Abstract

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), η οποία είναι επάνω ρυθμισμένη στον καρκίνο του πνεύμονα, περιλαμβάνει την ενεργοποίηση μιτογόνων σημάτων και ενεργοποιεί πολλαπλά καταρράκτες σηματοδότησης. Για να αναλύσουμε αυτά τα καταρράκτες EGFR, χρησιμοποιήσαμε 14 διαφορετικές φωσφο-EGFR αντισώματα για την ποσοτικοποίηση φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας ένα

in situ

δοκιμασία εγγύτητας απολίνωση (

in situ

PLA). Η φωσφορυλίωση στο EGFR-Thr654 και -Ser1046 ήταν EGF-εξαρτώμενη στον υποδοχέα φυσικού τύπου (WT), αλλά EGF-ανεξάρτητη σε μια κυτταρική γραμμή που φέρει την μετάλλαξη του EGFR L858R. Χρησιμοποιώντας ένα ProtoAarray ™ περιέχει περίπου 5000 ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες στο τσιπ πρωτεΐνη, βρήκαμε ότι AURKA αλληλεπίδρασε με το μεταλλαγμένο EGFR-L861Q. Επιπλέον, η υπερέκφραση του EGFR θα μπορούσε να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με AURKA, και οι αναστολείς του EGFR AURKA και μειώθηκε EGFR-Thr654 και φωσφορυλίωση -Ser1046. Ανοσοϊστοχημική χρώση του σταδίου Ι ιστών αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα έδειξαν μια θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης AURKA και φωσφορυλίωση του EGFR σε Thr654 και Ser1046 σε

EGFR

μεταλλαγμένου δείγματα, αλλά όχι σε

EGFR

Μ.Β. δείγματα. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του EGFR και AURKA παρέχει μια εξήγηση για τη διαφορά στην εξάρτηση από το ΕΤΠ μεταξύ

EGFR

Μ.Β. και

EGFR

μεταλλαγμένου κύτταρα και μπορεί να παρέχει μια νέα θεραπευτική στρατηγική για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα που μεταφέρουν

EGFR

μεταλλάξεις

Παράθεση:. Τσεν TC, Liu YW, Huang YH, Yeh YC, Chou ΤΥ, Wu YC, et al. (2013) φωσφορυλίωση πρωτεΐνης Profiling Χρησιμοποιώντας ένα

In Situ

Εγγύτητα Δοκιμασία Η πρόσδεση: Η φωσφορυλίωση της AURKA-Προκαλείται EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (3): e55657. doi: 10.1371 /journal.pone.0055657

Επιμέλεια: Karl X. Chai, University of Central Florida, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14, Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 3 Ιαν. 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (NSC101-2325-B-010-011 και NSC101-2627-Β-010-001), το Κέντρο αριστείας για την Έρευνα του Καρκίνου σε Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων (DOH101-TD-C- 111-007), και το Υπουργείο Παιδείας, στόχος για το σχέδιο Top Πανεπιστήμιο (Εθνικό Yang Ming Πανεπιστημίου) για να CYH. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, και το πενταετές σχετικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα είναι λιγότερο από το 15% [1]. Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι καρκίνου του πνεύμονα: ο καρκίνος του πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC, περίπου το 20% των καρκίνων του πνεύμονα) και καρκίνων του πνεύμονα μη μικρών κυττάρων (NSCLC, περίπου το 80% των καρκίνων του πνεύμονα) [2], [3]. Υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), η οποία είναι μία κινάση τυροσίνης υποδοχέα (RTK), εκκινεί πολλαπλές οδούς σηματοδότησης που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου, όπως αυτές που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η μετανάστευση /εισβολή και του κυτταρικού κύκλου [4] – [7]. Η υπερέκφραση του EGFR έχει παρατηρηθεί σε περίπου 50% των NSCLCs και συνδέεται επίσης με φτωχή πρόγνωση και μια πιο επιθετική πορεία της νόσου [8], [9].

EGFR

μεταλλάξεις συχνά ανιχνεύονται σε ασθενείς με ΜΜΚΠ (10-40%) [10], [11]. Περίπου το 50% των

EGFR

μεταλλάξεις αποτελούνται από διαγραφές στο εξόνιο 19, ενώ 35-45% αποτελείται από μετάλλαξης L858R και 5% αποτελούνται από ενθέσεις στο εξώνιο 20 ή την μετάλλαξη L861Q [10] – [12]. Gefitinib (Iressa) και Η erlotinib (Tarceva) είναι EGFR αναστολείς που χρησιμοποιούνται κλινικά για τη θεραπεία του προχωρημένου NSCLC, κυρίως, ότι με το

EGFR

μεταλλάξεις στα πεδία κινάσης τυροσίνης [13] – [16].

EGFR ενεργοποιείται από το δέσμευση του συγγενή προσδέματα του, όπως EGF και ΤΟΡα. Η σύνδεση του συνδέτη με το αγρίου τύπου (WT) αποτελέσματα EGFR σε διμερισμό του υποδοχέα και ενεργοποίηση της περιοχής κινάσης εγγενούς, ακολουθούμενη από φωσφορυλίωση ειδικών υπολειμμάτων τυροσίνης στην κυτταροπλασματική ουρά [17] – [19]. Η απορύθμιση της EGFR-ενεργοποιημένες πορείες μπορεί να προκύψει από μεταλλάξεις που προκαλούν ανεξάρτητη από συνδέτη διμερισμού του υποδοχέα, ενεργοποίηση και κατάντη σηματοδότησης [16], [20]. Κατά την διέγερση EGF, φωσφορυλίωση τυροσίνης EGFR είναι μια «πρώιμη εκδήλωση», ενώ EGFR σερίνης /θρεονίνης φωσφορυλίωση, π.χ. Ser967, λαμβάνει χώρα με μια χρονική καθυστέρηση [21], [22]. Η φωσφορυλίωση του EGFR σε πολλές θέσεις τυροσίνης μετά από διέγερση προσδέματος ενεργοποιεί καθοδικά καταρράκτες σηματοδότησης, και το φωσφορυλίωση του EGFR στην σερίνη /θρεονίνη έχει αναφερθεί ότι εξασθενεί αυτά τα σήματα μέσω αρνητικής ανάδρασης [23] – [25]. Πολλές περιοχές σερίνης και θρεονίνης είναι παρόντες σε EGFR, αλλά η λειτουργία τους παραμένει ασαφής. Επιπλέον, το αποτέλεσμα σηματοδότησης που επάγεται από τη φωσφορυλίωση διαφόρων θέσεων επί EGFR είναι περίπλοκη και παραμένει να διευκρινιστεί για την ανάπτυξη θεραπευτικών εφαρμογών.

