Αφηρημένο

Οι αναδυόμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα microRNAs που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Εδώ βρήκαμε ότι το miR-202-3p ήταν συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Η υπερέκφραση του miR-202-3p στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα ΜΚΝ-28 και BGC-823, αξιοσημείωτα κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επαγωγή απόπτωσης από τα δύο

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, η έκφραση Gli1 ήταν συχνά θετικά σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και αντιστρόφως συσχετίζεται με miR-133b έκφρασης. Έχουμε αποδείξει ότι η μεταγραφικού παράγοντα Gli1 ήταν ένας στόχος του miR-202-3p και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο ως μεσολαβητής των βιολογικών επιδράσεων των miR-202-3p σε καρκίνο του στομάχου. MiR-202-3p επίσης ανέστειλε την έκφραση του γ-κατενίνης και BCL-2. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το miR-202-3p μπορεί να λειτουργήσει ως ένα μυθιστόρημα καταστολέα όγκου σε καρκίνο του στομάχου και η δράση κατά των όγκων του μπορεί να αποδώσει την άμεση στόχευση και την αναστολή της Gli1

Παράθεση:. Zhao Υ, Λι C, Wang M, L Su, Qu Υ, Li J, et al. (2013) Μείωση του miR-202-3p έκφρασης, ένα μυθιστόρημα Ογκοκατασταλτικής, σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10.1371 /journal.pone.0069756

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 28 Φλεβάρη του 2013? Αποδεκτές: 11, Ιουν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουλ, 2013

Copyright: © 2013 Zhao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αρ. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 και 81272749), Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (αριθ. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 και 12PJ1406300), Key Projects στο Πρόγραμμα πυλώνα Εθνικό Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (Αρ 2011BA203191), Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης της Κίνας (Αρ 20110073110071), βασικό έργο της επιτροπής της Σαγκάης Παιδείας (αρ. 12ZZ102, 12ZZ105) και του Ιδρύματος Καινοτομίας Οι απόφοιτοι διδακτορικό της Σαγκάης Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Γαστρικό καρκίνο (GC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες και η δεύτερη πιο κοινές αιτίες θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο παγκοσμίως [1]. Αν και προόδους στη θεραπεία, το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με GC είναι απογοητευτική, αυτό οφείλεται κυρίως στην ανεπάρκεια των ειδικών θεραπευτικών στόχων. Ως εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας για τον εντοπισμό των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών (18-25 νουκλεοτίδια), μη κωδικεύοντα, μονόκλωνο ενδογενούς RNA. Καταστέλλουν έκφραση πρωτεϊνών μέσω της αλληλεπίδρασης με τέλεια ή ατελή συμπληρωματικές αλληλουχίες που βρίσκονται στις 3 ‘μη μεταφραζόμενη περιοχές (3’UTRs) των γονιδίων στόχων. Μελέτες των τελευταίων ετών έχουν δείξει ότι απορυθμισμένη miRNAs παίζουν σημαντικούς ρόλους σε διάφορους καρκίνους [1] – [4], συμπεριλαμβανομένων GC [5] – [13]. Τα δεδομένα από τη μελέτη για miRNAs και τα γονίδια στόχους τους μπορούν να παρέχουν συναρπαστικές θεραπευτικές δυνατότητες [3].

Έχουμε εντοπίσει πρόσφατα διάφορες miRNAs απελευθερωθεί σε GC, όπως η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-126 [14], miR-409-3p [15], miR-625 [16], καθώς και προς τα πάνω ρύθμιση του miR-21 [17], miR-301a [18]. Παρά το γεγονός ότι πολλοί miRNAs έχουν εντοπιστεί συνδέει με GC, ο μηχανισμός αυτών των miRNAs σε γαστρική καρκινογένεση χρειάζεται ακόμη να διερευνηθεί. Σε προηγούμενη εργασία μας, πολυάριθμες υποθετικές miRNAs που έδειξαν διαφορική έκφραση μεταξύ ιστών GC και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου τους από 28 ασθενείς ταυτοποιήθηκαν [19]. Μεταξύ αυτών, miR-202-3p ήταν ένα από τα πιο σημαντικά μειωμένη miRNAs. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-202-3p στο GC σπάνια διερευνώνται.

MiR-202-3p, προηγούμενο όνομά του HSA-miR-202, το οποίο βρίσκεται μέσα σε μια εύθραυστη θέση χρωμοσωμική στο 10q26. Η διαγραφή της εύθραυστης θέσης έχει συσχετιστεί με ενδομητρίου [20], οι όγκοι του εγκεφάλου [21], [22]. MiR-202 έχει αναφερθεί να απελευθερωθεί στον καρκίνο του μαστού [23], [24], του τραχήλου της μήτρας πλακωδών κυττάρων [25], ορθοκολικό καρκίνο [26] και οζώδες λέμφωμα [27]. Petrocca et al. Βρέθηκε ότι miR-202 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε χρόνια γαστρίτιδα [28]. MiR-202 έχει δειχθεί ότι είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη με 4-hydroxynoneal (ΗΝΕ) σε HL-60 λευχαιμικά κύτταρα [29]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε επίσης ότι το miR-202 στοχεύει άμεσα πρωτο-ογκογονίδιο MYCN, με αποτέλεσμα την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων νευροβλαστώματος [30].

