Αφηρημένο

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PDAC) είναι μια θανατηφόρα ασθένεια, με πενταετή επιβίωση της τάξης του 3-5%. Οι μεταλλάξεις σε K-Ras βρίσκονται σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις, αλλά K-μεταλλάξεις ras δεν επαρκούν για την ανάπτυξη της PDAC. Πρόσθετοι παράγοντες συμβάλλουν στην ενεργοποίηση της Ras σηματοδότησης και να οδηγήσει σε σχηματισμό όγκου. Γαλεκτίνη-3 (Gal-3), μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη β-γαλακτοσίδη δέσμευσης, εκφράζεται έντονα σε PDAC. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε ο λειτουργικός ρόλος του Gal-3 σε παγκρεατικά εξέλιξη του καρκίνου και τη σχέση του με Ras σηματοδότησης. Η έκφραση του Gal-3 προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία, Q-PCR και ανοσοστύπωμα. Λειτουργικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση παγκρεατικών κυτταρικών γραμμών γενετικά για να εκφράζουν υψηλά ή χαμηλά επίπεδα Gal-3. δραστηριότητα ras εξετάστηκε από Raf δοκιμασίες pull-down. Συν-ανοσοκατακρήμνιση και ανοσοφθορισμό χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι Gal-3 ήταν ιδιαίτερα πάνω ρυθμισμένα σε ανθρώπινους όγκους και σε ένα μεταλλαγμένο μοντέλο ποντικού Κ-Ras του PDAC. Κάτω ρύθμιση του Gal-3 από lentivirus shRNA μειωμένο πολλαπλασιασμό PDAC κυττάρων και εισβολή in vitro και μειωμένο όγκο και το μέγεθος του όγκου σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού. Gal-3 δεσμεύεται Ras και διατηρείται δραστηριότητα Ras? κάτω ρύθμιση Gal-3 μειωμένη δραστικότητα Ras, καθώς και Ras κατάντη σηματοδότησης συμπεριλαμβανομένης φωσφορυλίωσης της ERK και ΑΚΤ και Ral Α δραστηριότητα. Επιμόλυνση του Gal-3 cDNA σε PDAC κύτταρα με χαμηλού επιπέδου Gal-3 επαυξημένης δράση Ras και σηματοδότησης κατάντη της. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι Gal-3 συμβάλλει στην παγκρεατική εξέλιξης του καρκίνου, εν μέρει, με σύνδεση και ενεργοποίηση Ras σηματοδότησης Ras. Gal-3 μπορεί επομένως να είναι ένας πιθανός νέος στόχος για αυτήν την θανάσιμη ασθένεια

Παράθεση:. Song S, Ji Β, Ramachandran V, ο Wang Η, Hafley Μ, Logsdon C, et al. (2012) υπερεκφράζεται γκαλεκτίνη-3 σε καρκίνο του παγκρέατος Προκαλεί κυτταρικού πολλαπλασιασμού και εισβολή από Δεσμευτική Ras και ενεργοποίηση σηματοδότησης Ras. PLoS ONE 7 (8): e42699. doi: 10.1371 /journal.pone.0042699

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23η Φεβρουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 10, Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Αυγούστου 2012

Copyright: © Song et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου χορηγήσει R01CA69480 (RSB), αμερικανικής Γαστρεντερολογικής Association Βραβείο Έρευνας Μελετητή (Σ τραγούδι), και της Υπηρεσίας Δημόσιας Υγείας Grant DF56338, το οποίο υποστηρίζει τις ασθένειες του Τέξας Ιατρικό Κέντρο Πεπτικό Κέντρο (Σ τραγούδι) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) είναι σήμερα η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται, με κατ ‘εκτίμηση 43.140 νέα κρούσματα και 36.800 θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Λόγω της επιθετικής ανάπτυξης της, στις αρχές του μεταστατικού διάδοση και την έλλειψη αποτελεσματικών θεραπειών, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για την ασθένεια αυτή παραμένει στο 3-5% [2]. Σημαντική προσπάθεια έχει ως εκ τούτου έχουν γίνει για την κατανόηση των μοριακών γεγονότων που μπορεί να οδηγήσει την παθογένεια της PDAC. Μεταξύ των πολυάριθμων μοριακές αλλαγές που προσδιορίζονται στην PDAC, οι μεταλλάξεις στο προ-ογκογονίδιο K-Ras βρίσκονται σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις [3] και είναι ένα πρώιμο συμβάν για την ανάπτυξη των PDAC [4]. K-Ras μεταλλάξεις δεν επαρκούν για την ανάπτυξη της PDAC. Οι K-Ras μεταλλάξεις που βρίσκονται συχνά σε χρόνια παγκρεατίτιδα και μπορεί ακόμη και να βρεθούν σε φυσιολογικά άτομα [5]. Επιπλέον, K-Ras μετάλλαξη σε ένα μοντέλο ποντικού με χαμηλή δραστικότητα Ras δεν αυθόρμητα να οδηγήσει στην ανάπτυξη PDAC [6], ενώ K-Ras μετάλλαξη σε ένα μοντέλο ποντικού με ένα υψηλό επίπεδο δραστικότητας Ras σχετίζεται με την ταχεία ανάπτυξη της CP με άφθονη ίνωση και εξέλιξης σε PDAC το οποίο μιμείται την ανθρώπινη ασθένεια [3]. Επομένως, έχει προταθεί ότι είναι η δραστηριότητα της K-Ras και όχι η παρουσία της μετάλλαξης per se η οποία είναι η βιολογικώς σχετικό παράμετρος που σχετίζεται με την παθογένεση του καρκίνου του παγκρέατος. [2] Οι πρόσθετοι παράγοντες που απαιτείται που συμβάλλουν στη δραστηριότητά Ras? Ωστόσο, οι μηχανισμοί με τους οποίους περαιτέρω ενεργοποιείται δραστικότητα Ras είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

