Αφηρημένο

Ιστορικό

Beclin 1 και Beclin 2 είναι αυτοφαγία σχετίζονται πρωτεΐνες που παρουσιάζουν παρόμοιες αλληλουχίες αμινοξέων και δομές τομέα. Beclin 1 ίδρυσε την πρώτη σύνδεση μεταξύ αυτοφαγία και του καρκίνου. Ωστόσο, ο ρόλος του Beclin 2 στον καρκίνο είναι ασαφής. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να αναλύσει Beclin 1 και Beclin 2 εκφράσεις στην προφορική καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές, και να αξιολογήσουν πιθανούς ρόλους τους στην εξέλιξη του καρκίνου.

Μέθοδοι

Ερευνήσαμε Beclin 1 και Beclin 2 εκφράσεις με ανοσοϊστοχημεία σε 195 περιπτώσεις καρκίνου του στόματος. Οι προγνωστικοί ρόλοι των Beclin 1 και Beclin 2 αναλύθηκαν στατιστικά.

In vitro

, η υπερέκφραση και knockdown πρωτεϊνών Beclin διεξήχθησαν σε μία από του στόματος κυτταρική σειρά καρκίνου, SAS. Οι δοκιμασίες ροής ανοσοφθορισμού και αυτοφαγία επιβεβαίωσε ότι Beclin πρωτεΐνες ενεπλάκησαν σε αυτοφαγία. Οι επιπτώσεις της Beclin 1 και Beclin 2 στην αυτοφαγία και της ανάπτυξης των όγκων αξιολογήθηκαν από την μετατροπή της LC3-Ι LC3-II και από κλωνογενείς δοκιμασίες, αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

Στοματική καρκινικούς ιστούς παρουσίασαν παρεκκλίνουσα εκφράσεις του Beclin 1 και Beclin 2. Οι κυτταροπλασματικές Beclin 1 και Beclin 2 εκφράσεις ήταν άσχετες με το στόμα καρκινικούς ιστούς. Σε αναλύσεις επιβίωσης, υψηλή κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 1 σχετίστηκε με χαμηλή ειδική της νόσου επιβίωση, και αρνητική έκφραση της πυρηνικής Beclin 1 συσχετίστηκε με υψηλό επαναλαμβανόμενο επιβίωση χωρίς. Οι ασθενείς είτε με υψηλή ή χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 2 είχαν σημαντικά μικρότερο συνολικό ποσοστό επιβίωσης επιβίωσης και της νόσου από εκείνους με μέτρια έκφραση. Στην προφορική καρκινικά κύτταρα, η υπερέκφραση του είτε Beclin 1 ή 2 Beclin οδήγησε στην ενεργοποίηση αυτοφαγία και αυξημένη κλωνογονική επιβίωση? νοκ ντάουν της Beclin 2 απομειωθεί αυτοφαγία και αυξημένη κλωνογονικού επιβίωση.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι διαφορετικά πρότυπα των Beclin 1 και Beclin 2 σχετίστηκαν με την επιθετική κλινική έκβαση. Beclin 1 υπερέκφραση, καθώς και Beclin 2 υπερέκφραση και εξάντληση, συνέβαλαν στην ανάπτυξη του όγκου. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν οι Beclin πρωτεϊνών που σχετίζονται με ογκογένεση

Παράθεση:. Liu J-L, Chen F-F, Chang S-F, Chen C-Ν, Πνευμόνων J, Lo C-H, et al. (2015) Έκφραση του Beclin πρωτεΐνες της οικογένειας συνδέεται με την εξέλιξη του όγκου σε καρκίνο του στόματος. PLoS ONE 10 (10): e0141308. doi: 10.1371 /journal.pone.0141308

Επιμέλεια: Spencer B. Gibson, Πανεπιστήμιο της Μανιτόμπα, Καναδάς

Ελήφθη: 24 Ιούνη του 2014? Δεκτές: 7 Οκτ 2015? Δημοσιεύθηκε: 27η Οκτωβρίου του 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Ταϊβάν (MOST 103-2320-Β-182Α-018, NMRPG6D0071) (ΠΙΟ 104-2320-Β -182A-012-, NMRPG6E0041), Chang Gung Memorial Hospital Τσιγιάι Branch (CMRPG6E0071), και Chang Gung Ιατρικό Κέντρο Ερευνών (CMRPD6C0013). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στόματος είναι μία από τις πιο κοινούς καρκίνους και ένα αυξανόμενο πρόβλημα σε όλο τον κόσμο. Τα υψηλά ποσοστά εμφάνισης συμβαίνουν στη Νότια και Νοτιοανατολική Ασία, περιοχές της Ευρώπης, περιοχές της Λατινικής Αμερικής και του Ειρηνικού [1]. Πρόσφατα, η συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του στόματος έχει αυξηθεί, ιδιαίτερα σε οικονομικά αναπτυγμένες χώρες [2]. Η συντριπτική πλειοψηφία του καρκίνου του στόματος είναι πλακώδες καρκίνωμα, το οποίο προκύπτει από την πλακώδους επιθηλίου του στόματος επιφάνειας. Παρά την παρόμοια ιστολογική φαινότυπο, η μοριακή βάση του καρκίνου του στόματος είναι ιδιαίτερα περίπλοκη, το οποίο παρουσιάζει πολλαπλές γενετικές και επιγενετικές μεταλλάξεων [3, 4]. Ο εντοπισμός νέων βιοδεικτών για καρκίνο του στόματος θα μπορούσε να εφαρμοστεί στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παρεμβάσεων.

