Αφηρημένο

Η legumain πρωτεάση κυστεΐνη εμπλέκεται σε διάφορες βιολογικές και παθολογικές διαδικασίες, και η πρωτεάση έχει βρεθεί υπερ-εκφράζεται και σχετίζεται με επεμβατικές και μεταστατικό φαινότυπο σε ένας αριθμός των συμπαγών όγκων. Κατά συνέπεια, legumain έχει προταθεί ως προγνωστικός δείκτης για ορισμένες μορφές καρκίνου, και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο. Παρ ‘όλα αυτά, λεπτομέρειες για το πώς προχωράει legumain κακοήθη εξέλιξη μαζί με την ρύθμιση της πρωτεολυτική δράση του είναι ασαφής. Στην παρούσα εργασία, legumain έκφραση εξετάστηκε σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές. Ουσιαστικές διαφορές σε ποσότητες των θετικών και των δραστικών μορφών legumain, μαζί με διακριτά ενδοκυτταρική σχήματα κατανομής, παρατηρήθηκαν σε HCT116 και τα κύτταρα SW620 και τις αντίστοιχες υποδόρια ξενομοσχεύματα. Legumain πιστεύεται ότι βρίσκεται και η επεξεργασία για την ενεργή μορφή της κατά κύριο λόγο στις ενδο-λυσοσώματα? Ωστόσο, η υποκυτταρική κατανομή παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Με την ανάλυση υποκυτταρικά κλάσματα, ένα πρωτεολυτικά δραστική μορφή της legumain βρέθηκε στον πυρήνα του δύο κυτταρικές σειρές, εκτός από την κανονική ενδο-λυσοσωμική παραμονής.

Επί τόπου

αναλύσεις legumain έκφρασης και δραστικότητας επιβεβαίωσαν την ενδο-λυσοσωμική και πυρηνική εντοπισμοί σε καλλιεργημένα κύτταρα και, το σημαντικότερο, επίσης σε τομές από ξενομοσχεύματα και βιοψίες από ασθενείς με καρκίνο του παχέος. Στις κυτταρικές σειρές HCT116 και SW620 πυρηνική legumain βρέθηκε να αποτελούν περίπου το 13% και το 17% του συνολικού legumain, αντίστοιχα. Σε ομοιότητα με προηγούμενες μελέτες σχετικά με την πυρηνική παραλλαγές που σχετίζονται με πρωτεασών κυστεΐνης, legumain φάνηκε να επεξεργαστεί ιστόνης H3.1. Η ανακάλυψη των εντοπισμένων πυρηνικών legumain εγκαινιάζει μια εντελώς νέα αρένα των legumain βιολογίας και των λειτουργιών του καρκίνου

Παράθεση:. Haugen MH, Johansen ΗΤ, Pettersen SJ, Solberg R, Brix Κ, Flatmark K, et al. (2013) Πυρηνική Legumain Δραστηριότητα στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (1): e52980. doi: 10.1371 /journal.pone.0052980

Επιμέλεια: Ματθαίος Bogyo, το Πανεπιστήμιο του Stanford, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιουνίου, 2012? Αποδεκτές: 22 Νοέμ 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Haugen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει γενναιόδωρα χρηματοδοτήθηκε από τη Νοτιοανατολική περιφερειακές υγειονομικές αρχές [Hso, # 2011142], www.helse-sorost.no? Το Νορβηγικό Συμβούλιο Έρευνας στο πλαίσιο του Προγράμματος Λειτουργική Γονιδιωματική [Φούγκα, # 158954 /S10], www.forskningsradet.no/fuge? Søren και Jeanette Bothners κληρονομιά και η Νορβηγική Εταιρεία Καρκίνου [# PR-2006-0272], www.kreftforeningen.no? Το Πανεπιστήμιο του Όσλο? Anders Jahres θεμέλιο για την Προώθηση της Επιστήμης? Astrid και Birger Ίδρυμα Torsteds? και το Ίδρυμα Νάνσεν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Legumain, ή AEP (ασπαραγίνυλο ενδοπεπτιδάση), ανήκει στην πρωτεάση κυστεΐνη οικογένεια C13 στο CD γενιά, σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Merops πεπτιδάσης [1]. Ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά στην φασόλια [2] και απροσδόκητη επιτυχία του αίματος (

Schistosoma mansoni

) [3] πριν από Τσεν και οι συνεργάτες του περιέγραψαν την έκδοση των θηλαστικών, το 1997 [4]. Η πρωτεάση θηλαστικών είναι σαφώς ομόλογη με legumain από είδη μη-θηλαστικών και τη διατήρηση κατά μήκος της εξελικτικής γενεαλογία δείχνει προφανώς λειτουργική σημασία. Το ανθρώπινο προ-ένζυμο του 433 αμινοξέα υφίσταται πολλές διαδοχικές διασπάσεις τόσο Ν- και C-τερματικά, εκ των οποίων μερικά απαιτούν όξινο ρΗ, πριν φτάσει στην ώριμη μορφή ενεργού ενζύμου. Η διαδικασία ωρίμανσης είναι μερικώς αυτοκαταλυτική, αλλά εξαρτάται επίσης από άλλα πρωτεολυτικά ένζυμα τα οποία, μαζί με την πλήρη κατανόηση της διαδικασίας ενεργοποίησης, δεν έχουν χαρακτηριστεί πλήρως [5] – [7]. Η δραστική πρωτεάση δείχνει πολύ συγκεκριμένη προτίμηση για υδρόλυση υποστρώματος Ο-τερματικώς προς ασπαραγίνη και σε κάποιο βαθμό μετά το ασπαρτικό οξύ υπό περισσότερο όξινες συνθήκες. Οι πιο ισχυροί ενδογενείς αναστολείς της legumain είναι Κυστατίνη E /M και κυστατίνη C [8], [9], ενώ το κλασικό χημικό αναστολέα πρωτεασών κυστεΐνης, η ένωση Ε64, δεν επηρεάζει legumain δραστηριότητα [4].