Η κινάση πρωτεΐνης AURKA έχει προσελκύσει την προσοχή επειδή η υπερέκφραση του έχει βρεθεί σε διάφορα επιθηλιακά κακοήθεις όγκους [26], [27], όπως του μαστού [28], του παχέος εντέρου [29], [30] και των πνευμόνων των ωοθηκών [31], ως αποτέλεσμα της ενίσχυσης του γονιδίου, μεταγραφική απορρύθμιση ή ελαττώματα σταθερότητα της πρωτεΐνης και τον έλεγχο της δραστικότητας κινάσης [32]. Δυσλειτουργία του AURKA και EGFR παρατηρείται σε διάφορους τύπους καρκίνου και είναι ένας σημαντικός δείκτης της πρόγνωσης στην ανάπτυξη καρκίνου [33]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το ΕΤΠ που προκαλείται από την πρόσληψη των πυρηνικών EGFR και STAT5 στον υποκινητή AURKA αυξήθηκε περαιτέρω γονιδιακή έκφραση AURKA [34]. Επιπλέον, EGFR αυξάνει την πρωτεΐνη έκφραση AURKA ενεργοποιώντας το μεταφραστικό μηχανισμό μέσω των ERK και ΑΚΤ οδών [35]. Τα ευρήματα αυτά εγείρουν την πιθανότητα ότι αυτές οι δύο πρωτεΐνες που συνδέονται λειτουργικά.

Πρόσφατα, η

in situ

δοκιμασία εγγύτητας απολίνωση (

in situ

PLA) αναπτύχθηκε για να εντοπίσει και να απεικονίσει ενδογενή PPIs και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών, π.χ. φωσφορυλίωση, με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα [36], [37]. Για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης πρωτεΐνης, επιλέχθηκαν διπλή στόχοι του πρωτογενούς ζεύγη αντισώματος [ένα που αναγνωρίζει την πρωτεΐνη-στόχο (π.χ. EGFR) και ένα άλλο που αναγνωρίζει το φωσφο-θέση του στόχου (π.χ. pEGFR-Tyr1068)]. Εάν οι στόχοι ενός ζεύγους αντισώματος είναι σε στενή εγγύτητα, δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια θα είναι επαρκώς κοντά για να χρησιμεύσει ως πρότυπα για την απολίνωση των δύο επιπλέον γραμμικών ολιγονουκλεοτιδίων σε έναν κύκλο DNA. Ο κύκλος DNA μπορεί να ενισχυθεί με το ολιγονουκλεοτίδιο ενός από τα δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιώντας ενίσχυση κυλιόμενου κύκλου (RCA). Το προϊόν RCA μπορεί στη συνέχεια να υβριδοποιηθεί με φθορισμό σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια για να δημιουργήσει ένα σήμα τελεία που δείχνει την υποκυτταρική τοποθεσία και τη συχνότητα της φωσφορυλίωσης [36], [37]. Αυτή η τεχνική έχει υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία για την αξιολόγηση της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης και παρέχει νέες ευκαιρίες για την ποσοτικοποίηση ακρίβεια φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών και μεταγωγής σήματος στα κύτταρα.

Εδώ, θα χρησιμοποιηθούν 14 διαφορετικά αντισώματα-στόχευση δικτυακών τόπων φωσφορυλίωση του EGFR με

in situ

PLA να διευκρινίσει τις διαφορές μεταξύ EGFR-WT και EGFR-L858R μεταλλαγμένο σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ταυτοποίηση δύο θέσεις φωσφορυλίωσης EGF-ανεξάρτητο (EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046) σε κύτταρα που φέρουν το EGFR-L858R μετάλλαξη. Επιπλέον, τόσο EGFR-WT και EGFR-L858R μεταλλαγμένο έδειξε φυσικές αλληλεπιδράσεις με AURKA κάτω από διέγερση EGF. EGFR-Thr654 και φωσφορυλίωση του EGFR-Ser1046 μειώθηκε κατόπιν αιτήσεως ενός αναστολέα AURKA, αλλά μόνο σε μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές EGFR-L858R, η οποία αύξησε την πιθανότητα της θεραπευτικής εφαρμογής των αναστολέων AURKA σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

χαρακτηρισμού της φωσφορυλίωσης του EGFR σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα

EGFR φωσφορυλίωση παίζει ένα ρόλο κλειδί στη ρύθμιση της ενεργοποίησης των οδών που συνδέονται με την πρόοδο του καρκίνου σηματοδότηση [4] – [7]. Υπάρχουν πολυάριθμες θέσεις φωσφορυλίωσης EGFR (https://www.phosphosite.org) [38], και πολλοί από αυτούς δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς (Σχήμα 1), λόγω έλλειψης αντισωμάτων και των μεθόδων ανίχνευσης. Στην παρούσα μελέτη, 14 φωσφορυλιωμένη αντισώματα EGFR χρησιμοποιήθηκαν για

in situ

PLA για την ποσοτικοποίηση της βασικό επίπεδο σηματοδότηση EGFR σε κύτταρα HeLa, τα οποία είναι η κοινή γραμμή κυττάρων για τη διαλογή (Πίνακας 1). Όλα τα αντισώματα ελέγχθηκαν αρνητικά στο

in situ

PLA δοκιμασία σε κύτταρα HeLa, η οποία είναι συνεπής με την ιδέα ότι ο EGFR ενεργοποιείται με την δέσμευση του συνδέτη του και ενεργοποιεί προς τα κάτω τελεστών μέσω διμερισμό του υποδοχέα και φωσφορυλίωση τυροσίνης ειδικών κατάλοιπα στην κυτταροπλασματική ουρά [17] – [19]. Για να επιβεβαιωθεί η ευαισθησία και η εξειδίκευση των

in situ

PLA, μπορούμε στη συνέχεια χρησιμοποιούνται κύτταρα Α431, τα οποία είναι γνωστά για να εκφράσουν υψηλά επίπεδα του EGFR και υπερ-φωσφορυλιωμένη EGFR-Tyr1068 υπό διέγερση EGF. (Εικόνα 2, οι αντιπροσωπευτικές εικόνες επικάλυψης BlobFinder δείχθηκαν στο σχήμα S1). Έτσι, τα κύτταρα Α431 επελέγησαν ως θετικός έλεγχος. Η pEGFR-Tyr1068 ρυθμίζεται αυξητικά από μια περίπου 15-πλάσια αύξηση μετά από διέγερση EGF, όπως προσδιορίζεται με

in situ

PLA δοκιμασίας (Σχήμα 2Α και 2Β), ενώ ρυθμίζεται αυξητικά μόνο κατά 2,6 φορές όπως προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση ( Σχήμα 2C), το οποίο δείχνει την υψηλή ευαισθησία του

in situ

δοκιμασία PLA.

Οι πληροφορίες EGFR θέση φωσφορυλίωσης λήφθηκε από PubMed και PhosphoSitePlus (https://www.phosphosite.org) .

Η

Α431 κύτταρα ήταν άνευ ορού για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGF (10 ng /ml) σε μέσο άνευ ορού για 10 λεπτά. (Α)

Επί τόπου

PLA είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη για την ανίχνευση της φωσφορυλίωσης της pEGFR-Tyr1068 μετά από διέγερση EGF. (Β) Η ποσοτικοποίηση αυτών των δύο σημάτων δεικνύεται. (C) EGFR και pEGFR-Tyr1068 ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα Α431 με ανοσοαποτύπωση ανάλυση.

Η

Η διαφορική έκφραση της φωσφορυλίωσης του EGFR μετά EGF διέγερση μεταξύ EGFR-WT και EGFR-μεταλλαγμένα κύτταρα

ενεργοποίηση EGFR εκκινεί πολλαπλές οδούς σηματοδότησης, και η απορύθμιση του EGFR που ενεργοποιούνται μονοπάτια μπορεί να είναι συνέπεια των διαφόρων

EGFR

μετάλλαξη [39]. Για να προσδιορίσετε την κατάσταση φωσφορυλίωσης απόκλιση των θέσεων φωσφορυλίωσης του EGFR, ανιχνεύσαμε φωσφορυλίωση του EGFR σε διαφορετικές τοποθεσίες σε καρκινικά κύτταρα Η1299 πνεύμονα που εκφράζεται σταθερά ένα άδειο φορέα, EGFR-WT ή EGFR-L858R μεταλλαγμένο με ή χωρίς διέγερση με συνδέτη. Σε Η1299-EGFR-WT σταθερά κύτταρα, 9 από 14 θέσεις φωσφορυλίωσης του EGFR ήταν φωσφορυλιωμένη μετά από διέγερση EGF. Το υπόλοιπο των αντισωμάτων pEGFR απέτυχε να δείξει ένα σήμα στην ανοσοκηλίδωση. Σε αντίθεση, στα μεταλλαγμένα κύτταρα EGFR-L858R, EGF-επαγώμενη (EGFR-Tyr992, EGFR-Tyr1068 και EGFR-Tyr1148) και φωσφορυλίωση EGF-ανεξάρτητο (EGFR-Thr654, EGFR-Tyr845, EGFR-Tyr974, EGFR-Ser1046, EGFR -Tyr1086, και EGFR-Tyr1101) ταυτοποιήθηκαν (Σχήμα 3Α-3C). Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα του

in situ

PLA και ανοσοστύπωση, παρατηρήθηκαν παρόμοια πρότυπα φωσφορυλίωσης για όλες τις θέσεις φωσφορυλίωσης διαλογή (Πίνακας S1 και S2 Σχήμα). Τα πρότυπα φωσφορυλίωσης των 14 διαφορετικών θέσεις φωσφορυλίωσης του EGFR, όπως καθορίζεται από

in situ

PLA και ανοσοκηλίδωση συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η1299 κύτταρα εξέφρασαν σταθερά τον κενό φορέα, EGFR-WT ή μεταλλαγμένης EGFR -L858R. (Α) μετά από διέγερση με EGF (10 ng /ml) σε μέσο άνευ ορού για 10 λεπτά, κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με τις υποδεικνυόμενες φωσφο-τυροσίνης αντισώματα. EGF-εξαρτώμενη (EGFR-Tyr992, -Tyr1148 και -Tyr1068) και EGF-ανεξάρτητο [EGFR-Tyr845, -Tyr974, -Tyr1086 και -Tyr1101, -Thr654 (βλέπε παρακάτω) και -Ser1046 (βλέπε παρακάτω)] φωσφορυλίωση παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Η1299 που εκφράζουν EGFR-L858R μεταλλαγμένο. Η φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 (Β) και -Ser1046 (C) με ή χωρίς αγωγή με EGF σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα παρακολουθήθηκε μέσω