Η αυτοφαγία είναι μια εξελικτικά συντηρημένη καταβολική διαδικασία που περιλαμβάνει την υποβάθμιση των περιττών ενδοκυτταρική μεταβολιτών και ζημιές οργανιδίων από λυσοσωμικά ένζυμα. Η διαδικασία περιλαμβάνει το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα, η οποία καταβροχθίζουν τα ανεπιθύμητα κυτταροπλασματικό περιεχόμενο και στη συνέχεια να τα παραδώσει σε λυσοσώματα. Η πρωταρχική λειτουργία του αυτοφαγία είναι η διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης, ιδιαίτερα σε συνθήκες θρεπτικά συστατικά στερούνται. Μεταξύ των γονιδίων που σχετίζονται με την αυτοφαγία,

Beclin 1

ίδρυσε την πρώτη σύνδεση μεταξύ αυτοφαγία και τον καρκίνο [5], και θεωρείται ως ένα haploinsufficient ογκοκατασταλτικό γονίδιο [6, 7]. Beclin 1 συμμετέχει στην autophagosome φύτρων στο πρώιμο στάδιο της αυτοφαγία. Επιπλέον, Beclin 1 αλληλεπιδρά με πολλά θετικά και αρνητικά ρυθμιστές που επηρεάζουν τη δραστηριότητα αυτοφαγικά και ογκογένεση [8-12]. Λειτουργεί ως ένα κρίσιμο διαμεσολαβητή στη ρύθμιση αυτοφαγία.

Beclin 2

, από τη στιγμή που ονομάζεται

BECN1P1

, είχε αρχικά θεωρηθεί ως ένα ψευδογονίδιο. Το 2013, He et al εκτίθεται ότι το γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που δείχνει υψηλή ομοιότητες με Beclin 1 σε αλληλουχία αμινοξέων και τις δομές τομέα, και ονόμασαν τη νέα πρωτεΐνη Beclin 2 [13]. Αυτή η νέα πρωτεΐνη που προσδιορίζονται βρέθηκε να λειτουργούσε σε αυτοφαγία, endolysosomal αποικοδόμηση, και το μεταβολισμό. Είναι αλληλεπιδρά επίσης με διάφορους εταίρους δέσμευσης του Beclin 1, συμπεριλαμβανομένων ATG14, AMBRA1, VPS34, και Bcl-2. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν το ρόλο της στη ρύθμιση αυτοφαγία [13].

Η σύνδεση των Beclin 2 και ο καρκίνος δεν έχει αντιμετωπιστεί, και η σχέση μεταξύ Beclin 2 και Beclin 1 έκφρασης και τα αποτελέσματα των ασθενών με καρκίνο δεν έχουν μελετηθεί ποτέ . Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τις εκφράσεις του Beclin 1 και Beclin 2 σε προφορική καρκινικούς ιστούς, και εξέτασε τις συσχετίσεις μεταξύ των εκφράσεων του Beclin 1 και Beclin 2, κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά, και τα ποσοστά επιβίωσης. Είμαστε επιθεωρούνται επίσης τις επιπτώσεις της μεταβολής των πρωτεϊνών Beclin στην αυτοφαγία και τον καρκίνο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Αυτή η αναδρομική μελέτη εγκρίθηκε από τις θεσμικές Review Board του Αγίου Martin De Porres Νοσοκομείο (Τσιγιάι City, Ταϊβάν) και Chang Gung Memorial Hospital Τσιγιάι Branch (Τσιάγι County, Ταϊβάν). την πληροφόρηση των ασθενών ήταν ανώνυμες και de-εντοπίστηκαν πριν από την ανάλυση. Φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα ιστών από ασθενείς με καρκίνο του στόματος λήψη χειρουργική εκτομή ελήφθησαν από τα αρχεία του Αγίου Martin De Porres Νοσοκομείο μεταξύ του Ιανουαρίου 2003 και του Δεκεμβρίου του 2008. Όλα τα περιστατικά ήταν διαγνώσθηκε για πρώτη φορά, επιβεβαιώθηκε ιστολογικά ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα. Οι ασθενείς που έλαβαν προεγχειρητική εισαγωγική θεραπεία ή είχαν μέγεθος όγκου μικρότερο από 5 mm εξαιρέθηκαν από αυτή τη μελέτη. Οι κλινικές πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας των ασθενών, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, την κατάσταση των λεμφαδένων, μετάσταση, και τα δεδομένα παρακολούθησης, ελήφθη από ιατρικά αρχεία. Το στάδιο του όγκου-node-μετάσταση (TNM) ορίστηκε σύμφωνα με την έβδομη έκδοση της μεικτής επιτροπής Αμερικής σχετικά με το σύστημα του καρκίνου στάσης [14]. Συνολική επιβίωση (OS) ορίστηκε ως ο χρόνος μεταξύ χειρουργική επέμβαση και θάνατο όλων των αιτιών. Νόσος ειδική επιβίωση (DSS) ορίστηκε ως ο χρόνος μεταξύ χειρουργική επέμβαση και το θάνατο που προκαλείται από τον καρκίνο του στόματος. Υποτροπής επιβίωση χωρίς (RFS) ορίστηκε ως ο χρόνος μεταξύ χειρουργική επέμβαση και η πρώτη τοπική ή συστηματική υποτροπή.

Ένα σύνολο από 198 περιπτώσεις καρκίνου του στόματος είχαν περιληφθεί αρχικά. Τρεις υποθέσεις που παρουσιάζουν περιορισμένη ή καθόλου ιστού στις ενότητες σχετικά με μικροσυστοιχίες ιστό αποκλείστηκαν. Η μελέτη, τέλος, αποτελούνταν από 195 περιπτώσεις για ανοσοϊστοχημική λεκέδες και στατιστική ανάλυση.