υπάρχουν αρκετές αναφορές legumain είναι υπερ-εκφράζεται σε έναν αριθμό στερεών όγκων (π.χ. παχέος εντέρου και καρκίνου του μαστού), και αυτό έχει επίσης συσχετιστεί με μια πιο επεμβατική και μεταστατικό φαινότυπο [10] – [12]. Πρόσφατα, έχουμε διαλογή ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών μελανώματος και διαπίστωσε ότι legumain εκφράστηκε και ενεργός στις περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε [13]. Σε φυσιολογικούς ιστούς, legumain είναι πιό κυρίως εκφράζεται στο πλακούντα, νεφρό και σπλήνα [10]. Legumain knock-out ποντίκια γεννιούνται υγιή και γόνιμα, αλλά εμφανίζουν μειωμένο σωματικό βάρος, παρεκκλίνουσα ενδο-λυσοσώματα με ανάπτυξη της νεφρικής ανεπάρκειας και εξωμυελική αιμοποίηση στο σπλήνα [14] – [16].

Πρόσφατα έχει δείξει ότι legumain μπορεί να εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανεξάρτητη από την δραστηριότητα ενδοπεπτιδάσης [17]. Επιπλέον, legumain έχει καταδειχθεί ότι ενεργοποιούν προΜΜΡ-2, η οποία μπορεί να εξηγήσει εν μέρει την παρατηρούμενη συσχέτιση μεταξύ legumain έκφρασης και μεταστατικό δυναμικό [18]. Η αυστηρή εξειδίκευση υποστρώματος σε συνδυασμό με την υπερ-έκφραση σε διάφορους τύπους όγκων έχει κίνητρο εκμετάλλευση legumain σαν ένας ενεργοποιητής προ-φάρμακο στη θεραπεία του καρκίνου, για παράδειγμα με την προσθήκη ενός διασπάσιμο πεπτιδική αλυσίδα στη δοξορουβικίνη ή αουριστατίνη [10], [19] και τη στοχοθέτηση των φαρμακευτικές ενώσεις χρησιμοποιώντας μια legumain αναστολέα ενζύμου [20]. Άλλες γνωστές βιολογικές λειτουργίες του legumain περιλαμβάνουν αυτοφαγικά-λυσοσωμική επεξεργασία του ηπατοκυτταρικού πρωτεϊνών [21], την επεξεργασία των αντιγόνων για MHC τάξης παρουσίαση II [22], και η ωρίμανση στον υποδοχέα Toll-όπως σηματοδότηση [23].

Σε αυτό το μελέτη, legumain έκφρασης και πρωτεολυτική δραστηριότητα εξετάστηκαν σε δύο κυτταρικές σειρές ορθοκολικού καρκινώματος (CRC), HCT116 και SW620. Αξιοσημείωτες διαφορές στη δραστικότητα ταυτοποιήθηκαν αρχικά και χρησιμοποιήσαμε περαιτέρω αυτές οι κυτταρικές σειρές να εξεταστούν legumain διανομής και δραστηριότητα σε υποκυτταρικά επίπεδα. Μεγάλο ενδιαφέρον και μάλλον μη αναμενόμενη, η πυρηνική πρωτεολυτική ενεργός legumain αποκαλύφθηκε στις δύο κυτταρικές σειρές εκτός από την αναμενόμενη ενδο-λυσοσωμική εντόπιση. Αυτά τα αποτελέσματα περαιτέρω αναγνώρισε με ανοσοφθορισμό, ανοσοϊστοχημεία και

in situ

μετρήσεις δραστηριότητα σε καλλιεργούμενα κύτταρα και ξενομοσχευμάτων, καθώς επίσης και τεκμηριώνονται σε ανθρώπινο ιστό του όγκου CRC. Τέλος, legumain έδειξε να διασπά πρωτεολυτικά ιστόνης H3.1

in vitro

αποκαλύπτοντας μια πιθανή λειτουργική επιπτώσεις της πυρηνικής τοπική legumain δραστηριότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, ξενομοσχεύματα και CRC βιοψίες

RKO, CO205, SW48, ΟοΙο320ϋΜ, ΗΤ29, SW620 και HCT116 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). KM20L2 και HCC2998 (DCTD όγκου /Κυτταρική Γραμμή Repository) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Michael R. Boyd (Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Frederick, MD, USA), καθώς και LS174T [24] και TC7 [25] κυτταρικές σειρές από τον Dr. Richard Χάμελιν (INSERM, Παρίσι, Γαλλία). ταυτότητα γραμμή κυττάρων ελέγχθηκε από σύντομη ανάλυση διαδοχική επανάληψη για την HCT116 και κυτταρικές σειρές SW620. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε RPMI 1640 (BioWhittaker) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone), 20 mM Hepes (BioWittaker) και 2 mM Glutamax (Invitrogen). Όλες οι κυτταρικές σειρές συνήθως βρέθηκαν αρνητικά για

Mycoplasma

. Υποδόρια ξενομοσχεύματα από HCT116 και SW620 καθορίστηκαν με ένεση 1 * 10

6 κύτταρα σε αμφότερες τις πλευρές των τοπικά εκτρέφονται θηλυκών BALB /c γυμνά (πυ /ηυ) ποντικούς [26]. Στέγαση και όλες τις διαδικασίες που αφορούν τα ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκε από το Νοσοκομείο Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης των Ζώων του Πανεπιστημίου του Όσλο, σε συμμόρφωση με τις κατευθυντήριες γραμμές Αρχής Έρευνας Norwegian των ζώων για την καλή διαβίωση των ζώων. Ανθρώπινα βιοψίες ελήφθησαν από ασθενείς κατά τη διάρκεια της πρωτοβάθμιας χειρουργική επέμβαση θεωρείται ή επαληθεύονται CRC. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Περιφερειακή Επιτροπή Δεοντολογίας της νότιας Νορβηγίας (# Σ-98080) και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους ασθενείς.