γαλεκτίνης-3 (Gal-3), α β-γαλακτοσίδη πρωτεΐνη δέσμευσης παρουσιάζει πλειοτροπικές βιολογικές και παθολογικές λειτουργίες, και έχει ενοχοποιηθεί σε κύτταρο αύξηση, διαφοροποίηση, προσκόλληση, επεξεργασία RNA και κακοήθη μετασχηματισμό [7] – [10]. Gal-3 βρίσκεται σε πολλαπλά κυτταρικά διαμερίσματα, συμπεριλαμβανομένου του κυτταροπλάσματος, στην κυτταρική επιφάνεια, τον πυρήνα, και Gal-3 εκκρίνεται επίσης [11]. Η σημασία της Gal-3 έκφραση έχει αξιολογηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος [12] – [16]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι Gal-3 mRNA ρυθμίζεται προς τα πάνω σε παγκρεατικά ιστούς όγκου σε σύγκριση με τους ιστούς ελέγχου [15], [17], [18], [19], και παροδική καταστολή της γαλεκτίνης-3 έχει αναφερθεί ότι επάγουν παγκρεατική καρκίνος κυτταρική μετανάστευση και εισβολή [16]. Wang et al βρήκαν ότι Gal-3 ήταν επίσης τα πάνω ρυθμισμένη σε χρόνια παγκρεατίτιδα και πρότεινε ότι είχε εμπλακεί σε δύο εξωκυττάρια μήτρα (ECM) μεταβολές και ο σχηματισμός συμπλόκου πόρου [20]. Ωστόσο, η πλήρης σημασία του Gal-3 σε PDAC παραμένει ασαφής και λίγα είναι γνωστά για τους πιθανούς μηχανισμούς λειτουργίας του Gal-3 στην παθογένεση της PDAC. Πρόσφατα, Κίοοβ και συνεργάτες έδειξαν ότι η K-RAS GTP στρατολογεί Gal-3 από το κυτοσόλιο στην πλασματική μεμβράνη όπου γίνεται αναπόσπαστο συστατικό nanocluster. Το κυτοσολικό επίπεδο του Gal-3 καθορίζει το μέγεθος της K-Ras GTP nanoclustering και σήματος εξόδου σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [21]. Πιο πρόσφατα, οι παρατηρήσεις από την ίδια ομάδα έδειξε ότι ένωση K-Ras με Gal-3 συμβάλλει στην θυρεοειδή κακοήθειας [22]. Δεδομένου ότι μεταλλάξεις στο K-Ras είναι σχεδόν καθολική στην PDAC και το επίπεδο δραστηριότητας του Ras φαίνεται ότι είναι ένα βασικό μηχανισμό που ελέγχει την ανάπτυξη του PDAC, επιδιώξαμε να καθοριστεί εάν Gal-3 επηρεάζει δραστικότητα του Ras που συμβάλλουν στην παθογένεση του καρκίνου του παγκρέατος.

στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε συστηματικά την έκφραση του Gal-3 σε 120 ζεύγη ανθρώπινου παγκρεατικού ιστούς από φυσιολογικούς πάγκρεας, παγκρεατίτιδα και του παγκρέατος, και για πρώτη φορά προσδιορίζεται η έκφραση του Gal-3 σε ιστούς και κύτταρα όγκου προερχόμενα από ενός μεταλλαγμένου μοντέλου ποντικού Κ-Ras καρκίνου του παγκρέατος. Έχουμε επεκτείνει τα αποτελέσματα των προηγούμενων μελετών, και περαιτέρω οριοθετείται η λειτουργία του Gal-3 in vivo και in vitro σε σχέση με το σχηματισμό καρκίνου του παγκρέατος. Gal-3 εκφράσεως είναι αυξημένο σε καρκίνους του παγκρέατος και καρκινικά κύτταρα, και διεγείρονται παγκρεατικό του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων και εισβολή και προώθησε την ανάπτυξη του όγκου. Gal-3 δεσμεύει Ras και ενισχύει την δράση Ras και κατάντη σηματοδότησης. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι Gal-3 μπορεί να είναι ένας πιθανός νέος στόχος για αυτήν την θανάσιμη ασθένεια.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι μελέτες που αφορούν τα ζώα έχουν εγκριθεί από το MD Anderson Cancer Center Θεσμικών IACUC επιτροπή (ACUF 09-04-08832). Όλες οι άλλες μελέτες που παρουσιάζονται εδώ ήταν ο ερευνητής-ξεκίνησε και δεν απαιτούν έγκριση από άλλους ρυθμιστικούς φορείς.

Τα κύτταρα και τα αντιδραστήρια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου PaCa (L3.6pl, BxPC-3, Mpanc96, Panc-1, και ΜΙΑΡΑΟΑ-2) δόθηκαν ευγενικά από τον Dr. C. Logsdon (Τμήμα Βιολογίας του Καρκίνου) και ο Δρ Σ Guha (Τμήμα Γαστρεντερολογίας, ηπατολογίας & amp? Διατροφή) στο UT MD Anderson Κέντρο Καρκίνου και έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [23], [31]. Όλες οι ταυτότητες κυτταρική σειρά ελέγχθηκε από το DNA λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και αντιβιοτικά (100 μg /mL στρεπτομυκίνη και 100 IU /mL πενικιλίνη). Αντι-Gal-3 αντίσωμα ελήφθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Αντι-Ras μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-Rala μονοκλωνικό αντίσωμα, αντι-φωσφο-ΑΚΤ και αντι-φωσφο-ΕΚΚ αντισώματα ήταν από τη Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, ΜΑ). Αντι-κυκλίνης D1 και αντίσωμα αντι-c-myc ήταν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).