in situ

PLA. Η ποσοτικοποίηση των

in situ

PLA εμφανίζεται στα δεξιά. EGFR-Thr654 και -Ser1046 φωσφορυλιώθηκαν κατά την αγωγή με EGF σε Η1299-EGFR-WT κύτταρα, ενώ η φωσφορυλίωση τους ήταν EGF-ανεξάρτητη σε Η1299-EGFR-L858R κύτταρα. (Δ) Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης των EGFR-Thr654 και -Ser1046 διεξήχθη σε μεταλλαγμένα κύτταρα EGFR (H1975, το οποίο περιέχει το EGFR-L858R και -T790M μεταλλάξεις) και κύτταρα που εκφράζουν EGFR-WT (Α549). Η φωσφορυλίωση του EGFR-Tyr1068 προκλήθηκε με EGF. Η φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 και -Ser1046 ήταν EGF-ανεξάρτητη H1975 και Η1299-EGFR-L858R κύτταρα, όπως καθορίζεται από ανοσοαποτύπωση.

Η

φωσφο-EGFR-Thr654 και φωσφο-EGFR-Ser1046 έκθεμα ΕΟΡ- ανεξάρτητος φωσφορυλίωση σε μεταλλαγμένα κύτταρα Η1299-EGFR-L858R

στην κυτταρική σειρά Η1299-EGFR-L858R, ο φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 (Σχήμα 3Β) και EGFR-Ser1046 (Σχήμα 3C) ταυτοποιήθηκε ως EGF-ανεξάρτητο φωσφορυλίωση από

in situ

PLA και αναλύσεις κηλίδος western (οι αντιπροσωπευτικές εικόνες επικάλυψης BlobFinder δείχθηκαν στο σχήμα S3 και S4 Σχήμα). Ωστόσο, αυτές οι δύο θέσεις φωσφορυλίωσης παρουσίασαν EGF-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση σε Η1299 κύτταρα που εκφράζουν EGFR-WT. Επιπλέον, pEGFR-Thr654 και pEGFR-Ser1046, τα οποία θεωρήθηκαν να φωσφορυλιωθεί από άλλες κινάσες [40] – [42]. Αλλά όχι από EGFR auto-φωσφορυλίωση, επιλέχθηκαν για να ελέγξει τις λειτουργικές επιπτώσεις στο μονοπάτι σηματοδότησης EGFR

Αξιολογήσαμε περαιτέρω εάν ο EGF-ανεξάρτητο φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 και -Ser1046 εμφανίζεται μόνο σε κύτταρα με υπερέκφραση του EGFR-L858R και προκαλείται από δυσ-ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης EGFR. Χρησιμοποιήσαμε Α549 (καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων με ενδογενή EGFR-WT) και H1975 (καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα με ενδογενή μεταλλαγμένα EGFR-L858R-T790M) για να τους παρακολουθούν. Σχήμα 3Δ δείχνει ότι η φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 και -Ser1046 ήταν EGF-ανεξάρτητη σε κύτταρα που εκφράζουν εξωγενή και ενδογενή EGFR-L858R. Έτσι, διαφορετικά /θρεονίνης πρότυπα φωσφορυλίωσης του EGFR σερίνη παρατηρήθηκαν ως φωσφορυλίωση EGF-ανεξάρτητο σε μεταλλαγμένα κύτταρα EGFR-L858R.

Η φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ AURKA και EGFR

AURKA είναι μια κινάση που εκφράζεται έντονα σε μίτωση και έχει ενοχοποιηθεί στις διεργασίες μετασχηματισμού κυττάρου [43]. Σε μια έρευνα για πρόσθετα υποστρώματα και πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με χρήση ProtoAarray ™ [44] που περιείχε περίπου 5000 ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών στο τσιπ πρωτεΐνης (www.invitrogen.com/protoarray), βρήκαμε ότι AURKA αλληλεπίδρασε με το μεταλλαγμένο EGFR-L861Q, η οποία περιλαμβάνει ~ 5% των

EGFR

μεταλλάξεις σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [10], αλλά όχι EGFR-WT (Σχήμα 4Α). Για να επιβεβαιωθεί αυτή η αλληλεπίδραση, η οποία μπορεί να ρυθμίζεται από τη δραστηριότητα κινάσης της AURKA, AURKA-WT και AURKA-KD (AURKA-K162I μετάλλαξη, η οποία είναι κινάσης-νεκρό), χρησιμοποιήθηκαν για συν-ανοσοκατακρήμνιση, η οποία έδειξε ότι EGFR-WT και EGFR-L858R αλληλεπίδρασε με AURKA-WT και AURKA-KD κάτω από την υπερέκφραση του EGFR και AURKA (Σχήμα 4Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καταλυτική δραστικότητα του AURKA δεν διαμορφώνει την αλληλεπίδραση με EGFR. Εφόσον εμφανίζεται EGFR-L858R μεταλλαγμένο συχνά (περίπου 35-45%) σε ασθενείς με NSCLC [12], επιλέξαμε Η1299-EGFR-L858R σταθερά κύτταρα να χαρακτηριστεί περαιτέρω η αλληλεπίδραση με AURKA. Για να εξεταστεί αν υπάρχουν τα ενδογενή αλληλεπιδράσεις EGFR-AURKA σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και αν είναι EGF που εξαρτάται, εφαρμόσαμε

in situ

PLA για προσδιορισμό της αλληλεπίδρασης του EGFR AURKA σε Α549 και H1975 με ή χωρίς διέγερση EGF (Σχήμα 4C). Έδειξε τόσο EGFR-WT και EGFR-L858R αλληλεπιδράσει με AURKA κάτω από διέγερση EGF.

