Αφηρημένο

Παρά θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT), επίμονη υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σηματοδότησης επιτρέπει απόφυση του καρκίνου του ανθεκτικού ευνουχισμό του προστάτη (CRPC). Σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (PCA), ADT μπορεί να ενισχύσει δραστικότητα AR μέσω επαγωγής του οξειδωτικού στρες. Στο παρόν, ερευνήσαμε τους ρόλους των Nrf1 και Nrf2, μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν την αντιοξειδωτική της γονιδιακής έκφρασης, στην ορμόνη μεσολάβηση AR διενεργοποίησης χρησιμοποιώντας ένα συγγενικό

in vitro

μοντέλο εξαρτάται από ανδρογόνα (LNCaP) και ανθεκτικά ευνουχισμό (C4-2B ) κύτταρα του προστάτη. Διυδροτεστοστερόνη (DHT) διεγείρεται τρανσενεργοποίηση του στοιχείου απόκρισης ανδρογόνου (ARE) ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε κύτταρα C4-2B παρά σε κύτταρα LNCaP. DHT που προκαλείται AR μετενεργοποίηση συζεύχθηκε με υψηλότερες πυρηνική μετατόπιση του p65-Nrf1 σε C4-2B κύτταρα, σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP. Αντίθετα, DHT διέγερση κατέστειλε τα επίπεδα της ολικής Nrf2 στα κύτταρα C4-2B αλλά αυξημένα επίπεδα ολικής Nrf2 στα κύτταρα LNCaP. Είναι ενδιαφέρον, siRNA μεσολαβεί αποσιώπηση των Nrf1 εξασθενημένο AR μετενεργοποίηση, ενώ p65-Nrf1 υπερέκφραση ενισχυμένη AR διενεργοποίηση. Μεταγενέστερες μελέτες έδειξαν ότι Nrf1 αλληλεπιδρά φυσικά με AR και ενισχύει δραστικότητα δέσμευσης DNA AR του, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ρ65-Nrf1 ισομορφή είναι ένας δυνητικός AR συνενεργοποιητή. Σε αντίθεση, Nrf2 κατέστειλε AR-ενεργοποίηση μέσω διεγείροντας την πυρηνική συσσώρευση του p120-Nrf1 οποία καταστέλλεται AR διενεργοποίηση. Μελέτες ποσοτικής RT-PCR επικυρωθεί περαιτέρω τις επαγωγικές επιδράσεις της p65-Nrf1 ισομορφή στο ανδρογόνων ρυθμιζόμενα γονίδια, PSA και TMPRSS2. Ως εκ τούτου, τα ευρήματά μας εμπλέκουν διαφορική ρόλους των Nrf1 και Nrf2 στη ρύθμιση AR διενεργοποίηση στα κύτταρα του προστάτη. Τα ευρήματα μας δείχνουν επίσης ότι η DHT-διεγείρονται αύξηση του p65-Nrf1 και η ταυτόχρονη καταστολή και των δύο Nrf2 και p120-Nrf1 διευκολύνει τελικά AR διενεργοποίησης σε CRPC κύτταρα

Παράθεση:. Schultz MA, Hagan SS, Datta Α, Zhang Υ, Freeman ML, Sikka SC, et al. (2014) Nrf1 και Nrf2 Μεταγραφή παράγοντες ρυθμίζουν ανδρογόνων υποδοχέων Μετενεργοποίησης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (1): e87204. doi: 10.1371 /journal.pone.0087204

Επιμέλεια: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Γαλλία

Ελήφθη: 19 Φλεβάρη 2013? Αποδεκτές: 26 Δεκεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Schultz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτές οι μελέτες υποστηρίχθηκαν από τα ταμεία από το Υπουργείο άμυνας? PC080811 (Ο.Μ.), PC081598 (AA), και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Τ32-CA093240 (MF), και από τη Λουιζιάνα Cancer Research Consortium (DM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη. κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στην αμερικανική άνδρες [1] και αυξημένα υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σηματοδότησης διευκολύνει την ανάπτυξη του προστάτη. Ως εκ τούτου, θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) έχει σχεδιαστεί για να καταστρέφουν συστηματικά επίπεδα ανδρογόνων και έτσι να καταστείλουν σηματοδότησης AR στην ορμόνη που εξαρτώνται από τα κύτταρα του προστάτη [2]. Ωστόσο, οι ασθενείς που ανταποκρίνονται μόνο σε ADT για περίπου 18 μήνες λόγω της επιλογής και απόφυση των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη ανθεκτικού ευνουχισμό (CRPC). Είναι ενδιαφέρον ότι, CRPC κύτταρα διατηρούν τόσο την έκφραση AR και λειτουργίας [2], [3]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση των μηχανισμών της επίμονης λειτουργία AR σε κύτταρα CRPC παρά ADT θα βοηθήσει στην ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών που καταστέλλουν του προστάτη υποτροπή.

Έχει προταθεί ότι η εναπομένουσα παραγωγή ανδρογόνων στο μικροπεριβάλλον του όγκου συμβάλλει στην επίμονη σηματοδότηση AR [3 ]. Διυδροτεστοστερόνη (DHT) είναι ένας ισχυρός ανδρογόνο που διεγείρει AR μεσολάβηση μετενεργοποίηση στο στοιχείο απόκρισης ανδρογόνων (ARE), παρούσα στην υποκινητές πολλών γονιδίων σημαντικών στην ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη [4]. Είναι ενδιαφέρον ότι η κλασσική πορεία AR διενεργοποίησης συχνά παρακάμπτεται σε CRPC κύτταρα όπου επίμονη λειτουργία AR συμβαίνει παρά τα χαμηλά επίπεδα ανδρογόνων [5], [6]. Αυτό μετενεργοποίηση AR σε CRPC κυττάρων έχει αποδοθεί στην αυξημένη έκφραση AR και ενισχυμένη έκφραση των ενζύμων που μετατρέπουν τα ανδρογόνα να DHT [3], [7]. Ωστόσο, πρόσφατες ενδείξεις υποδεικνύουν επίσης ότι οι παράλληλες οδούς σηματοδότησης που αυξάνουν την έκφραση και τη δραστηριότητα των AR συνενεργοποιητές μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της δραστηριότητας AR [3], [8]. Μερικές από αυτές τις συνενεργοποιητές AR μπορεί να αλλάξει τη διαμόρφωση του θύλακα δέσμευσης συνδέτη AR, αυξάνοντας έτσι την εξειδίκευση δέσμευσης AR για στεροειδούς συνδετήρες. Εναλλακτικά, AR μπορεί να συνδεθεί με διάφορα συμπαράγοντες και συνοδούς που διευκολύνουν τον πυρηνικό εντοπισμό της και την ικανότητα [9] δεσμευτική. Ως εκ τούτου, η αναγνώριση των AR συμπαράγοντες θα βελτιώσει την κατανόηση της εξέλιξης του προστάτη σε CRPC.

