Αφηρημένο

Σκοπός

microRNAs έχουν αναδειχθεί ως βασικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης, και αλλαγμένη έκφραση τους έχει συνδεθεί με ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Έτσι, microRNAs έχουν δυνατότητες ως δύο βιοδείκτες του καρκίνου ή /και των πιθανών νέων θεραπευτικών στόχων. Αν και συσσώρευση στοιχεία δείχνουν το ρόλο της ανώμαλης έκφρασης microRNA στην ενδομητρίου καρκινογένεση, εξακολουθούν να υπάρχουν περιορισμένα διαθέσιμα για την προγνωστική σημασία των microRNAs στον καρκίνο του ενδομητρίου δεδομένων. Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι η διερεύνηση της προγνωστικής αξίας επιλεγμένων βασικών microRNAs στον καρκίνο του ενδομητρίου από την ανάλυση των αρχειακών φορμόλη-σταθερής ιστούς παραφίνης.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Σύνολο RNAs εξήχθησαν από 48 ζεύγη φυσιολογικών και του ενδομητρίου δείγματα όγκων χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ προσέγγιση που βασίζεται. Η έκφραση του miR-26a, αφήστε-7g, miR-21, miR-181β, miR-200c, miR-192, miR-215, miR-200c, και miR-205 ήταν ποσοτικά με ανάλυση της έκφρασης qRT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Στόχοι των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Η στατιστική ανάλυση έγινε με GraphPad Prism 5.0

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα έκφρασης του miR-200c (P & lt? 0.0001). Και miR-205 (P & lt? 0,0001) ήταν σημαντικά αυξημένα σε ενδομητρίου όγκων σε σύγκριση στους φυσιολογικούς ιστούς. ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα της έκφρασης miR-205 σχετίστηκαν με την κακή ασθενή συνολική επιβίωση (λόγος επικινδυνότητας, 0.377? τεστ Logrank, P = 0,028). Επιπλέον, η μειωμένη έκφραση ενός στόχου miR-205 ΡΤΕΝ ανιχνεύτηκε σε ενδομητρίου καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς.

Συμπέρασμα

miR-205 διαθέτει ένα μοναδικό δυναμικό ως προγνωστικό βιοδείκτη σε καρκίνο του ενδομητρίου.

Παράθεση: Karaayvaz Μ, Zhang C, Liang S, Shroyer KR, Ju J (2012) προγνωστική σημασία του miR-205 σε καρκίνο του ενδομητρίου. PLoS ONE 7 (4): e35158. doi: 10.1371 /journal.pone.0035158

Εκδότης: J. Christopher Πολιτείες, το Πανεπιστήμιο του Louisville, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Νοεμβρίου 2011? Αποδεκτές: 13 Μάρ 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Απριλίου 2012

Copyright: © 2012 Karaayvaz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Stony Brook University Translational Research Laboratory Start-up ταμείο (Δρ Ju), R01CA155019 (Δρ Ju) και R33CA147966 (Δρ Ju). Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του ενδομητρίου είναι η πιο συχνή κακοήθεια του γυναικείου γεννητικού συστήματος στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Η συνολική πενταετής επιβίωση του καρκίνου του ενδομητρίου είναι περίπου 80% μεταξύ των όλα τα στάδια. Αν και έχει ένα σχετικά χαμηλό ποσοστό θνησιμότητας σε σύγκριση με άλλα γυναικολογικούς καρκίνους, ορισμένοι τύποι ιστολογική είναι ιδιαίτερα επεμβατική, συχνά μεταστατικών και έχουν κακή ποσοστά επιβίωσης. Η πιο κυρίαρχη υπότυπο, ενδομητριοειδές καρκίνο του ενδομητρίου (ΕΟΚ) αντιπροσωπεύει περίπου το 80% των περιπτώσεων. Η χειρουργική επέμβαση είναι συνήθως θεραπευτική με την πλειονότητα αυτών των περιπτώσεων που διαγιγνώσκονται σε πρώιμο στάδιο. Αντίθετα, οι ασθενείς με προχωρημένο στάδιο ή nonendometrioid ενδομητρίου καρκίνων έχουν την τάση να εμφανίζει πιο επιθετική χαρακτηριστικά και έχουν πολύ λιγότερο ευνοϊκή πρόγνωση [2]. Αν και οι μορφολογικές μεταβολές αντανακλούν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τον καρκίνο του ενδομητρίου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική μοριακή προγνωστικούς βιοδείκτες για την πρόβλεψη καλύτερα το αποτέλεσμα του καρκίνου του ενδομητρίου, ιδιαίτερα σε περισσότερα από το 25% των ενδομητριοειδές ενδομητρίου όγκων με υψηλό κίνδυνο να αναπτύξουν πιο επιθετικές ασθένειες.