(Α) Χρησιμοποιήσαμε ProtoArray ™ για τον εντοπισμό EGFR ως νέου εταίρου αλληλεπίδρασης για AURKA. Εν συντομία, εξέφρασε, ανασυνδυασμένο His-tagged ανθρώπινη AURKA επεσημάνθη επί ProtoArray ™ μικροσυστοιχίες ανθρώπινη πρωτεΐνη σε επτά συγκεντρώσεις (0, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50 και 100 ng /μl) εις διπλούν. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι EGFR-L861Q, αλλά όχι EGFR-WT, αρχικά προσδιορίζεται να αλληλεπιδρούν με AURKA. (Β) ΗΕΚ293Τ συν-επιμολύνθηκαν με Μγο-EGFR (EGFR-WT, EGFR-L858R και -L861Q μεταλλάξεις) και Flag-AURKA [AURKA-WT και AURKA-κινάσης νεκρός (KD)]. Μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες, τα κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε συν-ανοσοκαταβύθιση με γέλη συγγένειας αντι-FLAG Μ2. Η έκφραση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωμα με αντι-Μγο και αντι-FLAG. Έδειξε ότι και οι δύο EGFR-WT και μεταλλαγμένων EGFR συνεργάτες με AURKA-WT και AURKA-KD. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) Η αλληλεπίδραση EGFR-AURKA με ή χωρίς διέγερση EGF (10 ng /ml για 10 λεπτά) προσδιορίστηκε μέσω

in situ

PLA σε Α549 (EGFR-WT) και H1975 (μεταλλάξεις του EGFR L858R-Τ790Μ ). Τόσο EGFR-WT και -L858R μεταλλαγμένο συνδέθηκαν με AURKA κάτω από διέγερση EGF. Η ποσοτικοποίηση των

in situ

σήματα PLA παρουσιάστηκε στα δεξιά. (Δ) Οι θέσεις φωσφορυλίωσης του EGFR-Thr654 και -Ser1046 ταιριάζει τις ακολουθίες συναίνεσης υπόστρωμα για AURKA. (Ε) H1975 κυττάρων έδειξαν πιο εμφανή φωσφορυλίωση σε EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 και AURKA-Thr288 σε νοκοδαζόλη-συνελήφθησαν Μ-φάση από ό, τι στην μεσόφαση.

Η

EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 αγώνα AURKA φωσφορυλίωση συναινετικές αλληλουχίες

Επειδή AURKA που σχετίζονται με EGFR, είμαστε δίπλα διερευνηθεί αν AURKA φωσφορυλιώνει EGFR σε Thr654 και Ser1046. Οι γειτονικές σειρές για τις θέσεις φωσφορυλίωσης του EGFR σε Thr654 και Ser1046 είναι RHIVRKRT

654LRRLLQE και DSFLQRYS

1046SDPTGAL, αντίστοιχα. Τα μοτίβα φωσφορυλίωση AURKA περιέχουν R-X-S /T, K-X-S /T, K-R-X-S /T, R-R-X-S /T και R-X-X-S /T (Χ υποδεικνύει οποιοδήποτε αμινοξύ) [45]. Με βάση αυτά τα μοτίβα, EGFR-Thr654 συμπλήρωσαν το R-X-X-S /T συναινετική αλληλουχία και EGFR-Ser1046 ταυτοποίησε την συναινετική αλληλουχία R-X-S /T του AURKA (Εικόνα 4D). Αν και EGFR-Thr654 αναφέρθηκε να φωσφορυλιωθεί από κινάση πρωτεΐνης C (PKC) [42], PKC μπορεί να μην είναι η μόνη κινάση που φωσφορυλιώνει EGFR σε αυτό το υπόλειμμα. Επειδή η δραστικότητα της κινάσης του AURKA αυξήσεις στην Μ φάσης [46], χαρακτηρίσαμε πρώτα τη φωσφορυλίωση του ενδογενούς EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 κατά φάσης Μ σε Α549 και H1975 κυττάρων. κύτταρα H1975 αποδειχθεί πιο εμφανή φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 και AURKA-Thr288 από τα κύτταρα Α549. Σε αντίθεση, EGFR-Tyr1068 επέδειξε το ίδιο μοτίβο φωσφορυλίωσης σε Μ-φάση και ενδιάμεση (Εικόνα 4Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα μοτίβα έκφρασης του φωσφορυλιωμένου EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 ήταν το ίδιο με εκείνο του AURKA ιδιαίτερα σε EGFR-μεταλλαγμένα κύτταρα .

EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 φωσφορυλίωση συμβαίνει αργότερα από φωσφορυλίωση του EGFR-Tyr1068 μετά EGF διέγερση

Η φωσφορυλίωση του EGFR-Tyr1068 μετά από διέγερση EGF παρατηρείται σε 0, 2, 5, 10 και 30 λεπτά σε Η1299 κύτταρα που εκφράζουν EGFR-WT ήταν ταχύτερη από την φωσφορυλίωση της Thr654 και Ser1046. Η φωσφορυλίωση του EGFR-Tyr1068 κορυφώθηκε στα 2 λεπτά μετά τη διέγερση EGF, αλλά φωσφορυλίωση του EGFR σε Thr654 και Ser1046 κορυφώθηκε σε 10 λεπτά μετά την EGF διέγερση (Σχήμα 5Α). Αντίθετα, σε EGFR-L858R κύτταρα, δεν υπήρχε διαφορά στην κινητική φωσφορυλίωσης μεταξύ Thr654 και Ser1046 (Σχήμα S5). Έτσι, η φωσφορυλίωση τυροσίνης EGFR εμφανίζεται πριν από την άλλη φωσφορυλίωση σερίνης /θρεονίνης στη Thr654 και Ser1046, η οποία συνίστατο με την προηγούμενη μελέτη του EGFR σερίνης /θρεονίνης φωσφορυλίωση με χρονική καθυστέρηση [21], [22].

