Αφηρημένο

Κυκλοφορούν καρκινικών κυττάρων (CTC) απαρίθμηση υπόσχεται να είναι ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης της κλινικής έκβασης για μια σειρά από καρκίνους. Καθιερωμένες μεθόδους απαρίθμησης CTC βασίζονται κατά κύριο λόγο για τη δέσμευση συγγένειας των αντιγόνων κυτταρικής επιφάνειας, και έχουν επικριθεί για την υποτίμηση των αριθμών CTC λόγω αντιγονική προκατάληψη. Οι αναδυόμενες στρατηγικές σύλληψη CTC τυπικά διακρίνουν αυτά τα κύτταρα με βάση την υπόθεση βιομηχανικών χαρακτηριστικών τους, οι οποίες συχνά επικυρωθεί χρησιμοποιώντας καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει ένα εργαλείο λογισμικού για τη διερεύνηση των μορφολογικών ιδιοτήτων της ΚΜΑ από ασθενείς με ανθεκτική ευνουχισμού καρκίνο του προστάτη και καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη, προκειμένου να διαπιστωθεί αν ο τελευταίος είναι ένα κατάλληλο μοντέλο για την πρώην. Απομονώσαμε δύο ΚΜΑ και καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα από το ολικό αίμα χρησιμοποιώντας το σύστημα CellSearch® και εξετάστηκαν διάφορα κυτταρομορφολογική χαρακτηριστικά. Σε αντίθεση με καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα, CTCs εμπλουτίζονται με σύστημα CellSearch® βρέθηκαν να έχουν σημαντικά μικρότερο μέγεθος, μεγαλύτερα αναλογία πυρηνικά κυτταροπλασματική, και πιο επίμηκες σχήμα. Αυτά τα κέντρα θεραπείας χολέρας βρέθηκαν επίσης να εμφανίζουν σημαντικά μεγαλύτερη μεταβλητότητα από καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα σε αναλογία και το σχήμα του προφίλ πυρηνικά κυτταροπλασματική

Παράθεση:. Πάρκο S, Ang RR, Duffy SP, Bazov J, Chi KN, Μαύρο PC, et al. (2014) μορφολογικές διαφορές μεταξύ κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα από τον καρκίνο του προστάτη ασθενείς και κύτταρα που καλλιεργήθηκαν καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (1): e85264. doi: 10.1371 /journal.pone.0085264

Επιμέλεια: David T. Eddington, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Ιούλη του 2013? Αποδεκτές: 25 Νοεμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Φυσικών Επιστημών και Μηχανικής Συμβούλιο Έρευνας του Καναδά, καναδική Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας, Καρκίνος του προστάτη Καναδά, Πρωτοβουλία Μεταγραφική έρευνα Βανκούβερ του προστάτη Κέντρου για την ταχεία ανακάλυψη και ανάπτυξη, Μηχανικοί-in-τρίβει πρόγραμμα κατάρτισης σε UBC, Terry Fox Research Institute , και ένα βραβείο από το παγκόσμιο σχέδιο δράσης Movember (GAP) καρκίνο του προστάτη βιοδεικτών πρωτοβουλίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι ο συν-συγγραφέας Peter Black είναι ένα PLoS ONE Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Έχουν

Εισαγωγή

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ) έχουν ενοχοποιηθεί ως πιθανοί σπόροι της μετάστασης του καρκίνου και ως εκ τούτου μεγάλη σημασία στην έρευνα, τη διαχείριση της νόσου, και την ανάπτυξη φαρμάκων [1] – [3]. Ιδρύθηκε μέθοδοι για τη λήψη αυτών των κυττάρων, όπως το σύστημα Veridex CellSearch® (Raritan, NJ, USA), βασίζονται σε σύλληψη συγγένειας του επιθηλιακό αντιγόνο κυτταρικής επιφάνειας, EpCAM, ακολουθούμενη από σήμανση φθορισμού της ενδοκυτταρικής κυτοκερατίνης (CK) [4] – [ ,,,0],6]. Ενώ ο προσδιορισμός και καταμέτρηση CTC, με βάση την επιθηλιακή έκφραση βιοδεικτών, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη κακή κλινική έκβαση [7] – [10] Η στρατηγική αυτή μπορεί να είναι επιρρεπής σε υποτίμηση του αριθμού CTC λόγω των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση [11] – [ ,,,0],14], η κακή έκφραση αυτών των παραγόντων σε ορισμένους τύπους όγκων [14], ή αλλαγές στην έκφραση αυτών των παραγόντων μετά από χημειοθεραπεία [15]. Οι περιορισμοί αυτοί μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντική, δεδομένου ότι η εμφάνιση των μεσεγχυματικών ΚΜΑ σχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου [16] και τη συμπερίληψη πρόσθετων κριτηρίων αναγνώρισης CTC μπορεί να είναι ένα πολύτιμο συμπλήρωμα στη συμβατική απαρίθμηση CellSearch® CTC.