κυτταρολύματα, κλιματισμό συγκομιδή των μέσων ενημέρωσης και υποκυτταρικών εμπλουτισμού

Για να αποκτήσει κυτταρολύματα για ανοσοκηλίδωση, υπο-συρρέουσες καλλιέργειες αποσυνδέθηκαν χρησιμοποιώντας EDTA (BioWittaker) και πλύθηκαν 3 φορές σε παγωμένο PBS (BioWittaker) πριν ψυχρό ρυθμιστικό λύσης (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 0,1% ΝΡ-40 ) με το μίγμα αναστολέα πρωτεάσης CompleteMini (Roche Diagnostics) προστέθηκε σε ξηρό κυτταρικά ιζήματα και αφέθηκε σε πάγο για 15 λεπτά. Τέλος, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους και φυγοκεντρήθηκαν στις 15.000 χ g για 15 λεπτά για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Σε δείγματα για μετρήσεις δραστικότητας ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (100 mM κιτρικό νάτριο, 1 mM δινάτριο EDTA, 1% η-οκτυλ-βήτα-ϋ-γλυκοπυρανοσίδη, ρΗ 5,8) χρησιμοποιήθηκε χωρίς αναστολείς πρωτεάσης. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ BCA (δικιγχονινικού οξύ) δοκιμασία πρωτεΐνης (Pierce) ή δοκιμασία Bradford [27]. Όλα τα δείγματα φυλάχθηκαν στους -80 ° C. Ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων αποκτήθηκε με σπορά 7,5 * 10

5 κύτταρα σε πλάκες 6 φρεατίων και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα σε μέσο που περιέχει ορό, στη συνέχεια πλένονται και καλλιεργούνται για άλλες 24 ώρες σε 1 ml μέσο χωρίς ορό. Το ρυθμισμένο μέσο άνευ ορού υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 15,000 χ g για 5 λεπτά και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Πρωτεΐνες από το ρυθμισμένο μέσο συμπυκνώθηκαν με προσθήκη 4 όγκων παγωμένου ακετόνη, αφήνοντας τα δείγματα σε πάγο για 15 λεπτά και φυγοκέντρηση στους 4 ° C και 12,000 χ g για 10 λεπτά. Υγρό απομακρύνθηκε και στέγνωσε στον αέρα ίζημα σε θερμοκρασία δωματίου πριν την εκ νέου διάλυση σε ρυθμιστικά διαλύματα για ανοσοκηλίδωση ή δραστηριότητας μετρήσεις, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που ακολούθησαν. Υποκυτταρική εμπλουτισμό λυσοσώματα και πυρήνων πραγματοποιήθηκε με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας σύμφωνα με Brix

et al.

[28] με τον διαχωρισμό των κλασμάτων επαναλήφθηκε δύο φορές για την εξασφάλιση υψηλής καθαρότητας. Η λύση ρυθμιστικά διαλύματα ρυθμίστηκαν σε ρΗ 5.0 και 7.4 για λυσοσωμική και πυρηνικά κλάσματα, αντίστοιχα. Όλα τα άλλα υποκυτταρικών εμπλουτισμός έγινε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το υποκυτταρικά Kit Πρωτεΐνη κλασματοποίηση για καλλιεργημένα κύτταρα (Thermo Scientific) στις 5 * 10

6 κύτταρα HCT116 και 10 * 10

6 SW620 κύτταρα να αποκτήσουν ίσους όγκους σφαιριδίων κυττάρων ως αφετηρίας υλικό σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών, και με την προσθήκη πλύση του ιζήματος μεταξύ όλων των κλασμάτων για την εξασφάλιση υψηλής καθαρότητας.

Ανοσοκηλίδωση και ELISA

τα δείγματα έτρεξαν σε πηκτώματα NuPAGE 4-12% ( Invitrogen) στα 150 V και θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας το παρεχόμενο MES-buffer (που περιέχει SDS) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών, και στη συνέχεια, κηλιδώθηκε επί 0,45 μm πολυβινυλιδενο φθοριδίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore Corp.) στο ότι το κλείδωμα X-κυττάρων ( Invitrogen) στους 4 ° C για μία ώρα σε 20% μεθανόλη που περιέχει Tris-Glycine ρυθμιστικό. Την ποιότητα της μεταφοράς πρωτεΐνης επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας Amidoblack για τζελ 1D. Οι μεμβράνες στη συνέχεια δεσμεύτηκαν για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε 5% ξηρό γάλα TBST-ρυθμιστικό διάλυμα (Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα με Tween 20) και ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε 5% TBST ρυθμιστικό ξηρό γάλα για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, στην ακόλουθη Οι συγκεντρώσεις: legumain κατσίκας πολυκλωνικό αντίσωμα (pAb) (1:1000? Ε & amp? D Systems? AF2199), καθεψίνη L κατσίκα pAb (1:500? Ε & amp? D Systems? AF952), καθεψίνη pAb Β κουνελιού (1:10000? Calbiochem? 219408), κυστατίνη /Μ pAb κατσίκα (1:500? R &? D Systems? AF1286), α-τουμπουλίνης μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (mAb) (1:5000? Calbiochem? cp06), αρυλοσουλφατάσης Β (ARSB) mAb ποντικού (1 :500, R & amp? D Systems? MAB4415), πρωτεΐνη λυσοσωμικής μεμβράνης σχετιζόμενη (λάμπα-2) mAb ποντικού (1:250, Santa Cruz, SC-18822), πρωτεΐνη ιδιαιτερότητα 1 (SP1) κουνελιού pAb (1:10000, Millipore , 07-645), και ιστόνης Η3 mAb κουνελιού (1:10000, Millipore, 05-928). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 φορές σε ρυθμιστικό χωρίς ξηρό γάλα, ανιχνεύθηκαν με ΗΚΡ-δευτερεύον (υπεροξειδάση κρένου) αντίσωμα (1:5000? DakoCytomatation) ειδικά έναντι αντίστοιχων ειδών για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και μετέπειτα πλύθηκαν 3 φορές. Ανάπτυξη διεξήχθη χρησιμοποιώντας SuperSignal West Dura Extended Διάρκεια υπόστρωμα (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών, οπτικοποιούνται για την ιατρική φιλμ ακτίνων Χ (Kodak ή Thermo Scientific) και μετατρέπονται σε TIFF χρησιμοποιώντας ένα επίπεδο σαρωτή φιλμ (Canon). Για πυκνομετρία αναλύει το φιλμ σαρώθηκε σε ένα βαθμονομημένο πυκνόμετρο GS-800 (Bio-Rad) και ποσοτικοποιούνται με QuantityOne v.4.6.5 (Bio-Rad). Όλες οι μετρούμενες ποσότητες ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον αντίστοιχο έλεγχο φόρτωσης (α-τουμπουλίνης). Μετρήσεις ELISA της ανθρώπινης συνολικού legumain (R &? D Systems, DY4769) από τρεις ξεχωριστές απομονώσεις πρωτεΐνης διεξήχθησαν εις διπλούν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή

Μετάλλαξη αναλύσεις

DNA από το HCT116 κυτταρικές γραμμές. και SW620 απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen).

LGMN

(ENSG00000100600) εξόνιο 12 (ENSE00000808693) στη συνέχεια δημιουργήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ειδικά προς τα εμπρός (5′-agaggctggacttggggtat-3 ‘) και ανάστροφα (5′-gcttccgttacatggaggac-3’) εκκινητές. Οι αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές και το Dyenamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham) όπως περιγράφεται από τον προμηθευτή. Τα δείγματα υποβλήθηκαν τελικά να τοποθετήσει καθαρίσει, διαχωρίστηκαν με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο προσδιορισμού αλληλουχίας MegaBACE1000 (Amersham).

Legumain δραστηριότητα, ανοσοφθορισμό και ανοσοϊστοχημεία

Legumain δραστικότητα σε προϊόντα λύσης κυττάρου και υποκυτταρικό κλάσματα μετρήθηκε εις τριπλούν με διάσπαση του υποστρώματος Z-Ala-Ala-Asn-NHMec (Τμήμα Βιοχημείας, Πανεπιστήμιο του Cambridge, UK) όπως περιγράφεται προηγουμένως [4], [29]. Εν συντομία, κυτταρικό λύμα (20 μΐ) προστέθηκε σε μαύρο μικροπλακίδια 96 φρεατίων (Νο 3915? Costar, Corning). Μετά την προσθήκη 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος και 50 μΐ διαλύματος υποστρώματος (τελική συγκέντρωση 10 μΜ) σε είτε ρΗ 5.8 ή 7.4, μια κινητική μέτρηση βασίζεται στην αύξηση του φθορισμού επί 10 λεπτά διεξήχθη στους 30 ° C σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας (Wallac Victor 3 , PerkinElmer) και παρουσιάζονται ως μονάδες ενζύμου όπου μια μονάδα δραστικότητας ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που απελευθερώνει 1,0 μmol του προϊόντος /min κάτω από τις πρότυπες συνθήκες που περιγράφονται. Ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε αποστειρωμένες γυάλινες πλάκες σε πλάκες των 6-φρεατίων στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν σε 4% PFA και κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Τπίοη-Χ100, πριν από χρώση με legumain πρωτογενές αντίσωμα (1:100) και ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με Alexa488 (Invitrogen, 1:200, Α-11034) σε ρυθμιστικό που περιέχει 0.1% BSA. πλάκες ελέγχου παρασκευάστηκαν χωρίς την προσθήκη του πρωτογενούς αντισώματος. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DRAQ5 ™ (Biostatus) και καλυπτρίδες τοποθετούνται σε Mowiol σε 200 mM Tris-HCI, ρΗ 8.5 (Hoechst) πριν παρατήρηση επί LSM 510 σάρωσης λέιζερ συνεστιακή σύστημα απεικόνισης ή LSM710 (Carl Zeiss). arithmetics εικόνας διεξήχθησαν σύμφωνα με Jedeszko

et al.

[30] χρησιμοποιώντας Image J [31]. Η ανάλυση των εντοπισμένων πυρηνικών legumain έγινε στις 5 z-στοίβες καθένα αποτελείται από 25-35 τμήματα και το καθένα περιέχει 30-40 κύτταρα σταματούν χωρίς κορεσμένα pixels.

Επί τόπου

δραστηριότητα των legumain σε κύτταρα και ιστικές τομές από ξενομοσχεύματα μετρήθηκε με διάσπαση του υποστρώματος Suc-Ala-Ala-Asn-NHNapOME (Τμήμα Βιοχημείας, Πανεπιστήμιο του Cambridge, UK) όπως περιγράφηκε προηγουμένως και επαληθεύεται ιστού από legumain ποντίκια knock-out [32], [33] χρησιμοποιώντας τελικές συγκεντρώσεις 1 mM 5-νιτρο-σαλικυλαλδεϋδη, 0.5 mM υπόστρωμα και παρέχονται με ϋΑΡΙ (Invitrogen) για να απεικονίσει πυρήνες. Τα κύτταρα τοποθετημένα σε OCT ένωση (Tissue-Tek) και ξενομοσχεύματα κόπηκαν σε τομές κρυοστάτη (6 μm) και επωάστηκαν με διάλυμα δοκιμασίας 50 μΐ για 10-15 λεπτά στους 37 ° C πριν την παρατήρηση μέσω λέιζερ σάρωσης LSM710 συνεστιακή σύστημα απεικόνισης ή LSM 510, αντίστοιχα, και με τη χρήση της μονάδας συν-εντοπισμό του Ζεν λογισμικού 2009 για ψευδο-χρωματισμού (λευκό). πλάκες ελέγχου παρασκευάσθηκαν με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος χωρίς υπόστρωμα, η εποξική αναστολέας Ε64 (Sigma) σε τελική συγκέντρωση 1 μΜ ή ανθρώπινη ανασυνδυασμένη κυστατίνη E /M (R &? D Systems, 1286-ΡΙ) σε μια τελική συγκέντρωση 0,1 μΜ. Η ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε σε σταθεροποιημένα με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα ιστού από υποδόρια ξενομοσχεύματα αναπτύχθηκαν και τα ανθρώπινα βιοψίες CRC, χρησιμοποιώντας την legumain αντίσωμα σε αραίωση 1:300 με τη μέθοδο της βιοτίνης-στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Goat-IgG χρώσεις ελέγχου ισοτύπου διεξήχθησαν στους παρόμοια συγκέντρωση σε τομές ιστών όγκου ξενομοσχεύματος και CRC