Εδώ, έχουμε αποδείξει μια γενική μείωση των επιπέδων έκφρασης του miR-202-3p στην 150 ιστοί GC σε σχέση με τους μη καρκινικούς ιστούς και να βρει ότι τα miR-202-3p επίπεδα που σχετίζονται με το μέγεθος του όγκου και την ηλικία των ασθενών. Εκτός αυτού, ανακαλύψαμε, για πρώτη φορά, ότι miR-202-3p θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη και να επάγει απόπτωση κυττάρων GC τόσο

in vitro

και

in vivo από

κατευθείαν στόχευση του παράγοντα μεταγραφής Gli1 και αναστολή της έκφρασης των γονιδίων στόχων Gli1 γ-κατενίνης και BCL-2.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

γραπτή συγκατάθεση έχει ληφθεί από όλους τους συμμετέχοντες. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνών του Ανθρώπου Δεοντολογίας της Ruijin Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Shanghai Jiao Tong University (HREC 08-028), το Εργαστήριο Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων της Ruijin Νοσοκομείο (ΗΠΑΜ 11-062). πειραμάτων σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών ζώων Φροντίδα και Χρήση (IACUC) στο Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Κίνα.

Cell Culture

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου GC SGC -7901 και BGC-823 αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-45 και ΜΚΝ-28 ελήφθησαν από την ιαπωνική Cancer Research Τράπεζα Πόρων (Tokyo, Japan). NCI-Ν87, AGS, ΚΑΤΟ III και SNU-1 κυτταρικές σειρές αρχικά αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ανθρώπινων εμβρυϊκών κυττάρων νεφρού γραμμή 293Τ (ΗΕΚ-293Τ) διατηρήθηκε στο ινστιτούτο μας. Τα κύτταρα αποθηκεύονται, ανακτώνται από κρυοσυντήρηση σε υγρό άζωτο και χρησιμοποιούνται σε πρώιμο περάσματα. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συν 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και καλλιεργήθηκαν σε 5% CO2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα.

ιστούς ασθενών

Πρωτοβάθμια ιστούς GC και συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από 150 ασθενείς GC που υποβάλλονται σε ριζική γαστρεκτομή στο Τμήμα Χειρουργικής, Ruijin Νοσοκομείο, Σχολή Ιατρικής, Σαγκάη Πανεπιστήμιο Jiao Tong. Τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως μετά την επέμβαση. Όλα τα δείγματα επιβεβαιώθηκαν από ανεξάρτητη παθολογική εξέταση. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν προεγχειρητική θεραπεία. Για όλους τους ασθενείς, κλινικοπαθολογοανατομικές πληροφορίες ήταν διαθέσιμες. ταξινόμηση όγκου σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση Καρκίνου Ενάντια (2009).

Απομόνωση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές σειρές και τα δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συγκεντρώσεις και καθαρότητα των δειγμάτων RNA μετρήθηκαν με ηλεκτροφόρηση και φασματοφωτομετρικές μεθόδους. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-202-3p και U6 μικρού πυρηνικού RNA (RNU6B) αναλύθηκαν εις τριπλούν με τη μέθοδο stem-loop RT-PCR χρησιμοποιώντας φουρκέτα-it ™ miRNAs qPCR ποσοτικοποίηση Kit (GenePharma, Σαγκάη, Κίνα) με ειδικούς εκκινητές formiR-202-3p και U6 μικρό πυρηνικό RNA (RNU6B). Σχετική έκφραση miRNA του miR-202-3p ομαλοποιήθηκε έναντι του ενδογενούς ελέγχου, U6, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο DDCt. Τα επίπεδα mRNA του Gli1 και GAPDH μετρήθηκαν εις τριπλούν με τη χρήση του SYBR Green πραγματικού χρόνου PCR (Applied Biosystems, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσοτικοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας τη σχετική μεθόδου ποσοτικού DDCt με Ανθρώπου GAPDH ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: Gli1 (με νόημα: 5′-GGA ΑΟΤ ΟΑΤ ACT CAC GCC TCG Α-3 ‘? Αντινόημα: 5′-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC Α-3′) [31] και GAPDH (έννοια: 5’-GGA ΚΔ GAC CTG CCG TCT AG-3 ‘? αντίθετης φοράς: 5′-GTA GCC CAG GAT GCC CTT GA-3’.)