Οι μελέτες έχουν δείξει ότι ADT μπορεί να προκαλέσει οξειδωτικό στρες και αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του προστάτη με αντοχή ευνουχισμό [ ,,,0],10]. Η χρόνια οξειδωτικό στρες έχει παρατηρηθεί σε επιθετικά κύτταρα προστάτη και εκθέσεις έχουν δείξει ότι αυτά τα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιήσουν ROS επάγονται αντιοξειδωτικό πρωτεΐνες για να ενισχύσει την επιβίωση και τη διατήρηση σηματοδότηση AR [6], [11] – [13]. Πράγματι, πολλοί τελεστές της ROS σηματοδότησης που λειτουργούν ως AR συνενεργοποιητές υπερεκφράζεται σε ΠΑΠ και η έκφρασή τους μπορεί να ρυθμίζεται με ορμόνη σηματοδότηση [14] – [16]. Το αντιοξειδωτικό πρωτεΐνη peroxiredoxin-1 (Prx-1) δρα ως συνοδός για να ενισχύσει σηματοδότηση ορμόνη και ανδρογόνων ευαισθησία μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με AR, το οποίο αυξάνει πυρηνικό εντοπισμό του [14], [15]. Επιπλέον, η διατάραξη της σηματοδότησης των ανδρογόνων (δηλαδή ADT) στον προστάτη μπορεί να επάγει οξειδωτικό στρες αυξάνοντας την έκφραση του ROS παραγωγής οξειδάσες NADPH (NOx) [16], [17]. Αυτές οι αλλαγές στην ROS επηρεάζουν την δραστικότητα παραγόντων μεταγραφής όπως Nrf1 και Nrf2 (NF-E2 παράγοντα 1 συνδέονται και 2) ότι η ρύθμιση της έκφρασης πολυάριθμων αντιοξειδωτικό πρωτεϊνών και NADPH Οξειδάσες [18] – [20]. Οι προκύπτουσες αλλαγές στην ΝΟΧ και έκφραση αντιοξειδωτικό πρωτεΐνης μπορεί να σχετίζεται με την αυξημένη επιβίωση του όγκου [21] – [23]. Ωστόσο, αν και οι δύο Nrf1 και Nrf2 έχουν σημαντικές επιπτώσεις στο οξειδωτικό στρες σηματοδότηση, τις άμεσες επιπτώσεις τους στην AR τρανσενεργοποίηση δεν έχουν διερευνηθεί προηγουμένως.

Nrf1 και Nrf2 είναι master ρυθμιστές του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από γονιδιακή έκφραση [18], [ ,,,0],24] – [26]. Είναι cap-n-κολάρο βασικό φερμουάρ λευκίνης (CNC-bZIP) μεταγραφικών παραγόντων που, ως απάντηση σε διάφορες μορφές οξειδωτικού στρες, μπορεί να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση μέσω της ηλεκτρονιόφιλο στοιχείου απόκρισης (EpRE). Υπό κανονικές συνθήκες ομοιοστατική οξειδοαναγωγής, Nrf2 διαχωρίζεται από Keap1 (Kelch-όπως ECH-πρωτεΐνη που σχετίζεται με 1) στο κυτταρόπλασμα, όπου ρυθμίζει αρνητικά Nrf2 μέσω μεσολάβηση ουμπικιτίνης αποικοδόμηση του πρωτεασώματος [26]. Κατά ROS διέγερση, Keap1 απελευθερώνει Nrf2 για να επιτραπεί πυρηνικό εντοπισμό και διενεργοποίησης του μέσω των αλληλουχιών EpRE. Ωστόσο, αν και πολλή προσοχή έχει επικεντρωθεί στο ρόλο του Nrf2 στον καρκίνο [25], οι έρευνες για τον ρόλο των Nrf1 που έλειπε σοβαρά.

Σε αντίθεση με Nrf2, το Ν-τερματικό πεδίο (NTD) του Nrf1 (TCF11), η οποία αγκιστρώνει Nrf1 στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) της μεμβράνης και της πυρηνικής μεμβράνης, ρυθμίζει την ενεργοποίηση Nrf1 και μετατόπιση του προς τον πυρήνα [27] – [29]. Επιπλέον, το ανθρώπινο γονίδιο Nrf1 μπορεί να δημιουργήσει τόσο πλήρους μήκους 120 kDa Nrf1 αρκετές περικοπεί (36, 55, 65, και 95 kDa) ισόμορφα του Nrf1 [30] (p120-Nrf1) και, [31]. Από αυτές τις μικρότερες ισομορφές Nrf1, η ισομορφή Ν-τερματική κολοβωμένη-65 kDa (ρ65-Nrf1) έχει δειχθεί ότι διαθέτει σημαντικές ρυθμιστικές επιδράσεις σε σχέση με Nrf2 μεσολάβηση μεταγραφής. Είναι ενδιαφέρον ότι, εκτελούνται έκφραση του p65-Nrf1 μπορεί να αναστείλει Nrf2 μεσολαβούμενη επαγωγή του EpRE ρυθμιζόμενα γονίδια [30]. Μελέτες έχουν δείξει, επίσης, ότι τόσο Nrf1 και Nrf2 μεσολαβήσει ROS σηματοδότησης [18], [30]. Έτσι, ROS σηματοδότησης και της κυτταρικής ομοιόστασης μπορεί να συμβεί μέσω της ρύθμισης της κρίσιμης ισορροπίας μεταξύ Nrf1 και Nrf2 έκφρασης και δραστηριότητας. Ωστόσο, ο ρόλος τους στο AR διενεργοποίηση στα κύτταρα του προστάτη δεν έχει διερευνηθεί