Επιπλέον για την έκφρασή τους των αντιγόνων όγκου, είναι ευρέως αποδεκτό ότι ΚΜΑ έχουν διακριτά βιομηχανικών χαρακτηριστικών, συμπεριλαμβανομένων των μεγαλύτερου μεγέθους από λευκοκύτταρα, μεγαλύτερη πυρήνα προς κυτόπλασμα (N: C) αναλογία, καθώς και διακριτά πυρηνική μορφολογία [17]. Πολυάριθμες στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί για τον εμπλουτισμό για CTCs βασίζεται σε αυτά τα χαρακτηριστικά [18]. Οι ΚΜΑ απομονωθεί χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας [19] ή με βάση το μέγεθος, χρησιμοποιώντας micropore διήθηση [20] – [22]. Πρόσφατα, μικρορροϊκές τεχνολογίες έχουν επιτευχθεί ανώτερη απόδοση της δέσμευσης της CTC και τον εμπλουτισμό χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις όπως η υδροδυναμική χρωματογραφία [23] – [28], μικρορευστονικής διήθηση [29] – [31], και dielectrophoresis [32] – [35]. Η ανάπτυξη αυτών των τεχνολογιών που χρησιμοποιούνται τυπικά καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα ως μορφολογικό μοντέλο για κλινική CTCs. Ωστόσο, ενώ τα καρκινικά κύτταρα και μερικά CTCs έχουν κοινά χαρακτηριστικά βιοφυσικών [17], ΚΜΑ μπορεί να παρουσιάζουν διακριτά μορφολογικά χαρακτηριστικά, ανάλογα με τον τύπο του όγκου καταγωγής [36]. Μια εναλλακτική στρατηγική θα ήταν να ενσωματώσει εμβιομηχανική χαρακτηρισμός με τον πιο καθιερωμένες αντιγόνο-based στρατηγική απαρίθμηση CellSearch® CTC.

Έχουμε αναπτύξει ένα εργαλείο λογισμικού για την ανάλυση των κυτταρομορφολογική ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων. Χρησιμοποιήσαμε αυτό το εργαλείο για να εξετάζει τόσο CTC ασθενή και τον καρκίνο μοντέλο μορφολογία κυτταρική σειρά, μετά από CellSearch® εμπλουτισμό. Τα αποτελέσματα αυτά θα παρέχουν σημαντικά στοιχεία για να βοηθήσουν στην ταυτοποίηση CTC βασίζεται σε συνδυασμό αντιγόνου και εμβιομηχανική κριτήρια [36], καθώς και στην επιλογή των κατάλληλων μοντέλων για τη βελτιστοποίηση της εμβιομηχανικής εμπλουτισμού CTC.

Υλικά και Μέθοδοι

συλλογή δειγμάτων αίματος

τα δείγματα αίματος από υγιείς δότες και ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη (CRPC) ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση και συλλέγονται χρησιμοποιώντας πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Κλινική συμβούλιο δεοντολογικής εξέτασης UBC (http: //έρευνα. ubc.ca/ethics/clinical-research-ethics-board). Οι CRPC ασθενείς που συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ηλικίας από 53-83 ετών, και τα επίπεδα PSA από 21.1-2200 μg /L (Πίνακας S1). Τα δείγματα αίματος και στις δύο περιπτώσεις συλλέγονται και αποθηκεύονται σε CellSave® Vacutainer σωλήνες (Becton Dickinson, Raritan, NJ).

Απομόνωση και καταμέτρηση των CTCs από CellSearch

απομόνωση ΚΜΑ και καταμέτρηση πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του σύστημα CellSearch® όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], [5], [37]. Εν συντομία, τα δείγματα αίματος ελήφθησαν σε σωλήνες 10 ml CellSave Vacutainer (Becton Dickinson) που περιέχει αντιπηκτικό ιδιόκτητο και συντηρητικό. Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και υποβάλλεται σε επεξεργασία εντός 48 ωρών μετά τη συλλογή. Το σύστημα CellSearch® συλλαμβάνει κύτταρα που εκφράζουν EpCAM χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια επικαλυμμένα με αντίσωμα και στη συνέχεια αυτά τα κύτταρα ετικέτες με φθορίζουσες χρωστικές, όπως ϋΑΡΙ, CD45, και κυτοκερατίνες, για να διακρίνει εν δυνάμει CTCs από λευκοκύτταρα. Μετά ανοσομαγνητικά σύλληψη και χρώση φθορισμού, οι εικόνες των υποψηφίων ΚΜΑ ελήφθη στο φωτεινού και τρεις φθορισμού κανάλια (DAPI, CD45, και κερατίνες). Οι εικόνες που έχουν ληφθεί κατά διαστήματα σε πολλά μικρότερα εικόνες που το καθένα περιέχει ένα μόνο κύτταρο και να συγκεντρωθούν σε ένα πάνελ στο λογισμικό. Τέλος, ένας εξουσιοδοτημένος τεχνικός προσδιορίζει θετικά τις ΚΜΑ, εξετάζοντας το μέγεθος, το σχήμα και την ένταση φθορισμού του κάθε υποψηφίου κυττάρων