Η παθολογική εξέταση

Η αιματοξυλίνη και διαφάνειες ηωσίνη-βάφονται κάθε περίπτωση είχαν επανεκτιμηθεί από έναν παθολόγο για να επιβεβαιώσετε την ιστολογικός τύπος , το βαθμό, την κατάσταση της νέκρωσης και lymphovascular εισβολή. Η ιστολογική βαθμού ταξινομήθηκε ως βαθμού 1 (καλά διαφοροποιημένο), βαθμού 2 (μέτρια διαφοροποιημένα), και βαθμού 3 (ελάχιστα διαφοροποιημένο). Περιπτώσεις με νεκρωτικές περιοχές που αποτελούν περισσότερο από το 10% των εκτάσεων του όγκου θεωρήθηκαν ως «εκτεταμένη νέκρωση» και οι άλλες περιπτώσεις καταγράφηκαν ως «περιορισμένη ή καθόλου νέκρωση.» Lymphovascular εισβολή ορίστηκε ως η παρουσία των καρκινικών κυττάρων μέσα στα κανάλια lymphovascular.

κατασκευή ιστών μικροσυστοιχιών

κατασκευή ιστών μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, ένας παθολόγος ανέλυσε την αιματοξυλίνη και διαφάνειες ηωσίνη-βάφονται, και στη συνέχεια επισημαίνονται οι αντιπροσωπευτικές περιοχές πρέπει να λαμβάνονται δείγματα για τις διαφάνειες και τα αντίστοιχα τμήματα του ιστού. Η βασική επιλογή δείγματος από το μπλοκ των ιστών περιλαμβάνονται δύο πυρήνες 1.5-mm-διαμέτρου για κάθε περίπτωση καρκινικούς ιστούς, και ένα πυρήνα 1,5-mm-διαμέτρου για κάθε περίπτωση από τις κανονικές προφορική βλεννογόνων. Τα επιλεγμένα πυρήνες αποκόπηκαν και μεταφέρθηκαν στις παραφίνη μπλοκ δέκτη. Διαδοχική 4-μm πάχους τομές παρήχθησαν, και αιματοξυλίνη και εοσίνη χρώση πραγματοποιήθηκε σε κάθε μπλοκ παραλήπτη για να επιβεβαιώσει την παρουσία των επιλεγμένων ζωνών.

Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημική λεκέδες διεξήχθησαν στις 4 -μm-πυκνά τμήματα από τις μικροσυστοιχίες ιστού από τη Leica Bond-Max Autostainer (Leica Microsystems, Bondbiotech, Taichung, Ταϊβάν) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με μικρές τροποποιήσεις. Τα τμήματα αποπαραφινοποιήθηκαν από Bond Dewax Λύση (Leica Microsystems) και επανυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης αλκοόλης. Heat-επαγόμενη ανάκτηση αντιγόνου επιτεύχθηκε με Bond Επιτόπου Ανάκτηση Λύση 1 (Leica Microsystems) για 20 λεπτά στους 100 ° C. Οι πλάκες επωάστηκαν σε υπεροξείδιο υδρογόνου για 5 λεπτά ώστε να μειωθεί η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι Beclin 1 (1: 400, κουνελιού πολυκλωνικό, Abcam, Cambridge, UK) και Beclin 2 (1: 400, κουνελιού πολυκλωνικό, Novus Biologicals, Littleton, CO, ΗΠΑ). Μια μετα-πρωτεύον συνδετικό αντιδραστήριο IgG εφαρμόστηκε για 8 λεπτά, και τα πλακίδια επωάστηκαν με ένα πολυμερικό αντιδραστήριο IgG υπεροξειδάση χράνου για 8 λεπτά για να εντοπιστεί το πρωτογενές αντίσωμα. Διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική (DAB) χρησιμοποιήθηκε ως το υπόστρωμα για την ανίχνευση σύνδεσης αντιγόνου-αντισώματος. Τέλος, αιματοξυλίνη εφαρμόστηκε για 5 λεπτά της αιματοξυλίνης πυρήνες.

Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημείας

Η ένταση, ποσοστό, και υποκυτταρικός εντοπισμός της ανοσοϊστοχημική χρώση κάθε περίπτωση καταγράφηκαν. Κανονική αμυγδαλής ιστός χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Χρώση παραλείποντας το πρωτογενές αντίσωμα εκτελέστηκε ως αρνητικός έλεγχος. Κυτταροπλασματική και πυρηνική εκφράσεις αξιολογήθηκαν ξεχωριστά. Η ένταση και το ποσοστό των θετικά χρωσμένων κυττάρων σε κάθε πυρήνα σαρώθηκαν σε ένα χαμηλό πεδίο ισχύος (100 Χ) και στη συνέχεια αξιολογούνται πεδία υψηλής ισχύος (400 Χ). Η ένταση της χρώσης καταγράφηκε ως 0, 1, 2, και 3 αναφέρονται σε αρνητικό, ασθενές, μέτρια και ισχυρή χρώση, αντίστοιχα. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων καταγράφηκε από 0% έως 100%. Τα αποτελέσματα της χρώσης βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας γρήγορη (Q) σκορ, το οποίο ελήφθη από τον πολλαπλασιασμό του ποσοστού των θετικών κυττάρων (Ρ) από την ένταση (Ι) (Q = P × Ι? Μέγιστο = 300) [16]. Δύο παθολόγους αξιολογείται ανεξάρτητα τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημική χρώση χωρίς τη γνώση των κλινικοπαθολογική δεδομένων. Αντικρουόμενα αποτελέσματα επιλύθηκαν από multihead μικροσκόπιο.