Πρόσφατα, μοριακές μελέτες έχουν εντοπίσει αστάθεια μικροδορυφόρου και μεταλλάξεις στο ΡΤΕΝ, K-ras, βήτα-κατενίνης, ρ53, HER-2 /neu, το ρ16 και τα γονίδια Ε-καδερίνης σε περιπτώσεις καρκίνου του ενδομητρίου [ ,,,0],3]. Ιδιαιτέρως, η συχνότητα εμφάνισης μεταλλάξεων ΡΤΕΝ έχει αναφερθεί ότι είναι η υψηλότερη μεταξύ άλλων γενετικών αλλοιώσεων, οι υπάρχουσες σε 34-55% των καρκίνων του ενδομητρίου [4] – [6]. ΡΤΕΝ είναι ένας σημαντικός καταστολέας όγκων σε καρκίνο του ενδομητρίου, και η ταυτοποίηση αυτών των μοριακών αναδιατάξεις μπορούν να βοηθήσουν στην καλύτερη κατανόηση της βιολογίας του ενδομητρίου καρκίνου και μπορεί επίσης να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων μοριακών στόχων για την ανίχνευση, πρόγνωση, και θεραπεία. Παρά το γεγονός ότι αυτές οι γενετικές αλλαγές έχουν περιγραφεί ως σημαντικό, δεν είναι καθολικά παρούσα σε όλες τις περιπτώσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι επιγενετικών μηχανισμών (όπως microRNAs) μπορεί επίσης να εμπλέκονται.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης μόρια RNA του 19-25 νουκλεοτιδίων που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά μέσω σύνδεσης προς την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του mRNA που στόχου, προκαλώντας τη διάσπαση του mRNA, μεταγραφική καταστολή, ή mRNA αποσύνθεση [3], [7] miRNAs έχουν έχουν βρεθεί να ρυθμίζει πολλές κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης [8] – [11], η διαφοροποίηση [12] – [14], και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [8], [13], [15], [16]. Η ανώμαλη έκφραση των miRNAs παρατηρείται στους περισσότερους τύπους όγκου, υποδεικνύοντας ένα ρόλο στην καρκινογένεση και μια πιθανή ως προγνωστικό /διαγνωστικά βιοδείκτες στον καρκίνο [17], [18]. Έχουμε λόγο ότι miRNAs μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια καλύτερη τάξη των βιοδεικτών λόγω της ευρείας ρυθμιστικές λειτουργίες τους. Επιπλέον, η ανώτερη σταθερότητα των miRNAs σε φορμόλη-σταθερού εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) σε ιστούς και διάφορα σωματικά υγρά (π.χ., πλάσμα, ορός) διευκολύνει περαιτέρω την κλινική χρησιμότητα της miRNAs.

Ένας αριθμός πρόσφατες μελέτες έχουν ανέφερε τα προφίλ έκφρασης των miRNAs σε καρκίνο του ενδομητρίου [19] – [26]. Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να ερευνήσει την προγνωστική αξία της miRNAs χρησιμοποιώντας αρχειακό δείγματα FFPE των ασθενών με καρκίνο του ενδομητρίου. Εμείς ποσοτικά συστηματικά τις εκφράσεις των υποψηφίων miRNAs που εμπλέκονται σε κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες, όπως ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου, χημειοαντίσταση, κυτταρικό θάνατο και EMT μετάβασης (miR-26a, αφήστε-7g, miR-21, miR-181β, miR-192, το miR-215 , miR-200c, και miR-205) χρησιμοποιώντας ποσοτική ανάλυση πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR). Αυτά τα miRNAs επιλέχθηκαν με βάση την κρίσιμη γονίδιά τους στόχους που έχουν διαταραχθεί κατά τη διάρκεια του ενδομητρίου καρκινογένεση (π.χ. p53, K-ras, PTEN) [27] – [32]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-200c και miR-205 ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του ενδομητρίου. Ωστόσο, μόνο η έκφραση του miR-205 ήταν σημαντικά σχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών. Προηγούμενες μελέτες έχουν προσδιορίσει ΡΤΕΝ ως ένας από τους άμεσους στόχους του miR-205 [33], [34]. Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της PTEN στην ενδομητρίου βιολογία του καρκίνου, υποθέσαμε ότι η μεσολάβηση του μηχανισμού αναστολής ΡΤΕΝ miR-205 μπορεί να έχει

in vivo

φυσιολογικό ενδιαφέρον στον καρκίνο του ενδομητρίου. Πράγματι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-205 σημαντικά αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα έκφρασης του ΡΤΕΝ. Ως αποτέλεσμα, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το miR-205 μπορεί να κατέχει ένα μοναδικό δυναμικό ως βιοδείκτη για την πρόγνωση του καρκίνου του ενδομητρίου.