Cell Culture & Επεξεργασίας

κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη Ανθρωπίνων συμπεριλαμβανομένων των LNCaP (ATCC.: CRL-1740), DU145 (ATCC: ΗΤΒ-81), και C4-2 (ATCC: CRL-1595) πολλαπλασιάστηκαν σε καλλιέργεια χρησιμοποιώντας μέσο RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C με 5% CO

2. PC3 (ATCC: CRL-1435) κύτταρα καλλιεργήθηκε παρομοίως, αλλά με τη χρήση ϋΜΕΜ (HyClone, Logan, UT) μέσο αντ ‘αυτού. Καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε 7.5 ml αίματος από έναν υγιή δότη σε CellSave® Vacutainer σωλήνες και επεξεργασία εντός 48 ωρών με τον ίδιο τρόπο όπως το δείγμα του ασθενούς.

Επεξεργασία Εικόνας

Για τη μελέτη της μορφολογίας της ΚΜΑ και καλλιεργήθηκαν καρκινικά κύτταρα, θα εξάγονται εικόνες των μεμονωμένων κυττάρων από το σύστημα CellSearch® και τους αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα λογισμικού που αναπτύχθηκε με τη χρήση LabView (Σχήμα S1? National Instruments, Austin, ΤΧ). Οι εικόνες ήταν πλατεία πίνακες με μεγέθη που κυμαίνονται 80 έως 200 pixels και μορφοποιηθεί ως φορητά γραφικά δικτύου αρχείων (PNG) ως 8 μονο bit ή 24 bit χρώματος σύνθετα υλικά (Σχήμα S1). Για να υπολογιστεί περιοχή σε εικονοστοιχεία, οι εικόνες αρχικά σε επεξεργασία με χρήση κατωφλίου συμπλέγματος για τον εντοπισμό φωτεινά αντικείμενα για να ταιριάζει με την αυτόματη έκθεση πραγματοποιείται από το σύστημα CellSearch® (Εικόνα 1Α). Σωματίδια με εικονοστοιχεία σε επαφή με την ακμή του πλαισίου εικόνας απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο σωματιδίων απόρριψη των συνόρων για την εξάλειψη των κυττάρων ατελώς οριοθετείται από τις εικόνες (Σχήμα S1). εικόνες πολυ-σωματιδίων, επίσης απαλείφονται, χρησιμοποιώντας καμπή κατάτμησης. σωματίδια τα συντρίμμια απομακρύνθηκαν με τη χρήση δύο επαναλήψεις ενός φίλτρου σωματιδίων διάβρωση 3 × 3. Κυττάρων και η πυρηνική μέγεθος προσδιορίστηκε μετρώντας τον αριθμό των pixels πάνω-όριο στην κυτοκερατίνη και το κανάλι DAPI αντίστοιχα. Αποτελέσματα για τον υπολογισμό των κυττάρων και το πυρηνικό μέγεθος διηθούνται προς απομάκρυνση των κυττάρων με πυρηνική απίθανο μεγέθη, τα οποία ορίζουμε ως πυρηνικό έκταση που υπερβαίνει το 95% της περιοχής των κυττάρων. Αυτά τα στάδια επεξεργασίας απορρίπτεται 209 από 732 εικόνες, ή 28,5% του συνόλου. Η πλειοψηφία των απέρριψε τις εικόνες που περιέχονται θραύσματα κυττάρων ή εμφανίζει εικόνες χαμηλής ποιότητας (Εικόνα S2). Κατεβάστε το

Labview εκτελεί τη σειρά των εργασιών στις μεγάλες διαφορετικές μάγοι σύνολα δεδομένων που παρέχονται από το σύστημα CellSearch®. Οι δύο παράλληλες φιλτραρίσματος και μετρήσεις, όπως τον υπολογισμό περιοχή σε pixels (Α) και εκτίμηση της βέλτιστης προσαρμογής έλλειψη (Β) πραγματοποιείται για βέλτιστη απόδοση και τα αποτελέσματα.

