Αφηρημένο

εικοσιπεντανοϊκό οξύ (EPA) και το δοκοσαεξανοϊκό οξύ (DHA) είναι η κύρια n-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA) στο ιχθυέλαιο που μειώνουν τον κίνδυνο του καρκίνου του προστάτη. Tumor-σχετίζεται μακροφάγα (ΤΑΜ) είναι οι κύριοι λευκοκύτταρα του εντός του όγκου διήθηση, και αυξημένη ΤΑΜ συσχετίζεται με κακή πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, ο μηχανισμός της η-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα σε εξέλιξη του κυτταρικού καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από ΤΑΜ δεν είναι καλά κατανοητός. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τα αποτελέσματα των EPA και DHA για τη διαμόρφωση της μετανάστευσης και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων του προστάτη που προκαλείται από ΤΑΜ-όπως μακροφάγων M2 τύπου. PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα προκατεργάστηκαν με EPA, DHA, ή το υπεροξεισωμάτων υποδοχέα που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (ΡΡΑΚ) -γ ανταγωνιστής, GW9662, πριν από την έκθεση σε ρυθμισμένο μέσο (CM). CM προήλθε από Μ2-πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1. Τα μεταναστευτικά και επεμβατική ικανότητες του PC-3 κύτταρα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα συγκαλλιέργεια των μακροφάγων Μ2-τύπου και PC-3 κύτταρα. χορήγηση EPA /DHA μειωμένη μετανάστευση και εισβολή του PC-3 κύτταρα. Η δραστικότητα δέσμευσης του DNA-PPAR-γ και κυτοσολικές ανασταλτικό παράγοντα κBα (ΙκΒα) έκφραση της πρωτεΐνης αυξήθηκε ενώ το πυρηνικό παράγοντα (NF) δραστηριότητα -κB ρ65 μεταγραφικής και επίπεδο πρωτεΐνης ρ65 πυρηνικό ΝΡ-κΒ μειώθηκε σε PC-3 κύτταρα επωάζονται με CM στην παρουσία EPA /DHA. Περαιτέρω, EPA /DHA μειωτικά εκφράσεις mRNA της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9, της κυκλοοξυγενάσης-2, αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα, και μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών. Προεπεξεργασία με GW9662 κατάργησε τις ευνοϊκές επιδράσεις της EPA /DHA στο PC-3 κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η χορήγηση ΕΡΑ /DHA μειώνεται μετανάστευση, εισβολή και μακροφάγων χημειοταξία PC-3 κυττάρων που επάγεται από ΤΑΜ-όπως μακροφάγων M2 τύπου, η οποία μπορεί εν μέρει να εξηγηθεί από την ενεργοποίηση του PPAR-γ και μειωμένη ΝΡ-κΒ ρ65 μεταγραφική δραστικότητα.

Παράθεση: Li CC, Χου YC, Yeh CL, Yeh SL (2014) Επιδράσεις των εικοσιπεντανοϊκό οξύ και δοκοσαεξανοϊκό οξύ για τον καρκίνο του προστάτη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή Induced από σχετίζονται με τον όγκο μακροφάγα. PLoS ONE 9 (6): e99630. doi: 10.1371 /journal.pone.0099630

Επιμέλεια: Rolf Müller, Πανεπιστήμιο Philipps, Γερμανία

Ελήφθη: 27 Δεκέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 17η Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση του Εθνικού Συμβουλίου Επιστήμης NSC 100-2320-B-038-009 Ταϊπέι, Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι ο πιο κοινός καρκίνος διαγνωστεί μεταξύ των ανδρών στις αναπτυγμένες χώρες και είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Παρά τις βελτιώσεις σε διάφορες θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά τα τελευταία έτη, η θεραπεία για ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη εξακολουθεί να στερείται αποτελεσματικότητας. Η συμπαγής όγκος αποτελείται από νεοπλασματικά κύτταρα και τα στρωματικά συστατικά συμπεριλαμβανομένου ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, και των μεταναστευτικών αιμοποιητικά κύτταρα. Τα μακροφάγα είναι τα πιο άφθονα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος στο μικροπεριβάλλον του όγκου, ούτως ονομάζονται μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) [2], [3]. ΤΑΜ είναι κυρίως μακροφάγα Μ2 τύπου επειδή εκφράζουν μια σειρά δεικτών επιφάνειας όπως CD36 και CD163 [4]. Επίσης, ΤΑΜ δείχθηκε ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων, και υψηλότερες ΤΑΜ διείσδυση συχνά συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε πολλούς όγκους, όπως ο καρκίνος του προστάτη. Μια κλινική μελέτη που πραγματοποιήθηκε από Lissbrant et al. [5] που βρέθηκαν θετικές συσχετίσεις της πυκνότητας του ΤΑΜ με πολλαπλασιασμό του όγκου του προστάτη των κυττάρων και μικροαγγειακή πυκνότητα. Επιπλέον, μπορεί να διευκολύνει την ΤΑΜ μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή εκκρίνοντας παράγοντες, όπως αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες, χημειοτακτικοί παράγοντες, και μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) [6] – [9].