παροδική επιμόλυνση των miRNA Μιμείται

ΜΙΚ 202-3p μιμείται (dsRNA ολιγονουκλεοτίδια) και αρνητικό mimics1 ελέγχου (NC) (με νόημα: 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ‘, αντίθετης φοράς: 5′-ACG UGA CAC Ουυ CGG AGA ΑΤΤ-3’) αγοράστηκαν από GenePharma (Σανγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων την ημέρα πριν από την επιμόλυνση για να εξασφαλιστεί το 40% συρροή κυττάρων κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης. Η επιμόλυνση του miRNA μιμείται σε κύτταρα διεξήχθη με Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή. Τα μιμητικά miRNA χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 100 ηΜ.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με miRNA μιμείται, κύτταρα (2 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο ) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε εις τριπλούν με υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου (WST) δοκιμασία χρησιμοποιώντας το κινητό Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) και μετρήθηκε μετά τις οδηγίες του κατασκευαστή.

αποικίας μαλακού άγαρ Δοκιμασία Σχηματισμού

μιμείται miRNA επιμολυσμένα κύτταρα επαναιωρήθηκαν με 0,3% μαλακή αγαρόζη (A9045, χαμηλής θερμοκρασίας σχηματισμού γέλης, Sigma-Aldrich, USA) σε RPMI 1640 που περιείχε 10% FBS και επιστρώθηκαν επάνω σε 0,4% στερεοποιήθηκε άγαρ σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS σε πλάκες 6-φρεατίων (1 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα τρυβλία επωάστηκαν για 2 εβδομάδες. Αποικίες που περιέχουν τουλάχιστον 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

Η απόπτωση Ανάλυση

Μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση με miRNA μιμείται, 1 × 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με Αηηβχίην /ΡΙ διπλό κιτ χρώσης (Biosciences BD, ΗΠΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα αποπτωτικά κύτταρα αξιολογήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα με κυτταρομετρία ροής επί FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).

ρετροϊικοί επιμόλυνσης για Σταθερές κυτταρικές γραμμές

γενωμική περιοχή που περιελάμβανε η πρωταρχική μεταγραφή του miR-202-3p κλωνοποιήθηκε στην θέση EcoRI-XhoI του τροποποιημένου ρετροϊικού φορέα pMSCV-GW-RFA-PGK-EGFP. Αρνητικός φορείς ελέγχου δεν είχε καμία ένθετο. κύτταρα ΗΕΚ 293Τ (1 × 10

6 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων την ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Δέκα μα ρετροϊικού κατασκευάσματος που περιέχει είτε miR-202-3p ή όχι ένθετο, 2 ug του gag /pol και 2 ug του VSVG συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ 293Τ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine ™ 2000 και Opti-ΜΕΜ Ι μειωμένη ορού μέσο σε κάθε πλάκα. Οι ιοί συλλέχθηκαν σε 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση από ιογενή μέσο συλλογής (RPMI-1640 με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS + 1% γλουταμίνη 20 mM Hepes). Λοιμώξεις του ΜΚΝ-28 κύτταρα διεξάγεται παρουσία 8 μg /mL πολυβρενίου σε κάθε φρεάτιο μιας 6-φρεατίων. Τα κύτταρα μολύνθηκαν περιστροφή στα 1500 rpm για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. υπερκείμενο ιού που περιέχει απομακρύνθηκε μετά από 2 ώρες. Θετικά κύτταρα επιλέχθηκαν για έκφραση GFP με FACS-διαλογή και ονομάζεται RV-miR-202-3p και RV-miR-ελέγχου, αντίστοιχα. MiR-202-3p έκφραση επιβεβαιώθηκε από qRT-PCR.

Η ανάπτυξη όγκων σε άτριχα ποντίκια

Άντρας BALB /c ηυ /ηυ, σε ηλικία έξι εβδομάδων (Ινστιτούτο Ζωολογίας Κινεζική Ακαδημία Επιστημών), στεγάστηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο-ελεύθερο περιβάλλον στο Εργαστήριο Ζωικής μονάδας, της Ιατρικής Σχολής, Shanghai Jiao Tong University, την Κίνα. Ποντίκια έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα και τα πρωτόκολλα μελέτης πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Animal Care and Use (IACUC) στο Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Κίνα. Τα κύτταρα (100 μΙ, 2 × 10

6 κύτταρα) από σταθερές επιμολυσμένα γραμμές RV-miR-202-3p ή RV-miR-ελέγχου συλλέχθηκαν και εμβολιάστηκαν υποδορίως σε ποντικούς. Έξι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ομάδα. Τα ποντίκια ελέγχθηκαν κάθε εβδομάδα, και οζίδια όγκων μετρήθηκαν με παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση V = 4 /3π × L /2 × (W /2)

2, όπου L είναι το μήκος μεσαίου άξονα, και W είναι η μεσαίου άξονα width.The καρκινικά κύτταρα αφέθηκαν να ανάπτυξη 5-εβδομάδων και τις καμπύλες ανάπτυξης όγκου και υπολογίστηκαν αναστολή συντελεστές. Μετά θυσιάστηκαν τα ποντίκια, όλα τα μοσχεύματα όγκου αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν, συλλέχθηκαν, σταθερό, και ενσωματωμένα. Κάθε πείραμα διεξήχθη δύο φορές.

