Abstract

Το ένζυμο 5α-αναγωγάσης, η οποία μετατρέπει την τεστοστερόνη σε διυδροτεστοστερόνη (DHT), εκτελεί βασικές λειτουργίες στον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) οδού σηματοδότησης. Τα τρία ισοένζυμα της 5α-αναγωγάσης εντοπιστεί μέχρι σήμερα κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια:

SRD5A1

,

SRD5A2

, και

SRD5A3

. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τους μηχανισμούς που διέπουν ρύθμιση ανδρογόνου της έκφρασης ισοενζύμου 5α-αναγωγάσης σε ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη. Βρήκαμε ότι ανδρογόνων ρυθμίζει το επίπεδο του mRNA ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης σε ένα κύτταρο τύπου-ειδικό τρόπο, ότι η εν λόγω ρύθμιση λαμβάνει χώρα στο μεταγραφικό επίπεδο, και ότι AR είναι απαραίτητη για τον κανονισμό αυτόν. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι AR προσλαμβάνεται σε ένα αρνητικό στοιχείο απόκρισης ανδρογόνων (nare) σχετικά με τον υποκινητή του

SRD5A3 in vivo

και απευθείας συνδέεται προς το Nare

in vitro

. Τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των ισοενζύμων της 5α-αναγωγάσης μπορεί να αναθέτει απάντηση ή αντοχή σε αναστολείς της 5α-αναγωγάσης και έτσι μπορεί να έχουν σημασία στην πρόληψη του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Li J, Ding Ζ, Wang Ζ, Lu JF, Maity SN, Navone NM, et al. (2011) ανδρογόνα κανονισμού της 5α-αναγωγάσης ισοενζύμων στον καρκίνο του προστάτη: Συνέπειες για την πρόληψη του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 6 (12): e28840. doi: 10.1371 /journal.pone.0028840

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 16, 2011? Αποδεκτές: 16 Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 14 Δεκεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το καρκίνο του προστάτη Ερευνητικό Πρόγραμμα στο MD Anderson Κέντρο Καρκίνου και υποστηρίζεται εν μέρει από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας μέσω Cancer Center Support Grant MD Anderson του, CA016672. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η πολυετής, πολυσταδιακή διαδικασία της καρκινογένεσης του προστάτη και μακρά περίοδο λανθάνουσας κατάστασης του το καθιστούν τον καρκίνο του προστάτη ιδανικό για χημειοπροφύλαξη [1]. Ο υποδοχέας ανδρογόνων (AR) μονοπάτι σηματοδότησης, η οποία είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του προστάτη και την κανονική λειτουργία, είναι κεντρικής σημασίας για την παθογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [2], [3]. Το ένζυμο κλειδί στη σηματοδότηση AR, 5α-αναγωγάσης, μετατρέπει την τεστοστερόνη στο πιο ισχυρός ανδρογόνο διυδροτεστοστερόνη (DHT) [4]. Παρά το γεγονός ότι η τεστοστερόνη μπορεί να συνδεθεί με και ενεργοποιούν τον AR, DHT συνδέεται σε αυτό με ένα ρυθμό διαχωρισμού τρεις φορές βραδύτερη από εκείνη της τεστοστερόνης [5], [6].

Τρεις ισοένζυμα της 5α-αναγωγάσης, τα οποία κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια (

SRD5A1

,

SRD5A2

, και

SRD5A3

), έχουν εντοπιστεί. Ανοσοϊστοχημική και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) αναλύσεις των ανθρώπινων ιστών του προστάτη υποδεικνύουν ότι τα επίπεδα SRD5A1 και SRD5A2 αλλάζουν με ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη [7], [8], [9].

In vitro

μελέτες έχουν επιβεβαιώσει τη δραστικότητα 5α-αναγωγάσης της πιο πρόσφατα-προσδιορίζονται SRD5A3 [10], το οποίο υπερεκφράζεται σε ορμονικά πυρίμαχων ιστούς καρκίνου του προστάτη [10], [11]. Knockdown του

SRD5A3

έκφραση μείωσε επίσης την ανάπτυξη και τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων προστάτη [10]. Με τη χρήση ενός μονοκλωνικού αντισώματος, Godoy et al. περαιτέρω έδειξαν αυξημένο επίπεδο SRD5A3 πρωτεΐνης στο καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με καλοήθη ιστούς του προστάτη [12]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι SRD5A3 μπορεί να συνεισφέρει στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη. Έχει επίσης αναφερθεί πρόσφατα ότι SRD5A3 μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην πρωτεΐνη γλυκοζυλίωσης [13]. Μεταλλάξεις του

SRD5A3

να οδηγήσει σε συγγενείς ανωμαλίες [13], [14] και το σύνδρομο Kahrizi [15].

Δύο αναστολείς της 5α-αναγωγάσης έχουν δοκιμαστεί κλινικά. Η φιναστερίδη αναστέλλει ειδικά SRD5A2 δραστηριότητα [16], και dutasteride αναστέλλει ότι τόσο SRD5A1 και SRD5A2 [17]. Η πρόληψη του καρκίνου του προστάτη Trial (PCPT) έδωσε ενθαρρυντικά αποτελέσματα: φιναστερίδη μείωσε τη συνολική επίπτωση του καρκίνου του προστάτη κατά 25%, αν και πιθανές επιπτώσεις των όγκων υψηλής ποιότητας ήταν σχετικά [18]. Ομοίως, η μείωση από Dutasteride του καρκίνου του προστάτη Εκδηλώσεις (ΜΕΙΩΣΗ) μελέτη έδειξε ότι dutasteride μείωσε τη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του προστάτη κατά 23% μεταξύ των ανδρών υψηλού κινδύνου και δεν αποκάλυψε καμία στατιστικά σημαντική αύξηση της υψηλής ποιότητας όγκου σε Dutasteride που έλαβαν οι άνδρες [19] , [20].