απομόνωση πρωτεϊνών και ανοσοαποτύπωση ανάλυση

Σύνολο του παγκρέατος λύματα των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ανθρωπίνων και ένα μοντέλο ποντικού Κ-Ras G12D [25] παρασκευάστηκαν σε 2% SDS ρυθμιστικό λύσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Κυτταροπλασματικά και πυρηνική εκχυλίσεις παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας NE-PER Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά Εκχύλιση Αντιδραστήρια (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. αναλύσεις κηλίδος Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9].

Δημιουργία σταθερών Gal-3 σίγηση και υπερεκφράζουν κυτταρικές γραμμές PADC με λεντοϊού shRNA

Για να παραχθεί φακοϊό για Gal-3 υπερέκφραση (L- Gal3) ή Gal-3-shRNA (Α3), pLVTHM-Gal3 ή pLVTHM-shGal3, αντίστοιχα, και τον φορέα ελέγχου συνεπιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο συσκευασίας (MD2G) και το πλασμίδιο φακέλου (ΡΑΧ2) που απαιτούνται για την ιική παραγωγή σε 293FT κύτταρα χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστήριο (Invitrogen). Μέσο που περιέχει φακοϊό με Gal-3 shRNA (ονομάζεται Α3) και φορέα ελέγχου (που ονομάζεται GN10) χρησιμοποιήθηκε για τη μεταγωγή Mpanc96, MIAPaCa-2 και κυτταρικές σειρές Panc-1 με υψηλά επίπεδα Gal-3 έκφραση. Μέσο που περιέχει φακοϊό με Gal-3 η υπερέκφραση (που ονομάζεται L-gal-3) και τον φορέα ελέγχου (που ονομάζεται V) χρησιμοποιήθηκε για τη μεταγωγή κυτταρικές σειρές BXPC-3 και L3.6pl PaCa με χαμηλή έκφραση Gal-3. Διαλογή κυττάρων διεξήχθη σε ένα κύτταρο ARIA διαλογή ενεργοποιημένων με φθορισμό κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences). Gal-3 έκφραση των σταθερών κυτταρικών σειρών επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τη Δυτική bloting.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση του CellTiter Υδατικό One Λύση κιτ προσδιορισμού κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όπως περιγράφεται [24].

Soft δοκιμασία σχηματισμού αποικίας agar

5 × 10

3 MPanc96 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά pLVTHM-shRNAGal3 ή φορέα ελέγχου pLVTHM αναμίχθηκαν με 0,6% άγαρ σε DMEM. Τα μίγματα κυττάρων /άγαρ τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων επικαλυμμένα με 0.3% άγαρ εις τριπλούν. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 10 ημέρες. Αποικίες βάφτηκαν με Diff-Quik (Dade Behring). Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές ανεξάρτητα.

συνανοσοκαθίζησης

συνανοσοκαθίζησης σε GN10 ελέγχου και Gal-3 κύτταρα shRNA Α3 και από τις δύο κύτταρα Panc-1 και Mpanc96 διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [9 ].

Ras και Ral Α

δοκιμασία δραστικότητας

Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης κυτταρολύματος από κύτταρα ελέγχου GN10 ή gal-3 κύτταρα Α3 shRNA από Panc-1 και Mpanc96 ή BXPC-3 L-gal -3 και του ελέγχου του BXPC-3 V επωάστηκαν για 45 λεπτά στους 4 ° C, με σφαιρίδια αγαρόζης επικαλυμμένα με Raf1-RBD για συνολική δραστικότητα Ras ή σφαιρίδια αγαρόζης επικαλυμμένα με Ral ΒΡ1 αγαρόζη για συνολική Ral Α δραστικότητα (Upstate Biotechnology, Inc. , Lake Placid, ΝΥ). Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν και η δεσμευμένη πρωτεΐνη εκλούστηκε με 2 × Laemmli ρυθμιστικό δείγματος που είχε προθερμανθεί στους 95 ° C και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση για Ras χρησιμοποιώντας αντι-Ras αντίσωμα ή δραστηριότητα Rala χρησιμοποιώντας αντι-Rala αντίσωμα.

Matrigel εισβολή δοκιμασία

Η επεμβατική ικανότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel θαλάμους εισβολή με μέγεθος 0.8-μm πόρων (BD Biosciences). Ένα εναιώρημα μονού κυττάρου που περιέχει 1 χ 10

5 κυττάρων προστέθηκε στο εσωτερικό θάλαμο. Μετά από 16 ώρες επώασης στους 37 ° C σε 5% CO2, τα κύτταρα στην ανώτερη επιφάνεια του εσωτερικού θαλάμου απομακρύνθηκαν με μπατονέτες. Εισβολή κύτταρα που προσκολλώνται στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν, χρωματίσθηκαν με Diff-Quik (Dade Behring), και μετρήθηκαν.

Έμμεση χρώση ανοσοφθορισμού και συνεστιακή μικροσκοπία laser

Έμμεση χρώση ανοσοφθορισμού σε BXPC-3 κύτταρα διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [9]. Έκφραση και εντοπισμός των πρωτεϊνών παρατηρήθηκαν κάτω από ένα συνεστιακό σύστημα μικροσκοπίου (FluoView FV500? Ολύμπου, Melville, ΝΥ) και αναλύθηκαν από CellQuest Pro λογισμικό (BD Biosciences, San Jose, CA) στην ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και Ανάλυση Εικόνας Βασικές Εργαστήριο στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου.