ΤΟΥΝΕΛ Ανάλυση

Ο τελικός προσδιορισμός επισήμανση νουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης μεσολάβηση nick τέλος (ΤΟΥΝΕΛ) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του κιτ αδιέξοδο ™ Χρωματομετρική ΤΟΥΝΕΛ System (Promega, ΗΠΑ). Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και εξουδετερώθηκε ενσωματωμένο σε μπλοκ παραφίνης. Τμήματα (4 μm) στη συνέχεια παρασκευάζονται για εξέταση. Μετά αποπαραφίνωση, οι τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 g /ml πρωτεϊνάσης Κ για 10 λεπτά, με 0,3% Η

2O

2 σε μεθανόλη για 10 λεπτά και 0,1% Triton Χ-100 σε 0.1% κιτρικό νάτριο για 2 λεπτά στον πάγο. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με μίγμα της αντίδρασης TUNEL για 60 λεπτά στους 37 ° C. Περαιτέρω επώαση με συζευγμένο με υπεροξειδάση αντίσωμα διεξήχθη για 30 λεπτά στους 37 ° C. Οι τομές χρωματίστηκαν με διάλυμα διαμινοβενζιδίνη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια με αιματοξυλίνη.

Ανοσοϊστοχημεία

Τομείς (πάχους 6 mm) του μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη όγκου specimenswere αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Η ενδογενής υπεροξειδάση παρεμποδίστηκε με τη χρήση 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά. Μετά ανάκτηση αντιγόνου σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0), οι τομές ιστών επωάστηκαν με φυσιολογικό ορό κατσίκας για να εμποδίσει μη ειδικής σύνδεσης αντισώματος (20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου). Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με αντισώματα Gli1 (1:50, sc-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) στους 37 ° C σε humidchambers για 2 ώρες. Μετά από πλύση με PBS τρεις φορές, οι τομές επωάστηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση IgG αντι-κουνελιού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι πλάκες ξεπλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν για 5 λεπτά με υπόστρωμα DAB για λιγότερο από 30 λεπτά. Αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε για αντιχρωματισμός.

Δόμηση των πλασμιδίων και δοκιμασία λουσιφεράσης Δραστηριότητα

Ένα 203-bp σε όλο το μήκος του άγριου τύπου (WT) Gli1-3’UTR ή μεταλλαγμένο Gli1-3 » UTR (mut) που περιέχει την υποθετική θέση δέσμευσης miR-202-3p συντέθηκε (Sangon, Σαγκάη, Κίνα). Μετά την πέψη με SpeI και HindIII, τα θραύσματα του άγριου τύπου και μεταλλαγμένων Gli1-3’UTR κλωνοποιήθηκαν εντός των θέσεων SpeI και HindIII του φορέα pMIR-Report Λουσιφεράσης (Applied Biosystems) και ονομάστηκε pMIR /Gli1 και pMIR /Gli1 /mut, αντίστοιχα. αλληλούχιση DNA χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση των κατασκευασμάτων.

κύτταρα ΗΕΚ-293Τ ενοφθαλμίστηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων 24 ώρες πριν από την εκτέλεση της ανάλυσης. Σε κάθε φρεάτιο, 100 ng pMIR /Gli1 ή pMIR /Gli1 /mut, 2 ng ρΡΙ_-ΤΚ (Promega, Madison, WI, USA) που περιέχει λουσιφεράση της Renilla και 100 ηΜ miRNA μιμείται συνεπιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine ™ 2000 και Opti-ΜΕΜΙ μειώνεται ορού μέσο. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης υπολογίστηκε 48 ώρες μετά συνεπιμόλυνση χρήση Dual-Glo δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, USA) σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή. δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly κανονικοποιήθηκε σε δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα και καρκινικά λύθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια M-PER και Ανάσχεση Αναστολέα Πρωτεάσης κιτ Κοκτέιλ (Pierce, USA). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρικών λυμάτων προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα BCA Protein Assay Kit (Pierce, USA). Πρωτεΐνη διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS και στυπώθηκε σε 0,22-μm μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, ΜΑ, USA). Οι ακόλουθες ειδικές αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: Gli1 (1:1000, Cell Signaling Technology), γ-κατενίνη (1:2000, BD Biosciences, USA), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, USA), και GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). τα επίπεδα πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν με τη συνολική GAPDH

Κατασκευή Gli1 έκφρασης πλασμιδίου και διαμόλυνση

Με την ενίσχυση του cDNA του ΜΚΝ-28 χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα εναύσματα:. αίσθησης (5′-AGT TGA ACA ΤΟΟ GAT ATC ΑΤ-3 ‘) και αντινόημα (5′-ATG CGG CCG CTT AGG CAC ΤΑ-3’), Gli1 λήφθηκε, υπέστη πέψη με EcoR V και Not Ι και κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pcDNA3.1 (Invitrogen) και ονομάστηκε πλήρους μήκους pcDNA3 0,1-Gli1. αλληλούχιση DNA χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση των κατασκευασμάτων.