Τρεις παράγοντες μπορεί να αναθέτει απάντηση ή αντίσταση στην 5α-αναγωγάσης αναστολείς. Πρώτον, η απόκριση ή αντίσταση μπορεί να προκύψει από την παρουσία διαφορετικών ισοενζύμων [21]. Δεύτερον, οι διαφορές στην ευαισθησία μπορεί να παρέχεται από

SRD5A2

γονοτυπική παραλλαγές [22]? Μακριδάκης et al. [23] έδειξε

in vitro

που

SRD5A2

παραλλαγές έχουν διαφορετικές συγγένειες για φιναστερίδη. Τρίτον, τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης θα μπορούσαν να συμβάλουν τόσο την ευαισθησία και την αντοχή. Σε αντίθεση με ανδρογόνων, η οποία μειώνει την τεστοστερόνη του προστάτη και DHT, η αναστολή της δραστικότητας 5α-αναγωγάσης μειώνει DHT αλλά αυξάνει την τεστοστερόνη [24], [25], [26]. Δεδομένου ότι οι αναστολείς 5α-αναγωγάσης αλλάξετε την αναλογία τεστοστερόνης-to-DHT, και με δεδομένο τον κρίσιμο ρόλο της 5α-αναγωγάσης στη σηματοδότηση AR, τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της 5α-αναγωγάσης μπορεί να παρέχει ενδείξεις για αντίδραση και αντίσταση στην 5α-αναγωγάσης αναστολέων στην πρόληψη του καρκίνου του προστάτη .

Τα ανδρογόνα μπορούν να επηρεάσουν την έκφραση του

SRD5A1

και

SRD5A2

σε διαφορετικούς ιστούς και κυτταρικούς τύπους. Στον κοιλιακό προστάτη του αρουραίου, θετική ρύθμιση του

SRD5A2 από

ανδρογόνων έχει αναφερθεί [27], και στους όρχεις αρουραίων, αρνητική ρύθμιση του

SRD5A1

[28]. Ανδρογόνων οδήγησε σε μειωμένη ανοσοχρώση της 5α-αναγωγάσης [29].

SRD5A1

και

SRD5A2

ρυθμίζονται επίσης από τεστοστερόνης και DHT σε Τ και Β λεμφοκυττάρων [30] και στο ήπαρ του αρουραίου και του εγκεφάλου [31], [32], [33], [ ,,,0],34]. Ωστόσο, το πώς η έκφραση 5α-αναγωγάσης ρυθμίζεται σε ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη δεν έχει ερευνηθεί εκτενώς.

πρωταρχικός σκοπός αυτής της μελέτης μας ήταν έτσι να αξιολογηθεί ρύθμιση ανδρογόνου των ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης σε ανθρώπινα κύτταρα του προστάτη. Ερευνήσαμε περαιτέρω το εάν οι ρυθμιστικές επιπτώσεις των ανδρογόνων για τα 5α-αναγωγάσες μεσολάβηση AR και αν υπάρχει μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ του

cis-ρυθμιστικών στοιχείων

των ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης και AR.

τα δεδομένα μας απέδειξαν τύπου ειδική ρύθμιση ανδρογόνου κυττάρων των ισοενζύμων που διαμεσολαβείται από AR. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι το Ar μπορεί να συνδέονται απευθείας προς το αρνητικό στοιχείο ανδρογόνων απόκρισης (nare) του

SRD5A3

υποκινητή σε LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα ευρήματά μας μπορεί να έχει κλινικές επιπτώσεις για τον εντοπισμό τους άνδρες των οποίων η νόσος μπορεί να ωφεληθούν από τους αναστολείς της 5α-αναγωγάσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και πολιτισμών

PWR-1E, LNCaP, και τα κύτταρα VCAP ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)? ΒΡΗ-1-GFP, ΒΡΗ-1-AR, και C4-2B4 κύτταρα ήταν ένα δώρο από τον Dr. Sue-Hwa Lin (Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, Houston, TX)? και LAPC-4 κύτταρα ευγενώς από τον Dr. Robert Reiter (University of California, Los Angeles, CA).

κύτταρα PWR-1E διατηρήθηκαν σε μέσο κερατινοκυττάρων χωρίς ορό (Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με /mL εκχυλίσματος 50 μg υπόφυσης βοοειδούς, 5% Ε-γλουταμίνη, και 5 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα. LNCaP, C4-2B4, ΒΡΗ-1-GFP, και τα κύτταρα ΒΡΗ-1-AR διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (P /S). LAPC-4 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσον του Iscove τροποποιημένο κατά Dulbecco (Invitrogen) συμπληρωμένου με 5% FBS και 1% Ρ /δ. κύτταρα VCAP διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% Ρ /δ. Όλες οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο αέρα με 5% CO

2. Οι κυτταρικές γραμμές επικυρώθηκαν σε Χαρακτηρίζεται Γραμμή MD Anderson του κυττάρου Πυρήνας από STR αποτυπωμάτων DNA χρησιμοποιώντας το κιτ AmpFℓSTR Identifiler (Applied Biosystems, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Τα προφίλ STR συγκρίθηκαν με τις γνωστές δακτυλικά αποτυπώματα ATCC, με την κυτταρική γραμμή Ολοκληρωμένη Μοριακής ταυτότητας Database έκδοση 0.1.200808 (https://bioinformatics.istge.it/clima/) [35], και στη βάση δεδομένων δακτυλικών αποτυπωμάτων MD Anderson του. Τα προφίλ STR της PWR-1E, LNCaP, C4-2B4, και τα κύτταρα vcap συμφωνημένα γνωστά τα δακτυλικά αποτυπώματα DNA? εκείνες του ΒΡΗ-1-AR και LAPC-4 κύτταρα ήταν μοναδικά.