σε πραγματικό χρόνο

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

για την ποσοτικοποίηση των αλλαγών στα επίπεδα Gal-3 mRNA, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR πραγματοποιήθηκε στο ΑΒΙ Prism 7900 ( Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας το διαθέσιμο στο εμπόριο προσδιορισμό γονιδιακής έκφρασης για Gal-3 (Mm00802901_m1), και το κυκλοφιλίνη Α (4326316E? Applied Biosystems) όπως περιγράφεται προηγουμένως [9]. Το 7900 Sequence Detection System 2.2 λογισμικό (Applied Biosystems, Foster City, CA) καθορίζεται αυτόματα την πολλαπλή μεταβολή για το Gal-3 σε κάθε δείγμα με τη μέθοδο δδCt με 95% εμπιστοσύνη.

Ανοσοϊστοχημεία

η ανοσοϊστοχημική χρώση για Gal3 διεξήχθη σε διαφάνειες μικροσυστοιχιών ιστού που αποτελείται από 125 παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα και αντιστοιχισμένο μη νεοπλασματικών παγκρέατος ιστούς τους από ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε pancreaticoduodenetomy στο MD Anderson Cancer Κέντρο. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του M. D. Anderson Κέντρο Καρκίνου. Μετά ανάκτηση αντιγόνου και ενδογενών απόφραξη υπεροξειδάσης, οι τομές επωάστηκαν στη συνέχεια με αντίσωμα έναντι Gal3 (1:100 αραίωση) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά. Τυπική αβιδίνης-βιοτίνης ανοσοϊστοχημική ανάλυση των τμημάτων έγινε σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Τα αποτελέσματα χρώσης αξιολογήθηκαν από έναν παθολόγο (HW) με βάση το ποσοστό της χρώσης στα καρκινικά κύτταρα (0, καμία χρώση? 1, ≤10%? 2, 10-50% και 3, & gt? 50%) και την ένταση χρώσης (0-αρνητικό, 1-αδύναμη, 2-μέτρια και 3- ισχυρή). Οι όγκοι κατηγοριοποιούνται σε Gal3-χαμηλή (σε συνδυασμό scores≤3) και Gal3-υψηλή (συνδυασμένη βαθμολογία ≥4).

Othotopic μοντέλο PADC

MPanc96 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με Gal-3 shRNA και αντίστοιχο φορέα ελέγχου σταθερώς μεταγωγή με λουσιφεράση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [26]. Τα ζώα χωρίστηκαν σε 2 ομάδες (η = 5 ανά ομάδα). Η πρώτη ομάδα εγχύθηκε με κύτταρα MPanc96 που επιμολύνθηκαν με τον φορέα (GN10) μόνο και η δεύτερη ομάδα με κύτταρα επιμολυσμένα με MPanc96 Gal-3 shRNA (Α3). Τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη-ξυλαζίνη λύση, ένα μικρό αριστερό κοιλιακή τομή πλευρό έγινε, και (1 × 10

6) Mpanc-96 κύτταρα σε 50 μL PBS εγχύθηκαν εντός του subcapsular περιοχή του παγκρέατος χρησιμοποιώντας ένα 27-gauge βελόνα και μια βαθμονομημένη διάταξη διανομής πάτημα κουμπιού ελεγχόμενη (Hamilton Σύριγγα Company). Το κοιλιακό τραύμα έκλεισε σε ένα στρώμα με κλιπ τραύματος (Braintree Scientific, Inc.).

Μία εβδομάδα μετά την εμφύτευση, οι όγκοι του όγκου παρακολουθείται σε εβδομαδιαία βάση από μη επεμβατική απεικόνιση βιοφωταύγεια σε πραγματικό χρόνο από την IVIS 200 (Xenogen) χρησιμοποιώντας ένα κρυογονικά ψυχόμενο σύστημα απεικόνισης βιοφωταύγεια συζευγμένο με ένα λογισμικό Image απόκτησης δεδομένων υπολογιστή που εκτελεί Living (Xenogen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Οι ποντικοί απεικονίστηκαν την ημέρα 7, 14, 21, και 28 μετά την εμφύτευση κυττάρων όγκου. Τα ζώα θανατώθηκαν την 28η ημέρα μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Πρωτογενής όγκων στο πάγκρεας αποκόπηκαν και μετρήθηκε η τελική βάρος. Όλες οι μετρήσεις συγκρίθηκαν μεταξύ των δύο ομάδων με τη χρήση

t

τεστ αταίριαστο του Student. Ο ιστός του όγκου και των γύρω οργάνων εγκλείστηκαν σε παραφίνη και σειριακές τομές 5-μm κόπηκαν, βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και εξετάστηκαν με μικροσκοπία φωτός για την επαλήθευση της παρουσίας του όγκου και μικροσκοπικών μεταστάσεων. ιστοί όγκου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία και χρωματίστηκαν για έκφραση γαλεκτίνης-3, Ras και phopho-ERK. όπως περιγράφεται παραπάνω.