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων την ημέρα πριν από την επιμόλυνση για να εξασφαλιστεί 80-90% συρροή κυττάρων κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης. Σε κάθε φρεάτιο, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 250 pmol του miR-202-3p μιμείται ή ελέγχου, μαζί με 4 ug του pcDNA3.1-Gli1 ή το pcDNA3.1 κενό φορέα, χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000. δοκιμασία WST διεξήχθη σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, ενώ η ανάλυση απόπτωσης διεξήχθη στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Στατιστική ανάλυση

οι συνεχείς μεταβλητές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμασία του Student για κανονικά κατανεμημένες μεταβλητές και Wilcoxon τεστ rank-sum για nonnormally διανεμηθεί μεταβλητές. Η σχέση μεταξύ των miR-202-3p επίπεδα έκφρασης και κλινικοπαθολογική παραμέτρους αναλύθηκε με τη χρήση του Pearson Chi-square test. Όλες οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SDS. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση PASW Στατιστικά 18,0 λογισμικού (IBM, ΗΠΑ). Ένα δίπλευρη τιμή

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση του miR-202-3p μειώνεται σε GC και συσχετίζεται με κλινικοπαθολογική παράμετροι

Εκφράσεις του miR-202-3p εξετάστηκαν από qRT-PCR σε καρκινικούς ιστούς και τα συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς από 150 ασθενείς GC (Εικ. 1Α). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση του miR-202-3p ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς σε 68% (102/150) των ασθενών GC. (Ρ & lt? 0,001? Σχ. 1Α, Β)

(Α) σχετική έκφραση του miR-202-3p σε 150 GC ιστούς ασθενών σε σύγκριση με παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς του. Τα αποτελέσματα qRT-PCR παρουσιάζονται ως -ΔΔCT τιμές. (Β) Τα κουτιά αντιπροσωπεύουν το 25 με εκατοστημόρια 75ο. Οι οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν τις διαμέσους. Τα μουστάκια αντιπροσωπεύουν τα 10ο και 90ο εκατοστημόριο. ***

P

& lt?. 0.001

Η

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης του miR-202-3p και κλινικοπαθολογική παραγόντων στην ανθρώπινη GC, οι 150 περιπτώσεις ήταν ακόμη αναλύθηκαν (Πίνακας 1). Με βάση την σχετική miR-202-3p έκφρασης, οι 150 υποθέσεις κατηγοριοποιήθηκαν σε 3 ομάδες: miR-202-3p χαμηλή έκφραση (αναλογία όγκου /μη όγκου & lt? 0.66, n = 85), miR-202-3p μέτρια έκφραση (όγκου /αναλογία μη-όγκου 0,66 έως 1,5, n = 34) και miR-202-3p υψηλή έκφραση (όγκο αναλογία /μη-όγκου & gt? 1.5, n = 31). Οι miR-202-3p επίπεδα έκφρασης συσχετίζεται αρνητικά με το μέγεθος του όγκου και συσχετίζεται θετικά με την ηλικία σε αυτούς τους ασθενείς, με το miR-202-3p ομάδα χαμηλής έκφρασης εμφάνισαν σημαντικά μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου (p = 0,013) και των ηλικιωμένων ηλικία σε σύγκριση με μέτρια ή ομάδες υψηλή έκφραση (p = 0,028). Ωστόσο, miR-202-3p επίπεδα έκφρασης δεν παρουσίασαν καμία σχέση με το φύλο, τη διαφοροποίηση, τη θέση του όγκου, του όγκου των τοπικών εισβολή, μετάσταση στους λεμφαδένες ή το στάδιο TNM.

Η

Η υπερέκφραση του miR-202-3p Αναστέλλει GC κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Δεδομένου ότι το miR-202-3p μειώνεται σημαντικά σε GC, μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας των όγκων. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε κατά πόσο η υπερέκφραση του miR-202-3p στα κύτταρα GC επηρεάζονται ανάπτυξη των κυττάρων. κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-28 και BGC-823, του οποίου η έκφραση του miR-202-3p ήταν η χαμηλότερη στις οκτώ δοκιμαστεί κυττάρων GC γραμμές (Εικ. 1Γ), επιλέχθηκαν για τα επόμενα expreiments. Συνθετικό miR-202-3p μιμείται και αρνητικό μάρτυρα μιμούνται μόρια (NC) διαμολύνθηκαν σε ΜΚΝ-28 και BGC-823 κύτταρα, αντίστοιχα. Η έκτοπη έκφραση του miR-202-3p σε κύτταρα επιβεβαιώθηκε με qRT-PCR.