Η

Η εκκεντρότητα των κυττάρων Shape

Μέτρηση

για να αναλυθεί η εκκεντρικότητα του κυτταρικού σχήματος, μία έλλειψη είχε τοποθετηθεί στο περίγραμμα του κυττάρου. Η επισκόπηση της εκτίμησης της βέλτιστης προσαρμογής έλλειψη χρησιμοποιώντας λογισμικό LabView φαίνεται στο Σχήμα 1Β. Για να ενισχυθεί η ανίχνευση του κυττάρου περίγραμμα, οι εικόνες ήταν αυξημένης αντίθεσης πριν αυτόματη κατωφλίου. Τρεις-επαναλήψεις ενός φίλτρου διάβρωση 3 × 3, καθώς και ένα μόνο φίλτρο διαστέλλονται διεξήχθησαν για να εξομαλύνουν τις άκρες των σωματιδίων. Τοποθέτηση πραγματοποιήθηκε σε μια δυαδική εικόνα χρησιμοποιώντας το περίγραμμα μέθοδο ανίχνευσης για να ψάξετε για τη μεγαλύτερη περίμετρο έλλειψη μέσα στην εικόνα (Σχήμα S1). Μετά την τοποθέτηση του ελλειπτική τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν οπτικά από τον χειριστή. Για να ποσοτικοποιηθεί η εκκεντρικότητα του σχήματος των κυττάρων, υπολογίσαμε τον συντελεστή επιμήκυνσης (EF), η οποία ορίζεται ως ο λόγος μεταξύ των μειζόνων και ελασσόνων αξόνων του ταιριάζει καλύτερα έλλειψη.

Βαθμονόμηση μέτρησης Μέγεθος

Για να βαθμονόμηση μετρήσεις μεγέθους από τις εικόνες CellSearch®, μετρήσαμε ξεχωριστά το μέγεθος των καλλιεργημένων κυττάρων καρκίνου του προστάτη σε εναιώρημα με τη χρήση της CEDEX XS αναλυτή κυττάρων απεικονίστηκαν με βάση (Roche, Germany). καλλιεργούνται καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα σε αγωγή με θρυψίνη και επανα-εναιωρούνται στο μέσο καλλιέργειας. Οι αριθμοί κυττάρων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μία αραίωση 1:01 του εναιωρήματος κυττάρων σε trypan blue (Gibco, Grand Island, ΝΥ). Ένα 10 μΐ κυτταρικού εναιωρήματος φορτώνεται στο Smart Slide (Roche, Germany), και στη συνέχεια, διαβάστε για τη μέτρηση της διαμέτρου των κυττάρων. Ο συντελεστής μετατροπής από pixels σε μικρόμετρα μπορεί να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση,

Το μέγεθος της ΚΜΑ από δείγματα ασθενών εκτιμήθηκε από τα προϊόντα του συντελεστή μετατροπής και την περιοχή της ΚΜΑ που μετράται από τις εικόνες CellSearch®.

πυρηνική Cytoplasmic

Μέτρηση λόγος

Η πυρηνική αναλογία κυτταροπλασματική ορίζεται ως ο λόγος της πυρηνικής περιοχής (Α

N) σε κυτταροπλασματική περιοχή (Α

C), όπου A

θεωρείται C καθώς η περιοχή του κυττάρου με εξαίρεση A

Ν.

Δείγμα επιλογής

ΚΜΑ αναλύονται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από την αρχική τιμή δείγματα αίματος των συναινούντων ασθενών που έχουν διαγνωστεί με μεταστατικό ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη ανθεκτικό που ήταν χημειοθεραπεία-αφελή και είναι εγγεγραμμένοι σε μια τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή φάσης ΙΙ ενός νέου παράγοντα [38]. Έχουμε συλλέξει όλες τις εικόνες που δείχνουν DAPI + CK + CD45-γεγονότα που εντοπίστηκαν από CellSearch® για τα 83 άτομα που συμμετείχαν στη μελέτη. Με βάση την πιθανότητα ότι ένα μικρό κλάσμα από αυτά τα γεγονότα εκπροσωπείται νόμιμα ΚΜΑ έχουμε περιορίσει την ανάλυσή μας σε 19 ασθενείς που είχαν & gt? 40 DAPI + CK + CD45-εκδηλώσεις. Τρεις από αυτούς τους ασθενείς αποκλείστηκαν περαιτέρω λόγω της χαμηλής ποιότητας των εικόνων. CTC απαρίθμηση ανεξάρτητα προσδιορίστηκε για τους υπόλοιπους 16 ασθενείς από έναν τεχνικό CellSearch® προσόντα και οι μετρήσεις κυμάνθηκαν 11-106 ΚΜΑ /7,5 ml, με μια μέση τιμή των 41,5 ΚΜΑ /7,5 ml. Μετά τον αποκλεισμό ακατάλληλες εικόνες (Εικόνα S2), επειδή δεν μπορούσαν να ερμηνευθούν από το λογισμικό μας, συνολικά 523 ΚΜΑ από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη αναλύθηκαν μαζί με 800 καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα από τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη τέσσερα.