Αποτελέσματα

Η έκφραση των miRNAs σε ανθρώπινο καρκίνο του ενδομητρίου και την αξιολόγηση της τους προγνωστικός τιμές

οι κλινικοπαθολογική παράμετροι των 48 ασθενείς καρκίνου του ενδομητρίου που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη περιγράφονται στον πίνακα 1. οι μισοί από τους ασθενείς είχαν καρκίνωμα ενδομητριοειδές, και οι υπόλοιποι ασθενείς διαγνώστηκαν με nonendometrioid ιστολογία (13 ορώδης καρκίνωμα, 5 σαφής καρκίνωμα, 5 κακοήθη μικτό του Muller όγκου (MMMT), και ένα αδιαφοροποίητο καρκίνωμα). Από αυτούς τους ασθενείς, 26 περιπτώσεις είχαν σταδίου Ι (54%), τέσσερις περιπτώσεις είχαν σταδίου ΙΙ (8%), 6 περιπτώσεις είχαν σταδίου ΙΙΙ (13%), και 12 περιπτώσεις είχαν σταδίου IV (25%) της νόσου. Για να διερευνηθεί η κλινική σημασία των επιλεγμένων miRNAs σε αυτούς τους ασθενείς με καρκίνο του ενδομητρίου, ποσοτικοποιήσαμε επίπεδα έκφρασης τους από 48 ζεύγη αρχειακό όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων ιστού FFPE χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου ανάλυση qRT-PCR. Των miRNAs που εξετάστηκαν, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης του miR-26a, αφήστε-7g, miR-21, miR-181β, miR-192 και miR-215 μεταξύ των καρκινικών ιστών και των αντίστοιχων φυσιολογικά δείγματα (P = 0.742 ? Ρ = 0,91? Ρ = 0,641? Ρ = 0,313? Ρ = 0,106? Ρ = 0.336, αντίστοιχα) (Σχήμα 1 Α-Ρ). Αντίθετα, η έκφραση των δύο miR-200c (Ρ & lt? 0,0001? Σχήμα 1G) και miR-205 (Ρ & lt? 0,0001? Σχήμα 1) ήταν σημαντικά up-ρυθμίζεται ενδομητρίου δειγμάτων καρκίνου σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς. Για να αναλυθεί περαιτέρω η σημασία του miR-200c και miR-205 από την άποψη της κλινική πρόγνωση, διεξήχθη ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier, χρησιμοποιώντας ασθενής συνολική επιβίωση (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-205 ήταν σημαντικά σχετίζονται με την επιβίωση των ασθενών. Οι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα (cut-off 15-πλάσια του miR-205) έτειναν να έχουν καλύτερη επιβίωση από τους ασθενείς με υψηλά επίπεδα miR-205 (αναλογία Ασάρ, 0.377? Τεστ Logrank, P = 0,028) (Εικόνα 2Β). Αυτό υποστηρίζει την ιδέα ότι τα αυξημένα επίπεδα του miR-205 σε ιστούς όγκων θα μπορούσε να οδηγήσει στο χειρότερο ποσοστά επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του ενδομητρίου. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης του miR-200c δεν συσχετίστηκαν με την επιβίωση των ασθενών (Ρ = 0,576? Σχήμα 2Α).

Σχετική ποσοτικοποίηση των miRNAs εκφράστηκε ως ομαλοποιήθηκε με ένα εσωτερικό γονίδιο RNU6B ελέγχου. (Α) έκφραση του miR-26a (P = 0.742). (Β) αφήστε-7g έκφραση (p = 0,91). (C) miR-21 έκφρασης (Ρ = 0,641). (D) miR-181β έκφραση (P = 0,313). έκφρασης (Ε) miR-192 (P = 0,106). έκφρασης (F) miR-215 (P = 0,336). (G) έκφραση του miR-200c (P & lt? 0,0001). (H) έκφραση του miR-205 (P & lt? 0,0001). Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με t-test μια αντιστοιχισμένη του Student.