Αρκετές μελέτες έχουν ενοχοποιήσει τη σημασία της Nrf2 σε προστάτη [32] – [34].. Η έκφραση του Nrf2 συσχετίζεται αρνητικά με Gleason βαθμολογίες σε ασθενείς PCa έχουν [32] και μειωμένα επίπεδα Nrf2 έχουν συνδεθεί με αυξημένη επιθετικότητα στο μοντέλο ποντικού TRAMP προστάτη [33], [34]. Είναι ενδιαφέρον, έχει επίσης προταθεί ότι μπορεί να ρυθμίσει Nrf1 Nrf2 έκφραση μέσω της ρύθμισης ενός EpRE που βρίσκονται στην περιοχή του υποκινητή Nrf2 [35]. Ωστόσο, παρά την ικανότητα του να καταστέλλει Nrf1 Nrf2 μεσολαβεί μεταγραφή [30], ο ρόλος των Nrf1 στην εξέλιξη της PCA είναι άγνωστη. προηγούμενες έρευνες μας έχουν δείξει ότι η CRPC κυτταρική γραμμή C4-2B έχει αυξημένη έκφραση του p65-Nrf1 και μειωμένη έκφραση Nrf2, σε σύγκριση με τα ανδρογονο-εξαρτώμενου κύτταρα LNCaP και τα μη ογκογόνα RWPE-1 και RWPE-2 κύτταρα [36] . Δεδομένου ότι τόσο ενισχυμένη σηματοδότηση AR και στέρηση ανδρογόνου μπορεί να επάγει την έκφραση ROS, μπορούμε υποτεθεί ότι Nrf1 και Nrf2 μπορεί να παίζει άμεσο ρόλο στη ρύθμιση της σηματοδότησης AR σε κύτταρα προστάτη [3], [10]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν Nrf1 και Nrf2 ρυθμίζουν διαφορικά AR τρανσενεργοποίηση στην εξαρτώμενη από ανδρογόνα κύτταρα LNCaP και ανδρογόνων ανεξάρτητες υπο-γραμμή τους, C4-2B.

Από LNCaP και C4-2B κύτταρα είναι συγγενικά γραμμές προστάτη, τα ευρήματά μας σε αυτές τις κυτταρικές σειρές δείχνουν ότι Nrf1 και Nrf2 μπορεί να έχουν σημαντικούς ρόλους στην εξέλιξη του προστάτη μέσα από την εκδήλωση της CRPC φαινότυπο. Τα ευρήματά μας σαφώς έδειξαν ότι οι αντίθετες λειτουργίες της Nrf2 και το p65 και ρ120 ισομορφές Nrf1 μπορεί να ρυθμίσει DHT που προκαλείται AR διενεργοποίησης στα κύτταρα του προστάτη. Οι μελέτες μας εμπλέκουν περαιτέρω νέους μηχανισμούς μέσω των οποίων Nrf1 και Nrf2 ρύθμιση τροποποιηθεί κατά τη ανθεκτικά ευνουχισμό C4-2B κυτταρική γραμμή για τη διευκόλυνση της ενισχυμένης μετενεργοποίησης AR.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

LNCaP κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Catalog # CRL-1740). Η κυτταρική γραμμή C4-2B είναι ένα μεταστατικό υπογραμμή οστό που προέρχεται από LNCaP, και ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Lelund Chung [37]. Αμφότερες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 από Mediatech (Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) από την Ατλάντα Biologicals (Lawrenceville, GA) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Mediatech). αγωγές DHT διεξήχθησαν σε άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI μέσο (Mediatech), με 10% απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα εμβρυϊκό βόειο ορό (CS-FBS) από Innovative Research Labs (Novi, Michigan). Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, επιστρώνονται και αφήνονται να συνδεθούν όλη τη νύκτα σε πλήρες μέσο, ​​μετά την οποία τα μέσα ενημέρωσης άλλαξε σε CS-FBS που περιέχει RPMI. Μετά από ολονύκτια επώαση σε CS-FBS που περιέχει μέσα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε DHT (0-10 ηΜ) σε μέσα CS-FBS και συλλέχθηκαν στους χρόνους που υποδεικνύονται για τη μέτρηση RNA, πρωτεΐνη και η έκφραση του γονιδίου αναφοράς.

Αντιδραστήρια

DHT λήφθηκε από Steraloids (Wilton, VA). Nrf1 αντίσωμα ελήφθη από Proteintech Group (Chicago, IL). Αντισώματα προς Nrf2, AR, και ΤΑΤΑ Protein Binding (ΤΒΡ) ελήφθησαν από την Abcam (Cambridge, ΜΑ). Ισοτύπου IgG (μη-ειδική έλεγχος) και όλες οι δευτερεύουσες αντι-ανθρώπινα αντισώματα ελήφθησαν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA). αντίσωμα αντι-V5 ελήφθη από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Το αντίσωμα AR χρησιμοποιείται για δοκιμασίες ChIP λήφθηκε από Active Motif (Carlsbad, CA). Η Nrf1 ειδικό siRNA και το μη ειδικό έλεγχο (NC1) siRNA ελήφθησαν από Integrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ?. Cat # HSC.RNAI N003204.12.1-3). Πλασμίδια ελήφθησαν από τις ακόλουθες πηγές: p65-Nrf1 φορέα έκφρασης (p65-Nrf1-V5His) ήταν ένα ευγενικό δώρο από τον Δρ Τσαν [30], ο φορέας έκφρασης ρ120-Nrf1-V5His ελήφθη από τον Dr. Zhang [38] και ο φορέας psPSA-Luc ανταποκριτή (λουσιφεράση πυγολαμπίδας) ελήφθη από το εργαστήριο του Δρ Abdel-Mageed του [39]. Ο φορέας ρΡΙ_-ΤΚ (λουσιφεράση της Renilla) αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI). Ο φορέας έκφρασης Nrf2 (pCMV6-Nrf2) αγοράστηκε από ΟηΟεηε (Rockville, MD) και φορέα μάρτυρα pcDNA3.1 αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA).