Στατιστική ανάλυση

Δοκιμασίες που παρουσιάζονται στις γραφικές παραστάσεις ως μέση ± SD και αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα από τουλάχιστον τρία πειράματα. Σημασία των διαφορών μεταξύ των ομάδων κρίθηκε χρησιμοποιώντας ένα two-tailed Student

t

τεστ. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν το

P

αξία ήταν & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Gal-3 είναι πολύ up-ρυθμίζονται σε ανθρώπινους ιστούς παγκρέατος όγκου

η γονιδιακή έκφραση profiling μελέτες προτείνουν ότι Gal-3 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε παγκρεατικών όγκων σε σύγκριση με τους ιστούς ελέγχου [18], [19]. Πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική χρώση των ανθρώπινων μικροσυστοιχίες παγκρεατικού ιστού με αντι-αντίσωμα Gal3 (Σχήμα 1Α). Βρήκαμε ότι Gal-3 έκφραση αυξήθηκε προοδευτικά στην αλληλουχία εξέλιξης της νόσου φυσιολογικά (Σχήμα 1Α, a, b), παγκρεατίτιδα (c, d) και πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (e, f). χρώση Gal-3 κατηγοριοποιήθηκε σε δύο ομάδες, Gal-3 Low (σκορ & lt? 3) και Gal-3-υψηλή (στείλει & gt? 4), με βάση την ένταση χρώσης και το ποσοστό θετική χρώση όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Βρήκαμε ότι 83 από 125 (66,4%) του παγκρέατος δείγματα πόρου αδενοκαρκίνωμα έδειξαν υψηλά επίπεδα Gal-3 έκφρασης (Gal3-υψηλή). Μεταξύ αυτών των περιπτώσεων, σε συνδυασμό μη νεοπλασματικά παγκρεατικούς ιστούς ήταν διαθέσιμα για αξιολόγηση σε 108 περιπτώσεις (72 δείγματα της χρόνιας παγκρεατίτιδας και 36 δείγματα φυσιολογικού παγκρεατικού ιστού) και 32 (29,6%) ήταν Gal3-υψηλής. Gal-3 έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη στην πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος από τα ζεύγη μη νεοπλασματικά δείγματα παγκρεατικού ιστού (ρ & lt? 0,0001). 28 από 72 (38,9%) της χρόνιας παγκρεατίτιδας δείγματα ήταν Gal3-υψηλές σε σύγκριση με 11,1% (4/36) των κανονικών δειγμάτων παγκρεατικού ιστού (Ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 1Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Gal-3 ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της ανθρώπινης παγκρεατικής νόσου κανονικό, παγκρεατίτιδα και πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος.

Α, διαφάνειες Tissue μικροσυστοιχιών που αποτελείται από 125 παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα και αντιστοιχισμένο μη νεοπλαστικά δείγματα παγκρεατικό ιστό ανοσοϊστοχημικά χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα Gal-3 όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Gal-3 εκφράσεως είναι αυξημένο κατά μήκος της νόσου αλληλουχία-φυσιολογική (Εικόνα 1Α, a, b), παγκρεατίτιδα (c, d) και πόρου αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος (e, f). B. Περίληψη της Gal-3 IHC από τις μικροσυστοιχίες ιστού PDAC. Οι όγκοι κατηγοριοποιήθηκαν σε Gal3-χαμηλό (συνδυασμένοι βαθμοί ≤3) και Gal3-υψηλή (συνδυασμένη βαθμολογία ≥4) με βάση το ποσοστό των Gal-3 χρώση σε κύτταρα όγκου (0, καμία χρώση? 1, ≤10%? 2, 10-50% και 3, & gt?. 50%) και η ένταση χρώσης (0-αρνητικό, 1-αδύναμη, 2-μέτρια και 3- ισχυρή)

η

Gal-3 είναι ιδιαίτερα απότομη ανωφέρεια ρυθμίζεται σε παγκρεατικά ιστούς και τα κύτταρα του όγκου από K-Ras μεταλλαγμένο ποντίκι μοντέλο

ένα περιέγραψε πρόσφατα μεταλλαγμένο μοντέλο ποντικού K-Ras ανακεφαλαιώνει την ανθρώπινη παγκρέατος ακολουθία της εξέλιξης του καρκίνου από φλεγμονή στο PanIN να PDAC [25]. Ήταν ενδιαφέρον να προσδιοριστεί κατά πόσον αυτό το μοντέλο ποντικού θα μιμηθεί επίσης τις αλλαγές σε Gal-3 έκφραση που παρατηρείται σε ανθρώπινα δείγματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, Gal-3 ήταν ανιχνεύσιμη σε ιστούς παγκρέατος από φυσιολογικούς ποντικούς (διαδρομές 1-3), αλλά ιδιαίτερα τα επάνω ρυθμισμένη σε επτά κυτταρικές γραμμές όγκου (διαδρομές 4-10) τα οποία προέρχονται από επτά διαφορετικούς όγκους ποντικού.

Α. Gal-3 έκφραση αναλύθηκε σε κύτταρα που προέρχονται από φυσιολογικό πάγκρεας και του παγκρέατος από K-Ras μεταλλαγμένα ποντίκια με κηλίδωση Western όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Β πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR για Gal-3 έκφραση RNA χρησιμοποιώντας Gal-3-ειδικούς εκκινητές μετά την ολική εκχύλιση RNA από φυσιολογικό πάγκρεας, ιστούς παγκρεατίτιδα και παγκρεατικών όγκων και από απομονωμένα κύτταρα από διαφορετικούς όγκους που προκύπτουν σε ένα μεταλλαγμένο μοντέλο ποντικού K-Ras ως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Fold αλλαγή από προσδιορισμούς εις τριπλούν.

Η

Για να προσδιοριστεί εάν Gal-3 mRNA ήταν επίσης τα πάνω ρυθμισμένη σε ιστούς όγκου ποντικού σε σύγκριση με την κανονική και παγκρεατίτιδα ιστούς, ιστούς από μεμονωμένα ποντίκια που ήταν φυσιολογικά, είχε παγκρεατίτιδα ή εκείνοι με όγκους εκχυλίστηκαν και PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συγκεκριμένων ποντίκι Gal-3 εκκινητές (Mm00802901_m1, Ambion, USA) (Σχήμα 2Β). Παρατηρήσαμε ότι Gal-3 έκφραση ήταν χαμηλή σε φυσιολογικούς ιστούς του παγκρέατος (διαδρομές 1-3), αλλά αυξήθηκε 10-27 φορές σε χρόνια παγκρεατίτιδα (διαδρομές 4-9) και αυξημένη 45 έως 215 φορές σε K-RAS ιστούς όγκων μεταλλαγμένο ποντίκι (λωρίδες 10-12). Gal-3 mRNA επίπεδα ήταν ακόμη υψηλότερο (62 φορές σε 831 φορές), όταν μετράται σε απομονωμένα κύτταρα του όγκου (λωρίδες 13-24).