αποκοπής επιλογή σημείο για ανοσοϊστοχημεία

Για την κυτταροπλασματική έκφραση της Beclin 1 και Beclin 2, οι βέλτιστες σημεία αποκοπής των βαθμολογιών Q προσδιορίστηκαν από την X-Πλακάκια λογισμικό 3.6.1, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Το πρόγραμμα υπολόγισε τα chi-square τιμές σε όλες τις πιθανές κατηγορίες με βάση την δοκιμασία log-rank για τις εκτιμήσεις Kaplan-Meier. Για κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 1, ένα βέλτιστο σημείο με την υψηλότερη αξία ήταν αποφασισμένος. Το σημείο αποκοπής της Q σκορ με ψηλότερο chi-square τιμές ήταν 55, 110, και 25 για το OS, DSS, και RFS, αντίστοιχα. Έχουμε επιλέξει 63 ως βαθμολογίας αποκοπής Q για Beclin 1 κυτταροπλασματική έκφραση. Για κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 2, οι chi-square τιμές καθορίζονται από 2 βέλτιστη σημεία αποκοπής ήταν μεγαλύτερες από αυτές που ορίζονται από 1 βέλτιστο σημείο. Έτσι έχουμε επιλέξει 2 σημεία αποκοπής για να χαρακτηρίσει την έκφρασή του σε 3 ομάδες: χαμηλή, μέτρια και υψηλή. Τα σημεία αποκοπής της βαθμολογίας Q με τα υψηλότερα chi-square τιμές ήταν (35, 125), (35, 145), και (25, 85) για το OS, DSS, και RFS, αντίστοιχα. Έχουμε επιλέξει (32, 118) όπως βαθμολογίες αποκοπής Q για Beclin 2 κυτταροπλασματική έκφραση.

Μόνο μια μειοψηφία των περιπτώσεων έδειξαν πυρηνική έκφραση της Beclin 1 ή Beclin 2. Έτσι, περιπτώσεις με πάνω από 10% στους τομείς της πυρηνικής χρώσης ταξινομήθηκαν ως θετικά? οι άλλοι είχαν ταξινομηθεί ως αρνητικό.

Οι κυτταροκαλλιέργειες και τα αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο προφορική πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα γραμμή SAS, που ιδρύθηκε από μια κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της γλώσσας, καλλιεργήθηκε σε 10% FBS συμπληρωμένο DMEM. Πλασμίδια που εκφράζουν σημαία-tagged Beclin 1 και Beclin 2 ελήφθησαν από Addgene και ένα δώρο από το εργαστήριο Levine του, αντίστοιχα. Για να δημιουργηθεί ένας φορέας λεντοϊού που εκφράζει Beclin 2, το PCR θραύσμα του flag-tagged

Beclin 2

κλωνοποιήθηκε σε φορέα λεντοϊού pLX301 (Addgene). Λεντιϊοί δημιουργήθηκαν με συνδιαμόλυνση κυττάρων ΗΕΚ293 με πλασμίδια pLX301-Beclin 2, pCMVDR8.2 και pMD.G με λιποφεκταμίνης 2000. λεντιϊοί που ελευθερώνονται στο μέσον καλλιέργειας συλλέχθηκαν σε 48 ώρες και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. κύτταρα SAS που υπερεκφράζουν σταθερά Beclin 2 ιδρύθηκαν από μόλυνση ιού lenti εκφράζουν Beclin

2

και πουρομυκίνης επιλογή. Βαφιλομυκίνης, ένας αναστολέας αυτοφαγία πρόληψη συγχώνευση μεταξύ αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα, ήταν αγορά από την εταιρεία Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).

siRNA νοκ ντάουν

Το δίκλωνο μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) κατά

Atg5

και

Beclin 2

ήταν η αγορά από Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) και Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), αντίστοιχα. κύτταρα SAS σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, και επιμολύνθηκαν με 100 pmole siRNA με RNAiMax (Invitrogen) στην επόμενη ημέρα.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν σε PBS που περιείχε 1% Triton Χ -100 και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich). Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 g στους 4 ° C για 15 λεπτά. Οι πρωτεΐνες στο προϊόν λύσης διαχωρίσθηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου και ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. Anti-Flag και αντι-ΑΤG

5

αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Anti-LC3 λήφθηκε από Nanotool (Teningen, Γερμανία). Anti-Beclin 1 και αντι-Beclin 2 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology και Novus Biologicals, αντίστοιχα. Αντι-Ρ62 αγοράστηκε από Abcam.

ανοσοφθορισμού χρώση

Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού με πρωτογενές αντίσωμα έναντι αντι-Flag (Μ2) και επώαση με fluorescence- επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (Invitrogen). Τέλος, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν και οι εικόνες συλλήφθηκαν υπό Leica μικροσκόπιο φθορισμού SP5.

κλωνογονική δοκιμασία

κύτταρα SAS επιμολυσμένα με πλασμίδια ή siRNA απλώθηκαν σε περίπου 200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν με 1% crystal violet σε μεθανόλη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο έξω τη χρωστική, μετρήθηκαν οι αποικίες.

Στατιστική ανάλυση

Οι δοκιμές chi-square χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η συσχέτιση της έκφρασης των πρωτεϊνών Beclin και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά. Οι συσχετίσεις των Q αποτελέσματα αξιολογήθηκαν από δοκιμές συσχετισμού Spearman rank, και οι συντελεστές rho του Spearman είχαν απεικονιστεί ως θερμότητα χάρτη. Καμπύλες για το OS, DSS, και RFS σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier, και οι διαφορές στα ποσοστά επιβίωσης σε σύγκριση με δοκιμές log-rank. Οι μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική Cox μοντέλα ποσοστό παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση των λόγων κινδύνου και τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% για τα αποτελέσματα των ασθενών. Όλα τα

P

τιμές ήταν 2 όψεων. Ένα

P

τιμή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Οι αριθμοί αποικιών σε κλωνογενείς δοκιμασίες εκπροσωπήθηκαν ως αναλογίες του ελέγχου +/- τυπικά σφάλματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS έκδοση 19.0 του λογισμικού (SPSS Inc., Armonk, NY, USA) και το Excel 2013 (Microsoft Excel, Microsoft, Redmond, WA, USA) για τα Windows.