Η δοκιμασία κυτταρικής ανάπτυξης WST έδειξαν σημαντική αναστολές κυτταρικής ανάπτυξης σε ΜΚΝ-28 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-202-3p (Σχ. 2.Στην). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε BGC-823 κύτταρα (Σχ. 2.Β). Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η επίδραση miR-202-3p επί της κυτταρικής ανάπτυξης, εκτελέσαμε προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγκαρ σε επιμολυσμένα κύτταρα. Βρήκαμε ότι ο αριθμός των αποικιών από ΜΚΝ-28 κύτταρα επιμολυσμένα με το miR-202-3p μιμείται ήταν σχεδόν το ήμισυ του ότι από τον έλεγχο και τη γονική ομάδα (Σχ. 2C). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε BGC-823 κύτταρα (Σχ. 2.Δ). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι miR-202-3p μπορεί να καταστείλει την κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC

in vitro

.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία WST σε ΜΚΝ-28 κύτταρα (Α) και BGC -823 κύτταρα (Β). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-202-3p μιμείται ή NC στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση υποβλήθηκαν σε δοκιμασία WST μαζί με γονικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. *,

P

& lt? 0,05. Η επίδραση του miR-202-3p επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία σχηματισμού αποικίας σε ΜΚΝ-28 κύτταρα (C) και BGC-823 κύτταρα (D). Κύτταρα μετεμβολιασμένα με 100 ηΜ miR-202-3pmimics ή ελέγχου σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 6-φρεατίων μαζί με γονικά κύτταρα. Ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε την 14η ημέρα μετά τη σπορά. Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες των αποικιών φαίνεται στο αριστερό πάνελ. Σχετική ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων παρουσιάζεται στα γραφήματα ράβδου (δεξιά πάνελ). Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Η υπερέκφραση του miR-202-3p Προκαλεί GC κύτταρα απόπτωση

Επειδή η αναστολή της ανάπτυξης μπορεί να οφείλεται σε μπλοκάρει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ή αυξημένη απόπτωση, έχουμε την επόμενη προσχηματισμένα δοκιμασία κύκλου κυτταρικής διαίρεσης και την απόπτωση με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα αποπτωτικά ποσοστά και των δύο κυττάρων ΜΚΝ-28 και BGC-823 επιμολυσμένα με miR-202-3p μιμείται ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (Σχ. 3Α, Β). Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο κυτταρικό κύκλο μεταξύ των ομάδων με διαφορετικό αγωγή (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-202-3p επάγει απόπτωση σε κύτταρα GC μπορεί συμβάλλει στις ανασταλτικές ιδιότητες ανάπτυξης του miR-202-3p.

(Α) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα που απεικονίζουν την απόπτωση των ΜΚΝ-28 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με 100 nM miR-202-3p μιμείται ή NC και γονικών κυττάρων (αριστερό πάνελ). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. παρουσιάζονται στα γραφήματα ράβδου (δεξιά πάνελ). (Β) Εκπρόσωπος ιστογράμματα που απεικονίζουν την απόπτωση των BGC-823 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με 100 nM miR-202-3p μιμείται ή NC και γονικών κυττάρων (αριστερό πάνελ). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. παρουσιάζονται στα γραφήματα bar (δεξιά πάνελ).

Η

Η υπερέκφραση του miR-202-3p Αναστέλλει Ογκογονικότητα και αυξάνει την απόπτωση

in vivo

Η

Δεδομένου ότι ΜΙΚ 202-3p αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων GC και επάγει την απόπτωση

in vitro

, εξετάσαμε έπειτα αν miR-202-3p θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου και επάγουν απόπτωση

in vivo

. Κύτταρα ΜΚΝ-28, RV-miR-202-3p (κύτταρα ΜΚΝ-28 με ρετροϊό μεσολάβηση miR-202-3p σταθερή έκφραση) ή RV-miR-ελέγχου (28 ΜΚΝ-κυττάρων με τον κενό φορέα) ελήφθησαν όπως περιγράφηκε σε Υλικά και Μέθοδοι. Τα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. σχηματισμός όγκων παρακολουθήθηκε. Ο χρόνος λανθάνουσας κατάστασης του όγκου έδειξαν σημαντική διαφορά μεταξύ των ποντικών που ενέθηκαν με κύτταρα RV-miR-NC και RV-miR-202-3p κύτταρα (Σχ. 4Α). Είναι σημαντικό ενδιαφέρον ότι οι όγκοι που προέρχονται από τον RV-miR-202-3p κύτταρα αναπτύχθηκαν σημαντικά βραδύτερα από την ομάδα RV-miR-έλεγχο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου (Σχ. 4Β). Το μέσο βάρος των όγκων που προκύπτουν από τον RV-miR-202-3p ήταν σημαντικά μικρότερη από ό, τι οι όγκοι που προέρχονται από τον RV-miR-μάρτυρα (Σχ. 4C, D).

(Α) Η λανθάνουσα κατάσταση του όγκου ήταν ο αριθμός των οι ημέρες για την εμφάνιση ψηλαφητών όγκων και οι τιμές που δίδονται ως μέση τιμή ± SD *,

P

& lt? 0,05. (Β) καμπύλες ανάπτυξης των όγκων μετρήθηκαν μετά την ένεση. Οι διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν κάθε 7 ημέρες. (Γ) Το βάρος του όγκου? οι τιμές δίνονται ως μέση ± δ.ϋ. *,

P

& lt? 0,05. (Δ) Η φωτογραφία δείχνει αντιπροσωπευτικά των ξενομοσχευμάτων όγκου 35 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. (Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του TUNEL δοκιμασίας ξενομοσχευμάτων όγκου ποντικών (αριστερά πάνελ). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκε (δεξιά πάνελ). Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. *,

P

& lt?. 0.05

Η

Επιπλέον, αναλύσεις TUNEL των καρκινικών ιστών διεξήχθησαν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Ε, οι RV-miR-202-3p κύτταρα έδειξε μια πιο καρκινικών κυττάρων θετική χρώση και ένα σημαντικά υψηλότερο αποπτωτικό δείκτη από τα κύτταρα RV-miR-ελέγχου (

P

& lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-202-3p αναστολή ογκογένεσης αποδίδεται σε αυξημένη απόπτωση

in vivo

.