Δημιουργία Gal-3 υπερ- και υπο-έκφραση PDAC κύτταρα

για να χειραγωγήσουν τα επίπεδα Gal-3 σε κύτταρα PADC, θα καθορίζεται πρώτα το επίπεδο της Gal-3 έκφρασης σε μια ποικιλία PADC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α, πάνω πίνακα). MPanc96, MIAPaCa-2 και Panc-1 κύτταρα είχαν υψηλή βασική έκφραση Gal-3 (Σχήμα 3Α) και διαμολύνθηκαν σταθερά με φακοϊό Gal-3 (κύτταρα Α3) shRNA ή φορέα μόνο (GN10 κύτταρα). Γαλεκτίνη-3 επίπεδα με επιτυχία μειωθεί σε MIAPaCa-2, Panc-1 και τα κύτταρα Mpan96 90%, 95% και 92% αντίστοιχα (Σχήμα 3Α, μεσαίο πλαίσιο). Προκειμένου να μελετηθούν οι επιδράσεις του πάνω ρύθμιση της γαλεκτίνης-3, Gal-3 cDNA lentivirus διαμολύνθηκαν σε κύτταρα PDAC με χαμηλότερα βασικά επίπεδα Gal-3 (Σχήμα 3Α, κάτω πάνελ). Αυτές οι παραλλαγές ορίστηκαν ως L-Gal3 και V (έλεγχος φορέα) όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, κάτω πάνελ. Αυτά PDAC κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί περαιτέρω η λειτουργία του Gal-3 στην παθογένεση του καρκίνου του παγκρέατος.

A. Gal-3 έκφραση σε διαφορετικούς PDAC κυτταρικές γραμμές όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western (άνω πάνελ). Knockdown Gal-3 με lentivirus shRNA του Gal3 (Α3) ή φορέα ελέγχου (GN10) σε Gal-3 υψηλά κυτταρικών γραμμών-Mpanc96, MIAPaCa-2 και Panc-1 προσδιορίστηκαν με ανοσοστυπώματα (Σχήμα 3Α, μεσαίο πλαίσιο). Η υπερέκφραση Gal-3 σε BXPC-3 και L3.6pl κύτταρα κάτω Gal3 εκφράζεται κύτταρα με φακοϊό μόλυνση Gal3 cDNA (L-Gal3) ή φορέα ελέγχου (ν) επιβεβαιώθηκε με ανοσοκηλίδων (Σχήμα 3Α, κάτω πάνελ. Β Επιπτώσεις του Gal -3 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. ο πολλαπλασιασμός των MIAPaCa-2 και Mpanc96 κύτταρα στα οποία Gal-3-κάτω ρυθμίζεται από shRNA ή BXPC-3 και L3.6pl κύτταρα στα οποία υπερ-εκφράζεται από Gal-3 cDNA προσδιορίστηκε με χρήση του CellTiter Υδατικό διάλυμα Ένα κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. C. Επίδραση της Gal-3 επί των καρκινικών κυττάρων εισβολή σε κύτταρα PDAC. Αντιπροσωπευτικά πεδία εμφανίζονται PDAC κύτταρα (1 χ 10

5), στην οποία Gal-3 έκφραση χτυπήθηκε κάτω από shRNA (Α3) και φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου (GN10) σπάρθηκαν πάνω σε επικαλυμμένα με Matrigel θάλαμοι εισβολής? 24 ώρες αργότερα, εισέβαλαν κύτταρα που προσκολλώνται στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με Diff Quick σετ, και μετρήστε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι D. Bar γραφική παράσταση ως προς το ποσοστό των εισβολή στα δύο κύτταρα Mpanc96 και MIAPaCa-2 με Gal3 knockdown (Α3) ή Control (GN10) αντιπροσωπεύει το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που εκτελούνται εις τριπλούν.? μπαρ, τυπικά σφάλματα, σ & lt?. 0.001

Η

Gal-3 ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τον σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα PADC in vitro

Για να προσδιοριστεί εάν Gal-3 παίζει ένα λειτουργικό ρόλο σε παγκρεατικά συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων in vitro, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές γραμμές γενετικώς τροποποιημένη για να εκφράσουν διαφορετικά Gal-3 επίπεδα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του Gal-3 επί της ανάπτυξης νεοπλασματικών κυττάρων (MTS δοκιμασία), εισβολή δοκιμασία εισβολής (Matrigel ) και in vitro ογκογονικότητα (δοκιμασία σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ). Γκρεμίσουμε της Gal-3 σε ΜΙΑΡΑΟΑ-2 και Mpanc96 κύτταρα μειώθηκε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε 72 ώρες (Εικόνα 3Β, επάνω πίνακα). Σε ένα συμπληρωματικό πείραμα, υπερ-έκφραση του Gal-3 σε L3.6PL και BXPC-3 κύτταρα (L3.6PL-L-Gal3 και BXPC-3-L-Gal3) αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου L3.6PL-V και BXPC-3-V (Σχήμα 3Β, κάτω πίνακας). Για να διερευνηθεί κατά πόσο Gal-3 επηρεάζει τις επεμβατικές δυνατότητες των κυττάρων PDAC, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις εισβολή Matrigel. Προς τα κάτω ρύθμιση του Gal-3 (Α3) σε MPanc96 και κύτταρα MIAPaCa-2 μειώθηκαν κύτταρο εισβολή κατά 95% και 90% αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3C και 3D). Σε αντίθεση, Gal3 cDNA εκφράζεται κύτταρα BXPC-3 L-Gal3 αυξημένη δυναμικότητα κύτταρο εισβολή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η Gal-3 παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην εισβολή των κυττάρων PDC.