αποτελέσματα και Συζήτηση

τηλέφωνα μέγεθος

Αναλύοντας τις εικόνες των κυττάρων σε επεξεργασία με τη χρήση του συστήματος CellSearch® και βαθμολογείται έναντι ενός προτύπου μικροσκοπία, βρήκαμε σημαντικές διαφορές μεγέθους μεταξύ ΚΜΑ καρκίνου του προστάτη και καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 2 ). Ειδικότερα, η μέση διάμετρος των CTCs συλλαμβάνεται από CellSearch®, μεταξύ 16 ασθενείς μας, είναι μόλις πάνω από το ήμισυ των καλλιεργημένων καρκινικών κυττάρων, με 7,97 ± 1,81 μm για ΚΜΑ και 13,38 ± 2,54 μm για καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα (ρ & lt? 0.001) αντίστοιχα . Ενώ Coumans και οι συνεργάτες του [21] χρησιμοποιείται μια στρατηγική διήθηση μικροσκοπικούς πόρους, για τον εμπλουτισμό των δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές και ΚΜΑ ασθενή που προέρχεται, που χαρακτήριζε τις μηχανικές ιδιότητες του ίδιου EpCAM

+ CK

+ CD45

– CTC πληθυσμός που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη. Η ανάλυσή τους ανέφερε ότι ΚΜΑ προστάτη ήταν μικρότερες από εκείνες του μαστού ή του παχέος εντέρου, ωστόσο, εκτιμάται ότι ΚΜΑ καρκίνος του προστάτη ήταν ~ 25% μεγαλύτερη από την τρέχουσα έκθεση μας. Ενώ αυτή η διαφορά μπορεί να αντιπροσωπεύει κυττάρων του στρες που επιβάλλονται στην επεξεργασία του δείγματος από ανοσοσύλληψης, στην παρούσα μελέτη, και διήθηση μικροπόρων, στην πρώην, η διαφορά αυτή μπορεί επίσης να έχουν προκύψει από τις διαφορετικές στρατηγικές που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση του μεγέθους των κυττάρων. Coumans χρησιμοποιηθεί μια πιπέτα Coulter για τη βαθμονόμηση του μεγέθους, η οποία ήταν λιγότερο ακριβές από ό, τι ανάλυση εικόνας για μικρής κλίμακας μήκους (& lt? 10 μm) εκτιμήσεις μεγέθους. Περαιτέρω, η εκτίμηση μας της διαμέτρου των κυττάρων είναι συνεπής με το μικρό μέσο όγκο κυττάρων που αναφέρθηκαν από Λίγκθαρτ και συνεργάτες [36], καθώς και μία άλλη πρόσφατη μελέτη δείχνει συνολική έκταση των κυττάρων LNCaP είναι 1,6 φορές μεγαλύτερη από εκείνη του EpCAM

+ CK

+ CD45

– προστάτη ΚΜΑ καρκίνου [39]. Είναι επίσης ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι το βέλτιστο μέγεθος των πόρων που χρησιμοποιούνται σε προηγούμενες μελέτες για διήθηση με βάση τη δέσμευση του ΚΜΑ ήταν 8 μm, η οποία συμπίπτει με την αναμενόμενη διάμετρο κυττάρων μας από 7,97 μm [21], [22], [29], [40] . στρατηγικές διήθηση Micropore ανέφεραν τόσο υψηλή όσο το 90% ανάκτηση CTC [40], αλλά έχουν σχετικά χαμηλή καθαρότητα του δείγματος [41] .Η ομοιότητα στο μέγεθος μεταξύ CRPC CTCs εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη και τα λευκοκύτταρα, αυτό μπορεί να αντιπροσωπεύει μια θεμελιώδη περιορισμό των στρατηγικών διήθησης που βασίζονται . Αυτός ο περιορισμός μπορεί να ενδεχομένως να ξεπεραστεί με τον εμπλουτισμό στρατηγικές που συνδυάζουν τον εμπλουτισμό CTC βασίζεται σε ένα συνδυασμό του μεγέθους των κυττάρων και παραμόρφωσης [29] – [31].

Η μέση διάμετρος της ΚΜΑ (7,97 μm) ήταν σημαντικά μικρότερη από καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα (13,38 μm) (p & lt? 0.001)