Ποσοτική RT-PCR

Μετά την επεξεργασία, το mRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). Το cDNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το High Capacity Reverse Transcription Kit από την Applied Biosystems (Foster City, CA). Οι RT-PCR εναύσματα συντέθηκαν σε Midland Certified Reagent Company (Midland, ΤΧ) και SYBR Green Master Mix αγοράστηκε από την Applied Biosystems (Foster City, CA). Οι ακόλουθες αλληλουχίες εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτική RT-PCR:

AR

: 5′-GGTGAGCAGAGTGCCCTATC-3 ‘και 5′-GAAGACCTTGCAGCTTCCAC-3’?

GAPDH

: 5′-TCCCATCACCATCTTCCA-3 ‘και 5′-CATCACGCCACAGTTTCC-3’?

PSA:

5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 ‘και 5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3’? και

TMPRSS2

:5′-GTCCCCACTGTCTACGAGGT-3 ‘και 5′-CAGACGACGGGGTTGGAAG-3’. Πτυχές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκαν μετά από κανονικοποίηση προς αντίστοιχα επίπεδα τους GAPDH mRNA.

πυρηνικής πρωτεΐνης Εκχύλιση

Πυρηνική σφαιρίδια για γουέστερν απομονώθηκαν με τη χρήση των CER-Ι και CER-ΙΙ ρυθμιστικά εξαγωγή από το NE-PER Nuclear Extraction kit (Pierce, Rockford, IL). Οι πυρήνες πλύθηκαν με HBSS και πυρηνική πρωτεΐνη εκχυλίζεται με ένα προσαρμοσμένο πυρηνικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης πρωτεΐνη [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 500 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 1% νάτριο-δεοξυχολικό, 0.1% SDS, 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF), και 1 mM EDTA]. Πυρηνική πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ εκτίμησης πρωτεΐνης BCA από την Thermo Scientific (Rockford, IL).

ανοσοαποτύπωσης

Τα δείγματα πρωτεΐνης βράσθηκαν εντός 1:01 όγκο πρωτεΐνης και ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης [100 mM Tris (ρΗ 6.8), 25% γλυκερόλη, 2% SDS, 0,01% μπλε βρωμοφαινόλη, 10% 2-μερκαπτοαιθανόλη] για πέντε λεπτά. Πυρηνικές πρωτεΐνες (20-50 μg) ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτές τρις-ΗΟΙ PAGE και υγρό μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό με 5% γάλα σε ρυθμιστικό TBST (TBS με 0.05% Tween-20), οι μεμβράνες υβριδοποιήθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Συγκροτήματα στη συνέχεια ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας το Lumiglo χημειοφωταύγειας σύστημα υπόστρωμα (KPL, Gaithersburg, MD). εντάσεις Band ποσοτικοποιήθηκαν με Image-J Λογισμικό (ΝΙΗ) και οι τιμές ομαλοποιήθηκαν προς τα επίπεδα πρωτεΐνης ΤΒΡ σε αντίστοιχα δείγματα τους.

παροδική επιμόλυνση και λουσιφεράσης Δοκιμασίες

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων όλη τη νύκτα πριν από την επιμόλυνση με αντιδραστήριο Lipofectamine-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) και τα υποδεικνυόμενα φορείς. Για τις δοκιμασίες λουσιφεράσης, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με είτε το psPSA-

luc

πλασμίδιο αναφοράς μόνο του ή σε συνδυασμό με ίσες ποσότητες φορέα έκφρασης Nrf1 (p65-Nrf1-V5-His ή ρ120-Nrf1-V5-His), ή φορέα Nrf2 έκφρασης (pCMV6-Nrf2), ή ένας φορέας έκφρασης ελέγχου (pcDNA3.1). Για την κανονικοποίηση για αποδοτικότητα διαμόλυνσης, τα κύτταρα επίσης συνεπιμολύνθηκαν με τον φορέα ρΡΙ_-ΤΚ (λουσιφεράση της Renilla). Western μελέτες διεξήχθησαν επίσης με τα υποδεικνυόμενα φορείς έκφρασης μόνο του. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύχτα σε διάλυμα διαμόλυνσης (20 μΐ λιποφεκταμίνη, τον φορέα λουσιφεράσης 400 ng ή /και φορέα έκφρασης, και 100 ng ρΡΙ_-ΤΚ) σε 2 ml /κόκκινο φαινόλης μέσο ελεύθερο ορού. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα εκτέθηκαν σε DHT (0, 1 ή 10 ηΜ) για 24 ώρες σε CS-FBS που περιέχει άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI. Κυτταρικά εκχυλίσματα συλλέχθηκαν και τα επίπεδα λουσιφεράσης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη διπλή Luciferase Reporter Assay kit (Promega, Madison, WI). Σε κάθε πείραμα, λουσιφεράση πυγολαμπίδας τιμές (από psPSA-Luc) κανονικοποιήθηκαν προς λουσιφεράση της Renilla τιμές (από pRL-ΤΚ). Πυρηνική πρωτεΐνη εκχυλίζεται μετά την κατεργασία και αξιολογούνται από δυτικούς για αλλαγές στην έκφραση της πυρηνικής πρωτεΐνης. Σε παράλληλα πειράματα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν επίσης με τους φορείς έκφρασης Nrf1 και Nrf2 μόνος με σκοπό την παρακολούθηση DHT-επαγόμενη έκφραση δύο AR ρυθμισμένων γονιδίων, PSA (ειδικό προστατικό αντιγόνο) και TMPRSS2 (διαμεμβρανική πρωτεάση, σερίνη 2).