Επιπλέον, κάτω ρύθμιση της Gal-3 από shRNA στα κύτταρα MPanc96 (MPanc96 Α3) μειώθηκε δραματικά τον αριθμό των αποικιών σε μαλακό άγαρ σύγκριση με τους μάρτυρες φορέα-επιμολυσμένα (Σχήμα 4Α, 4Β πινάκια κορυφής), ενώ τα πάνω ρύθμιση του Gal-3 σε BXPC-3 κύτταρα σημαντικά αυξημένους αριθμούς αποικιών σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήμα 4Α, 4Β κάτω πλαίσια). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα επίπεδα Gal-3 επηρεάζει PDAC κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εισβολή και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη.

A. δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα ελέγχου MPanc96 GN10 και Gal-3 shRNA γκρεμίζω κύτταρα Α3 (άνω πάνελ) ή BXPC-3 V κύτταρα ελέγχου και BXPC-3 Gal3 cDNA υπερεκφράζεται L-Gal3 κύτταρα (κάτω πίνακας), όπως περιγράφεται στο Υλικά και μεθόδους. κύτταρα MPanc96-A3 σχηματίζονται μικρότερα και λιγότερες αποικίες σε σύγκριση με το φορέα επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου (GN10). Σε αντίθεση, τα κύτταρα BXPC-3 L-Gal3 σχηματίζονται μεγαλύτερα και ένας μεγαλύτερος αριθμός αποικιών από V κύτταρα ελέγχου. Β Μπαρ γράφημα στη δεξιά πλευρά δείχνει τις μέσες αριθμούς αποικίας μετά τον εμβολιασμό, είτε κύτταρα ελέγχου MPanc96 GN10 και shRNA γκρεμίσουμε τα κελιά A3 (επάνω) ή BXPC-3 V και BXPC-3 L-Gal3 (κάτω)? p & lt? 0.001. Γ Αντιπροσωπευτικά βιοφωτισμός εικόνες των αθυμικών ποντικών 3 εβδομάδες μετά την ορθοτοπική εμφύτευση GN10 και Α3 καρκίνο του παγκρέατος κυττάρων ορθοτοπικά στο πάγκρεας αθυμικών ποντικών. Δ Μετρήσεις φωτόνια /s /cm

2 /steridian απεικονίζει έκταση βιοφωταύγεια σε 10% περιθώριο κορυφής (μέση ± SE) κατά την εβδομάδα 3, χρησιμοποιώντας Xenogen IVIS όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι (

n =

5

). Ε Tumor βάρη από ποντικούς ελέγχου (GN10, η = 5) και Gal3 knockdown ομάδα (Α3, η = 5) ζυγίστηκαν μετά ποντίκια ήταν θυσία στις τεσσάρων εβδομάδων. ΣΤ Mouse ιστούς όγκων από τον έλεγχο (GN10) και Gal-3 ομάδα knockdown (Α3) ανοσοϊστοχημικά χρώση χρησιμοποιώντας Gal-3, Ras και φωσφο-ΕΚΚ αντισώματα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Προς τα κάτω ρύθμιση του Gal-3 αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα in vivo μοντέλο ορθοτοπικού

για να διερευνηθεί η επίδραση της Gal-3 επίπεδα για in vivo ανάπτυξη του PDAC, κύτταρα MPanc96 σταθερά επιμολυσμένα με Gal-3 shRNA ή όργανα ελέγχου φορέα shRNA ήταν επισημασμένο με λουσιφεράση πυγολαμπίδας να επιτρέπει σε πραγματικό χρόνο απεικόνιση βιοφωταύγειας για την παρακολούθηση του όγκου του όγκου και την εξάπλωση in vivo. Αυτά τα κύτταρα ορθοτοπικά εγχέεται στο σώμα του παγκρέατος γυμνών ποντικών και η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με μη επεμβατική απεικόνιση μία φορά την εβδομάδα. Οι διαφορές στην ανάπτυξη των όγκων παρατηρήθηκαν μέσα σε 3 εβδομάδες (εκπρόσωπος εικόνες όπως φαίνεται στο Σχήμα 4C). Ποσοτική αξιολόγηση του φορτίου του όγκου έδειξε ότι οι όγκοι ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στην ομάδα ελέγχου σε σύγκριση με την Gal-3 γκρεμίζω ομάδα (Εικόνα 4D) (ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, οι πρωτογενείς βάρη των όγκων ήταν σημαντικά λιγότερο στην Gal3 γκρεμίζω ομάδα από την ομάδα ελέγχου, όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 4 Ε? Η ανοσοϊστοχημική χρώση για Gal-3, Ras και φωσφο-ΕΚΚ σε αυτούς τους ιστούς όγκους ποντίκια (Σχήμα 4F) επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι η έκφραση του Gal-3, Ras και το κατάντη τελεστή φωσφο-ΕΚΚ μειώνονται στο Gal-3 γκρεμίζω ομάδα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Περιφερειακή μικρομεταστάσεων παρατηρήθηκαν σε ζώα που ενέθηκαν με κύτταρα ελέγχου (5/5 ζώα), αλλά όχι σε ζώα που ενέθηκαν με κύτταρα στα οποία γαλεκτίνης-3 είχε χτυπηθεί κάτω από σταθερή επιμόλυνση των γαλεκτίνης-3 shRNA (0/5 ζώα) (Σχήμα S1 ).