πρωτεολυτική διάσπαση ιστόνης H3.1

Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη legumain (R &?. Συστήματα D, 2199-CY ) ήταν auto-ενεργοποιημένα στους 37 ° C για 2 ώρες σε όξινο ρυθμιστικό (50 mM NaOAc, 100 mM NaCl, ρΗ 4,0) σε συγκέντρωση 0,1 μg /μl. legumain βοοειδών απομονώθηκε από νεφρό, όπως περιγράφεται από Yamane

et al.

[35]. Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη ιστόνη H3.1 (New England BioLabs, M2503S) προστέθηκε σε ρυθμιστικό δοκιμασίας 50 μΙ (50 mM MES, 250 mM NaCl, ρΗ 5,0 ή ρΗ 7,0) με ή χωρίς κυστατίνη /Μ και με την τελική προσθήκη είτε ενεργή ανθρώπινη ή βοοειδών legumain. Κάθε μίγμα επωάζεται στους 37 ° C για 2 ώρες με ανακίνηση.

Αποτελέσματα

Legumain και καθεψίνη L είναι ετερογενώς εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές CRC

Τα υλικά λύσεως από ένα πάνελ CRC κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε διαχωρισμό με PAGE και στυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνες PVDF. Με διαδοχικές ανίχνευση με πολυκλωνικά αντισώματα, το συνολικό ποσό και διάφορες ώριμες μορφές legumain (άνω πάνελ, Σχ. 1 και το Σχ. S2A) και καθεψίνη L (μεσαίο πλαίσιο, Σχ. 1 και στο κάτω μέρος του πίνακα, Σχ. S2A) έγιναν ορατά. Legumain φάνηκε να είναι παρούσα σε δύο μορφές μοριακή μάζα περίπου 56 και 36 kDa (βέλη). Οι κυτταρικές γραμμές CRC εμφανίζεται ένα ευρύ φάσμα στο συνολικό ποσό των legumain, και επίσης σε σχετικές ποσότητες της υποτιθέμενης προ-μορφή 56 kDa και την ενεργό ώριμη μορφή της 36 kDa, η οποία και οι δύο ήταν ευαίσθητα σε ρύθμιση προς τα κάτω από ένα legumain ειδική siRNA (Σχ. S1). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη προ-legumain (rhLeg, 5 ng) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η καθεψίνη L ήταν παρούσα σε περισσότερες κυτταρικές σειρές αν και τα υψηλότερα επίπεδα παρατηρήθηκαν σε RKO, TC7 και HCT116. Στις δύο τελευταίες, οι οποίες φιλοξενούν μεγάλες ποσότητες ώριμου legumain, το πλέον κυρίαρχο καθεψίνη L ζώνη αντιστοιχούσε στην βαριά αλυσίδα 25 kDa της δραστικής μορφής δύο αλυσίδων (βέλος). Σε αντίθεση, η κυτταρική γραμμή RKO έδειξαν ταυτόχρονη υψηλή έκφραση του ανενεργού (30 kDa, μονής αλυσίδας) καθεψίνη L και ένα χαμηλότερο επίπεδο δραστικών legumain, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι πρωτεάσες κυστεΐνης υποβάλλεται σε αμοιβαία ενεργοποίηση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές.

ανοσοστυπώματα προϊόντων λύσης κυττάρου από ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών CRC επιδείξει υψηλή μεταβλητότητα στο συνολικό ποσό των legumain και καθεψίνη L, και επίσης με την παρουσία των διαφόρων ώριμων μορφών. HCT116 και SW620 κύτταρα ήταν ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα καθώς παρουσιάζουν αμοιβαία αποκλειόμενα υψηλή ποσότητα του δραστικού (36 kDa) και ανενεργά προ-μορφή (56 kDa) της legumain, αντίστοιχα. Uncut ανοσοκηλίδων (Σχ. S2A).

Η

Το κυτταρικές σειρές HCT116 και SW620 δείχνουν αποκλίνουσες legumain δραστηριότητα

κύτταρα HCT116 εμφανίζεται κυρίως την ώριμη 36 kDa μορφή της legumain, ενώ SW620 έδειξε επίσης σημαντική ποσότητες του 56 kDa προ-μορφή (σχήμα 1 και TL?. Εικ. 2Β) [6]. Κυτταρολύματα από αυτούς τους δύο κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν περαιτέρω για την ικανότητά τους να διασπούν μια legumain συγκεκριμένο υπόστρωμα. Αυτές οι μετρήσεις δραστηριότητας αποκάλυψε μια συνεπής αντιστοιχία μεταξύ της παρατηρούμενης ένταση της ζώνης 36 kDa και legumain δραστηριότητα συνολικά προϊόντα λύσης (TL? Εικ. 3Β). Επιπλέον, HCT116 και SW620 κύτταρα που κατεργάζονται με siRNA ειδικό για legumain έδειξε μια μείωση 70-90% στο legumain δραστικότητα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έχοντας συσταθεί ενδείξεις για τις διαφορές στην ποσότητα του δραστικού legumain σε HCT116 και SW620 ήταν ενδιαφέρον να προσδιοριστεί εάν αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί σε μεταλλάξεις σε Asn323 που βρίσκεται στο εξόνιο 12, το οποίο έχει αξιωθεί αναγκαία για τη διάσπαση του προ-ένζυμο στην ενεργό μορφή [5], [6], [36]. Ωστόσο, ο προσδιορισμός αλληλουχίας δεν έδειξαν μεταλλάξεις στο