Η

. Kaplan-Meier καμπύλες συνολική επιβίωση χαράχθηκαν με βάση την έκφραση miRNA. (Α) ΜΙΚ έκφραση 200c (P = 0,576, δοκιμή Logrank). (Β) miR-205 έκφρασης (P = 0,028, Logrank δοκιμή).

Η

Συσχέτιση της έκφρασης miR-205 και PTEN σε ασθενείς με καρκίνο του ενδομητρίου

Έχει αναφερθεί ότι miR-205 στοχεύει σε μια κρίσιμη ογκοκατασταλτικό γονίδιο ΡΤΕΝ [33], [34], η οποία είναι συχνά μεταλλαχθεί ή διαγραφεί σε καρκίνο του ενδομητρίου [4] – [6]. Ωστόσο, οι γενετικές μεταβολές δεν μπορούν να εξηγήσουν για κάθε απώλεια πρωτεΐνης PTEN παρατηρείται στην ενδομήτρια καρκινώματα, γεγονός που υποδηλώνει έντονα την συμμετοχή ενός μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης ΡΤΕΝ [35], [36]. Δεδομένου ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-205 ήταν αυξημένα σε καρκινικούς ιστούς, εμείς αιτιολογημένη ότι η ενισχυμένη αναστολή της ΡΤΕΝ με miR-205 μπορεί να είναι ένα φυσιολογικώς σχετικό μηχανισμό κατά τη διάρκεια του ενδομητρίου καρκινογένεση. Προκειμένου να διερευνηθεί η

in vivo

σχέση μεταξύ miR-205 και την έκφραση της πρωτεΐνης PTEN, κατασκευάσαμε μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs) από αρχειακό δείγματα ιστών FFPE και εκτελούνται ανοσοϊστοχημεία με PTEN 6H2.1 αντισωμάτων σε τομή TMAs. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση ΡΤΕΝ πρωτεΐνης μειώθηκε σε καρκίνο του ενδομητρίου σε σύγκριση με φυσιολογικά ενδομήτριο. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι διάμεση έκφραση ΡΤΕΝ ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ιστούς όγκου (Μέσος όρος 85) σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς (Μέσος όρος 132) (Ρ = 0,0058). Το σχήμα 3 (Β-Ε) δείχνει παραδείγματα χρώση ΡΤΕΝ σε φυσιολογικά ενδομήτριο (3Β), καρκίνωμα ενδομητριοειδές (3C), ορώδες καρκίνωμα (3D), και σαφείς καρκίνωμα (3Ε).

(Α) Διάγραμμα διασποράς του ανοσοχρώση βαθμολογίες για ΡΤΕΝ σε κανονική ενδομητρίου και του καρκίνου του ενδομητρίου που υπολογίζεται με ποσόστωση της ένταση χρώσης χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Μπάρες αντιπροσωπεύουν το μέσο για κάθε κατηγορία (φυσιολογική μέση τιμή = 85, μέση τιμή του όγκου = 132). έκφραση της πρωτεΐνης (Β-Ε) ΡΤΕΝ ανιχνεύεται στο φυσιολογικό ενδομήτριο (Β), καρκίνωμα ενδομητριοειδές (C), ορώδες καρκίνωμα (D), καθώς και σαφείς καρκίνωμα (Ε) όπως ανιχνεύεται με ανοσοϊστοχημεία.

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η αντίστροφη σχέση μεταξύ του miR-205 και την έκφραση ΡΤΕΝ, πραγματοποιήσαμε μια μη-παραμετρική ανάλυση Spearman συσχέτιση με τη χρήση των υποθέσεων που έχουν και τα δύο στοιχεία πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση miR-205 και PTEN. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν την παρουσία ενός αντίστροφος συσχετισμός στο 69% των περιπτώσεων (συντελεστής Spearman συσχέτισης = -0,502, P = 0,034) (Εικόνα 4Α). Εικόνα 4Β και Εικόνα 4C δείχνουν τα παραδείγματα της χρώσης PTEN συνοδεύεται από τα επίπεδα έκφρασης του miR-205 σε μεμονωμένες περιπτώσεις. Το Σχήμα 4Β παρουσιάζει μια αδιαφοροποίητο καρκίνωμα με χρώση υψηλή ΡΤΕΝ και μόνο μια ελαφρά προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης miR-205 μεταξύ όγκου και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (~1.25 φορές). Εικόνα 4C δείχνει μια σαφή καρκίνωμα με χρώση πολύ χαμηλή PTEN και ~350 φορές πάνω ρύθμιση στο miR-205 έκφρασης μεταξύ του όγκου και γειτονικό φυσιολογικό ιστό.