siRNA Επιμόλυνση

σύντομης παρεμβολής RNA (siRNA) επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Transfast από την Promega (Madison, WI). Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν για όλη τη νύχτα (περίπου 18 ώρες) σε διάλυμα επιμόλυνσης που αποτελούνταν από αντιδραστήριο Transfast (2:01 αραίωση), και 20 ηΜ είτε Nrf1 siRNA ή NC1 (έλεγχος) siRNA στον ορό και άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI. Για πλασμίδιο συμμετασκευές, τα κύτταρα ταυτόχρονα επιμολύνθηκαν με αμφότερα siRNA και το πλασμίδιο σε μία αραίωση 2:01 του αντιδραστηρίου Transfast, όπως περιγράφεται στην ενότητα λουσιφεράσης δοκιμασίας. Μετά από ολονύκτια επιμόλυνση, τα μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες και οι δοκιμασίες λουσιφεράσης διεξήχθησαν. Παράλληλα δείγματα, RNA και πυρηνική πρωτεΐνη ελήφθη για την παρακολούθηση της γονιδιακής έκφρασης από qRT-PCR και από τα δυτικά.

Ανοσοκαταβύθιση

Για συνανοσοκαθίζησης και ανοσοαποτύπωση (co-IP /ΙΒ) μελέτες, LNCaP και C4-2B κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 1, ή 10 ηΜ DHT για 6 ώρες. Πυρηνική σφαιρίδια απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό πυρηνική απομόνωση (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl

2, 100 μΜ EDTA, 500 μΜ DTT, 0,625% αναστολέων ΝΡ-40, αναστολέα πρωτεάσης, και φωσφατάση). Προστέθηκε Μετά την πλύση σε PBS δυο φορές, ρυθμιστικό RIPA (150 mM NaCl, 10 mM Tris (ρΗ 8.0), 5 mM EDTA, 1% δεοξυχολικό, 1% Triton Χ-100, 0.1% SDS, αναστολέα πρωτεάσης και αναστολείς φωσφατάσης) στην πυρηνική σφαιρίδια και τα σφαιρίδια υποβλήθηκαν σε ηχητική επεξεργασία για την απομόνωση της πυρηνικής πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη προ-εκκαθαριστεί για 30 λεπτά με την πρωτεΐνη-G /πρωτεΐνης-Α σφαιρίδια αγαρόζης (Calbiochem Cat # IP10). αντίσωμα AR (Abcam? ab74272) στη συνέχεια προστέθηκε σε 100 μg πυρηνικής πρωτεΐνης σε 400 μΙ RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως και επωάζονται στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Η πρωτεΐνη-G /πρωτεΐνη-Α σφαιρίδια αγαρόζης προστέθηκαν στη συνέχεια πρωτεΐνη και επωάστηκαν για 2 ώρες. Μετά την επώαση, τα σφαιρίδια πλύθηκαν 3 φορές σε ρυθμιστικό λύσης RIPA και χρώματος φόρτωσης προστέθηκε στο δείγμα. Τα δείγματα στη συνέχεια έβρασαν για 5 λεπτά στους 95 ° C, φορτώνεται επί της γέλης, και ανοσοστυπώθηκαν (IB) με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση

Για χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικά σετ, η Covaris (Woburn, MA) truChIP χρωματίνης κιτ διάτμηση με μη-ιοντικό ρυθμιστικό και η Active Motif (Carlsbad, CA) σετ τσιπ IT υψηλής ευαισθησίας. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή, με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, DHT θεραπεία (6 ώρες) LNCaP και C4-2B κύτταρα κουρεύεται χρησιμοποιώντας το κιτ Covaris truChIP χρησιμοποιώντας E220 επικεντρώθηκε-υπερήχων από Covaris. Τα δείγματα χρωματίνη αραιώθηκαν σε ρυθμιστικό μάρκα από το Active κιτ Motif. Τα δείγματα στη συνέχεια ανοσοκαταβυθίζονται (ΙΡ) είτε με το αντίσωμα Nrf1 (Proteintech Group) ή το αντίσωμα AR (Active Motif). Το υπόλοιπο της δοκιμασίας διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ Active Motif. Είναι ειδικά qRT-PCR πραγματοποιήθηκε στο DNA IP χρησιμοποιώντας εκκινητές για αλληλουχίες είναι-ΙΙ που βρίσκεται εντός της PSA-προαγωγό (5′-CCACAAGATCTTTTT ATGATGACAG-3 ‘και 5′-GCTCATGGAGACTTCATCTAG-3’). Αλλαγές στο ενισχυμένο εντάσεις μπάντα ήταν ποσοτικά.

Κινητικότητα Ηλεκτροφορητική Αναλύσεις Shift

Το 2

ου γενιά DIG Gel κιτ Shift από τη Roche (Branford, CT) χρησιμοποιήθηκε για τις μελέτες EMSA. Το στοιχείο απόκρισης ανδρογόνων (ARE) και το TCF11 και TCF11 /MafG (δεσμευτική Nrf1) ακολουθίες [29] συνετέθησαν από τον Ορκωτό εταιρείας αντιδραστήριο Midland. Οι αλληλουχίες για κάθε ολιγονουκλεοτίδιο EMSA έχουν ως εξής:

TCF11

:5′-GTCATTT-3 ‘και 3′-AAATGAC-5’?