Αποτελέσματα

Η παρεκκλίνουσα Beclin 1 και Beclin 2 εκφράσεις σε καρκίνο του στόματος ιστούς

για την αξιολόγηση Beclin 1 και Beclin 2 εκφράσεις και υποκυτταρικό εντοπισμό τους, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημεία σε 195 περιπτώσεις καρκίνο του στόματος ιστών και κανονικά από το στόμα των βλεννογόνων. Beclin 1 και 2 Beclin εκφράσεις κυρίως βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, και περιστασιακά στους πυρήνες. Η κανονική στοματική βλεννογόνο έδειξε αδύναμη έως μέτρια κυτταροπλασματική έκφραση και το εστιακό πυρηνική έκφραση της Beclin 1 και Beclin 2 (Σχήμα 1Α και 1Ε). Οι καρκίνο του στόματος ιστοί εκτίθενται μεταβλητή κυτταροπλασματική έκφραση της Beclin 1 και Beclin 2, που κυμαίνονται από ολική απώλεια για την εκτόνωση ισχυρή έκφραση (Σχήμα 1Β-1D και 1F-1). Οι μέσες Q βαθμολογίες των κυτταροπλασματικών Beclin 1 και Beclin 2 ήταν 67,46 ± 55,19 και 75,26 ± 62,16, αντίστοιχα. Τα σημεία αποκοπής για Beclin 1 και 2 Beclin περιγράφηκαν στα υλικά και μεθόδους. Για κυτταροπλασματική Beclin 1, 111 περιπτώσεις (56.92%) χαρακτηρίστηκαν ως χαμηλής έκφρασης, και 84 περιπτώσεις (43,08%) ταξινομήθηκαν ως υψηλή έκφραση. Για κυτταροπλασματική Beclin 2, 65 ασθενείς (33,33%) ταξινομήθηκαν ως χαμηλή έκφραση? 83 ασθενείς (42,56%) ταξινομήθηκαν ως μέτρια έκφραση? 47 ασθενείς (24,10%) ταξινομήθηκαν ως υψηλή έκφραση. Μόνο ένα μικρό υποσύνολο του στόματος καρκινικών ιστών εκφράζει πυρηνική χρώση των Beclin 1 (33/195, 16,92%) και Beclin 2 (29/195, 14,87%) (Σχ 1C, 1D και 1θ).

(Α ) Ασθενής έως μέτρια κυτταροπλασματική και πυρηνική έκφραση της Beclin 1 στην κανονική στοματική πλακώδους επιθηλίου. (Β) Χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση του Beclin 1 σε μια στοματική καρκινικού ιστού. (C) Υψηλή κυτταροπλασματική και θετική πυρηνική έκφραση του Beclin 1 σε μια στοματική καρκινικού ιστού. (D) Χαμηλή κυτταροπλασματική και θετική πυρηνική έκφραση του Beclin 1 σε μια στοματική καρκινικού ιστού. (Ε) Ασθενής έως μέτρια κυτταροπλασματική έκφραση του Beclin 2 στην κανονική στοματική πλακώδους επιθηλίου. (F) Χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση του Beclin 2 σε μια στοματική καρκινικού ιστού. (G) Μέτρια κυτταροπλασματική έκφραση του Beclin 2 σε καρκίνο του στόματος ιστού. (H) Υψηλή κυτταροπλασματική έκφραση του Beclin 2 σε καρκίνο του στόματος ιστού. (Ι) Μέτρια κυτταροπλασματική και θετική πυρηνική έκφραση της Beclin 2 σε καρκίνο του στόματος ιστού.

Η

Σύλλογοι της Beclin 1 και Beclin 2 εκφράσεις με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά και ο δείκτης autophagosomal στην προφορική καρκινικούς ιστούς

σύγκριση Beclin 1 και Beclin 2 εκφράσεις με την ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, την κατάσταση των λεμφαδένων, μετάσταση, το στάδιο, το βαθμό, lymphovascular εισβολή, και νέκρωση (Πίνακας 1). Beclin 1 έκφρασης ήταν άσχετη με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά. Χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση του Beclin 2 συσχετίστηκε με υψηλότερα ιστολογική Βαθμός (κακό προγνωστικό παράγοντα) σε σύγκριση με μέτρια και υψηλή εκφράσεις. Θετική η πυρηνική έκφραση της Beclin 2 συνδέθηκε με κακή προγνωστικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των λεμφαδένων μεταστάσεων και lymphovascular εισβολή.

Η

Τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκφράσεις Beclin 1 έδειξε ασθενή συσχέτιση (rho του Spearman = 0,287,

P

& lt? 0.001). Τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκφράσεις Beclin 2 ήταν επίσης ασθενώς συσχετίζονται (rho του Spearman = 0,212,

P

= 0,003). Η κυτταροπλασματική έκφραση της Beclin 1 και Beclin 2 ήταν άσχετο (rho του Spearman = -0,072,

P

= 0,318). Οι σχέσεις των πρωτεϊνών Beclin και την autophagosomal δείκτη, LC3B, αξιολογήθηκαν επίσης. Οι αυτοφαγοσώματα αντιπροσωπεύεται από LC3B punctae αξιολογήθηκαν σε προηγούμενη μελέτη μας [18]. Μόνο κυτταροπλασματική Beclin 1 συσχετίζεται με το επίπεδο των LC3B punctae (rho του Spearman = 0.305,

P

& lt? 0.001). (Σχήμα 2)

χρωματική κλίμακα για συντελεστή rho Spearman έχει δοθεί στην κάτω δεξιά, με το πράσινο αντιπροσωπεύει μια αρνητική συσχέτιση και κόκκινο θετικό. *

P

& lt? 0.05.