(A) Σχετική έκφραση του miR-202-3p και Gli1 σε κυτταρικές σειρές οκτώ GC διεξήχθη με qRT-PCR. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. (Β) Ακολουθία του Gli1 3’UTR που δείχνει την θέση δέσμευσης miR-202-3p και μετάλλαξη του Gli1 3’UTR θέση δέσμευσης για τη δημιουργία Gli1-mut. (C) miR-202-3p μιμείται τα κάτω-ρυθμιζόμενες δραστηριότητες της λουσιφεράσης ελέγχεται από άγριου τύπου Gli1 3’UTR (

P

& lt? 0.01), αλλά δεν επηρέασε λουσιφεράσης δραστηριότητα ελέγχεται από μεταλλαγμένο Gli1 3’ΙΙΤΡ. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία independentexperiments ± S.D. (D) mRNA Gli1 σε ΜΚΝ 28 κύτταρα αναλύθηκε με qRT-PCR στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με miR-202-3p μιμείται και NC. (Ε) Εκπρόσωπος κηλίδωση Western εικόνες της ενδεικνυόμενης πρωτεΐνης σε ΜΚΝ-28 κύτταρα (αριστερά πάνελ), με σχετική ποσοτικοποίηση (δεξιά πλευρά). Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. *,

P

& lt? 0,05. (F) Gli1 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε RV-miR-ελέγχου ή RV-miR-202-3p κύτταρα από υποδόρια όγκου σε γυμνούς ποντικούς (αριστερά πάνελ), με σχετική ποσοτικοποίηση (δεξί πάνελ). Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. *,

P

& lt?. 0.05

Η

MiR-202-3p Άμεσα στόχος Gli1

Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό που διέπει τις ιδιότητες αναστολής όγκου του miR-202 -3p σε GC, ψάξαμε για την υποτιθέμενη γονιδίων στόχων του τη δυνατότητα προ-ογκογόνο λειτουργίες χρησιμοποιώντας online εργαλεία αναζήτησης (RNAhybrid και Miranda αλγόριθμοι), και τα γονίδια που προβλέπεται από τις δύο εργαλείων βιοπληροφορικής επιλέχθηκαν ως τα γονίδια υποψήφιος στόχος του miR-202 -3p. Μεταξύ των εκατοντάδων υποψήφια γονίδια προβλεφθεί, ο ενεργοποιητής μεταγραφής Gli1 είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος (Εικόνα S1). Η υποθετική δευτερεύουσα δομή του RNA υβρίδιο για ανθρώπινη miR-202-3p και Gli1 φαίνεται στο Σχήμα S2. Gli1 έχει αναφερθεί εντόνως εκφρασμένο σε GC [32], [33]. Πρότεινε ότι η μείωση της έκφρασης της Gli1 οδήγησε σε GC αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης γραμμών και απόπτωση [33].

Μια άλλη ένδειξη για τον πιθανό ρόλο του miR-202-3p στη ρύθμιση της έκφρασης Gli1 προήλθε από την ανάλυση των οκτώ διαφορετικές κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (ΜΚΝ-45, SGC-7901, AGS, ΝΟΙ-Ν87, SNU-1, ΚΑΤΟ III, BGC-823 και ΜΚΝ-28). Η στατιστική ανάλυση έδειξε σημαντική ανεστραμμένο πρότυπα έκφρασης των miR-202-3p και Gli1 ((r = -0,345,

P

& lt?.. 0.001, σχήμα 5Α)

Για να εκτιμηθεί η κλινική συνάφεια αυτών των ευρημάτων, εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των εκφράσεων του Gli1 με miR-202-3p έκφραση σε ιστούς GC. Βρήκαμε ότι Gli1 και miR-202-3p έκθεμα αντίστροφο μοτίβο έκφρασης σε ιστούς GC (Πίνακας 2). αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το παραδοχή ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των miR-202-3p αυξάνει το επίπεδο της γονιδιακής Gli1 σε καρκίνο του στομάχου.

