS 1 /cos2).

Η

Ο καλύτερος-ζεύγος με αποτέλεσμα την δυναμική περιοχή, αναφορά οι φάσμα, και αραίωση παράγοντες εμφανίζονται για τις δοκιμασίες 7 βιοδεικτών, καθώς και αντιπροσωπευτικές τιμές διακύμανση ενδο-δοκιμασίας.

η

φυσικά, αλλάζοντας το ζεύγος αντισώματος αλλάζει την ευαισθησία της καμπύλης. Το σχήμα 2Β απεικονίζει ότι με την αλλαγή της c.Ab να RDPo και το d.Ab να RDMo, το εύρος ευαισθησίας άλλαξε από 0.01-1.0 ng /mL έως 1 έως 100 ng /mL. Τέλος, συγκρίναμε τις καμπύλες απόκρισης του ΡΑΡ μέσω του συστήματος με βάση σφαιρίδια με ELISA χρησιμοποιώντας το ίδιο ζευγάρι COS 1 /cos2 (Σχήμα 2D). Δείχνουμε μια βελτίωση προκειμένου 3-log in αναλυτική ευαισθησία χρησιμοποιώντας την προσέγγιση με βάση σφαιρίδια που αναδεικνύει την αυξημένη αναλυτική ευαισθησία οφείλεται στην απληστία της χάντρα σε σχέση με το επίπεδο του υποστρώματος ELISA.

Το ποσό των c.Ab και d. Ab ανά δοκιμασία διερευνήθηκε επίσης (S1 Σχήμα). Το προτεινόμενο από τον κατασκευαστή συγκέντρωση εργασίας χάντρα 150.000 χάντρες /mL και 200 ​​ng /mL d.Ab. Δοκιμάσαμε τιμές d.Ab των 100 και 400 ng /mL, καθώς 10,000-300,000 χάντρες /mL, αλλά δεν βρήκε καμία βελτίωση στην καμπύλη εξαρτώμενη από τη δόση από 10,0 να 0,015 ng /mL. Σε 1 ng /mL ανασυνδυασμένης πρότυπο PAP, το υψηλότερο σήμα επιτεύχθηκε με 10.000 σφαιρίδια /mL και 100 ng /mL του d.Ab. Ωστόσο, αυτές οι συνθήκες οδήγησε επίσης σε υψηλότερο σήμα υποβάθρου σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (S1 Σχήμα). Έτσι, 150.000 χάντρες /mL και 200 ​​ng /mL d.Ab χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις επόμενες αναλύσεις.

Χαρακτηρισμός Δοκιμασία

Εξετάσαμε επόμενο τόσο ενδο-δοκιμασίας (μεταξύ πηγάδια λειτουργούν με την ίδια ημέρα κατά την ίδια στιγμή) και διακύμανση δια-δοκιμασίας (διαφορά μεταξύ του μέσου του τρέχει σε διαφορετικές ημέρες? Σχήμα 2C). Για PAP, διακύμανση ενδο-δοκιμασίας κυμαίνονταν από 0,05% σχετική τυπική απόκλιση [37] σε 6 ng /mL έως 5,47% σε 0,02 ng /mL. Η διακύμανση δια-δοκιμασίας σε τρεις διαφορετικές ημέρες ήταν 7,1% RSD. Όλες οι άλλες δοκιμασίες είχαν & lt? 7% διακύμανσης για ενδο-δοκιμασίας διακύμανσης και & lt? 10% για διακύμανση μεταξύ δοκιμασία. Όταν κάνετε ημέρα με την ημέρα συγκρίσεις ήταν εξαιρετικά σημαντικό ότι οι καμπύλες βαθμονόμησης να διατάσσονται σε πλάκες 96 φρεατίων με τον ίδιο τρόπο σε κάθε επόμενη ημέρα. Επειδή κάθε σειρά στην πλάκα 96 και διαρκεί ~ 5 λεπτά για να αναλύσει, αλλάζοντας τη θέση των σφαιριδίων επιτρέπει μεγαλύτερους χρόνους επώασης, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε υψηλότερα χάντρα /ανοσοσυμπλόκου συσσώρευσης και ως εκ τούτου υψηλότερο σήμα.