are Κίνα: 5′-GATCCTTGCAGAACAGCAA GTGCTAGCTG-3 ‘και 3′-GAACGTCTTGTCGTTCACGATCGACCTAG-5’? και

TCF11

/

MafG

: 5′-CCCAAATGACAATGCGATTGA-3 ‘, 3′-TCAATCGCATTGTCATTTGGG-5’ (Genomatix MatInspector). Εν συντομία, η πυρηνική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κύτταρα επεξεργασμένα με DHT για 6 ώρες και δεσμευτική αντιδράσεις με DIG σημασμένο Ολιγονουκλεοτίδια διεξήχθησαν. ΟΙ oligos επωάστηκαν με πυρηνική πρωτείνη (10 μg) επί 30 λεπτά, μετά το οποίο προστέθηκε ρυθμιστικό φόρτωσης δείγματος και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 5% PAGE ΤΒΕ γέλη (Bio-Rad, Hercules, CA). Τα δείγματα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νάιλον, επωάστηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, εκτίθενται σε ένα αντίσωμα αντι-DIG, πλύθηκε και αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα χημειοφωταύγειας ECL, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Για τις μελέτες ανταγωνισμού, πυρηνικά εκχυλίσματα προεπωάστηκαν με περίσσεια (50 φορές) μη επισημασμένου ΕΙΝΑΙ, TCF11, ή TCF11 /MafG ολιγονουκλεοτίδια για 30 λεπτά πριν από την DIG-επισημασμένο ΕΙΝΑΙ ολίγος προστέθηκαν στην αντίδραση. Για τα πειράματα χρησιμοποιώντας αντισώματα, να ανταγωνίζονται για τη σύνδεση Nrf1, πυρηνικά εκχυλίσματα προ-επωάστηκαν είτε με Nrf1 αντίσωμα ή με IgG κουνελιού (μη ειδικό έλεγχο) για 30 λεπτά πριν από την DIG-επισημασμένο ΕΙΝΑΙ ολίγος προστέθηκαν στην αντίδραση. Ηλεκτροφόρηση, μεταφορά, και ο υβριδισμός διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Στατιστική Ανάλυση

Κάθε συνθήκη θεραπείας αποτελείτο από 2-4 επαναλήψεις και κάθε πείραμα εκτελέστηκε 2-5 φορές. Σχετική έκφραση προσδιορίστηκε με σύγκριση τιμών αγωγή με το μάρτυρα μετά από κανονικοποίηση με τους μάρτυρες φόρτωσης. Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με αμφίδρομη ΑΝΟνΑ χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism. Σημαντικές αλλαγές από τους ελέγχους που υποδεικνύεται από p-τιμές των & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

AR Μετενεργοποίησης επίπεδα είναι σημαντικά υψηλότερες σε C4-2B κύτταρα από ό, τι σε LNCaP κύτταρα

Για να συγκρίνουν DHT που προκαλείται από τα επίπεδα AR μετενεργοποίησης σε κύτταρα LNCaP και C4-2B, διενεργήσαμε δοκιμασίες λουσιφεράσης σε psPSA-

luc

επιμολυσμένα φορέα κύτταρα (Σχ. 1Α). Παρατηρήσαμε ότι AR μετενεργοποίηση ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0.001) υψηλότερο σε κύτταρα C4-2B παρά σε κύτταρα LNCaP. Μετά τη θεραπεία DHT, κύτταρα LNCaP παρουσίασαν δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο AR μετενεργοποίηση (5 φορές σε 1 ηΜ και 21 φορές σε 10 ηΜ). Σε αντίθεση, στα C4-2B κύτταρα, μία 100 πλάσια αύξηση παρατηρήθηκε ακόμη και σε 1 ηΜ ϋΗΤ (ρ & lt? 0.001) και μια περισσότερο από 130-πλάσια αύξηση (ρ & lt? 0.001). Παρατηρήθηκε μετά από έκθεση σε 10 ηΜ DHT (Εικ 1Α ). Επίσης διεξάγονται ανοσοκηλίδωση μελετών για τον προσδιορισμό των επιπέδων πυρηνικής AR υπό δύο μη διεγερμένα και διεγερμένα DHT-συνθήκες (Εικ. 1Β). Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, ένα 2-5 φορές αύξηση στα επίπεδα πυρηνικής AR παρατηρήθηκε μετά από 24 ώρες DHT-διέγερση. Παρά το γεγονός ότι παρόμοια πυρηνική AR επίπεδα μετά τη θεραπεία DHT, τα κύτταρα C4-2B έδειξε σημαντικά υψηλότερες τιμές AR μετενεργοποίησης σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP. Αυτό έδειξε ότι επιπλέον μηχανισμοί που ενισχύουν DHT-διεγερμένα AR διενεργοποίησης είναι παρούσες στα κύτταρα C4-2B.

(Α). Τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με psPSA-

Luc

και pRL-ΤΚ (εσωτερικός έλεγχος). Η επίδραση του 24 ώρες διέγερση είτε με 1 ηΜ ή 10 ηΜ DHT επί φορές αλλαγές στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης (πυγολαμπίδα /renilla RLU) εμφανίζονται (n = 3). DHT που προκαλείται AR μετενεργοποίησης είναι σημαντικά (***? Ρ & lt? 0.001) υψηλότερο σε κύτταρα C4-2B σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP. (ΣΙ). DHT που προκαλείται AR πυρηνικού εντοπισμού στα κύτταρα LNCaP και C4-2B. Μετά από 24 ώρες της DHT (0, 1 και 10 ηΜ) διέγερση (n = 4) Δυτική ανοσοστυπώματα δείχνουν μεταβολές στον AR πυρηνική επίπεδα. Και τα δύο κύτταρα C4-2B και LNCaP έδειξε παρόμοια επίπεδα πυρηνικής AR παρακάτω DHT-διέγερση. (ΝΤΟ). p65-Nrf1 και τα επίπεδα Nrf2 παρακάτω DHT διέγερση. Western ανοσοαποτυπώματα που δείχνει πυρηνική επίπεδα ρ65-Nrf1 και Nrf2 μετά από 24 ώρες διέγερσης DHT (n = 3). Οι διαφορές στον τομέα της πυρηνικής p65-Nrf1 και Nrf2 παρατηρήθηκαν σε κύτταρα LNCaP και C4-2B. Διπλώστε αλλαγές και οι τιμές ± SEM αντιπροσωπεύουν σχετικές διαφορές στην έκφραση του AR, p65-Nrf1, και Nrf2. Σε δύο (Β) και (Γ), τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα ΤΒΡ σε κάθε δείγμα.