η

επίσης, εξετάζεται το ενδεχόμενο κριτήρια ασθενή επιλογής μας (CTC μετράνε & gt? 40). μπορεί να μεροληπτεί για ένα μεγαλύτερο αριθμό μικρότερων ΚΜΑ. Ενώ οι επιλεγμένες ασθενείς ήταν χημειοθεραπεία-αρνητικά, θα έχουν συμμετάσχει σε ένα εύρος θεραπευτικών παρεμβάσεων και θα αντιπροσωπεύει ασθενείς στα τελευταία στάδια της ασθένειας. Λόγω αυτών ή άλλες μοναδικές φυσιολογικές φόρτου στην ομάδα μας ασθενή, πρέπει να δίνεται προσοχή στη γενίκευση των αποτελεσμάτων αυτών σε όλα τα CRPC ΚΜΑ. Ωστόσο, παρατηρήσαμε καμία συσχέτιση μεταξύ του μεγέθους CTC των κυττάρων και του αριθμού των κυττάρων (Πίνακας S1 και Εικόνα S3) που διαφορετικά θα σήμαινε ότι η σοβαρότητα της νόσου επηρεάζει το μέγεθος των κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ άλλες μελέτες έχουν αναφέρει ένα υψηλό βαθμό ετερογένειας στο κυτταρικό μέγεθος CTC [21], [36], [42], [43], την εκτίμηση του μεγέθους μας βασίζεται σε μικροσκοπική ανάλυση έδειξε ότι η μεταβολή της μέσης κυττάρου μεταξύ των ασθενών μέγεθος ήταν αρκετά μικρό, που κυμαίνονται από 7,05 μm έως 8,94 μm με ένα μέσο όρο 8,04 μm. Επιπλέον, η τρέχουσα αποδεκτή κριτήριο που χρησιμοποιείται από το σύστημα CellSearch® για την επικύρωση ΚΜΑ είναι ότι το μέγεθός τους πρέπει να είναι μεγαλύτερο από τη γειτονική λευκοκύτταρα [17]. Ωστόσο, αυτός ο ορισμός του μεγέθους ήταν σε μεγάλο βαθμό προσδιορίζεται με βάση ΚΜΑ που προέρχεται από καρκίνο του μαστού [44] – [47] που έχουν μια μέση διάμετρο των κυττάρων του 13,1 μm [21]. Η παρατήρησή μας ότι ΚΜΑ από ασθενείς με CRPC είναι σημαντικά μικρότερα σε μέγεθος (περίπου 8 μm) υποδηλώνει ότι αυτά τα συμβατικά κριτήρια για τον προσδιορισμό της CTC μπορεί να υποτιμούν την πραγματική καταμέτρηση CTC.

Επίσης, η παρατήρηση μας ότι ο καρκίνος του προστάτη EpCAM

+ ΚΜΑ είναι σταθερά μικρότερη από καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα είναι δυνητικά σημαντική για τις αναδυόμενες στρατηγικές εμπλουτισμού CTC ετικέτα-free. Πρώτον, ο εμπλουτισμός του ΚΜΑ με βάση το μέγεθος και μόνο μπορεί να έχει περιορισμένη αποτελεσματικότητα για τη σύλληψη των μικρότερων ΚΜΑ βρέθηκαν σε CRPC ασθενείς, επειδή δεν θα είναι τόσο ξεκάθαρα discriminable από τα λευκά αιμοσφαίρια του ασθενούς. Ενώ μεγαλύτερες καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούνται συνήθως για να αποδειχθεί η αποτελεσματικότητα αυτών των τεχνικών, όπως HeLa (& gt? 20 μm), LNCaP (18 μm), MCF-7 (& gt? 15 μm), MDA-231 (15 μm) [21 ], [48], [49], καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα, όπως τα κύτταρα L1210 λεμφώματος ποντικού (10 μm), με μικρότερη διάμετρο μπορεί να αντιπροσωπεύει καλύτερα μοντέλα για CTC εμπλουτισμό [31], [50], [51]. Δεύτερον, η συνεισφορά του πυρηνόπλασμα να κύτταρο ακαμψία είναι 10 φορές μεγαλύτερη από το κυτταρόπλασμα [52]? στρατηγικές εμπλουτισμού CTC που ΚΜΑ σύλληψης με βάση το μέγεθος και παραμόρφωσης μπορεί να αποδειχθούν ανώτερες από εκείνες που βασίζονται είδος με το μέγεθος και μόνο. ​​

τηλέφωνα Shape

Η χρήση των καλλιεργημένων καρκινικών κυττάρων εμπλουτισμένου σε αίμα από υγιείς δότες μπορεί να μοντελοποιήσει το διαχωρισμό αυτών των κυττάρων από κύτταρα αιματολογικές που διαφέρουν ως προς το μέγεθος των κυττάρων, αλλά η κοινή προ-επεξεργασία αυτών των κυττάρων με θρυψίνη, για να τους διαχωρίσει από φιάλες καλλιέργειας ιστών, ή επεξεργασία του δείγματος με τη χρήση του CellSearch στρατηγική σύλληψης συγγενείας μπορεί επίσης να επηρεάσει δραματικά το το σχήμα των κυττάρων. Μέσω της σύγκρισης της σε επεξεργασία με θρυψίνη καλλιεργημένα κύτταρα και CRPC ΚΜΑ, μετά τον εμπλουτισμό CellSearch® CTC, αξιολογήσαμε εάν αυτά τα καλλιεργημένα κύτταρα είναι κατάλληλα μοντέλα για την ΚΜΑ που λαμβάνονται από ασθενή. Σε αντίθεση με τα καλλιεργημένα κύτταρα, τα οποία ήταν γενικά στρογγυλό σχήμα, CTCs παρουσίασε σημαντική μεταβλητότητα σχήμα με πολλά κύτταρα που έχουν πιο επίμηκες σχήμα (Σχήμα 3). Εμείς ποσοτικοποιηθεί η εκκεντρότητα του σχήματος κυττάρου χρησιμοποιώντας τον παράγοντα επιμήκυνσης (EF), που ορίζεται ως η αναλογία μεταξύ των μειζόνων και ελασσόνων αξόνων του ταιριάζει καλύτερα έλλειψη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, ΚΜΑ ήταν σημαντικά πιο επιμήκεις από καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα με μέσο όρο διάμεση EF 1,27 σε σύγκριση 1.17 για καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα (ρ & lt? 0,05). Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με άλλες μελέτες που αναφέρουν σημαντική pleomorhpism μεταξύ ΚΜΑ [21], [36], [42], [43]. Μια πιθανή αιτία για την ποικιλία στη μορφολογία των κυττάρων είναι αποπτωτικά γεγονότα που σχετίζονται με τη διάδοση CTC [53]. Ωστόσο, οι κυτταρομορφολογική αλλαγές που παρατηρούνται στην ΚΜΑ μπορεί να αντιπροσωπεύουν λειτουργικές αλλαγές που σχετίζονται με τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ CTC και ενδοθήλιο ή κυτταρική επιμήκυνση που σχετίζονται με αγγειακή μεταφορών [54], [55]. Είναι ενδιαφέρον, κυτταρομορφολογική ανωμαλία του ΚΜΑ έχει συσχετιστεί με φτωχή κλινική έκβαση σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη. [36].