Gal-3 δεσμεύεται με Ras και αυξάνει τη δραστηριότητα Ras σε κύτταρα PDAC

έχει ήδη αναφερθεί ότι η Gal-3 συνδέεται με ενεργοποιημένο K-Ras και προωθεί την ισχυρή ενεργοποίηση των Raf- 1 και PI3-K αλλά εξασθενεί την ενεργοποίηση της ERK σηματοδότησης σε κύτταρα COS [21]. Ως εκ τούτου υποθέσαμε ότι Gal-3 θα δεσμεύονται με Ras και διαμεσολαβούν δραστικότητα Ras σε PDAC κύτταρα που χαρακτηρίζονται από τη συχνή εμφάνιση του Ras μεταλλάξεις. Χρησιμοποιώντας μια συστοιχία αντισωμάτων (Hypromatrix, Worcester, ΜΑ), ανιχνεύσαμε την αλληλεπίδραση μεταξύ Ras και Gal-3 χρησιμοποιώντας ΗΑ ετικέτα Gal3 επιμολυσμένα BXPC-3 λύμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ras επιβεβαιώθηκε να είναι ένας από τους συνεργάτες σύνδεσης του Gal-3 βασίζεται σε δεδομένα από τη συστοιχία αντισωμάτων. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η Ras αλληλεπιδρά με Gal-3, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασίες συν-immunoprocipitation. Κυτταρολύματα από Panc-1 και MPanc96 με ή χωρίς χτυπήσει κάτω από Gal-3 υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση είτε με Gal3 μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου ή ένα τηγάνι μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Ras ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με αντι-Ras ή μυρμήγκι-Gal3 αντισώματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Gal-3 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με Ras, ενώ λύματα με φυσιολογική IgG δεν έδωσαν ορατή ζώνη (Σχήμα 5Α).

A. Συν-ανοσοκατακρήμνιση εκτελέστηκε σε Panc-1 και MPanc96 με γκρεμίζω Gal-3 με τη χρήση είτε αντι-Ras ή αντίσωμα αντι-Gal-3 όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. B. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κύτταρα ελέγχου Panc-1 και Mpanc96 GN10 ή κύτταρα shRNA Α3 επωάστηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης επικαλυμμένα με Raf1-RBD, και ενεργό Ras-GTP ανιχνεύθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Γ Active δραστικότητα Ras GTP προσδιορίστηκε σε BXPC-3 κύτταρα L-Gal3 και κύτταρα ελέγχου (V), όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. D. Κυτταρική μεμβράνη πλάσματος και κλάσματα Κυτταροπλασματικά του GN10 και Α3 κύτταρα τόσο από Panc-1 και MPan96 υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν με αντι-Ras αντίσωμα. Ε έμμεσος ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε σε BXPC-3-V και BXPC-3 κύτταρα L-Gal3 χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-Gal-3 (TIB166 1:100, κόκκινο) και αντι-Ras αντίσωμα (1:100, πράσινο), που ακολουθείται από DAPI αντιχρωματισμός (μπλε). Η συγχώνευση της Gal-3 (κόκκινο) και το Ras (πράσινο) με DAPI (μπλε) παρουσιάζεται επίσης.

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν η αλληλεπίδραση μεταξύ Ras και Gal-3 επηρεάζει δραστηριότητα Ras, εξετάσαμε το επιδράσεις του χειρισμού Gal-3 έκφρασης στη δραστηριότητα Ras. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, κάτω ρύθμιση Gal-3 σε Panc-1 και κύτταρα MPan96 (Α3) μειωμένη δραστικότητα Ras χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό Ras-GTP, ενώ η υπερέκφραση του Gal3 σε BXPC-3 κύτταρα αυξημένη δραστηριότητα Ras GTP (Σχήμα 5C) . Προκειμένου να μελετήσουμε περαιτέρω πώς Gal-3 διαμεσολαβεί δραστηριότητα Ras, κυτταρική μεμβράνη και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών απομονώθηκαν [26] από Panc-1 και των κυττάρων ελέγχου MPanc96 (GN10) και γκρεμίζω κύτταρα (Α3) και της πρωτεΐνης Ras ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ανοσοαποτύπωση. Λιγότερη πρωτεΐνη Ras ανιχνεύθηκε στις μεμβράνες του πλάσματος των Panc 1-A3 κύτταρα και κύτταρα Mpanc96 Α3 σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου GN10 (Σχήμα 5D). Στη σύμβαση, πιο RAS πρωτεϊνών παρατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα των Panc-1 και Mpanc96 Α3 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου GN10. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η Gal-3 μπορούν να ρυθμίζουν Ras υποκυτταρικό εντοπισμό. Ομοεστιακή ανοσοφθορισμού επιβεβαίωσε ότι πάνω ρύθμιση του Gal-3 σε BXPC-3 κύτταρα συνδέεται με αυξημένη Ras στη μεμβράνη πλάσματος (Σχήμα 5Ε) .Αυτό υποδηλώνει ότι Gal-3 δεσμεύει Ras και είναι υπεύθυνος για Ras προσάρτηση στην μεμβράνη των κυττάρων του πλάσματος, έτσι μεσολαβούν τη δράση του.

Gal-3 διαμεσολαβεί Ras κατάντη σηματοδότησης σε κύτταρα PDAC

η ενεργοποιημένη Ras (GTP-δεσμευμένη κατάσταση) ενεργοποιεί καθοδικούς τελεστές συμπεριλαμβανομένης της Raf /ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνης (ΜΑΡ) /