Η

DHT κανονισμού Mediated της p65-Nrf1 και Nrf2 Nuclear Localization

Πρέπει πρώτα καθοριστεί αν θεραπεία DHT αλλάζει Nrf1 και Nrf2 πυρηνικό εντοπισμό (Εικ. 1 C). Πυρηνική επίπεδα του p65-Nrf1 επηρεάστηκαν διαφορετικά στα κύτταρα LNCaP και C4-2B. Σε C4-2B κύτταρα, DHT διέγερση αυξημένη πυρηνική επίπεδα p65-Nrf1, ενώ στα κύτταρα LNCaP DHT-διέγερση δεν άλλαξε σημαντικά πυρηνικά επίπεδα p65-Nrf1. Ωστόσο, Nrf2 πυρηνικού εντοπισμού δεν τροποποιήθηκε σημαντικά με θεραπεία DHT είτε LNCaP ή C4-2B κύτταρα (Σχ. 1 C). Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την ικανότητα της p65-Nrf1 και Nrf2 για τη ρύθμιση AR μετενεργοποίηση και στις δύο κυτταρικές σειρές του προστάτη.

Ρύθμιση του p65-Nrf1 Έκφραση μεταβλήθηκε σημαντικά σε DHT που προκαλείται AR Μετενεργοποίησης

Εμείς εξέτασε κατά πόσον έκτοπη αλλαγές στα επίπεδα Nrf1 μπορούν να επηρεάσουν AR μετενεργοποίηση σε DHT-διεγερμένα LNCaP και C4-2B κύτταρα (Εικ. 2). Δεδομένου ότι η πυρηνική p65-Nrf1 είναι μόνιμα υψηλότερη σε κύτταρα C4-2B από ό, τι στα κύτταρα LNCaP [36], που χρησιμοποιείται siRNA να φιμώσουν τα ενδογενή επίπεδα Nrf1 στα κύτταρα C4-2B (Σχήμα 2Α & amp?. 2Β) και V5-His οδηγείται p65- Nrf1 φορέα έκφρασης (p65Nrf1-V5-His) για να υπερεκφράζουν p65-Nrf1 σε κύτταρα LNCaP (Σχ 2C & amp?. 2D). Τα επίπεδα των πυρηνικών Nrf1 σε siRNA επιμολυσμένα κύτταρα C4-2B και τα επίπεδα των πρωτεϊνών σύντηξης V5 σε Nrf1 υπερεκφράζεται LNCaP κύτταρα φαίνεται στα σχήματα 2Β και 2D, αντίστοιχα. Σε C4-2B κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με την psPSA-

luc

φορέα, και είτε με Nrf1 siRNA ή NC1 ελέγχου siRNA, δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι η καταστολή Nrf1 σημαντικά (ρ & lt? 0.001) μειώνει AR διενεργοποίηση (Σχήμα 2Α).. Σε κύτταρα LNCaP, προσδιορισμοί λουσιφεράσης έδειξε επίσης ότι ρ65-Nrf1 υπερέκφραση ενισχύει δραστικότητα AR DHT-διεγείρεται από περίπου 2-φορές σε 1 ηΜ DHT και κατά περίπου 4,4 φορές στα 10 ηΜ DHT (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 2C).. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η p65-Nrf1 ενισχύει AR μετενεργοποίησης AR τρανσενεργοποίηση και στις δύο κυτταρικές σειρές του προστάτη.

(Α) Επίδραση της Nrf1 νοκ ντάουν για AR διενεργοποίησης σε κύτταρα C4-2B DHT-τονωθεί. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το psPSA-Luc φορέα και είτε με το Nrf1 siRNA ή ελέγχουν siRNA (NC1). Πτυχές αλλαγές στην ενεργότητα λουσιφεράσης (πυγολαμπίδα /renilla RLU) μετά Nrf1 knockdown εμφανίζονται (n = 3? Ρ & lt? 0,01). (Β) p65-Nrf1 επιπέδων πυρηνικής πρωτεΐνης μετά siRNA μεσολαβεί knockdown σε κύτταρα C4-2B (n = 2). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα ΤΒΡ. (C) Επίδραση της p65-Nrf1 υπερέκφραση σε DHT που προκαλείται AR διενεργοποίησης σε κύτταρα LNCaP. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με το psPSA-Luc φορέα και είτε με τον φορέα ελέγχου (pcDNA3.1) ή του φορέα έκφρασης ρ65-Nrf1 (p65-Nrf1-V5-His). Φορές αλλαγή της λουσιφεράσης δραστηριότητα εξής Nrf1 υπερέκφραση εμφανίζονται (n = 3? Ρ & lt? 0.001). (Δ) Οι αλλαγές στην πρωτεΐνη πυρηνικής V5 (tag) σε pcDNA3.1 (έλεγχος) ή ρ65-Nrf1-V5-His επιμολυσμένα LNCaP κύτταρα (n = 2). Διπλώστε τις αλλαγές αντιπροσωπεύουν σχετική (/TBP V5) διαφορές στην Nrf1.

Η

Σε παράλληλες μελέτες, έχουμε επίσης μέτρησαν την έκφραση δύο AR ρυθμίζονται τα γονίδια, PSA και TMPRSS2 σε κύτταρα επιμολυσμένα με την έκφραση p65-Nrf1 φορέας (Εικ. S1-Α & amp? S1-Β). Τα δεδομένα μας qRT-PCR με σαφήνεια έδειξε ότι το p65-Nrf1 σημαντικά (p & lt? 0.01) αυξάνει τα επίπεδα τόσο ΤΜΡΡδδ2 και PSA mRNA σε κύτταρα LNCaP DHT-θεραπεία. Αυτό χρησίμευσε ως επιβεβαιωτικά στοιχεία ότι p65-Nrf1 είναι μια πιθανή AR συνενεργοποιητή.

Nrf2 Αρνητικά Ρυθμίζει AR Μετενεργοποίησης

Οι επιπτώσεις της Nrf2 υπερέκφραση σε AR μετενεργοποίηση ελέγχθηκαν τόσο σε LNCaP και C4-2B κύτταρα (Σχ. 3). Nrf2 υπερέκφραση καταστέλλεται σημαντικά τη δραστικότητα AR DHT-τονωθεί. (Εικ. 3Α) σε LNCaP κύτταρα, Nrf2 υπερέκφραση καταστέλλεται AR διενεργοποίηση στο πλαίσιο τόσο της βασικής (50%? P & lt? 0.001) και οι συνθήκες DHT-διεγείρονται (60%? P & lt? 0,0001). Nrf2 υπερέκφραση μείωσε επίσης DHT που προκαλείται από τα επίπεδα AR μετενεργοποίησης σε κύτταρα C4-2B (Σχήμα 3Β). Κατά περίπου 33% στο 1 ηΜ DHT και κατά 40% στα 10 ηΜ DHT (ρ & lt? 0,05). έκφραση Πυρηνική Nrf2 σε επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP και C4-2B δείχνονται πάνω από κάθε συνθήκες θεραπείας.