(Α) Συσχέτιση του miR-205 και η έκφραση ΡΤΕΝ αναλύθηκε με δίπλευρη Spearman μη παραμετρική δοκιμασία συσχέτισης (P = 0,034, Spearman συντελεστής συσχέτισης = -0.502). έκφραση πρωτεΐνης ΡΤΕΝ συνοδεύεται από έκφραση miR-205 (εις τριπλούν) απεικονίζεται σε μεμονωμένες περιπτώσεις? αδιαφοροποίητο καρκίνωμα (Β), και σαφείς καρκίνωμα (C).

Η

Τέλος, για να υποστηρίξει την υπόθεση μας ότι μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης ΡΤΕΝ διαμεσολαβείται από ένα μετα-μεταγραφικό έλεγχο, εμείς ποσοτικοποιηθεί επίπεδα ΡΤΕΝ mRNA χρησιμοποιώντας πραγματικό χρόνου φθάνουν qRT-PCR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης ΡΤΕΝ mRNA σε ενδομητρίου δειγμάτων καρκίνου έδειξαν καμία διαφορά σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς παρακείμενα (Σχήμα 5). Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η έλλειψη συσχετισμού του ΡΤΕΝ mRNA με την απώλεια της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης σε καρκίνο του ενδομητρίου ήταν πιθανόν να οφείλεται σε μετα-μεταγραφικά ρυθμίζονται μηχανισμό.

Σχετική ποσοτικοποίηση της ΡΤΕΝ mRNA εκφράστηκε ως ομαλοποιήθηκε με ένα εσωτερικό έλεγχο β-ακτίνης γονίδιο (p = 0.31). Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με ένα αντιστοιχισμένο t-test του Student.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίστηκαν σημαντικά υπερεκφράζεται miR-200c και miR-205 στον καρκίνο του ενδομητρίου σε σύγκριση με φυσιολογικό ενδομητρίου ιστού (Εικόνα 1). Το εύρημα αυτό συμφωνεί με πολλές άλλες μελέτες αναφέρουν αυξημένα επίπεδα αυτών των δύο miRNAs σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου του ενδομητρίου [19] – [24], [26]. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι η υπερέκφραση υπογραφή αυτών των miRNAs στον καρκίνο του ενδομητρίου δεν είναι ειδικό για ιστολογικός τύπος. Chung

et al.

Ανέφερε ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση του miR-205 συσχετίστηκε με προχωρημένο στάδιο καρκίνου του ενδομητρίου [22]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση miR-205 δεν είχε σχέση με το στάδιο της νόσου ή του όγκου του τύπου (Σχήμα S1). Ανακαλύψαμε ότι η έκφραση miR-205 συσχετίστηκε σημαντικά με τη συνολική επιβίωση των ασθενών, έτσι ώστε οι ασθενείς με υψηλότερα επίπεδα miR-205 τείνουν να έχουν χειρότερη επιβίωση φαινότυπο (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν μια αντίληψη ότι το miR-205 μπορεί να έχει δυνατότητες ως βιοδείκτη για την αρνητική πρόγνωση του καρκίνου του ενδομητρίου και θεραπευτικές προσεγγίσεις που στοχεύουν αυξημένα επίπεδα των miR-205 θα πρέπει να διερευνηθεί ως νέα προσέγγιση για τη βελτίωση των κλινικών αποτελεσμάτων.

Η οικογένεια miR-200 και miR-205 έχουν επίσης αναφερθεί να απορυθμίζεται σε άλλους τύπους καρκίνου. Η οικογένεια miR-200 έχει αναφερθεί ότι είναι up-ρυθμίζεται με καρκίνο των ωοθηκών και χολαγγειοκαρκίνωμα [37] – [39], αλλά κάτω-ρυθμίζονται σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, τον καρκίνο του μαστού και καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [40] – [42]. Αντίθετα, miR-205 έχει αναφερθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε ωοθηκών, της ουροδόχου κύστης, και καρκινώματα του μαστού [37], [43], [44], αλλά κάτω-ρυθμίζονται σε προστάτη και του οισοφάγου καρκίνων [45], [46] . Αυτά τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης σε μερικούς τύπους καρκίνου μπορεί να αντικατοπτρίζει την παρουσία των μηχανισμών ειδικά για τον τύπο του όγκου που προκαλούνται από ρυθμιστικά miRNAs. Η πιο γνωστή λειτουργία του miR-200 οικογένειας και miR-205 είναι η ικανότητά τους να ρυθμίζουν την έκφραση της Ε-καδερίνης μεταγραφικοί καταστολείς ZEB1 (επίσης γνωστή ως δEF1) και SIP1 (επίσης γνωστή ως ZEB2), παράγοντες σημαντικοί για επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) και μετάσταση όγκου [32]. Ωστόσο, miR-200 οικογένεια και miR-205 λειτουργούν ως καταστολείς των όγκων μέσω της αναστολής της EMT. Δεδομένου ότι η έκφραση αυτών των miRNAs είναι αυξημένη στα δείγματα όγκου, εμείς αιτιολογημένη ότι άλλες πρωτεΐνες αποτελούν στόχο αυτών των miRNAs μπορεί να εμπλέκεται στον καρκίνο του ενδομητρίου. Ένας από τους στόχους που αναφέρθηκαν από miR-205 είναι ένα κρίσιμο ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ΡΤΕΝ [33], [34].