Η

είναι διακριτά πρότυπα έκφρασης των πρωτεϊνών Beclin σχετίζεται με κακή πρόγνωση

Οι καμπύλες Kaplan-Meier των σωρευτικών OS, DSS, και RFS πιθανότητες για Beclin 1 και Beclin 2 παρουσιάζονται στο σχήμα 3. ασθενείς με υψηλή κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 1 έδειξε χαμηλή DSS (

P

= 0,008), καθώς και τα άτομα με αρνητική έκφραση της πυρηνικής Beclin 1 έδειξε υψηλό RFS (

P

= 0,036). Οι ασθενείς είτε με υψηλή ή χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 2 είχαν σημαντικά χαμηλότερο λειτουργικό σύστημα και τα ποσοστά DSS σε σύγκριση με τους ασθενείς με μέτρια κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 2. Οι πιθανότητες επιβίωση μεταξύ των ασθενών με χαμηλή και υψηλή κυτταροπλασματική εκφράσεις δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Η έκφραση της πυρηνικής Beclin 2 ήταν μη σχετιζόμενο με την κατάσταση επιβίωσης.

Η

Τα αποτελέσματα της μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική επιβίωση αναλύει τη χρησιμοποίηση των μεθόδων παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου Cox παρουσιάζονται στους Πίνακες 2, 3 και 4. Υψηλή κυτταροπλασματική Beclin 1 και αρνητικό πυρηνικών Beclin 1 σχετίστηκαν με την κακή DSS και RFS κάτω μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση, αντίστοιχα. Επιπλέον, κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 2 ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για το OS και DSS. Χαμηλή και υψηλή κυτταροπλασματική εκφράσεις Beclin 2 συσχετίστηκαν με την επιθετική κλινική έκβαση.

Η

Η

Είτε Beclin 1 ή 2 Beclin υπερέκφραση προκαλεί αυτοφαγία και προάγει τον καρκίνο του στόματος κυτταρική ανάπτυξη

Για τη διερεύνηση των επιδράσεων της Beclin 1 και 2 Beclin υπερέκφραση στον καρκίνο του στόματος, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα SAS επιμολυσμένα με πλασμίδιο που εκφράζει flag-tagged Beclin 1 και Beclin 2, αντίστοιχα. Η υπερέκφραση του Beclin 1 ή 2 Beclin οδήγησε σε αύξηση της μετατροπής της LC3-Ι LC3-ΙΙ υπό κανονικές συνθήκες. Ωστόσο, το φαινόμενο αυτό inevident υπό συνθήκες πείνας (Σχήμα 4Α). Η αναλογία της LC3-II /LC3-Ι και επιπέδου ρ62 ήταν τόσο αυξημένη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Beclin 1 ή 2 Beclin σε σύγκριση με τον έλεγχο μετά τη θεραπεία βαφιλομυκίνη στην πείνα (S1 Σχήμα). Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώνουν το ρόλο της Beclin 2 στην οδό αυτοφαγία.

(Α) κύτταρα SAS ήταν επιμολυσμένα με το πλασμίδιο ελέγχου, πλασμίδια που εκφράζουν τη σημαία-tagged Beclin 1 (Β1) ή Beclin 2 (Β2). Στις 24 ώρες μετά την διαμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ισορροπημένο διάλυμα αλάτων Earle (EBSS) για 1 ώρα λιμοκτονία. Το λύμα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Η ένταση της LC3-Ι και-ΙΙ LC3 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ και την αναλογία του LC3-II /LC3-Ι παρουσιάζονται παρακάτω. κύτταρα (Β) ΗΕΚ293 σταθερώς εκφράζουν GFP-LC3 επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο που εκφράζει flag-tagged Beclin 1 ή 2 Beclin και καλλιεργήθηκαν είτε σε κανονικό μέσο καλλιέργειας (DMEM) ή κατάσταση λιμοκτονίας (EBSS) όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Έμμεση χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντι-Flag Μ2. 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) χρώση αποκάλυψε τον πυρήνα. Η περιοχή κιβώτιο μεγεθύνεται (α). κύτταρα (C) SAS επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή τη σημαία-tagged Beclin 1 και 2 Beclin για 24 ώρες. Τα επιμολυσμένα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν σε 200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων. Μετά από 14 ημέρες, οι αποικίες έγιναν ορατές με τη χρήση 1% κρυσταλλικό ιώδες σε μεθανόλη. Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

Η

Για να αξιολογηθεί η υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών Beclin, κύτταρα ΗΕΚ293 διαμολύνθηκαν με πλασμίδιο που εκφράζει flag-tagged Beclin 1 και Beclin 2, αντίστοιχα. Υπό κανονικές συνθήκες, ο αριθμός των GFP-LC3 puncta ήταν χαμηλή, και Beclin 1 και Beclin 2 ήταν ως επί το πλείστον εντοπισμένες στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 4Β, αριστερό πάνελ). Μετά την επαγωγή αυτοφαγία από θρεπτικά συστατικά πείνα και τη θεραπεία βαφιλομυκίνη, τα κύτταρα έδειξαν αυξημένη LC3 punctae? Beclin 1 και Beclin 2 έδειξε μερική colocalization με LC3 punctae (Σχήμα 4Β, δεξιά πλευρά). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι LC3 punctae διευρύνθηκαν σε Beclin 2 υπερεκφράζουν κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο και Beclin 1 υπερεκφράζουν κύτταρα. Περαιτέρω, τα κύτταρα είτε με Beclin 1 ή 2 Beclin υπερέκφραση οδήγησε σε αυξημένη ικανότητα κλωνογονική επιβίωση σε σύγκριση με τον έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα (σχήμα 4Γ). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση της Beclin 1 ή 2 Beclin ενεργοποιεί αυτοφαγία και προωθεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, και τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης της Beclin 1 και Beclin 2 ήταν ανεξάρτητες η μία από την άλλη.