Ποσοτική αντίστροφης μεταγραφής PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από κάθε κυτταρική γραμμή με τη χρήση ενός RNeasy Plus μίνι κιτ (Qiagen Inc., Valencia, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός TaqMan One-Step κιτ RT-PCR (Applied Biosystems, Life Technologies Corp.), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, η ρύθμιση qRT-PCR για κάθε αντίδραση ήταν 48 ° C για 30 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά, και 42 κύκλοι των 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό. Ανθρώπινη β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ο ενδογενής έλεγχος σε κάθε αντίδραση. Primer και ανιχνευτές για

SRD5A1

,

SRD5A2

, και

SRD5A3

γονίδια ήταν επίσης από την Applied Biosystems.

θεραπεία ανδρογόνων

Η τεστοστερόνη και DHT αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). R1881, ένα συνθετικό ανδρογόνο, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Sue-Hwa Lin. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων με κανονικό μέσο ανάπτυξης τους. Μετά ασιτία ορού όλη τη νύκτα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αιθανόλη (έλεγχος) ή σε 1 ηΜ, 10 ηΜ, ή 100 ηΜ ανδρογόνων. Μετά από 24 ώρες και 48 ώρες επώαση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το RNA εκχυλίζεται για ανάλυση qRT-PCR.

ακτινομυκίνη D θεραπεία

ΒΡΗ-1-AR, LNCaP, και PWR-1E κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO? έλεγχος) ή 1 μg /mL ή 5 μg /mL του ακτινομυκίνη D για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από αιθανόλη (έλεγχος) ή 10 ηΜ DHT. Μετά από επώαση 24 ωρών, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το συνολικό RNA εξάγεται.

Η επιμόλυνση με μικρά RNA παρεμβολής (siRNA)

Για να γκρεμίσουμε έκφραση AR, έχουμε σπαρμένα κύτταρα LNCaP σε πλάκες 12 φρεατίων, ορό τους πεινασμένο τη διάρκεια της νύχτας, και στη συνέχεια να τα επιμολυσμένα με 20 nM AR siRNA ή τον έλεγχο siRNA με τη χρήση DharmaFECT 1 (Dhamarcon, Inc., Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Μετά την επώαση όλη την νύχτα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αιθανόλη (έλεγχος) ή 2 ηΜ DHT. Οι AR siRNA και ελέγχου siRNA ελήφθησαν από Dhamarcon.

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά από 24 ώρες επώασης με siRNA, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στις 5000 rpm για 5 λεπτά. Τα κυτταρικά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Boston Bioproducts, Inc., Ashland, ΜΑ) με αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Mannheim, Germany), επωάστηκαν για 20 λεπτά με περιστασιακή ανάμιξη στροβιλισμού, και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο αποχύθηκε και φυλάχθηκε για κηλίδωση Western. Η όλη διαδικασία πρωτεΐνη-εκχύλιση διεξήχθη στους 4 ° C, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη χρήση της ανιχνεύσεως BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, ΜΑ). Το υπερκείμενο έβρασε για 5 λεπτά, φορτώθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, τρέχει, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, το οποίο στη συνέχεια αποκλείστηκε σε TBST (TBS με 0,2% Tween 20) + 5% γάλα για 1 ώρα πριν ανιχνεύθηκαν με αντι-AR αντίσωμα (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) σε ρυθμιστικό διάλυμα παρεμπόδισης όλη τη νύκτα στους 4 ° C, και ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με δευτερογενή υπεροξειδάση αρμορακίας-συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός κιτ ηλεκτροχημειοφωταύγειας (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ).

λουσιφεράσης δοκιμασία

Το

SRD5A3

υποκινητή (-1027 /+ 155 bp) κλωνοποιήθηκε στον βασικό φορέα pGL2 (Promega Corp., Madison, WI) στις θέσεις XhoI και ΜΙυΙ, όπως ήταν περαιτέρω κατασκευάσματα διαγραφής. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με αυτά τα κατασκευάσματα, χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Fugene 6 (Roche) ή Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Για να δοκιμαστεί η AR-εξαρτώμενη ικανότητα καταστολής του SRD5A3, μπορούμε επίσης να εισαχθεί προαγωγέα του (-191 /-72 bp) στο κατασκεύασμα pGL3-4ARE-Ε4-Luc στις θέσεις PstI και Xhol. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με αυτό και στη συνέχεια καλλιεργούνται σε απουσία και παρουσία του DHT για 24 ώρες.

Μια δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Promega. Η αναλογία λουσιφεράσης προήλθε από τη διαίρεση της δραστηριότητας λουσιφεράσης από το

ΚβηϊΙΙβ

δραστηριότητα.

Μεταλλαξιογένεση

Οι μεταλλάξεις έγιναν στην περιοχή nare του

SRD5A3

υποκινητή με τη χρήση ενός τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση κιτ QuickChange II XL (Strategene, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ακολουθία CTGTTTTGCGTCT μεταλλάχθηκε σε ATTTTTTTATTAT στο πλαίσιο της pGL3-4ARE-Ε4-Luc κατασκεύασμα.