έκφραση ΡΤΕΝ έχει αναφερθεί να μειωθεί σε ενδομήτριο καρκίνωμα [4], έτσι έχει ένα κρίσιμο ρόλο στον καρκίνο του ενδομητρίου βιολογία [35], [36], [47], [48]. Ωστόσο, οι μεταλλάξεις /διαγραφές των PTEN δεν είναι ο μόνος λόγος για τη μειωμένη έκφραση ΡΤΕΝ. Αντίθετα, στην επιγενετική, όπως μεθυλίωση προαγωγός, αυξημένη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης PTEN ή ρύθμιση μέσω miRNAs είναι επίσης σημαντικά [49]. Με αυτό κατά νου, αναλύσαμε τα επίπεδα έκφρασης του ΡΤΕΝ mRNA και πρωτεΐνης σε ασθενείς με καρκίνο του ενδομητρίου. Έχουμε δείξει ότι, αν και δεν υπήρχε μεταβολή στην έκφραση του mRNA ΡΤΕΝ, η έκφραση της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης μειώθηκε σε ιστούς όγκου σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς. Αυτό υποστήριξε την υπόθεση ότι μια μετα-μεταγραφική ρύθμιση της PTEN, ενδεχομένως διαμεσολαβείται από miRNAs, είναι έγκυρη. Μαζί με τις αναφορές ότι ΡΤΕΝ είναι ο άμεσος στόχος του miR-205, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν τον πιθανό ρόλο των miR-205 στη ρύθμιση ΡΤΕΝ σε καρκίνο του ενδομητρίου.

Γενικά, μία μείωση στην έκφραση ΡΤΕΝ συσχετίζεται με endometriod καρκίνωμα και μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για τη διάκριση ενδομητριοειδές καρκίνωμα από ορώδες καρκίνωμα [4]. Ωστόσο, άλλες μελέτες έχουν αναφέρει καμία σημαντική διαφορά στην έκφραση ΡΤΕΝ, υποδηλώνοντας ότι ΡΤΕΝ δεν είναι πάντοτε χρήσιμο να γίνει διαχωρισμός των υποτύπων του όγκου [50], [51]. Ως εκ τούτου, η κλινική χρησιμότητα του ΡΤΕΝ ως βιοδείκτη μένει να καθοριστεί. Έχουμε λόγο ότι το miR-205 μπορεί να είναι μια ανώτερη βιοδείκτη από PTEN λόγω της ευρείας επιπτώσεις της στην πολλαπλούς στόχους και πορείες.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση του miR-205 και PTEN είναι αντιστρόφως ανάλογα με ενδομητρίου ασθενείς με καρκίνο, που συνεπάγεται τη φυσιολογική σημασία του μηχανισμού αναστολής μεσολάβηση ΡΤΕΝ miR-205 σε ενδομητρίου βιολογία του καρκίνου. Το πιο σημαντικό, η έκφραση του miR-205 συνδέεται με τον καρκίνο του ενδομητρίου επιβίωση του ασθενούς. Έτσι, είναι αυτονόητο ότι miR-205 μπορούν να ρυθμίζουν ΡΤΕΝ και άλλες έκφραση πρωτεΐνης στην παθογένεση του καρκίνου του ενδομητρίου. Μελλοντικές μελέτες είναι σαφώς αναγκαία για την επικύρωση πλήρως την κλινική χρησιμότητα του miR-205 ως προγνωστικό βιοδείκτη με πολυκεντρική μεγάλες καρκίνο του ενδομητρίου ομάδες ασθενών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική

κλινικό δείγμα ομάδα που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Ίδρυμα αναθεώρηση της Stony Brook University Medical Center. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται στη μελέτη.