LGMN

αλληλουχία νουκλεοτιδίων που αντιστοιχεί στη θέση αναγνώρισης διάσπασης σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν φαίνονται), και δεν μπορούσε να εξηγήσει την παρατηρούμενη διαφορά στην δραστικότητα της πρωτεάσης. Επιπλέον, κυστατίνης /Μ έχει αποδειχθεί ως η πλέον ισχυρός ενδογενής αναστολέας του legumain και έκφραση αυτής της πρωτεΐνης, συνεπώς διερευνηθεί. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι κυτταρικοί και εκκρίνεται επίπεδα κυστατίνης /Μ βρέθηκαν να είναι αρκετά διαφορετική μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Σε HCT116, δύο μορφές (14 και 17 kDa) της κυστατίνης /Μ βρέθηκαν σε ρυθμισμένα μέσα (CM? Εικ. 2Β), με πιο μέτρια ποσότητα και κυρίως με τη μορφή 14 kDa στο συνολικό προϊόν λύσης κυττάρου (TL). Σε αντίθεση, SW620 εκφράζεται κανένα ανιχνεύσιμες ποσότητες κυστατίνης /Μ ούτε εκκρίνεται ούτε ενδοκυτταρική.

(Α) ανοσοστυπώματα του legumain σε λυσοσωμικών (L) και πυρηνική (Ν) από κλάσματα εμπλουτισμένα HCT116 και SW620 κύτταρα χρησιμοποιώντας κλίση πυκνότητας φυγοκέντρηση. Όλες οι λωρίδες φορτώθηκαν με 15 μα ολικής πρωτείνης από κάθε κλάσμα. έλεγχοι καθαρότητα των υποκυτταρικών κλασμάτων αξιολογήθηκαν με βαφή για ARSB (διαλυτό λυσοσωματικής πρωτεΐνης) και SP1 (παράγοντας πυρηνικής μεταγραφής). (Β) ανοσοστυπώματα του legumain (άνω πάνελ), κυστατίνη /Μ (δεύτερη πάνελ) και καθεψίνη L (τρίτη πάνελ) σε εμπλουτισμένο υποκυτταρικά διαμερίσματα που απομονώνονται από HCT116 και SW620 κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ: κυτοσόλιο (C), οι μεμβράνες /λυσοσώματα ( M /L), η πυρηνική διαλυτό (NS), πυρηνική χρωματίνη δεσμευμένο (NC), το συνολικό προϊόν λύσης (TL) και ρυθμισμένα μέσα (CM). Όλες οι λωρίδες φορτώθηκαν με 15 μα ολικής πρωτείνης από κάθε κλάσμα, εκτός ρυθμισμένων μέσων όπου φορτώθηκε πρωτεΐνες καταβυθίζονται από 1 ml. έλεγχοι καθαρότητας των διαφορετικών υποκυτταρικά κλάσματα εκτιμήθηκαν με βαφή για α-τουμπουλίνης (κυτοσολική πρωτεΐνη), ARSB (διαλυτή πρωτεΐνη λυσοσωματική), φανός-2 (συνδεδεμένη με μεμβράνη πρωτεΐνη λυσόσωμα), SP1 (παράγοντας πυρηνικής μεταγραφής) και ιστόνη Η3 (πυρηνική χρωματίνη συνδεδεμένη με τις πρωτεΐνες). Uncut ανοσοστυπώματα του legumain και καθεψίνης L (Εικ. S2C).

Η

(Α) πρωτεολυτική δραστικότητα του legumain προσδιορίζεται με διάσπαση του υποστρώματος (Ζ-Ala-Ala-Asn-NHMec) σε σχέση με τη συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του κάθε υποκυτταρικό διαμέρισμα του HCT116 (διακεκομμένη μπάρες) και SW620 (καρό μπάρες) τα κύτταρα μετά φυγοκεντρήσεις βαθμίδας πυκνότητας. Οι λυσοσωμικές και πυρηνικά κλάσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν σε ρΗ 5,8 και 7,4, αντίστοιχα, επιδεικνύοντας πρωτεολυτική δραστικότητα του legumain τόσο λυσοσωμικών και την πυρηνική κλάσματα δύο κυτταρικές σειρές σε αμφότερες τις συνθήκες ρΗ, αν και υψηλότερα στην λυσοσωμιακό διαμέρισμα αναλύθηκε σε ρΗ 5.8. (Β) Η πρωτεολυτική δραστηριότητα των legumain μετρήθηκε σε ρΗ 5.8 σε υποκυτταρικά κλάσματα που παρασκευάζονται με εμπορικό κιτ βρέθηκε να είναι υψηλότερη στα κλάσματα M /L, αλλά ήταν επίσης σαφώς παρούσα στα κλάσματα NS και παρατηρήθηκαν με μικρές μόνο δραστικότητα στα κλάσματα C και των δύο κυτταρικών σειρών. Εξωκυτταρική legumain δεν επέδειξε καμία δραστηριότητα σε οποιαδήποτε κυτταρική σειρά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). (C) Συνολική legumain ποσά (προ- και δραστική μορφή) μετρήθηκαν με ELISA σε υποκυτταρικά κλάσματα (απομονωθεί χρησιμοποιώντας εμπορικό κιτ) και υπολογίζεται σε σχέση με τη συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη σε κάθε κλάσμα ήταν επίσης υψηλότερα στα κλάσματα M /L, ακόμη σαφώς παρούσα στο κλάσμα NS.