δοκιμασία κινητικότητας μετατόπισης ηλεκτροφορητικής (EMSA)

AR για σύνδεση με δίκλωνο ολίγο αξιολογήθηκε σε πυρηνικά εκχυλίσματα LNCaP κυττάρων εκτελώντας EMSA με ένα κιτ LightShift (όλα τα κιτ για EMSA ήταν από Thermo Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. εκχυλίσματα πυρηνική πρωτείνη απομονώθηκαν από κύτταρα LNCaP, και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με τη χρήση ενός κιτ δοκιμασίας BCA πρωτεΐνης. Ολίγος έχουν σχεδιαστεί για να καλύψει την περιοχή -191 /-91 για το

SRD5A3

υποκινητή και επισημαίνονται με τη χρήση ενός κιτ βιοτίνη 3′-άκρο επισήμανση DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. AR πρόσδεση σε δίκλωνο oligos αξιολογήθηκε σε πυρηνικά εκχυλίσματα LNCaP κυττάρων με EMSA χρησιμοποιώντας κιτ LightShift σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Unlabeled ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν σε EMSA ως ένα από τους ελέγχους. Βιοτίνη σημασμένο DNA ανιχνεύθηκε επί της μεμβράνης νάιλον με τη χρήση ενός κιτ χημειοφωταύγειας μονάδα ανίχνευσης νουκλεϊνικού οξέος.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασία

LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν τόσο στην παρουσία και απουσία 100 ηΜ DHT, και το chip διεξήχθη με τη χρήση ενός κιτ από Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, ΜΑ), σύμφωνα με το πρωτόκολλο τους. Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 37% φορμαλδεΰδη για να συνδέσει εγκάρσια πρωτεΐνες στο DNA. Cross-linked χρωματίνη χωνεύτηκε με μικροκοκκική νουκλεάση σε μήκος 150-900 bp, και οι πυρηνικές μεμβράνες έσπασαν με υπερήχους. AR-ειδικά αντισώματα (Dako) χρησιμοποιήθηκαν για να καθιζάνουν των βραχέων θραυσμάτων χρωματίνης, τα οποία στη συνέχεια πλύθηκαν και εκλούστηκαν. Οι διασυνδέσεις πρωτεΐνη-DNA αντιστράφηκαν και το DNA καθαρίζεται περαιτέρω με χρήση στηλών περιστροφής σε κάθε αντίδραση PCR. Το έναυσμα για την nare ήταν CTGTTTTGCGTCTTTGCTTCTG, και ο αντίστροφος εκκινητής ήταν GAGGTCCTTGGTCCTGGTC, που ενισχύουν ένα 120-bp προϊόν.

μοντέλα ξενομοσχεύματος

RNA από το MDA προστάτη 183, MDA προστάτη 144, MDA προστάτη 146 και MDA προστάτη μοντέλα 155 ξενομοσχευμάτων παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Sankar Ν Maity και ο Δρ Νόρα Μ Navone. Το MDA προστάτη 183 ξενομόσχευμα προήλθε από καρκίνωμα του προστάτη ανδρογόνο-εξαρτώμενη, ενώ οι υπόλοιποι προέρχονται από AR-αρνητικό ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη καρκινώματα με καρκίνωμα μικρών κυττάρων του προστάτη (SCPC) μορφολογία.

Η ποσοτικοποίηση της σχετικής mRNA επίπεδο ξενομόσχευμα

SRD5A3

και του ειδικού προστατικού αντιγόνου (

PSA

) έγινε με τη χρήση qRT-PCR με SYBR Green (Applied Biosystems, Inc.). qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στο [36]. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: SRD5A3: προς τα εμπρός, 5′-TCCAAGCTGGCTTCATGGTT-3 ‘που βρίσκεται στο εξόνιο 2 και αντίστροφη, 5′-CACTCGAAGAGTCTTCGTAA-3′ που βρίσκεται στο εξόνιο 3? PSA: προς τα εμπρός, 5’-GAGAGCTGTGTCACCATGTG-3 ‘που βρίσκεται στο εξόνιο 1 και αντίστροφη, 5′-CACAATCCGAGACAGGATGA-3’ που βρίσκεται στο εξόνιο 2.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. Δύο όψεων

t

δοκιμές έγιναν για βοήθεια μεταξύ των δειγμάτων των ανδρογόνων που έλαβαν και τους ελέγχους σύγκριση. Σημαντικότητας ορίστηκε στο αξία ap 0,05.

Αποτελέσματα

Όλα τα τρία ισοένζυμα της 5α-αναγωγάσης είναι παρούσες στα δοκιμάζονται κυττάρων του προστάτη γραμμές τα ανθρώπινα, με ποικίλες μορφές έκφρασης

Για την αναγνώριση καλό μοντέλο συστήματα για τη μελέτη των λειτουργιών των ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης, αξιολογήσαμε τα επίπεδα mRNA των ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές προστάτη, συμπεριλαμβανομένων PWR-1E αθανατοποιημένων κανονική επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη? κύτταρα ΒΡΗ-1-AR καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΒΡΗ), τα οποία εκφράζουν σταθερά AR? LAPC-4 και LNCaP καρκίνου του προστάτη κύτταρα ανδρογόνο ευαίσθητα? και C4-2B4 ανεξάρτητος από ανδρογόνο κύτταρα. PWR1-Ε, ΒΡΗ-1-AR και LAPC-4 κύτταρα εκφράζουν άγριου τύπου AR, ενώ LNCaP και C4-2B4 κύτταρα εκφράζουν ένα μεταλλαγμένο AR, T877A. (Τα χαρακτηριστικά αυτών των κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένης της πηγής τους, ανδρογόνων ευαισθησία, και την κατάσταση AR-έκφραση, συνοψίζονται στον Πίνακα S1.) Όπως Σχήμα 1 απεικονίζει, το mRNA και των τριών ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης ανιχνεύθηκε σε ανάλυση qRT-PCR κάθε κυτταρική γραμμή, υποδεικνύοντας ότι και οι τρεις εκφράζονται σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, το επίπεδο του mRNA του κάθε ισοενζύμου διέφερε μεταξύ των κυτταρικών σειρών, και κάθε ισοένζυμο είχε ένα ξεχωριστό πρότυπο έκφρασης.