Ασθενείς και δείγματα

Έγκριση από το Δ.Σ. κριτική Ίδρυμα ελήφθη τόσο για τη συλλογή των ιστών και τη χρήση του αρχειακού φορμόλη σταθερό ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) τμήματα ιστού. Για εκχύλιση RNA, δείγματα όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από 48 ασθενείς καρκίνου του ενδομητρίου που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή στο Stony Brook University Hospital, Stony Brook, ΝΥ. Τα χαρακτηριστικά αυτών των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα 1. Για ανοσοϊστοχημεία, ιστούς όγκων ελήφθησαν από 47 ασθενείς καρκίνου του ενδομητρίου και μη παθολογικές ενδομητρίου ιστούς ως κανονικά συγκριτικά ελήφθησαν από πέντε ασθενείς με καρκίνο μη-ενδομητρίου. Παραφίνη μπλοκ που περιέχει σταθεροποιημένο με φορμαλίνη δείγματα των ιστών (FFPE) αποκτήθηκαν από τις αρχειακές συλλογές του Τμήματος Παθολογίας και χρησιμοποιήθηκε για τις επόμενες αναλύσεις. Τα δείγματα επιλέχθηκαν 1995-2010 με έως και 15 χρόνια κλινική παρακολούθηση πληροφορίες.

ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs)

μικροσυστοιχίες ιστού παρασκευάστηκαν από FFPE μπλοκ δειγμάτων υστερεκτομή. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές από όλες τις περιπτώσεις προσεκτικά αναθεωρηθεί. Για κάθε περίπτωση, οι καθορισμένες περιοχές του καρκίνου του ενδομητρίου και φυσιολογικό ενδομήτριο. Χρησιμοποιώντας το Advanced Tissue arrayer (Μοντέλο: ATA-100, Millipore, Billerica, ΜΑ, USA), με μια βελόνα διαμέτρου 1.5 mm, τρεις πυρήνες εξήχθησαν από την περιοχή του όγκου και τρία πυρήνες απομακρύνθηκαν από τον καλοήθη ενδομήτριο για κάθε περίπτωση. Οι πυρήνες ενσωματωμένα σε ένα μπλοκ μικροσυστοιχία ιστού παραφίνης σε προκαθορισμένες θέσεις, με έως και 60 πυρήνες σε κάθε μικροσυστοιχία ιστό και δύο επιπλέον πυρήνες τοποθετούνται να ορίσει τον προσανατολισμό του μπλοκ.

ανοσοϊστοχημεία (IHC) Ανάλυση ΡΤΕΝ έκφρασης

TMAs κόπηκαν στα 5 μm και οι τομές ακινητοποιήθηκαν θερμότητα σε γυάλινες πλάκες στους 60 ° C όλη τη νύκτα. Μετά αποπαραφίνωση, ανάκτηση αντιγόνου εκτελέστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού [20 mmol /L (ρΗ = 6)] στους 120 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% για πέντε λεπτά. Η χρώση εφαρμόστηκε σε ιστούς FFPE χρησιμοποιώντας μια μέθοδο αβιδίνης-βιοτίνης (ABC) (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Οι τομές επωάστηκαν για μία ώρα με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ΡΤΕΝ, ΡΤΕΝ 6H2.1 (Cascade Biosciences, Winchester, ΜΑ) σε αραίωση 1:300. Τα μονοκλωνικά ποντικού IgG (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκε ως ισότυπος αρνητικού ελέγχου. χρώση ΡΤΕΝ οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη (Dako, Carpinteria, CA), και τα τμήματα κηλιδώνονται αντιθέτως με αιματοξυλίνη αραιό, αφυδατωμένα, και καλύφθηκαν για μικροσκοπία φωτεινού πεδίου. Χρώση για IHC ποσοτικά με μέσο όρο ένταση από τρεις πυρήνες της κάθε περίπτωσης (λογισμικό ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/)).

Απομόνωση RNA

Χρήση αρχειακό ιστούς FFPE, ξεχωριστές όγκου και φυσιολογικό ενδομήτριο ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το αντίστοιχο αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές και πυρήνων μέτρησης 1,5 mm σε διάμετρο και 2 mm σε μήκος (περίπου 0,005 g) εξάγεται. Ακολούθως, τα δείγματα αποπαραφινοποιήθηκαν, ενυδατωμένο, πέψη με πρωτεϊνάση Κ, και, τελικά, τα συνολικά RNAs απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad CA, USA).