Με μια βελτιστοποιημένη ζεύγος αντισώματος στο χέρι, είμαστε δίπλα ακάλυπτο και να διορθώνονται τυχόν παρεμβολές μήτρα και πάλι αποτυπώνουν με PAP. Χρησιμοποιήσαμε συγκεντρωμένο φυσιολογικό ορό θηλυκό που πρέπει να περιέχει καμία PAP. Ορού σε παράγοντες αραίωση από 1: 2-1: 256 παρασκευάστηκε και αναλύθηκε. Μια άλλη παρτίδα από αραιωμένα δείγματα εμπλουτίστηκε με 0,5 ng /mL PAP. Τα δείγματα αναλύθηκαν και η ανάκτηση τοις εκατό γραφικά στο σχήμα 3Α καθώς και δεδομένα ανάκτηση ακίδα για SPARC αιχμηρό στα 125 ng /mL και CA1 αιχμηρό στα 10 ng /mL. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανάκτηση 100% επιτεύχθηκε με παράγοντες αραίωσης 16-φορές για αυτές αναλυτών. Μειωμένη και αυξημένες τιμές ανάκτηση ακίδα οφείλονται σε μη ειδική δέσμευση άλλων πρωτεϊνών του ορού με τα αντισώματα. Οι άλλες πέντε βιοδείκτες έχουν βελτιστοποιηθεί παρόμοια.

Α) Ποσοστό ανάκτησης για τρεις αντιπροσωπευτικές βιοδείκτες. επιδράσεις της μήτρας μπορεί να είναι είτε αμβλύνουν το σήμα (CA1, PAP) ή φουσκώνουν σήμα (SPARC). Ιδανικό συντελεστές αραίωσης εξαρτώνται από την ευαισθησία της δοκιμασίας και αναφοράς εύρους του βιοδεικτών (Πίνακας 1). Μαύρη διακεκομμένη γραμμή δείχνει 100% ανάκτηση ακίδα. Β) οικόπεδο Bland-Altman [38] επικύρωση δείγμα ακεραιότητα ενός υποσυνόλου (Ν = 35) των κλινικών δειγμάτων με υψηλούς όγκους δείγματος. Κόκκινη διακεκομμένη γραμμή δηλώνει το διάστημα εμπιστοσύνης 95%.

Η

Κλινικά δείγματα

Το πρώτο βήμα ήταν να επικυρώσει τη σταθερότητα του δείγματος. Για να γίνει αυτό, μπορούμε να αναλύονται πάλι τις τιμές του PSA ενός υποσυνόλου (Ν = 35) των δειγμάτων που είχαν υψηλούς όγκους ορού χρησιμοποιώντας ένα Beckman Access κλινικός αναλυτής (Hybritech) στο Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Στάνφορντ και σύγκριση αυτή με τις τιμές που μετρήθηκαν αρχικά σε η στιγμή της συλλογής. Δημιουργήσαμε ένα οικόπεδο Bland-Altman και έδειξε ότι το 92% των δειγμάτων ήταν εντός του διαστήματος εμπιστοσύνης 95% (Σχήμα 3Β). Αυτή η επικύρωση χρησιμοποιούνται μόνο εκείνα τα δείγματα που είχαν αρκετό όγκο, τόσο για την κλινική σύστημα και δοκιμασίας με βάση σφαιρίδια. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ακεραιότητα PSA διατηρήθηκε κατά την αποθήκευση.

Στη συνέχεια, μετρήσαμε τα επίπεδα βιοδεικτών όλων των αναλυτών σε ορό αραιωμένο με τις συγκεντρώσεις που φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα δεδομένα για την καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, καπάκι, και μετά τη χειρουργική επέμβαση τα δείγματα πώματος που φαίνεται στο Σχήμα 4. η μέση τιμή από δείγματα ασθενών κεφαλαιοποίησης είναι 1,5-, 1,6, 0.83-, 0.94-, 0.79 και 1.03 φορές μεγαλύτερη από ό, τι ΚΥΠ για την CA1, PSA, IL6-sr, PAP, και SPARC δοκιμασίες, αντίστοιχα. Δοκιμές με μια σημαντική διαφορά μεταξύ της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και το καπάκι ήταν PSA (p & lt? 0,0001), CA1 (p = 0.03), SPARC (p = 0.049), και SPON2. (P & lt? 0.10

-6)

Πρώτες τιμές με μέσα για καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, καπάκι, και μετά τη χειρουργική επέμβαση (PS) δείγματα. Biomarkers περιλαμβάνουν tPSA (Α), fPSA (Β), CA1 (C), ΡΑΡ (D), IL6-SR (Ε), SPARC (F), και SPON2 (G). Οριζόντιες γραμμές δείχνουν μέσες τιμές.