(Α) Η φωσφορυλίωση του EGFR-Tyr1068 ήταν ταχύτερη από εκείνη του EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 κάτω από το EGF (10 ng /ml) διέγερσης. (Β) Τα κύτταρα στερήθηκαν ορό με την παρουσία του VE-465 (1 ηΜ ή 100 ηΜ), η οποία είναι ένας αναστολέας AURKA, για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGF (10 ng /ml) για 10 λεπτά. Η φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046, αλλά όχι pEGFR-Tyr1068, καταστάλθηκε από VE-465. (C) Τα κύτταρα στερήθηκαν ορό με την παρουσία του Iressa (10 μΜ) για 16 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με EGF (10 ng /ml) για 10 λεπτά. Iressa, η οποία είναι ένας αναστολέας του EGFR, χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της σηματοδότησης EGFR σε Η1299 κύτταρα εκφράζουν σταθερά EGFR-WT και EGFR-L858R μεταλλαγμένο. Η φωσφορυλίωση από AURKA σε Thr288 καταστάλθηκε από Iressa στις δύο κυτταρικές σειρές. (D) H1975 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με VE-465 ή /και Iressa (10 μΜ) για 16 ώρες. VE-465 και Iressa μπορεί να καταστείλει pEGFR-Thr654 και -Ser1046 σε H1975.

Η

αναστολέας AURKA καταστέλλει EGFR σερίνης /θρεονίνης φωσφορυλίωση

Για να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ της σερίνης EGFR /θρεονίνης φωσφορυλίωση και AURKA, ένας αναστολέας AURKA (VE-465), η οποία καταστέλλει δραστικότητα AURKA όπως μετρήθηκε με φωσφορυλίωση Thr288 [47], αλλά όχι στο επίπεδο πρωτεΐνης AURKA, εφαρμόστηκε για την παρακολούθηση της φωσφορυλίωσης του EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 καθώς και το EGFR μονοπάτι σηματοδότησης (ρΑΚΤ-Ser473). Υπό θεραπεία VE-465, η φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 και -Ser1046 μειώθηκε, αλλά φωσφορυλίωση του EGFR-Tyr1068 δεν επηρεάστηκε (Εικόνα 5Β), πράγμα που δείχνει ότι η φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 ρυθμιζόταν από τη δραστηριότητα κινάσης AURKA.

Iressa είναι ένας αναστολέας του EGFR που καταστέλλει την οδό ΑΚΤ και αναστέλλει AURKA φωσφορυλίωση

για να αξιολογηθεί η ρύθμιση του EGFR και AURKA στην οδό σηματοδότησης EGFR, έναν αναστολέα EGFR (Iressa) χρησιμοποιήθηκε για να εμποδίσει αυτοφωσφορυλίωσης EGFR και κατάντη σηματοδότησης του. Iressa καταστέλλεται δραστηριότητα AURKA και τη φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 (Σχήμα 5C), γεγονός που υποδηλώνει ότι AURKA μπορεί να χρησιμεύσει ως κατάντη στόχου του EGFR. Εκτός από τις EGFR-υπερεκφράζεται κύτταρα, δείξαμε επίσης την κατάσταση φωσφορυλίωσης του EGFR-Thr654 και -Ser1046 στην μετάλλαξη κύτταρα ενδογενή L858R (H1975) υπό θεραπεία της VE-465 και Iressa (Εικόνα 5D). Μείωση του pEGFR-Thr654 και -Ser1046 παρατηρήθηκε σε H1975 με VE-465 θεραπείας. Αν και Iressa ανέστειλε pEGFR-Thr654 και -Ser1046 στην H1975, ο συνδυασμός των Iressa και VE-465 μπορεί να μειωθεί περαιτέρω pEGFR-Thr654 και -Ser1046 σε H1975, υπονοώντας ότι αυτές οι δύο περιοχές pEGFR ρυθμίζονταν τόσο από EGFR και τη δραστηριότητα της κινάσης AURKA.

IHC ανάλυση των AURKA, pEGFR-Thr654 και pEGFR-Ser1046 στο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα σταδίου Ι

για να αξιολογηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ AURKA και φωσφορυλίωση του EGFR, τα δείγματα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα έχω 25 στάδιο υποβλήθηκαν σε IHC χρώση pEGFR-Thr654, pEGFR-Ser1046 και AURKA (Σχήμα 6). Δεκαοκτώ από αυτά τα δείγματα είχε NSCLC

EGFR

μεταλλάξεις όπως προσδιορίζεται με ανάλυση αλληλουχίας του

EGFR

τυροσίνης πεδία κινάσης. Η έκφραση του pEGFR-Ser1046 και AURKA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε όγκους σε σχέση με το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (p = 0.001) από 25 ασθενείς με NSCLC (Πίνακας 2). Επιπλέον, η έκφραση του AURKA έδειξαν θετική συσχέτιση με μια σημαντική συντελεστή συσχέτισης με pEGFR-Thr654 (ρ & lt? 0,05) και pEGFR-Ser1046 (ρ & lt? 0.001) σε ασθενείς με

EGFR

μεταλλαγμένη, αλλά όχι με το

EGFR

Μ.Β., όπως αναλύεται από μη-παραμετρικό τεστ συσχέτισης του Spearman (πίνακας 3). Εν ολίγοις, αυτή η χρώση ανοσοχημική παρέχει ενδείξεις για πιθανή σχέση μεταξύ AURKA και μεταλλαγμένων EGFR μέσω -Thr654 και -Ser1046.

Κάθε στήλη δείχνει έναν ασθενή και κάθε σειρά δείχνει ένα αντίσωμα. Η ένταση IHC στους ασθενείς ορίζεται ως 0, 1 και 2 για χρώση AURKA, pEGFR-Thr654 και pEGFR-Ser1046.