πραγματικού χρόνου qRT-PCR Ανάλυση των miRNA Έκφρασης

το miR-26a, αφήστε-7g, miR-21, miR-181β, miR-192, miR-215, miR-200c, και miR-205 ειδικούς εκκινητές και το εσωτερικό γονίδιο RNU6B ελέγχου αγοράστηκαν από την Ambion ( Applied Biosystems, CA, USA). cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε από το High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, CA, USA) με miRNA ειδικούς εκκινητές. Πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε σε ένα Applied Biosystems 7500 του συστήματος σε πραγματικό χρόνο (όργανο ΑΒΙ 7500HT) με miRNA ειδικούς εκκινητές από TaqMan Gene Expression Assay.

σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR ανάλυση του ΡΤΕΝ mRNA

για την ανίχνευση mRNA από τους ιστούς FFPE, cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε από το High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, CA, USA) με τυχαία εναύσματα. Για ανάλυση qRT-PCR, ειδικά σχεδιασμένα πραγματικού χρόνου PCR εναρκτήρες και διερευνητές για ΡΤΕΝ και τον εσωτερικό έλεγχο γονίδιο β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν (Applied Biosystems CA, USA). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να ληφθούν ως μικρά αμπλικόνια είναι δυνατόν, λόγω της ανησυχίας για την αποικοδόμηση του mRNA σε FFPE ιστούς [52]. Οι αλληλουχίες αυτών των εκκινητών /ανιχνευτών καταγράφονται στον Πίνακα 2. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα όργανο ΑΒΙ 7500HT με mRNA ειδικούς εκκινητές με TaqMan Gene Expression Assay υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 50 ° C, 2 λεπτά από την αντίστροφη μεταγραφή? 95 ° C, 10 λεπτά? 95 ° C, 15 s? 60 ° C, 1 λεπτό μέχρι 40 κύκλους (n = 3). Η έκφραση του ΡΤΕΝ mRNA κανονικοποιήθηκε σύμφωνα με τον εσωτερικό έλεγχο β-ακτίνης, και οι τιμές σχετικής έκφρασης απεικονίζονται.

Η

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού GraphPad Prism 5.0 . Gene τιμές ΔCt έκφραση του miRNAs από κάθε δείγμα υπολογίζεται από την κανονικοποίηση σύμφωνα με τις εσωτερικές έκφραση RNU6B ελέγχου, και σχετικές τιμές ποσοτικοποίηση απεικονίσθηκαν. Οι διαφορές μεταξύ του όγκου και των φυσιολογικών ιστών αναλύθηκαν με t-δοκιμασία κατά ζεύγη Student. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν για να αξιολογήσουν τα επίπεδα έκφρασης του miR-200c και miR-205 με ποσοστό επιβίωσης. t-test Αζευγάρωτη Student χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η διαφορά στην κηλίδωση ΡΤΕΝ μεταξύ όγκου και φυσιολογικών ιστών. Η στατιστική σημαντικότητα ιδρύθηκε στην P & lt? 0,05 σε κάθε δοκιμή

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

Σχέση ανάμεσα στην έκφραση του miR-205 και τα διάφορα στάδια του καρκίνου του ενδομητρίου. έκφραση miR-205 εκφράσθηκε ως ομαλοποιήθηκε με ένα εσωτερικό γονίδιο RNU6B ελέγχου. (Α) Η μονόδρομη δοκιμή ANOVA χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της συσχέτισης του miR-205 έκφραση στο στάδιο Ι, στάδιο II, στάδιο III και το στάδιο IV του καρκίνου του ενδομητρίου. t-test (Β) unpaired Student χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της σύνδεσης του miR-205 έκφρασης στο στάδιο Ι & amp? ΙΙ

vs

σταδίου ΙΙΙ & amp? IV

doi:. 10.1371 /journal.pone.0035158.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσω Haiyan Zhai, Stephanie Burke, Saira Mehmood, και της Πηνελόπης Γεωργακόπουλος για τεχνική βοήθεια και χρήσιμα σχόλια. Ευχαριστούμε τον Δρ Xiao Xu (Βιοστατιστική Πυρήνα για το πεπτικό ιστών Συμβάσεων Διευκόλυνσης Ασθένειες Ερευνών του Πανεπιστημίου Stony Brook) για τη βοήθειά του στη στατιστική ανάλυση. Εκτιμούμε την κριτική εξέταση από την κα Σόνια Lorrain και προτάσεις από τους αναθεωρητές μας.