Beclin 2 εξάντληση βλάπτει αυτοφαγία και προωθεί το στόμα ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

Για να επιθεωρήσει το αποτέλεσμα της εξάντλησης Beclin 2 και η σχέση της με την αυτοφαγία στον καρκίνο του στόματος, εμείς επιμολυσμένα siRNAs που στοχεύουν είτε

Beclin 2

ή

Atg5

στα κύτταρα SAS . Επειδή το ενδογενές επίπεδο Beclin 2 ήταν χαμηλά στα κύτταρα SAS, η απόδοση του

Beclin 2

νοκ ντάουν με siRNA για πρώτη φορά προσδιορίζεται σε κύτταρα εκφράζεται σταθερά σημαία-tagged Beclin 2. Τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά Beclin 2 έδειξε υψηλότερη αναλογία των LC3- II /LC3-Ι (Σχήμα 5Α, αριστερό πάνελ). Μετά την επιμόλυνση siRNA που στοχεύει

Beclin 2

ή

Atg5

, έκφραση Beclin 2 ή Atg5 μειώθηκε σημαντικά, και οι αναλογίες των LC3-II /LC3-Ι μειώθηκαν ταυτόχρονα (Σχήμα 5Α, δεξιά πίνακας). Αν και η ενδογενής Beclin 2 δεν ήταν σε θέση να ανιχνεύσει μετά την επιμόλυνση siRNA που στοχεύει

Beclin 2

, ο Beclin 1 και τα επίπεδα Atg5 ήταν ανεπηρέαστες, και ο λόγος της LC3-II /LC3-Ι μειώθηκαν (Σχήμα 5Β). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι Beclin 2 εξάντληση προκαλεί χειροτέρευση αυτοφαγία. Κυττάρων είτε με Beclin 2 ή Atg5 εξάντληση έδειξε κλωνογονική ικανότητα επιβίωσης σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με έλεγχο siRNA (Σχ 5C). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν Beclin 2 εξάντληση εξασθενίζει μέρος της δραστηριότητας αυτοφαγία, και προωθεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

(Α) Τα κύτταρα SAS ή κύτταρα που εκφράζουν σταθερά flag-tagged Beclin 2 ή (Β) κύτταρα επιμολυσμένα με SAS ελέγχου siRNA ( SCR), Atg5 siRNA (siAtg5) ή το Βερολίνο 2 siRNA (siB2). Κυτταρόλυμα παρασκευάσθηκαν μετά από 48 ώρες μορφομετατροπή και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. κύτταρα (C) SAS επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA (SCR), Atg5 siRNA (siAtg5) ή το Βερολίνο 2 siRNA (siB2) για 24 ώρες. Τα επιμολυσμένα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν σε 200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 6 φρεατίων. Μετά από 14 ημέρες, οι αποικίες έγιναν ορατές με τη χρήση 1% κρυσταλλικό ιώδες σε μεθανόλη. Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

Η

Συζήτηση

Η οικογένεια Beclin έχει 2 ταυτοποιημένα μέλη, Beclin 1 και Beclin 2. Η προγνωστική ρόλος της Beclin 1 έχει μελετηθεί ευρέως σε διάφορες τύπους ανθρώπινων καρκίνων, και τις εκβάσεις των ασθενών καθορίζεται από κυτταροπλασματική έκφραση Beclin 1 μπορεί να είναι ειδικά για τον τύπο του καρκίνου. Για παράδειγμα, η χαμηλή έκφραση του Beclin 1 συνδέεται με κακή πρόγνωση στον καρκίνο του μαστού [19, 20], τον καρκίνο των ωοθηκών [21], ο καρκίνος του πνεύμονα [22], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [23], χολαγγειοκαρκίνωμα [24], του καρκίνου του παγκρέατος [25], υποφάρυγγα καρκίνος [26], του λάρυγγα καρκίνος [27], καρκίνο του οισοφάγου [28], του δωδεκαδάκτυλου καρκίνο [29], γαστρικού καρκίνου [30], λεμφώματα [31-33], κλπ υψηλή έκφραση Beclin 1 συνδέεται με την επιθετικότητα του όγκου σε ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα [34], καρκίνος του ενδομητρίου [35], και του παχέος εντέρου [36]. Οι έρευνες της Beclin 1 στην προφορική ιστούς του καρκίνου έδειξαν ότι η υψηλή έκφραση που σχετίζονται με την κακή προγνωστικούς παράγοντες ή /και επιθετική κλινική έκβαση [37, 38]. Η μελέτη μας ήταν σύμφωνο με προηγούμενες έρευνες, και αποκάλυψε επίσης ότι η υπερέκφραση του Beclin 1 σε SAS επαγόμενη ανάπτυξης όγκου σε κλωνογονική δοκιμασία, αποδεικνύοντας το ρόλο της εξέλιξης του όγκου σε καρκίνο του στόματος.

Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε πρώτα η έκφραση και προγνωστικές ρόλος του Beclin 2 στον ανθρώπινο καρκίνο. Εμείς αποκάλυψε ότι ασθενείς με καρκίνο του στόματος είτε με υψηλή ή χαμηλή έκφραση του Beclin 2 έδειξε χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με μέτρια έκφραση. Η έκφραση του Beclin 2 ήταν ανεξάρτητες από το στάδιο του καρκίνου (Πίνακας 1). Είτε υψηλή ή χαμηλή Beclin 2 έκφραση σε καρκινικούς ιστούς προτεινόμενες δυσλειτουργία σε αυτοφαγία και το μεταβολισμό. Beclin 2 λειτουργικές αναλύσεις έδειξαν περαιτέρω είτε εξάντληση ή υπερέκφραση του προώθησε την ανάπτυξη του όγκου στα καρκίνο του στόματος κύτταρα SAS. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν Beclin 2 σχετίζεται με ογκογένεση σε καρκίνο του στόματος. Χειραγώγηση της γονιδιακής έκφρασης του

Beclin 1

δεν επηρέασε Beclin πρωτεΐνη 2, και το αντίστροφο. Οι κυτταροπλασματικές εκφράσεις των 2 πρωτεϊνών ήταν άσχετες επίσης σε καρκινικούς ιστούς του στόματος (Σχήμα 2). Τα αποτελέσματα προτείνουν ο μοριακός μηχανισμός που εμπλέκονται στην ογκογένεση του στόματος από αυτές τις 2 πρωτεϊνών είναι ανεξάρτητος.

Autophagy έχει ενοχοποιηθεί τόσο καταστολή του όγκου και της προόδου του όγκου. Autophagy αναστέλλει κακοήθη μετασχηματισμό των κανονικών κυττάρων με τη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης, κανονικό μεταβολισμό, και γονιδιωματική σταθερότητα [39]. Σε καθιερωμένες όγκων, αυτοφαγία προωθεί συχνά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με τη διατήρηση του μεταβολισμού στην αγχωτική κατάσταση [40, 41]. Ωστόσο, η πραγματική επιρροή της αυτοφαγία στην ογκογένεση μπορεί να είναι το πλαίσιο-εξαρτώμενη. Αυτοφαγία μπορεί να ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων με διαφορετικό τρόπο ανάλογα με το είδος των ιστών και συγκεκριμένες γενετικές ρυθμίσεις [42, 43]. Οι συσχετίσεις μεταξύ των πρωτεϊνών αυτοφαγία και Beclin έχουν καλά τεκμηριωμένες. Beclin πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τα συστατικά στην κατηγορία ΙΙΙ φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης συγκρότημα, το οποίο απαιτείται για την έναρξη της αυτοφαγία [13, 44]. Beclin 1 εμπλέκεται στο σχηματισμό του phagophore (ο πρόδρομος της autophagosome) στις αρχές της δεκαετίας βήμα της αυτοφαγία, και colocalized με LC3 punctae [45, 46]. Τα δεδομένα μας απέδειξαν για πρώτη φορά την συνεντόπισης της Beclin 2 και LC3, επιβεβαιώνοντας ότι Beclin 2 εμπλέκεται στην αυτοφαγία. Αν και βρήκαμε ότι οι χειρισμοί του Beclin 1 ή 2 επίπεδο Beclin έκανε οδηγούν στην αλλαγή αυτοφαγία, τις επιπτώσεις τους στην αύξηση του όγκου δεν μπορεί εξ ολοκλήρου άμεσα λόγω αυτοφαγία. Beclin 1 ήταν αρχικά να βρεθεί να έχει λειτουργία καταστολής όγκων [5]. Παραδόξως, υψηλή έκφραση Beclin 1 συνδέθηκε με την εξέλιξη του όγκου σε ορισμένες μορφές καρκίνου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34-38]. Αλληλόμορφη απώλεια του

Beclin 1

σχηματισμό ανέστειλε όγκου σε ορισμένους γονότυπους των ποντικών [47, 48]. Beclin 1 αλληλεπιδρά όχι μόνο με θετικές και αρνητικές ρυθμιστές της αυτοφαγία, αλλά συμμετέχει επίσης σε διάφορες μη-αυτοφαγικά διαδικασίες [49]. Οι επιπτώσεις της Beclin 1 για την εξέλιξη του όγκου μπορεί να είναι, τουλάχιστον εν μέρει, ανεξάρτητα από αυτοφαγία. Επιπλέον, η μελέτη μας καθιερώθηκε για πρώτη φορά τη σύνδεση της Beclin 2 και την εξέλιξη του όγκου. Οι σχέσεις των Beclin 2 και ογκογένεση μπορεί να είναι πιο περίπλοκη. Η εξέλιξη του όγκου που προκαλείται από Beclin 2 υπερέκφραση και εξάντληση μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικούς μηχανισμούς. Τα στοιχεία μας και της προηγούμενης βιβλιογραφίας διαπιστώθηκε ότι νοκ ντάουν της Beclin 2 εξασθενημένη, αλλά δεν καταργείται εντελώς αυτοφαγία [13]. Η ανάπτυξη του όγκου που προκλήθηκε από την εξάντληση Beclin 2 μπορεί να προκαλείται από αυτοφαγία ή /και μηχανισμούς αυτοφαγία-ανεξάρτητη. Beclin 2 μερίδια αρκετές αλληλεπιδρούν συνεργάτες του Beclin 1, και που απαιτούνται επιπροσθέτως για την αποδόμηση του GASP1 ρυθμιζόμενων υποδοχείς συζευγμένου με πρωτεΐνη (GPCRs) [13]. Πολλές GPCRs υπερεκφράζεται σε καρκίνους και συμβάλλουν σε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [50]. Απώλεια Beclin 2 μπορεί να προκαλέσει συσσώρευση ορισμένων GPCRs και να οδηγήσει στην εξέλιξη του όγκου.