Η

Η

Εν κατακλείδι, η αλληλεπίδραση μεταξύ AURKA και η EGFR-L858R μετάλλαξη μπορεί να εξηγήσει τη διαφορά σε μονοπάτια μεταξύ

EGFR

Μ.Β. και των μεταλλαγμένων κυττάρων, τα οποία παρατηρούνται συχνά σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, και έτσι μπορεί να παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για θεραπευτικές εφαρμογές.

Συζήτηση σηματοδότησης

Η απορύθμιση της EGFR-ενεργοποιημένες πορείες συνδέεται συχνά με μεταλλάξεις του υποδοχέα και προβλέπει την απάντηση σε τυροσίνης αναστολείς κινάσης σε ασθενείς με NSCLC [48], [49]. Το προφίλ της φωσφορυλίωσης του EGFR σε

EGFR

της μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, (1) αναλύονται συστηματικά ενδογενείς αλλαγές φωσφορυλίωση του EGFR να προσδιορίσει διακριτά εξάρτηση από το ΕΤΠ σε διάφορα

EGFR

γονότυπους στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα? (2) έδειξε μία νέα σχέση μεταξύ AURKA και EGFR, που μπορεί να προκαλούνται μέσω μιας AURKA-προκάλεσε συμβάν φωσφορυλίωσης στο EGFR-Thr654 και -Ser1046 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα? και (3), προσδιορίστηκε η έκφραση της AURKA, EGFR-Thr654 και EGFR-Ser1046 σε ιστούς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Τα στοιχεία αυτά υπογραμμίζουν την ανάγκη για περαιτέρω ανάλυση για τη σχέση μεταξύ EGFR και AURKA στο

EGFR

μεταλλαγμένου ασθενείς και παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με την θεραπευτική εφαρμογή των αναστολέων AURKA σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

EGFR- Thr654 είναι γνωστό ότι φωσφορυλιώνεται από PKC και εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης EGFR μετά EGF διέγερση [50], [51]. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση του EGFR στο υπόλειμμα αναφέρθηκε Thr654 να συνδέεται με ακτινοβολία επαγόμενη μετατόπιση πυρηνική EGFR, το οποίο προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μετάσταση αυξάνοντας την μεταγραφή της κυκλίνης D1, iNOS και Β-Myb [52] – [54]. Αφού το κύτταρο υποβάλλεται σε ιονίζουσα ακτινοβολία, το DNA-εξαρτώμενη κινάση (ϋΝΑ-ΡΚ) αλληλεπιδρά με την πυρηνική EGFR και επισκευές μη ομόλογου άκρου συναρμογής DNA-θραύσεων διπλής έλικος, η οποία προκαλεί ραδιοαντοχή στην ακτινοθεραπεία. Στην παρούσα μελέτη, EGFR-Thr654 ήταν ιδιοσυστατικά φωσφορυλιωμένη σε μεταλλαγμένα κύτταρα EGFR-L858R. Θα ήταν ενδιαφέρον να εξεταστεί κατά πόσον η φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654 επηρεάζει ραδιοαντοχή κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας στα μεταλλαγμένα κύτταρα EGFR-L858R. Επιπλέον, αποδείξαμε επίσης ότι ένας αναστολέας AURKA μείωσε τη φωσφορυλίωση του EGFR-Thr654, που θα μπορούσαν να παρέχουν ένα δυναμικό λεωφόρο για μια νέα κλινική στρατηγική με έναν αναστολέα AURKA.

Cellular στρεσογόνους παράγοντες, όπως ο ΤΝΡ-α και ακτινοβολία UV , έχουν αναφερθεί ότι επάγουν την φωσφορυλίωση του EGFR-Ser1046 μέσω p38 ΜΑΡΚ και στη συνέχεια να προκαλέσει την απευαισθητοποίηση κατά την διέγερση του EGFR EGF και ενδοκυττάρωση [55], [56]. Στην ενεργοποίηση του EGFR που επάγεται με συνδέτη, αρκετά κατάλοιπα τυροσίνης, π.χ. Tyr-1045 και Tyr-1068, είναι κυρίως φωσφορυλιωμένη. Grb2 στη συνέχεια συνδέεται με φωσφορυλιωμένη τυροσίνη για την ενεργοποίηση ΜΑΡΚ. Στη συνέχεια, οι MAPKs φωσφορυλιώνουν σερίνη /θρεονίνης, όπως Ser-1046, επί EGFR ως έλεγχος ανάδρασης. Η φωσφορυλίωση του EGFR-Ser1046 από ρ38 επίσης πρόσφατα καθορίστηκε να είναι ένα βασικό μήνυμα που αποτρέπει την προ-αποπτωτική διάσπαση της κασπάσης και PARP κατά TNFα διέγερση [57]. Κατά την διέγερση EGF, EGFR είναι μόνο ελαφρώς φωσφορυλιωμένο στο Ser1046 να παρέχει ένα αντι-απόπτωση [57]. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι η φωσφορυλίωση του EGFR-Ser1046 είναι EGF-ανεξάρτητο σε μεταλλαγμένα κύτταρα EGFR-L858R, ενώ φωσφορυλίωση του EGFR-Ser1046 είναι EGF-εξαρτώμενη σε κύτταρα EGFR-WT. Έτσι, αν η φωσφορυλίωση του EGFR-Ser1046 σε EGFR-L858R μεταλλαγμένων κυττάρων οδηγεί σε ένα αντι-αποπτωτικό εντάλματα αποτέλεσμα την περαιτέρω έρευνα.