Γραφήματα απεικονίζουν τα σχετικά επίπεδα mRNA του

SRD5A1

,

SRD5A2

και

SRD5A3

ισοένζυμα σε PWR-1E, ΒΡΗ-1-AR, LAPC-4, LNCaP και C4-2B4 κυττάρων, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση qRT-PCR.

η

τα επίπεδα 5α-αναγωγάσης mRNA ρυθμίζεται από ανδρογόνα σε ένα κύτταρο τύπου-ειδικό τρόπο

Για να δοκιμαστεί εάν το επίπεδο του mRNA της 5α-αναγωγάσης ρυθμίζεται από ανδρογόνα, εμείς κατεργασμένα κύτταρα LNCaP είτε με αιθανόλη (δηλαδή, όχημα μόνο) ή με τεστοστερόνη ή DHT σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1, 10, και 100 ηΜ). Η φυσιολογική συγκέντρωση πλάσματος της τεστοστερόνης στους άνδρες κυμαίνεται από 350 να 1050 ng /dL (12,1 έως 36,4 ηΜ) [37], και το επίπεδο ευνουχισμού τεστοστερόνης είναι μικρότερη από 50 ng /dL (1.73 ηΜ) [38]. Η συγκέντρωση του DHT πλάσμα είναι περίπου το 1/10 της συγκέντρωσης τεστοστερόνης [39], [40]. Έτσι, κατεργασμένα κύτταρα με συγκεντρώσεις ανδρογόνων που βρίσκονται κοντά στο ευνουχισμού, φυσιολογικές, και superphysiologic επίπεδα. Ανάλυσή μας qRT-PCR έδειξε ότι η θεραπεία DHT οδήγησε σε αυξημένο επίπεδο

SRD5A1

mRNA, ενώ οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα του

SRD5A2

και

SRD5A3

mRNA σε LNCaP του προστάτη καρκινικά κύτταρα (Εικ. 2Α).

Α, κύτταρα LNCaP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αιθανόλη (όχημα μόνο) ή διάφορες συγκεντρώσεις της DHT (1 ηΜ, 10 ηΜ, 100 ηΜ) για 24 και 48 ώρες. PWR-1E (Β), ΒΡΗ-1-AR (C), LAPC-4 (D), και τα κύτταρα C4-2B4 (Ε) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο, αλλά για μόνο για 24 ώρες. Τα επίπεδα mRNA του

SRD5A1

,

SRD5A2

, και

SRD5A3

για όλες τις κυτταρικές σειρές ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001? 2-sided

t

τεστ.

Η

Δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση της DHT σε άλλες κυτταρικές σειρές. DHT δεν επηρέασε σημαντικά το επίπεδο mRNA του 5α-αναγωγάσης σε κύτταρα PWR-1Ε (Εικ. 2Β), ενώ σε ΒΡΗ-1-AR κύτταρα, DHT αύξησε τα επίπεδα του mRNA και των τριών ισοενζύμων (Σχ. 2C). Σε LAPC-4 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν άγριου τύπου AR, DHT επάνω ρυθμισμένη έκφραση SRD5A1 χωρίς να επηρεάζει SRD5A2 και έκφραση SRD5A3 (Σχ. 2D). Και στα ανδρογόνα ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη C4-2B4 κύτταρα, DHT ρυθμιζόμενη έκφραση 5α-αναγωγάσης παρομοίως με ρύθμιση της στα κύτταρα LNCaP, αλλά σε μικρότερο βαθμό (Εικ. 2Ε).

Βρήκαμε ενδιαφέρον το γεγονός ότι DHT ρυθμίζει το επίπεδο του mRNA της

SRD5A3

σε ένα κελί τύπου-ειδικό τρόπο, ένα εύρημα δεν έχουμε δει αναφέρθηκαν πριν. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον αυτό συμβαίνει μόνο σε LNCaP κυτταρικές γραμμές που παράγονται LNCaP ή, εμείς παρομοίως κατεργασμένα κύτταρα VCAP, τα οποία προέρχονται από ένα οστό ξενομοσχεύματος μετάστασης του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. DHT επίσης κάτω-ρυθμίζονται τα επίπεδα του mRNA της

SRD5A3

στα κύτταρα vcap (Σχήμα S1), υποδεικνύοντας ότι τα ανδρογόνα αρνητική ρύθμιση του

SRD5A3

δεν είναι ειδικά για LNCaP που προέρχονται από κυτταρικές σειρές LNCaP ή.

η τεστοστερόνη και R1881 είχε αποτελέσματα παρόμοια με εκείνα της DHT στην έκφραση της 5α-αναγωγάσης σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήματα S2 και S3). έτσι δεδομένα μας καταδεικνύουν ότι τα ανδρογόνα ρυθμίζουν το επίπεδο του mRNA ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης σε ένα κύτταρο τύπου-ειδικό τρόπο.