Η

Εμείς δημιουργήσαμε τις καμπύλες ROC και μέτρησαν την AUC για όλα τα βιοδείκτες με τη χρήση της διάγνωσης με βιοψία επιβεβαίωσε και τιμές μέτρησης (Σχήμα 5). Η PAP AUC ήταν 0,51? 95% διάστημα εμπιστοσύνης 0,43 έως 0,58 με p & gt? 0,50. Ο SPARC AUC ήταν 0,51? 95% διάστημα εμπιστοσύνης 0,43 έως 0,59 με p & gt? 0,50. Η CA1 AUC ήταν 0,55? 95% διάστημα εμπιστοσύνης 0,47 έως 0,63 με p = 0,17. Η IL-6SR AUC ήταν 0,57? 95% διάστημα εμπιστοσύνης 0,50 έως 0,65 με p = 0,06. Η SPON2 AUC ήταν 0,76? 95% διάστημα εμπιστοσύνης 0,69 έως 0,82 με p & lt?. 0.0001

Α) Οι μέσες τιμές με τυπική απόκλιση για τις επτά βιοδείκτες με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, καπάκι, και μετά τη χειρουργική επέμβαση [39] δείγματα. Οι μονάδες ng /mL. Η τιμή p αναφερθεί εδώ είναι η σημασία μεταξύ των δειγμάτων καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και της ΚΑΠ. AUC τιμές δίνονται επίσης και να αναφέρουν τις διακρίσεις μεταξύ ΚΓΠ και καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη. Κάτω πίνακας παρουσιάζει τις καμπύλες ROC για την PSA, SPON2, και PSA Ή SPON2. Ο τελεστής OR αυξάνει την AUC σε 0,84 από 0,80 μόνο για το PSA.

Η

Η τιμή AUC για την PSA είναι χαρακτηριστικό των αξιών βιβλιογραφία [40-42]. Σε μια μετα-ανάλυση χρησιμοποιώντας το δωρεάν και το συνολικό PSA, το σύνολο για 41 μελέτες με 19.643 συμμετέχοντες ήταν ένας AUC 0,70 [41]. Δυστυχώς, άλλοι βιοσημειωτές δεν βελτίωσε την AUC με την εξαίρεση των SPON2. Αυτό δείκτης είχε τιμή AUC του 0.76 σε σύγκριση με την PSA AUC του 0,80. Όταν οι δύο χρησιμοποιήθηκαν σε μια επιχείρηση ή, η AUC αυξήθηκε ελαφρώς 0,84. Δεν άλλες εργασίες ή άλλους συνδυασμούς των βιοδεικτών αύξησε την AUC καμπύλης.

Μελετήσαμε επίσης αν τυχόν βιοδεικτών μπορεί να εισάγει διακρίσεις μεταξύ Gleason 6 και Gleason 7 ασθενείς (S1 πίνακα). Καμία από τις νέες πρωτεΐνες έδειξε μια τιμή ρ & lt? 0.05. Ενώ αυτό το σύνολο δεδομένων έδειξε μια πολύ σημαντική διαφορά για tPSA (& lt? 0.01), αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στην παρουσία κάποιου αξίες της ακραία τιμή p ήταν 0,06 όταν χρησιμοποιούνται οι αρχικές κλινικές τιμές PSA. Κάναμε επίσης ανάλυση ROC για τις διάφορες βαθμολογίες Gleason σχέση με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη και σημείωσε τη σημασία με την IL-6SR. Κατά τη σύγκριση Gleason 7 ασθενείς έναντι ΒΡΗ με IL-6SR, βρήκαμε μια τιμή AUC είναι 0,66? το διάστημα εμπιστοσύνης 95% ήταν 0,57 να 0,76 με p = 0.005. Διαχωρισμό με σκορ Gleason δεν βελτίωσε τις τιμές AUC για άλλους βιοδείκτες.