Η1299-EGFR-L858R κύτταρα έχουν ένα χαμηλότερο επίπεδο EGFR από ότι στο Η1299-EGFR-WT κύτταρα? Ωστόσο, EGF-ανεξάρτητο βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης σε L858R κύτταρα σε πολλαπλά υπολείμματα Ser, Thr, Tyr και είναι ισχυρότερες από εκείνες σε κύτταρα EGFR-WT (Σχήμα 3). Αυτό δείχνει ότι ενώ το μεταλλαγμένο υποδοχέα L858R έδειξε ένα χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης, ήταν υπερ-φωσφορυλιωμένη από τον υποδοχέα άγριου τύπου. Επιπλέον, EGFR L858R μεταλλαγμένο είναι γνωστό ότι είναι περισσότερο δραστικό από το EGFR-WT σε προηγούμενη μελέτη [16]. Συνολικά, η φωσφορυλίωση του EGFR σε κύτταρα L858R ήταν λιγότερο ανταποκρίνεται στην ΕΤΠ. Αυτό μπορεί να οφείλεται στα υψηλότερα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης του μεταλλαγμένου υποδοχέα ή λόγω του χαμηλότερου επιπέδου της έκφραση. Επειδή σηματοδότηση EGFR μπορεί να αυξήσει την πρωτεΐνη έκφραση AURKA [34], [35], AURKA μπορεί επίσης να ρυθμίζει φωσφορυλίωση του EGFR. Εδώ, δείξαμε ότι η αλληλεπίδραση EGFR-AURKA είναι συνέβη μόνο μετά EGF διέγερση (Σχήμα 4C), υπονοώντας ότι AURKA θα μπορούσαν να συμμετάσχουν σε EGFR καταρράκτη σηματοδότησης. Σε νοκοδαζόλη-συνελήφθη Μ-φάσης, EGFR-μεταλλαγμένα κύτταρα έδειξαν πιο εμφανή φωσφορυλίωση σε EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 και AURKA-Thr288 από κύτταρα που εκφράζουν EGFR-WT (Σχήμα 4Ε). ενεργοποίηση EGFR συμβαίνει μέσω της οδού ΑΚΤ και EGFR μπορεί να ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση AURKA ενεργοποιώντας το μεταφραστικό μηχανισμό μέσω της οδού ΑΚΤ [35]. Η AURKA αναστολέας VE-465 κατέστειλε την οδό ΑΚΤ και ανέστειλαν EGFR σερίνης /θρεονίνης, ειδικά σε κύτταρα που φέρουν

EGFR

μεταλλάξεις, αλλά δεν επηρέασε EGFR φωσφορυλίωση τυροσίνης (Σχήμα 5Β). Όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον αναστολέα EGFR Iressa να εμποδίσει αυτοφωσφορυλίωση EGFR, ο φωσφορυλίωση AURKA εξαφανίστηκε (Σχήμα 5C), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μεταλλάξεις μπορεί να EGFR ιδιοσυστατικά ενεργοποιούν φωσφορυλίωση και την ενίσχυση της κατάντη σηματοδότησης για την προώθηση της καρκινογένεσης. Ωστόσο, η σχέση του AURKA, EGFR-WT, και μεταλλαγμένων EGFR πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω για τον εντοπισμό θεραπευτικοί στόχοι για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Εν περιλήψει, με προφίλ φωσφορυλίωσης του EGFR σε άγριου τύπου και μεταλλαγμένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, ταυτοποιήσαμε μια σχέση μεταξύ

EGFR

μεταλλάξεων και της φωσφορυλίωσης του EGFR-Thr654 και -Ser1046, η οποία σχετίζεται με την έκφραση AURKA σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και μπορεί να προκληθεί από AURKA. Η αλληλεπίδραση μεταξύ του EGFR και AURKA στο

EGFR

κύτταρα μετάλλαξη υποδηλώνει ότι οι αναστολείς AURKA μπορεί να έχει θεραπευτική επίδραση. Ελπίζουμε ότι η μελέτη αυτή θα διευκολύνει την ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής θεραπευτικής στρατηγικής για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, συγχρονισμό του κυτταρικού κύκλου, και EGF διέγερση

Η καθιέρωση Η1299 κλώνων που εκφράζουν σταθερά ένα άδειο φορέα (Η1299-Vec), EGFR-WT (Η1299-EGFR-WT) ή EGFR-L858R μετάλλαγμα (Η1299-EGFR-L858R) περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Α549 (με EGFR-WT), H1975 (με ενδογενή μεταλλαγμένο EGFR-L858R-Τ790Μ) και Η1299 σταθεροί κλώνοι καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640, και τα κύτταρα Α431 διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό θανατηφόρα βοοειδών (FBS), 100 U πενικιλλίνη, 0.1 mg /ml στρεπτομυκίνη, και 2 mM L-γλουταμίνη. Όλα τα αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας ήταν από την Invitrogen. Για το συγχρονισμό του κυτταρικού κύκλου των Α549 και ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικές σειρές H1975, εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα επωάστηκαν με 100 ng /ml nocodazole (Sigma) για 16 ώρες. Για να διεγείρουν τα κύτταρα με EGF, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 16 ώρες, ακολουθούμενη από μια κατεργασία 10-λεπτών με EGF (10 ng /ml) σε μέσο χωρίς ορό.

ανάλυση ανοσοαποτύπωσης

Τα προϊόντα λύσης κυττάρου (50 μg) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε polyvinylidenedifluoride (PVDF) (Millipore) με τη χρήση του συστήματος μεταφοράς Bio-Rad. Η μεμβράνη PVDF μπλοκαρίστηκε με 5% μη λιπαρό αποβουτυρωμένο γάλα (BD Bioscience) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, ακολουθούμενη από επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Όλα τα αντισώματα EGFR φωσφο-πολυκλωνικά (pEGFR-Thr654, pEGFR-Thr669, pEGFR-Ser671, pEGFR-Ser774, pEGFR-Tyr845, pEGFR-Tyr974, pEGFR-Tyr992, pEGFR-Tyr1045, pEGFR-Ser1046, pEGFR-Tyr1086, pEGFR-Tyr1101