η

Ενεργά legumain εντοπίζεται στην ενδο-λυσοσωμική και πυρηνικά διαμερίσματα

Legumain θεωρείται συνήθως μια πρωτεΐνη στοχευμένη και να διαμένουν στην ενδο-λυσοσώματα, και έχει επίσης αναφερθεί να εκτελέσει σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες μέσα σε αυτό το εξειδικευμένο διαμέρισμα [22], ενώ η διανομή και τα χαρακτηριστικά της σε άλλες υποκυτταρικά διαμερίσματα δεν έχει διευκρινιστεί. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αυτή η χρησιμοποιήσαμε δύο μεθόδους για την απομόνωση και τον εμπλουτισμό πρωτεϊνών από υποκυτταρικά διαμερίσματα, το ένα να βασίζεται σε φυγοκέντρηση κλίσης πυκνότητας σε ρυθμιστικό διάλυμα σακχαρόζης και το άλλο είναι ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ απομόνωσης υποκυτταρική. Για να εξεταστεί η διανομή του legumain, ανοσοκηλίδωση διεξήχθη σε 15 μg συνολικού λύματος πρωτείνης από κάθε κλάσμα εμπλουτισμένο υποκυτταρικό, εκτός από την συνολική κυτταρικό λύμα και της αντίστοιχης ρυθμισμένο μέσο αναπτύξεως (Σχ. 2). Αυτό επέτρεψε επίσης για τον έλεγχο της καθαρότητας των κλασμάτων με τη χρήση διαφόρων πρωτεϊνών θεωρείται περιορισμένης διανομής, που δείχνει υψηλό εμπλουτισμό του κάθε διαμερίσματος και με σχεδόν καμία ανιχνεύσιμη διασταυρούμενη μόλυνση (Σχ. 2, διαμέρισμα-ειδικούς δείκτες εμφανίζονται παρακάτω μαύρες γραμμές). Σε αμφότερες τις υποκυτταρική μεθόδους εμπλουτισμού η 36 kDa ενεργός legumain ήταν παρούσα σε σημαντικές ποσότητες στο λυσοσωμική (L) και της μεμβράνης /λυσοσωμιακό (M /L) κλάσματα, όπως επίσης και στον πυρηνικό (Ν) και της πυρηνικής διαλυτό (NS) κλάσματα τόσο και οι δύο κυτταρικές σειρές. Ήταν πάλι αντιληπτό ότι η συνολική HCT116 σε σύγκριση με κύτταρα SW620 περιείχε ένα χαμηλότερο επίπεδο του 56 kDa προ-μορφή σε όλα τα υποκυτταρικά κλάσματα, επιβεβαιώνοντας τις παρατηρήσεις που έγιναν από συνολικά κυτταρολύματα (Εικ. 1 και 2), ενώ ο prolegumain 56 kDa ήταν επίσης παρατηρήθηκαν στους πυρηνικούς κλάσματα στις δύο κυτταρικές σειρές. κύτταρα HCT116 εμφανίζονται επίσης μικρότερες ποσότητες από 36 legumain kDa στο κυτοσολικό (C) και της πυρηνικής χρωματίνης δεσμευμένο (NC) κλάσματα (Σχ. 2Β και Σχ. S2C, αριστερά μεσαία πλαίσια). Η 56 kDa προ-μορφή της legumain βρέθηκε να εκκρίνονται και να ανιχνευθούν σε ρυθμισμένα μέσα (CM? Εικ. 2Β), αλλά μόνο από HCT116. Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος ήταν η σαφής παρουσία του 36 kDa ενεργό legumain στα πυρηνικά κλάσματα από τις δύο κυτταρικές σειρές, εκτός από την αναμενόμενη παρουσία στα κλάσματα λυσοσωμικών. Επιπλέον, η υποκυτταρική εμπλουτισμός διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο εμπορικά διαθέσιμο κιτ απομόνωσης υποκυτταρικές (Qiagen), επίσης αποδεικνύουν την πυρηνική εντόπιση του ώριμου 36 kDa legumain (Εικ. S2B). Όσον αφορά την ενδογενώς εκφρασμένη αναστολέα κυστατίνη /Μ, ίχνη μόνο ποσότητες της μορφής των 14 kDa παρατηρήθηκε τόσο στην M /L και NS κλάσμα HCT116. Τέλος, υποκυτταρική κατανομή της καθεψίνης L αξιολογήθηκε επίσης και αυτό πρωτεάσης βρέθηκε να είναι πολύ λιγότερο εμφανής σε SW620 σε σύγκριση με HCT116 κύτταρα (Σχ. 2Β και Σχ. S2C, κατώτερο πάνελ), όπως ήταν επίσης εμφανής σε συνολικά κυτταρολύματα (Σχ. 1 και 2Β). Σε HCT116 η υποτιθέμενη 25 kDa δραστική μορφή δύο αλυσίδων της καθεψίνης L [37] ήταν σαφώς παρούσα στο M /L και τα κλάσματα NS καθώς και σε TL και CM, αλλά επίσης σε κάποιο βαθμό στις C και NC κλάσματα. Παρά το γεγονός ότι υπάρχει σε δραστική μορφή στο CM, το κλάσμα αυτό έδειξε επίσης την προ-μορφή της καθεψίνης L δει από μια ισχυρή ζώνη περίπου 38 kDa. Η καθεψίνη L μορφή μονής αλυσίδας 30 kDa ήταν κυρίως παρούσες στα κλάσματα M /L και NS και των δύο κυτταρικών σειρών. Σε SW620, ασθενέστερη ζώνες της καθεψίνης L παρατηρήθηκαν μόνο σε M /L και τα κλάσματα NS καθώς και σε TL, και επίσης με ελαφρά παρουσία του προ-μορφής σε cm.