Συζήτηση

Υπάρχουν πολλές προσεγγίσεις για τη μέτρηση νέων βιοδεικτών ΚΓΠ μετά το παραδοσιακό ELISA. Ένα από τα θεμελιώδη σημεία συμφόρησης στα περισσότερα προγράμματα ανάπτυξης προσδιορισμός είναι ο προσδιορισμός ενός κατάλληλου ζεύγος αντισώματος. Αυτό είναι ίσως το πιο σημαντικό πλεονέκτημα της προσέγγισης που βασίζεται χάντρα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία την ταυτοποίηση ενός ζεύγος αντίσωμα συνήθως διαρκεί λιγότερο από 2 ημέρες από την σύνθεση των αντιδραστηρίων για την τελική επιλογή της βέλτιστης ζεύγους. Αυτό το σύστημα έχει καλή αναπαραγωγιμότητα δια- και ενδο-προσδιορισμού (CV & lt? 10%) και μπορεί να ελαχιστοποιήσει γρήγορα παρεμβολές μήτρα. Άλλα πλεονεκτήματα περιλαμβάνουν τα χαμηλότερα όρια ανίχνευσης λόγω της απληστίας στο σχεδιασμό χάντρα, καθώς και χαμηλό όριο για την εκπαίδευση των χρηστών. Περιορισμοί του συστήματος περιλαμβάνουν τις σχετικά υψηλές απαιτήσεις όγκος του δείγματος λόγω της περιορισμένης πολυπλεξίας. Για να λυθεί αυτό, αναπτύσσουμε πρόσθετα αναλυτικά εργαλεία στα εργαστήριά μας όπως η μαγνητο-nanosensor για πολυπλεξίας αναλύει με μεγάλη δυναμική εύρος και την ένταση χαμηλή δείγματος (40 μl) απαιτήσεις κρίσιμη για τα πολύτιμα δείγματα [4].

είναι σημαντικό ότι ο έλεγχος βιοδείκτη επιτρέπεται να αποτύχουν γρήγορα, πριν οι σημαντικές επενδύσεις που έγιναν στην ανάπτυξη τεστ ή τη χρήση των πολύτιμων κλινικά δείγματα. Αυτό το σύστημα με βάση σφαιρίδια επιτρέπει την ταχεία εξακρίβωση των πιθανών βιοδεικτών. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι πολλοί από τους βιοδείκτες πρωτεΐνης έχουν αναφερθεί στο παρελθόν σε διακρίσεις μεταξύ ΚΓΠ και ασθενείς BPH απέτυχε με συγκεκριμένα δείγματα ασθενών μας. Ίσως το πιο εκπληκτικά ήταν CA1. Σε προηγούμενη εργασία με τη χρήση 54 δειγμάτων CaP και 60 υγιείς ελέγχους [23], αυτή η πρωτεΐνη είχε μια τιμή AUC του 0,64 και τιμή AUC του 0,76 όταν συνδυάζεται με PSA. Μια σημαντική διαφορά είναι το γεγονός ότι περιορίζεται μελέτη δειγμάτων τους σε ασθενείς σε λεγόμενη «γκρίζα ζώνη» του PSA τιμές δοκιμής-PSA μεταξύ 4 και 10 ng /mL. IL-6SR έχει επίσης δειχθεί ότι συσχετίζεται με την πρόοδο [27] και των οστών μετάσταση [26] και ήταν εύλογο ότι διαφορική έκφραση θα έχουν μετρηθεί σε ΒΡΗ έναντι δειγμάτων ασθενών καπάκι, ωστόσο παρατηρήσαμε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ αυτών των δύο πληθυσμούς ασθενών.

η συνεργασία μας με SPON2 δείχνει ότι έχει κάποια χρησιμότητα σε δοκιμές ΚΓΠ. Ένα περίεργο χαρακτηριστικό αυτής της μελέτης είναι ότι τα επίπεδα σε ασθενείς με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (126,5 ng /mL) ήταν στην πραγματικότητα υψηλότερο από ό, τι οι ασθενείς ΚΓΠ (73,0 ng /mL). Αυτή η διαφορά ήταν πολύ σημαντική στο ρ = & lt? 10