ΚΜΑ ήταν αισθητά μικρότερες από καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα (Α-Δ). Καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα ήταν ως επί το πλείστον γύρο με κανονικό κύτταρο και την πυρηνική σχήματα. Ο πυρήνας τυπικά στο κέντρο και περιβάλλεται από κυτοκερατίνη (Ε-Ε). ΚΜΑ επέδειξαν εξαιρετικά μεταβλητή σχημάτων, συμπεριλαμβανομένων στρογγυλό (Ε), οβάλ (F), επίμηκες (G-J), και συστάδες (L). Μη γύρο και multi-nucleate κύτταρα παρατηρείται μερικές φορές (G-K). Η κίτρινη γραμμή κλίμακας είναι 5 μm σε μήκος

Η

Α:. Επιμήκυνση παράγοντα (EF) του ΚΜΑ από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Η διάμεση EF της ΚΜΑ ήταν γενικά μεγαλύτερη με σημαντική δια- και ενδο-ασθενούς μεταβλητότητα. Β: Πυρηνική κυτταροπλασματική (Ν /Ο) αναλογίες CTCs από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Μέσος με άνω και κάτω τεταρτημόρια δείχνεται για κάθε δείγμα. Η μέση αναλογία N /C για ΚΜΑ ήταν γενικά μεγαλύτερη με σημαντική δια- και ενδο-ασθενούς μεταβλητότητα.

Η

Πυρηνική Cytoplasmic Λόγος

Η πυρηνική κυτταροπλασματική αναλογία (N /C) ορίζεται ως ο λόγος της εμφανούς πυρηνικής περιοχής και την εμφανή περιοχή κελί με τον πυρήνα αφαιρείται. Σε σύγκριση με καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα, CTCs αναμένεται να έχουν μεγαλύτερες N /C λόγω του μικρότερου μεγέθους των κυττάρων τους και πιθανόν μεγαλύτερο πυρηνικό μέγεθος λόγω πιθανών χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Βρήκαμε το μεσαίο N /C για όλα τα καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα να είναι 1,12 ενώ η μέση μέση αναλογία N /C από τη CTC των ασθενών, εμπλουτίζεται με σύστημα CellSearch® να είναι 1,43. Αυτή η παρατήρηση υπογραμμίζει περαιτέρω την πιθανή αποτελεσματικότητα παραμορφωσιμότητα με βάση τον εμπλουτισμό CTC, καθώς πυρηνόπλασμα συνεισφέρει 10-φορές περισσότερο σε κύτταρο ακαμψία από ότι το κυτταρόπλασμα [52]. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Β, CTCs έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη μεταβλητότητα N /C από καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο λόγος N /C του ΚΜΑ συσχετίζεται με κακή έκβαση της νόσου [36], μπορεί να σκεφτεί ότι, εντός αυτής της ετερογενούς πληθυσμού, υπάρχουν κύτταρο υποπληθυσμών με μεγαλύτερη μεταστατικό δυναμικό. Αν ναι, τότε ίσως μια πιο σχετικό μέτρο της κατάστασης της νόσου είναι η μέτρηση ενός ορισμένου υποπληθυσμού ΚΜΑ και όχι την καταμέτρηση όλων των CTCs όπως χρησιμοποιείται σήμερα [9], [56].