Τα διάφορα υποκυτταρικά κλάσματα από HCT116 και SW620 κύτταρα στην συνέχεια αναλύθηκαν για την ικανότητά τους να διασπούν πρωτεολυτικά μια legumain ειδικό πεπτίδιο υποστρώματος σε σχέση με τη συνολική ποσότητα των πρωτεϊνών που υπάρχουν σε κάθε κλάσμα μετρήθηκε. Σε λυσοσωματικής και της πυρηνικής κλάσματα διαχωρίστηκαν με βαθμίδες πυκνότητας σακχαρόζης, η δραστικότητα μετρήθηκε σε δύο ρΗ 5,8 και 7,4, αντίστοιχα, για να μιμούνται τις φυσιολογικές συνθήκες (Εικ. 3Α). Σε συνδυασμό με προηγούμενες μελέτες, τα κλάσματα λυσοσωμική κατέδειξαν υψηλή πρωτεολυτική δραστικότητα legumain, αλλά πιο απροσδόκητες οι πυρηνικές κλάσματα και των δύο κυτταρικών σειρών που μετράται σε ουδέτερο ρΗ έδειξε επίσης σημαντικές legumain δραστηριότητα. Στα υποκυτταρικά κλάσματα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το εμπορικό κιτ, πρωτεολυτική δραστικότητα της legumain μετρήθηκε σε ρΗ 5,8 ήταν επίσης υψηλότερα στην M /L (Εικ. 3Β) κλάσμα, όμως, σε αντιστοιχία με τα προηγούμενα αποτελέσματα, σημαντικές legumain δραστηριότητα βρέθηκε στα πυρηνικά κλάσματα και των δύο κυτταρικών σειρών, ιδίως τα διαλυτά κλάσματα (NS). Επιπλέον, legumain έκφραση στα υποκυτταρικά κλάσματα που λαμβάνονται με τη χρήση του εμπορικού κιτ αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ELISA σάντουιτς είναι ικανός να ανιχνεύει συνολικού legumain (δηλαδή αμφότερες οι προ- και δραστικές μορφές) (Σχ. 3C). Σε όλα τα κλάσματα παρατηρήθηκαν ανιχνεύσιμες ποσότητες legumain (σε σχέση με τη συνολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη σε κάθε κλάσμα), ενώ παρατηρήθηκαν τα υψηλότερα επίπεδα στην M /L και τα κλάσματα NS, όπως φαίνεται και από τα ανοσοαποτυπώματα (Εικ. 2Β). Μια μη αναμενόμενη αποτέλεσμα ήταν η ποσότητα και η δραστηριότητα των legumain στα υποκυτταρικά κλάσματα από 10 * 10

6 SW620 κύτταρα τα οποία μετρήθηκαν για να είναι περίπου διπλάσια σε κλάσματα κατασκευασμένα από 5 * 10

6 κύτταρα HCT116, αν και όλοι λωρίδες φορτώθηκαν με 15 μα πρωτεΐνης. Ωστόσο, συνολικά λύματα ολόκληρο το ποσό του legumain (προ και ώριμα-μορφή) ήταν σχεδόν ίσα, αλλά τα κύτταρα HCT116 είχαν υψηλότερη συνολική legumain δραστηριότητα στα συνολικά κυτταρολύματα που αντιστοιχεί στην παρατηρούμενη ποσότητα του δραστικού legumain στα ανοσοστυπώματα (Σχ. 2Β).

επί τόπου

διανομή legumain έκφρασης

για να εξετάσει legumain έκφραση

in situ

, HCT116 και SW620 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες διαφάνειες, ανοσοφθορισμό χρωματίστηκαν και οπτικοποιήθηκαν με χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας (Σχ. 4A-4D και το Σχ. S3A-S3b). Legumain κατανεμήθηκε κυρίως στην περιπυρηνική περιοχή, ενδεχομένως να υποδηλώνει majorly εντοπισμού στο

trans

-Golgi δίκτυο (TGN) και ενδο-λυσοσώματα, και πιο ευδιάκριτα στα κύτταρα HCT116 (Εικ. 4Α), ενώ στην κύτταρα SW620 legumain περιέχουν κυστίδια εμφανίστηκαν περισσότερο κατανεμημένη (Εικ. 4C). Τόσο HCT116 και SW620 εμφανίζεται επίσης legumain βρίσκονται στους πυρήνες των κυττάρων. Με την απεικόνιση μόνο της πυρηνικής εντοπισμένη legumain στα τρία ορθογώνια επίπεδα των κυττάρων, legumain παρατηρήθηκε να διανείμει περίπου σφαιρικές δομές, πιθανώς πυρηνίσκους, μέσα στους πυρήνες (Εικ. 4Β και 4D). Χρησιμοποιώντας αριθμητική εικόνα σχετικά με την οπτική φέτες από πέντε ανεξάρτητα z-στοίβες, που καθεμία περιέχει 30-40 ανοσοφθορισμό επισημασμένα κύτταρα, το μέσο ποσοστό των ενδοκυτταρικών legumain εντοπισμένη στον πυρήνα ενός κυττάρου εκτιμήθηκε σε 12,8% σε HCT116 και 16,5% σε SW620 (Σχ. 5). Επιπρόσθετη ανάλυση των δύο κυτταρικών γραμμών που καλλιεργούνται ως υποδόρια ξενομοσχεύματα σε ποντικούς αποκάλυψαν παρόμοια αποτελέσματα με την επισήμανση ανοσοφθορισμού όταν ανοσοϊστοχημικά βάφτηκαν για legumain (Εικ. 4Ε και 4F, και το Σχ. S3C-S3F), με HCT116 δείχνοντας έντονη κοκκοποιημένο χρώση ενώ SW620 έδειξε μια πολύ πιο διάχυτο πρότυπο χρώσης. Επιπλέον, σε ξενομοσχεύματα και από τις δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν legumain ετερογενής έκφραση, με έντονα χρωματισμένο περιοχές, πιθανώς νεκρωτικό ιστό. Πυρηνικού εντοπισμού ήταν πιο ορατό σε κύτταρα με τη συνολική υψηλή legumain έκφραση, αλλά σημεία της legumain χρώση ανιχνεύθηκαν επίσης μέσα πυρήνες στα ασθενέστερα χρωματισμένο κύτταρα (κίτρινα βέλη). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των τομές παραφίνης ιστού του όγκου από ασθενείς CRC, αποκάλυψε επίσης ετερογενής έκφραση legumain που ήταν εμφανής τόσο στα κύτταρα του όγκου και των γύρω στρωματικά κύτταρα (Σχ. 4G και το Σχ. S3G).