-6. Σε ένα προηγούμενο έγγραφο [31], τα επίπεδα SPON2 σε ασθενείς ΚΓΠ (77.5 ng /mL) ήταν υψηλότερες από ό, τι σε ασθενείς με «χωρίς ένδειξη κακοήθειας» (23,6 ng /mL). Ενώ οι διαφορές σε απόλυτες τιμές, είναι πιθανό να αποδοθούν σε διαφορές στο πρότυπο και το αντίσωμα επιλογής, η τάση είναι κάπως ασαφής. Μια πιθανή εξήγηση είναι σε διαφορές επιλογή των ασθενών. Αυτές οι κανονικές υγιείς μάρτυρες είναι μια πολύ διαφορετική ομάδα ασθενών από την ομάδα ΚΥΠ που χρησιμοποιείται για τη σύγκριση στη μελέτη μας. Πράγματι, είναι πιθανό ότι τα επίπεδα αυξάνουν κατά SPON2 ΒΡΗ ανωτέρω τιμές που παρατηρούνται σε κανονική ή καπάκι υποκείμενα. Μελλοντικές εργασίες θα πρέπει να μελετήσει περαιτέρω SPON2 επίπεδα σε πολλές ομάδες ασθενών και ελέγχου, με μεγάλο αριθμό ασθενών για την καλύτερη κατανόηση αυτών των διαφορών.

Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι SPON2 ισχύει μόνο για τους ασθενείς με τιμές PSA κάτω από 10 ng /mL [30]. Ο περιορισμός δείγματα μας σε αυτούς τους ασθενείς έδωσε μια μέση τιμή BPH των 119,9 ± 65,9, μέση τιμή της ΚΓΠ του 82,6 ± 50,36 (p = 0.004) και η AUC του 0,72. Ετσι, περιορίζοντας τα δεδομένα μας σε αυτούς τους ασθενείς δεν βελτίωσε την AUC.

Ανάλυση του μετά τη χειρουργική επέμβαση οι ασθενείς έδειξαν ότι οι πιο δραματικές μεταβολές στα επίπεδα βιοδεικτών συνέβη σε δοκιμές PSA-based. Η tPSA σε ασθενείς μετά από προστατεκτομή μειώθηκε 18 φορές έναντι ΒΡΗ και 30-πλάσια για τους ασθενείς καπάκι. επίπεδα ΡΑΡ στους ασθενείς μετά από προστατεκτομή ήταν 2 έως 3 φορές μικρότερη. Άλλοι βιολογικοί δείκτες δεν έδειξε σημαντική (P & gt? 0,05) αλλαγή

Συμπέρασμα

Σας αναφέρω ένα πιεζοηλεκτρικό αισθητήρα χάντρα που βασίζεται σε μέτρηση των πρωτεϊνών του ορού με δυνατότητα να διακρίνουν μεταξύ καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και της ΚΑΠ.. Αυτή η μελέτη επιβεβαίωσε τη χρήση του PSA να διακρίνουν μεταξύ καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη και της ΚΑΠ, αλλά οι τιμές AUC ήταν υπο-βέλτιστη για τον έλεγχο του πληθυσμού σε ολόκληρη. Έχουμε, επίσης, έδειξε ότι η χρήση SPON2 σε συνδυασμό με την PSA με μια λειτουργία ή μπορεί να αυξήσει την AUC 0,80 έως 0,84. Αυτή η προσέγγιση έχει χρησιμότητα για μια ποικιλία των κυκλοφορούντων βιοδείκτες και μελλοντικές εργασίες θα αξιολογήσει πιο ελπιδοφόρα βιοδείκτες, καθώς και βιοδείκτες των ούρων που βασίζεται, όπως η TMPRSS2:. ERG σύντηξης

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Βελτιστοποίηση των σφαιριδίων και d.Ab συγκέντρωση.

Παραλλαγές στη συγκέντρωση d.Ab δύο φορές πάνω και κάτω από τη συνιστώμενη 200 τιμή ng /mL χρησιμοποιήθηκαν εκτός από την αύξηση των συγκεντρώσεων των σφαιριδίων (ένθετο). Οι καμπύλες βαθμονόμησης σε κάθε ένα από αυτά τα σημεία δείχνουν ότι η απάντηση είναι σταθερό ± 15%, παρά αυτές τις παραλλαγές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0139484.s001

(PDF)

S1 πίνακα. . Βιοδείκτη συγκεντρώσεις ως συνάρτηση του Gleason Score

PSA έδειξε τις πιο σημαντικές διαφορές μεταξύ των ασθενών με Gleason σκορ 6 και 7.

doi: 10.1371 /journal.pone.0139484.s002

(PDF)

S1 βίντεο.