συρρίκνωση κυττάρων

Μία ανησυχία που σχετίζεται με τη μέτρηση του μεγέθους των κυττάρων χρησιμοποιώντας το σύστημα CellSearch® είναι αν αποθήκευση κυτταρικών δειγμάτων στους σωλήνες CellSave® τροποποιεί το μέγεθος του κυττάρου και του πυρήνα. Για να διερευνήσουν, συγκρίναμε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν σε αίμα από υγιείς δότες σε επεξεργασία αμέσως με τα ίδια κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία μετά από 48 ώρες αποθήκευσης. Η διάμετρος των κυττάρων βρέθηκε να μειωθεί κατά ~ 6%, ενώ η πυρηνική διάμετρος βρέθηκε να μειωθεί κατά περίπου 10% από το 0 έως 48 ώρες (Σχήμα 5). Το αποτέλεσμα αυτό δίνει μια εκτίμηση της διακύμανσης των μετρούμενων παραμέτρων μορφολογία των κυττάρων που προέρχονται από το χρόνο αποθήκευσης του δείγματος, αλλά δεν μπορούν να εξηγήσουν τις σημαντικές διαφορές στην μορφολογία της ΚΜΑ και καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα, ή τη μεταβλητότητα που βρέθηκαν μέσα σε κάθε δείγμα CTC.

Α: Η διάμετρος των καρκινικών κυττάρων του προστάτη καλλιεργήθηκαν μειώθηκε ~ 6% κατά μέσο όρο. Β:. Η πυρηνική διάμετρος των καρκινικών κυττάρων που καλλιεργούνται προστάτη μειώθηκε περίπου 10% κατά μέσο όρο

Η

Συμπέρασμα

Εν κατακλείδι, ΚΜΑ απομονωθεί από ασθενείς με καρκίνο ανθεκτικό ευνουχισμού του προστάτη, χρησιμοποιώντας το σύστημα CellSearch® , ήταν μικρότερα σε μέγεθος, πιο επίμηκες σχήμα, και είχε μεγαλύτερη N /C σε σύγκριση με καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα. ΚΜΑ έδειξαν επίσης σημαντικά μεγαλύτερη μεταβλητότητα στο σχήμα και N /C. Ενώ το σύστημα συλλαμβάνει μόνο EpCAM-υψηλής κύτταρα, CTC εικόνες από CellSearch® απαρίθμηση είναι ευρέως διαθέσιμο και η παρούσα αναλυτική στρατηγική θα μπορούσε να εφαρμοστεί για τον προσδιορισμό μορφολογικά χαρακτηριστικά της CellSearch® εμπλουτισμένο ΚΜΑ. πρέπει να ληφθούν υπόψη στο σχεδιασμό και τη δοκιμή των συσκευών που απομονώνουν CTC σε μια ετικέτα χωρίς μόδα βασίζεται σε κυτταρομορφολογική κριτήρια Οι μορφολογικές διαφορές μεταξύ των καλλιεργημένων κυτταρικών γραμμών και CTC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Screen-shot του προγράμματος LabView® αναπτυχθεί για να αναλύσει τις εικόνες που λαμβάνονται από το σύστημα CellSearch®. Το πρόγραμμα αποκτά τις εικόνες για κάθε υποψήφιο CTC. Μια επιλεγμένη εικόνα (επισημαίνονται με κίτρινο) αναλύεται για να μετρηθεί η περιοχή σε εικονοστοιχεία. Μια έλλειψη έχει τοποθετηθεί σε αυτήν την εικόνα και επικαλύπτονται στην κορυφή της αρχικής εικόνας για έλεγχο. Παράμετροι για ενδιάμεσα στάδια επεξεργασίας εικόνας, καθώς και στατιστικά στοιχεία για το σύνολο της συλλογής εμφανίζονται επίσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085264.s001

(DOCX)

Εικόνα S2.

Απορρίφθηκε εικόνες από θραύσματα κυττάρων από τον προσδιορισμό της CTC. Αυτές οι εικόνες των θραυσμάτων κυττάρων εμφανίστηκε συχνά κατά τη διάρκεια της ανάλυσης εικόνας και δεν συμπεριλήφθηκαν στην καταμέτρηση ή το μέγεθος των κυττάρων μετρήσεις CTC. Τυπικά θραύσματα CTC περιλαμβάνουν έναν πυρήνα που καλύπτεται εν μέρει από κυτοκερατίνη, ή έναν πυρήνα διαχωρίζονται πλήρως από κυτοκερατίνης. Αυτά τα θραύσματα πιθανόν προήλθε από ΚΜΑ που υποβάλλονται σε απόπτωση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085264.s002

(DOCX)

Εικόνα S3.

μέγεθος των κυττάρων έναντι καταμέτρηση CTC. φαίνεται να υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του μεγέθους CTC κυττάρων και του αριθμού των κυττάρων για την ΚΜΑ που προσδιορίζονται από CellSearch από ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του ευνουχισμού ανθεκτικά προστάτη εκεί. Το μέγεθος των κυττάρων κυμαινόταν από 6,9 μm έως 8,95 μm? ενώ η CTC καταμέτρηση κυμαίνεται από 11 έως 106.

doi: 10.1371 /journal.pone.0085264.s003

(DOCX)

Πίνακα S1.

Ασθενής συνοπτικές πληροφορίες. Όλοι οι ασθενείς είχαν διαγνωστεί με μεταστατικό ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού (mCRPC). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στο επίπεδο του PSA και το μέγεθος της ΚΜΑ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085264.s004

(DOCX)