η

δοκιμασίες λουσιφεράσης έγιναν για να ελέγξει μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των miR-202-3p και την 3’UTR της Gli1. λουσιφεράσης δημοσιογράφοι είχαν κατασκευαστεί περιέχουν είτε αγρίου τύπου ακολουθία Gli1 3’ΙΙΤΡ συμπεριλαμβανομένης της θέσης miR-202-3p δέσμευσης (pMIR /Gli1), ή ένα μεταλλαγμένο Gli1 3’ΙΙΤΡ (pMIR /Gli1 /mut) (Εικ. 5Β ). Η pMIR /Gli1 και pMIR /Gli1 /mut λουσιφεράσης κατασκευάσματα ρεπόρτερ επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ, μαζί με miR-202-3p ή NC μιμείται. Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης του ρεπόρτερ pMIR /Gli1 ήταν αξιοσημείωτα κατέστειλε συγκρίθηκε με εκείνη της pMIR /Gli1 /mut σε miR-202-3p-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 5C). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει έντονα ότι 3’UTR της Gli1 φέρει τις άμεσες θέσεις σύνδεσης του miR-202-3p.

Για να καθοριστεί σε επίπεδο mRNA ή το επίπεδο της πρωτεΐνης miR-202-3p κάτω-ρυθμίζονται Gli1, ανιχνεύσαμε την έκφραση Gli1 με qRT-PCR και κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Ε, το επίπεδο της πρωτεΐνης Gli1 μειώθηκε σε miR-202-3p μιμείται-επιμολυσμένα ΜΚΝ-28 κυττάρων σε σύγκριση με NC μιμείται επιμολυσμένα και τη γονική ΜΚΝ-28 κύτταρα. Εν τω μεταξύ, δεν υπήρχε καμία επίδραση από miR-202-3p στο επίπεδο Gli1 mRNA (Σχ. 5D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι miR-202-3p ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση Gli1 στο μεταφραστικό επίπεδο.

Μεταξύ των γονιδίων που αναφέρθηκαν να αναστέλλουν την απόπτωση των GC, γ-κατενίνη (πλακοσφαιρίνη) και BCL-2 είναι άμεση μεταγραφική στόχοι της Gli1 [34], [35]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Ε, τα επίπεδα πρωτεΐνης του γ-κατενίνης και BCL-2 σημαντικά μειωμένη σε ΜΚΝ-28 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-202-3p μιμείται.

Επιπλέον, εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης Gli1 σε υποδόριους όγκους που προέρχονται από RV-miR-ελέγχου και RV-miR-202-3p σε γυμνά ποντίκια με ανάλυση κηλίδος Western. Το επίπεδο της πρωτεΐνης Gli1 σε όγκους από RV-miR-202-3p έδειξαν υποστροφή σε σύγκριση με εκείνη στο RV-miR-ελέγχου (Εικ. 5F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι miR-202-3p ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση Gli1 μετα-μεταγραφικά.

Η υπερέκφραση του Gli1 διάσωση Επίδραση του miR-202-3p σε κύτταρα GC

Από το miR-202-3p ρυθμίζεται προς τα κάτω Gli1 να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και διεγείρουν απόπτωση, είναι αιτιολογημένη ότι η υπερέκφραση του Gli1 μπορούσε να αντιστρέψει το φαινόμενο αυτό τουλάχιστον εν μέρει. Πράγματι, όταν Gli1 υπερεκφράζουν πλασμίδιο (pcDNA3.1-Gli1) εισήχθη εντός ΜΚΝ-28 ή BGC-823 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με miR-202-3p μιμείται, η ανασταλτική δράση του miR-202-3p επί της κυτταρικής ανάπτυξης αντιστράφηκε εν μέρει, η οποία παρατηρήθηκε με τη δοκιμασία ανάπτυξης κυττάρου WST (Σχ. 6Α, Β). Επιπλέον, η πρόοδος προς την απόπτωση επίσης παρεμποδίζεται όταν Gli1 υπερεκφράστηκε σε ΜΚΝ-28 ή BGC-823 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με miR-202-3p μιμείται (Σχ. 6C, D) .Οι δεδομένα παρέχουν αποδείξεις ότι η αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται από miR-202-3p είναι τουλάχιστον εν μέρει με τις επιπτώσεις της στην έκφραση Gli1.

κατά την επιμολυσμένα με φορέα έκφρασης Gli1 (pcDNA3.1-Gli1), ΜΚΝ-28 κύτταρα (Α) και BGC-823 κύτταρα ( Β) εν μέρει διασώθηκαν από miR-202-3p ανάπτυξη ανασταλτικές ιδιότητες. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-202-3p μιμείται ή ελέγχου, μαζί με pcDNA3.1-Gli1or pcDNA3.1 κενό φορέα (pcDNA3.1) στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση υποβλήθηκαν σε δοκιμασία WST. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. *,

P

& lt? 0,05. Εκπρόσωπος ιστογράμματα που απεικονίζουν την απόπτωση ΜΚΝ-28 κύτταρα (C) και BGC-823 κύτταρα (D) επιμολυσμένα με miR-202-3p μιμείται ή ελέγχου, μαζί με pcDNA3.1- Gli1) ή pcDNA3.1 με κυτταρομετρία ροής (αριστερά πάνελ). Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. παρουσιάζονται στα γραφήματα ράβδου (δεξιά πάνελ).

Η

Συζήτηση

Συσσωρευμένα αποδεικτικά στοιχεία έδειξαν απορύθμιση των συγκεκριμένων miRNA σε GC [4], [13], [36].