Κανονισμός του επιπέδου mRNA 5α-αναγωγάσης λαμβάνει χώρα μέσω μεταγραφής

Τα ανδρογόνα θα μπορούσε να ρυθμίσει 5α- αναγωγάσης έκφρασης με έλεγχο της μεταγραφής 5α-αναγωγάσης ή επηρεάζοντας τη σταθερότητα του mRNA. Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό που διέπουν τη ρύθμιση της 5α-αναγωγάσης από ανδρογόνα, που αντιμετωπίζονται κύτταρα ΒΡΗ-1-AR με ακτινομυκίνη D, έναν αναστολέα της μεταγραφής. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της ανάλυσης qRT-PCR στο σχήμα 3, DHT αυξημένος έκφραση και των τριών ισοενζύμων 5α-αναγωγάσης σε σχέση με εκείνη στην αιθανόλη (όχημα) έλεγχος σε ΒΡΗ-1-AR κύτταρα. Ωστόσο, το επίπεδο του mRNA της 5α-αναγωγάσης δεν άλλαξαν με την θεραπεία DHT όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με ακτινομυκίνη D σε 1 μg /mL και συγκεντρώσεις /mL 5 μg (Σχ. 3Α). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης 5α-αναγωγάσης από ανδρογόνα είναι ευαίσθητο σε ακτινομυκίνη D θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα ανδρογόνα ρυθμίζουν τη μεταγραφή του 5α-αναγωγάσης.

ΒΡΗ-1-AR (Α) και LNCaP ( Β), και PWR-1E (κύτταρα C) υποβλήθηκαν σε αγωγή για 30 λεπτά με DMSO (όχημα μόνο έλεγχος) ή ακτινομυκίνη D σε 1 μg /mL και συγκεντρώσεις 5 μg /mL. Η θεραπεία είτε με αιθανόλη (όχημα μόνο) ή 10 ηΜ DHT ή η τεστοστερόνη ακολούθησε. Εμείς ποσοτικά τα επίπεδα του mRNA της

SRD5A1

,

SRD5A2

, και

SRD5A3 από

qRT-PCR.

Η

Ομοίως, όταν τα κύτταρα LNCaP ήταν αντιμετωπίζονται με ακτινομυκίνη D, η τεστοστερόνη δεν αυξάνει σημαντικά την

SRD5A1

ή ελάττωση

SRD5A2

και

SRD5A3

επίπεδα του mRNA (Εικ. 3Β). Ως αρνητικός έλεγχος, θα αντιμετωπίζονται επίσης κύτταρα PWR-1E με ακτινομυκίνη D, ακολουθούμενη από επεξεργασία DHT (Σχ. 3C). Στην περίπτωση του DMSO μόνο για τον έλεγχο, DHT δεν επηρέασε το επίπεδο του mRNA της

SRD5A1

,

SRD5A2

, ή

SRD5A3

. Με τη θεραπεία ακτινομυκίνη D, DHT δεν μετέβαλε σημαντικά το επίπεδο mRNA αυτών των γονιδίων, είτε.

Κανονισμός του επιπέδου mRNA της 5α-αναγωγάσης από ανδρογόνα είναι AR εξαρτάται

Με τη χρήση κηλίδωση Western, διαπιστώσαμε η έκφραση του AR σε κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν σε σύγκριση με εκείνη των AR-αρνητικά κύτταρα ΒΡΗ-1-GFP (Εικ. 4Α).

Α, το επίπεδο της πρωτεΐνης AR κάθε κυτταρική σειρά προστάτη ήταν αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. κύτταρα ΒΡΗ-1-GFP χρησιμοποιήθηκαν ως ένας αρνητικός έλεγχος για έκφραση AR. Β, Το επίπεδο της πρωτεΐνης AR αναλύθηκε με κηλίδωση Western για τα κύτταρα LNCaP (αριστερά) με τρεις ελέγχου και δύο αγωγές AR siRNA. Το επίπεδο AR mRNA αναλύθηκε με qRT-PCR για κύτταρα PWR-1E (δεξιά), επίσης με τρεις ελέγχου και δύο αγωγές AR siRNA. C, LNCaP και PWR-1E κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με siRNAs ελέγχου και AR siRNAs και στη συνέχεια κατεργάζεται με 2 ηΜ DHT. Μετρήσαμε τα επίπεδα του mRNA της

SRD5A1

,

SRD5A2

, και

SRD5A3

χρησιμοποιώντας qRT-PCR και ομαλοποιηθούν οι τιμές σε β-ακτίνη. Οι μεταβολές στα επίπεδα mRNA με θεραπεία DHT που φαίνεται σε σχέση με τα επίπεδα σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με όχημα μόνο. ​​

Η

Για να καθοριστεί εάν AR απαιτείται να μεσολαβήσει ρύθμιση της έκφρασης 5α-αναγωγάσης από ανδρογόνα, εκτελέσαμε Western κηλίδωση και την ανάλυση qRT-PCR μετά την αγωγή LNCaP και PWR-1E κυττάρων με AR siRNAs και στη συνέχεια με 2 ηΜ DHT. Western και qRT-PCR επικύρωσε την αποτελεσματική εξουδετέρωση της έκφρασης AR από το AR siRNAs (Εικ. 4Β). qRT-PCR έδειξε ότι τα siRNAs ελέγχου δεν μετέβαλε σημαντικά την επίδραση της DHT στα επίπεδα 5α-αναγωγάσης σε LNCaP κύτταρα (Σχ. 4C, κορυφή). θεραπεία DHT μόνη της οδήγησε σε αύξηση

SRD5A1

mRNA αλλά μειώθηκε

SRD5A2

και

SRD5A3

mRNA (σχ. 4C, κορυφή). Σε αντίθεση, τα επίπεδα 5α-αναγωγάσης σε κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με AR siRNAs δεν άλλαξαν σε απόκριση σε θεραπεία με DHT (Εικ. 4C, κορυφή). Όταν αντιμετωπίζονται LAPC-4 κύτταρα με παρόμοιο τρόπο,

SRD5A1

mRNA ομοίως αυξήθηκε με DHT ή η τεστοστερόνη θεραπεία μόνη της, αλλά όχι όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με AR siRNA (Σχήμα S4). Όταν επεξεργασμένα κύτταρα PWR-1Ε με τον ίδιο τρόπο, DHT δεν επηρέασε το επίπεδο mRNA του 5α-αναγωγάσης σε κύτταρα PWR-1Ε, ανεξάρτητα από το εάν έλαβαν θεραπεία με τα siRNA ελέγχου ή AR siRNAs (Εικ. 4C, κάτω).

Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση της 5α-αναγωγάσης από ανδρογόνα είναι AR εξαρτάται.

SRD5A3

υποκινητή περιέχει ένα ρουθούνι

Δείξαμε ότι ανδρογόνων ρυθμίζει τη μεταγραφή του 5α-αναγωγάσης, και ότι το AR είναι απαραίτητο να μεσολαβήσει αυτή μεταγραφική ρύθμιση. AR συνδέεται άμεσα με τον Άρη και ρυθμίζει τη μεταγραφή των γονιδίων AR-στόχο. Έτσι, ερευνήσαμε αν AR μπορεί να ρυθμίσει άμεσα την μεταγραφή του 5α-αναγωγάσης. Εμείς κλωνοποιηθεί μια περιοχή προαγωγού του

SRD5A3

(-1.027 να +155 bp) στο pGL2-βασικό φορέα. Σε κύτταρα LNCaP, αυτό το κατασκεύασμα έκφρασης λουσιφεράσης κινεί και, όταν είναι σε κατεργασία με 100 ηΜ DHT, μια μείωση κατά 75% των αποτελεσμάτων λουσιφεράσης δραστηριότητας (εικ. 5Α). Αυτό είναι παρόμοιο με την απόκριση του ενδογενούς

SRD5A3

να ανδρογόνων θεραπεία σε κύτταρα LNCaP. Έτσι, η ARE μπορεί να βρίσκεται σε αυτή την περιοχή του υποκινητή 1-kb του

SRD5A3

.

Α, διαγραφή ανάλυση των

SRD5A3

υποκινητή για να περιορίσετε τη θέση του nARE- που περιέχει την περιοχή. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με λουσιφεράση κατασκευάσματα που περιέχουν μια σειρά διαγραφής του

SRD5A3

υποκινητή και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αιθανόλη (όχημα μόνο? -ΟΗΤ) ή 100 ηΜ DHT (+ DHT) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν, και τα προϊόντα λύσης τους χρησιμοποιήθηκαν για την δοκιμασία λουσιφεράσης. Β,

SRD5A3

έχει ένα ρουθούνι. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με pGL3-4ARE-Ε4 κατασκευάσματα με και χωρίς εισαγωγή της αλληλουχίας

SRD5A3

υποκινητή (-191 /-72 bp) σε δύο προσανατολισμούς ή με εισαγωγή ενός

SRD5A1

υποκινητή θραύσματος (-1601 /-1501 bp). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αιθανόλη (όχημα μόνο) ή 100 ηΜ DHT για 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για τη δοκιμασία λουσιφεράσης. C, Μεταλλάξεις στο nare καταργηθεί κατασταλτική δράση της. LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με pGL3-4ARE-Ε4 κατασκευάσματα με και χωρίς την εισαγωγή του

SRD5A3

υποκινητή (-191 /-72 bp) ή με την εισαγωγή του μεταλλαγμένου

SRD5A3

προαγωγό (-191 /-72 bp) και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε θεραπεία DHT και τη δοκιμασία λουσιφεράσης

η

για την αναγνώριση των θεωρούμενων ΕΙΝΑΙ, κάναμε μια σειρά κατασκευασμάτων διαγραφής στο

SRD5A3

περιοχή του υποκινητή.? οι κατασκευές διατηρούνται ανταπόκριση σε ανδρογόνα θεραπεία μέχρι να διαγραφούν τα -191 /-91 bps, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υποτιθέμενη ARE βρίσκεται στην περιοχή αυτή (Εικ. 5Α).

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω κατά πόσον αυτή η περιοχή περιέχει πράγματι ένα ρουθούνι , εισαγάγαμε την περιοχή του -191 /-72 bp μεταξύ του πυρήνα υποκινητή 4ARE και Ε4 στο κατασκεύασμα pGL3-4ARE-Ε4-Luc [41], τα επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP με αυτό, και στη συνέχεια κατεργάζεται τα κύτταρα με DHT. Το κατασκεύασμα pGL3-4ARE-Ε4-Luc περιλαμβάνει τέσσερις διαδοχικές επαναλήψεις του είναι του

PSA

γονιδίου και ένα πυρήνα υποκινητή Ε4 [41]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, θεραπεία DHT που προκαλείται από περίπου 24-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα της λουσιφεράσης της pGL3-4ARE-Ε4-Luc κατασκεύασμα. Όταν το -191 /-72-bp περιοχής του

SRD5A3

υποκινητή εισήχθη μεταξύ 4ARE και Ε4, η δραστικότητα της λουσιφεράσης αυξήθηκε μόνο 3- έως 6-πλάσια από επεξεργασία DHT, υποδηλώνοντας ότι αυτή η περιοχή περιέχει ένα nare. Όταν ένα 101-bp περιοχής που προέρχεται από το

SRD5A1

προαγωγό (-1601 /-1501 bp) παρομοίως εισάγεται μεταξύ 4ARE και Ε4 ως έλεγχος, θεραπεία DHT ακόμη προκάλεσε μια 26 φορές αύξηση στη δραστηριότητα λουσιφεράσης. Επιπλέον, μεταλλάξεις στο -191 /-72-bp περιοχής του

SRD5A3

καταργηθεί κατασταλτική ικανότητά του (Εικ. 5C). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το

SRD5A3

έχει μια λειτουργική nare στο υποστηρικτής του.