Οι επιδράσεις της υπερέκφρασης Nrf2 στη δραστικότητα AR DHT-διεγερμένα παρακολουθήθηκαν σε αμφότερα LNCaP (Α) και C4-2B (Β) κύτταρα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με το psPSA-luc πλασμίδιο ανταποκριτή, και είτε με το φορέα έκφρασης Nrf2 (pCMV-Nrf2) ή του φορέα ελέγχου (pcDNA3.1) και διεγέρθηκαν με DHT (0-10 ηΜ) επί 24 ώρες (η = 5) . Οι σημαντικές διαφορές στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης (πυγολαμπίδα /renilla RLU) από τους ελέγχους εκπροσωπήθηκαν ως *? p & lt? 0,05, ***? p & lt? 0.001 και ****? p & lt? 0,0001. Σε αμφότερα τα (Α) και (Β), πάνελ πάνω από τις ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν μεταβολές στην πυρηνική επίπεδα Nrf2 μετά από επιμόλυνση με pCMV-Nrf2. Στο (C) και (D), τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης Nrf2 για την πυρηνική επίπεδα AR τόσο μη επεξεργασμένα και DHT (0, 1, 10 ηΜ) κατεργάζεται LNCaP (C) και C4-2B (D) κύτταρα δεικνύονται. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν στην πυρηνική επίπεδα ΤΒΡ. Διπλώστε αλλαγές και οι τιμές ± SEM αντιπροσωπεύουν διαφορές στην πυρηνική AR επίπεδα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Στη συνέχεια, η επίδραση της υπερέκφρασης Nrf2 επί των επιπέδων πυρηνικής AR μετρήθηκαν στα δύο κύτταρα LNCaP (Εικ. 3C) και C4-2B κύτταρα (Σχ. 3D). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε κύτταρα LNCaP DHT-θεραπεία, Nrf2 υπερέκφραση μειωμένη AR πυρηνικού εντοπισμού κατά σχεδόν 79%. Ωστόσο, Nrf2 υπερέκφραση δεν μετέβαλλε σημαντικά τα επίπεδα πυρηνικής AR σε κύτταρα C4-2B DHT-θεραπεία. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι Nrf2 μπορεί να είναι ένας ισχυρός αρνητικός ρυθμιστής της DHT που προκαλείται AR μετενεργοποίηση στις δύο κυτταρικές σειρές PCa. Ωστόσο, σε κύτταρα LNCaP, αλλά όχι σε κύτταρα C4-2B, αυτή η κατασταλτική δράση μπορεί να προκαλείται μέσω καταστολής του AR πυρηνικού εντοπισμού.

Αλλαγές στην Nrf1 και Nrf2 δεν μεταβάλλουν AR Gene Expression ή AR πυρηνικού εντοπισμού

επόμενο αξιολογηθεί κατά πόσον οι τροποποιήσεις στο Nrf1 και Nrf2 υπερέκφραση επηρεάζουν AR γονιδιακής έκφρασης και AR πυρηνικού εντοπισμού (Εικ. S2). Μελέτες qRT-PCR έδειξε ότι ούτε η υπερέκφραση p65-Nrf1 σε κύτταρα LNCaP (Εικ. S2-Α), ούτε p65-Nrf1 knockdown σε κύτταρα C4-2B (Εικ. S2-Β) μεταβάλλονται τα επίπεδα AR mRNA, είτε υπό τη βασική ή διεγειρόμενη DHT συνθήκες. μελέτες Western ανοσοανίχνευση έδειξαν ότι DHT που προκαλείται από πυρηνικό εντοπισμό του AR ήταν ανεπηρέαστη από οποιοδήποτε p65-Nrf1 υπερέκφραση (Εικ. S2-C) ή Nrf1 knockdown (Εικ. S2-D). Ομοίως, Nrf2 υπερέκφραση σε DHT επεξεργασμένου LNCaP και C4-2B κύτταρα δεν επηρέασε σημαντικά την έκφραση του γονιδίου AR (Σχ S2-Ε & amp?. S2-F). Έτσι, Nrf1 δεν τροποποιεί AR διενεργοποίησης μέσω της ρύθμισης των γονιδίων είτε AR έκφραση ή AR πυρηνικού εντοπισμού. Επιπλέον, οι κατασταλτικές δράσεις της Nrf2 δεν οφείλονται σε αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων AR.

αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μεταξύ Πυρηνική Nrf1 και AR συμβεί και στα δύο LNCaP και C4-2B κύτταρα

Για να προσδιοριστεί εάν οι πρωτεΐνες Nrf1 (p65- και p120-) ρυθμίζουν τη λειτουργία AR μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με πρωτεΐνη πυρηνικής AR, πραγματοποιήσαμε ανοσοκαταβυθίσεις AR (IP) από πυρηνικά εκχυλίσματα των μη επεξεργασμένων και DHT-επεξεργασμένα κύτταρα LNCaP και C4-2B (Σχ. 4Α). Οι πρωτεΐνες IP στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν (IB) είτε p65-Nrf1 ή ρ120-Nrf1. Οι μελέτες Co-IP /ΙΒ έδειξαν ότι τόσο η p65-Nrf1 και ρ120-Nrf1 συνεργάτης με πρωτεΐνη πυρηνικής AR τόσο LNCaP και C4-2B κύτταρα. Ωστόσο, η πυρηνική AR αλληλεπιδράσει με p65-Nrf1 σε πολύ υψηλότερο επίπεδο από αυτό που παρατηρήθηκε με p120-Nrf1.