AR έχει προσληφθεί στο Nare που περιέχουν περιοχή των

SRD5A3

Η

για να διερευνηθεί κατά πόσο AR στρατολογείται στον υποκινητή του

SRD5A3 in vivo

, πραγματοποιήσαμε ChIP χρησιμοποιώντας θραύσματα γενωμικού DNA από κύτταρα LNCaP (150 – 900 bp? Εικ. 6Α) με εκκινητές που στοχεύουν ειδικά την περιοχή nare του

SRD5A3

. Όπως φαίνεται στην PCR, AR εμπλουτίστηκε στην περιοχή nare όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν με την παρουσία του DHT (Εικ. 6Β). Φυσιολογική ανοσοσφαιρίνη ποντικού G (ως αρνητικός έλεγχος) χρησιμοποιήθηκε επίσης για ανοσοκαταβύθιση με LNCaP γονιδιωματικό DNA? η ανοσοσφαιρίνη G δεν γκρεμίζουν κάθε ακολουθίες DNA AR-συνδέεται του

SRD5A3

υποκινητή (Εικ. 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι AR προσλαμβάνεται στην περιοχή Nare στον προαγωγό του

SRD5A3

.

Α, ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης του πέψη χρωματίνης των κυττάρων LNCaP που αναπτύχθηκαν απουσία και παρουσία 100 ηΜ DHT. DNA θραύσματα γενικά κυμαίνονται μεταξύ 150 και 900 bp. Β, υπέστη πέψη χρωματίνη κυττάρων LNCaP αναπτύσσονται εν απουσία και παρουσία 100 ηΜ DHT χρησιμοποιήθηκε στο πείραμα ανοσοκατακρήμνισης με αντίσωμα αντι-AR ή φυσιολογική ανοσοσφαιρίνη ποντικού G. Στη συνέχεια, ο διασταυρωμένης σύνδεσης πρωτεΐνης-ΟΝΑ αντιστράφηκε, και καθαρισμένο DNA χρησιμοποιήθηκε σε οι αντιδράσεις PCR με εκκινητές που πλευρίζουν την περιοχή nare. C, Τρεις ιχνηλάτες ολιγο έχουν σχεδιαστεί για να καλύψει την περιοχή bp -191 /-91 στον προαγωγέα του

SRD5A3

. D, AR συνδέεται με το Nare του

SRD5A3

. Οι τρεις (επισημασμένα με βιοτίνη) ανιχνευτές ολιγο επωάστηκαν με πυρηνικό εκχύλισμα LNCaP κυττάρων, με πυρηνικό εκχύλισμα LNCaP κυττάρων συν μη επισημασμένη ανιχνευτές ολίγο, ή με πυρηνικό εκχύλισμα LNCaP κυττάρων συν AR-ειδικό αντίσωμα.

Η

Για να προσδιορίσετε αν AR μπορεί να αλληλεπιδρούν άμεσα με το ρουθούνι του

SRD5A3

, θα πραγματοποιηθεί EMSA με τρεις ανιχνευτές ολίγο, καθένα από τα 40 bp, για την κάλυψη των -191 /-91-bp περιοχής του

SRD5A3

υποκινητή (Εικ. 6C). Μόνο καθετήρα 1 έδειξε μια μετατόπιση της κινητικότητας (Εικ. 6D). Για να επιβεβαιώσετε ότι αυτή η μετατόπιση της κινητικότητας είναι ειδικά για AR, προσθέσαμε αντισώματα αντι-AR με τις αντιδράσεις? καθετήρα 1 παρουσίασαν περαιτέρω μετατόπιση της κινητικότητας (Εικ. 6D). Αν και μη σημασμένο ανιχνευτή άγριου τύπου 1 ήταν σε θέση να ανταγωνιστούν με σημασμένο ανιχνευτή 1 για δέσμευση AR στην EMSA, έχασε ότι η ικανότητα, όταν κάναμε μεταλλάξεις στον ανιχνευτή 1 αλληλουχία (Σχήμα S5).

Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ανιχνευτής 1 περιέχει το ρουθούνι και ότι AR συνδέεται άμεσα με αυτήν την περιοχή

in vitro

.

για

SRD5A1

και

ανάλυση υποστηρικτής SRD5A2

, μπορούμε επίσης να διεξαχθεί και ChIP, αλλά δεν είχαμε ανιχνεύσει μια περιοχής είναι ή άμεση AR δεσμευτική για τις περιφέρειες τους εγγύς υποκινητή. Η regulational μηχανισμός για την έκφρασή τους είναι ακόμα υπό διερεύνηση.

SRD5A3

mRNA αυξήσεις στο AR-αρνητικό μοντέλο SCPC ξενομοσχεύματος

Από την παρατήρηση της ανδρογόνο-αρνητική ρύθμιση της em

SRD5A3

στις δοκιμαζόμενες κυτταρικές σειρές, μας ενδιαφέρει να διερευνηθεί κατά πόσον αυτό το AR-εξαρτώμενη ρύθμιση εμφανίζεται επίσης

in vivo

. Επομένως, εξετάσαμε το επίπεδο mRNA του

SRD5A3

σε διαφορετικά μοντέλα ξενομοσχεύματος, συμπεριλαμβανομένης της MDA PCa 183, ένα AR-εκφράζουν εξαρτώμενων από ανδρογόνα ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη, και τρεις AR-αρνητικών ανεξάρτητος από ανδρογόνο ξενομοσχεύματα SCPC, MDA PCa 144 , MDA PCa 146, και MDA PCa 155. στις qRT-PCR, παρατηρήσαμε μια εντυπωσιακά υψηλότερο επίπεδο του mRNA της

PSA

στην MDA PCa 183 ξενομοσχεύματος από ό, τι τα άλλα (Σχ. 7, κορυφή), που είναι σύμφωνο με την κατάσταση AR αυτών των κυτταρικών σειρών.