υπεροξεισωμάτων υποδοχείς που ενεργοποιούνται από πολλαπλασιαστή ( PPARs) είναι πυρηνικούς υποδοχείς και συνδετήρα-ενεργοποιημένων παραγόντων μεταγραφής στο υπεροικογένειας στεροειδούς. Η οικογένεια PPAR αποτελείται από τρεις διαφορετικούς υποτύπους: ΡΡΑΚ-α, ΡΡΑΚ-β /δ, και PPAR-γ. Μπορούν ετεροδιμερίζονται με τον υποδοχέα ρετινοειδούς Χ (RXR) και ρυθμίζουν γονιδίου στόχου εκφράσεις με σύνδεση προς στοιχεία απόκρισης υπεροξυσώματος πολλαπλασιαστή (PPREs) που βρίσκεται στην περιοχή του υποκινητή [10]. PPAR-γ εκφράζεται κυρίως σε λιπώδεις ιστούς και παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού της γλυκόζης και των λιπιδίων και της διαφοροποίησης των λιποκυττάρων [11]. Έχει αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση του PPAR-γ μπορούν να διαμορφώσουν φλεγμονώδεις αποκρίσεις και αναστέλλουν την ανάπτυξη και την εξέλιξη της ένα ευρύ φάσμα των ανθρώπινων καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από, συμπεριλαμβανομένων προστάτη, του μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου [12] – [14]. Επιπλέον, η επαγωγή της έκφρασης PPAR-γ συσχετίστηκε με την αναστολή του πυρηνικού παράγοντα (NF) -κB δραστηριότητα και μειωμένη έκφραση αγγειογόνων πρωτεϊνών σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα κύτταρο. Τα εν λόγω ευρήματα υποδεικνύουν ότι η απενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ μπορεί να εμπλέκεται σε μία ΡΡΑΚ-γ-εξαρτώμενο μονοπάτι [15].

εικοσιπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ) και δοκοσαεξαενοϊκό οξύ (DHA) είναι οι δύο πιο κοινά μακράς αλύσου Ν- 3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (PUFA) στο ιχθυέλαιο. Επιδημιολογικά δεδομένα έδειξαν ότι η κατανάλωση ψαριών είναι αντιστρόφως συνδέονται με τη συχνότητα εμφάνισης και θνησιμότητας από καρκίνο του προστάτη, ιδίως μεταστατικού καρκίνου [16] – [18]. Ορός επίπεδα EPA και DHA σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ήταν χαμηλότερα από αυτά των ασθενών με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη [19]. Αυξανόμενες ενδείξεις απέδειξε ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα ασκούν αντικαρκινικές ιδιότητες. Ωστόσο, έχει δοθεί ελάχιστη προσοχή στη σχέση μεταξύ ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και την εξέλιξη του κυτταρικού καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από ΤΑΜ. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι το ΕΡΑ αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη καρκίνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου ΗΤ-29, και αυτό το αποτέλεσμα ήταν το αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του PPAR-γ [12]. Περαιτέρω, η-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα δείχθηκε ότι επάγουν απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του PPAR-γ σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [20]. Από το n-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα έχει αποδειχθεί ότι συνδέονται αποτελεσματικά με την περιοχή σύνδεσης προσδέματος του PPAR-γ και ενεργοποιούν προσδιορισμούς των στοιχείων αναφοράς απόκρισης PPAR σε διάφορες κυτταρικές γραμμές [12], [21], υποθέσαμε ότι το ΕΡΑ και χορήγηση DHA καταστέλλουν το προοδευτική ιδιότητες του καρκίνου του προστάτη μέσω ενεργοποίησης του PPAR-γ εμπλέκονται οδό. Έτσι, χρησιμοποιείται PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με ρυθμισμένο μέσο (CM) από τα μακροφάγα M2 τύπου ή σε ένα σύστημα χωρίς επαφή για τον προσδιορισμό των επιδράσεων και των πιθανών μηχανισμών της ΕΡΑ και DHA για τη μετανάστευση του καρκίνου του προστάτη κυττάρων και εισβολή που προκαλείται από ΤΑΜ.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

προστάτη PC-3 καρκινικά κύτταρα και ανθρώπινα κύτταρα μονοκυτταρικής ΤΗΡ-1 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, ΗΠΑ). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (10 ng /mL πενικιλλίνη και 10 U /mL στρεπτομυκίνη), και 2.5 mM γλουταμίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 θερμοκοιτίδα.

Παρασκευή αλβουμίνης ορού λιπαρού οξέος των βοοειδών (BSA) σύμπλοκα

EPA, DHA, και BSA αγοράστηκαν από την Sigma ( St. Louis, ΜΟ, USA). σύμπλοκα οξύ-BSA λιπαρά παρασκευάστηκαν ως αποθέματα 10 mmol /L με μία αναλογία λιπαρών οξέων προς BSA από 4:01 και διαλυτοποιήθηκαν με συσκευή υπερήχων σε ένα λουτρό ψυχρού νερού για 60 λεπτά. αποθέματα λιπαρό οξύ BSA φυλάχθηκαν στους -20 ° C υπό αργό μέχρι να είναι έτοιμο για χρήση [22].

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των PC-3 κυττάρων προσδιορίστηκε με Alamar blue δοκιμασίας (Invitrogen). PC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (1000 κύτταρα /φρεάτιο) όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές δόσεις του ΕΡΑ ή DHA (0~400 μΜ). BSA όχημα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (C). Μετά από 20 ώρες αγωγής, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο που περιέχει 10% Alamar blue χρωστικής εις 37 ° C επί 4 ώρες, και η χρωματομετρική μεταβολή μετρήθηκε με έναν αναγνώστη μικροπλακών στα 570 και 600 nm.

παρασκευάσματα CM και θεραπείες

μακροφάγων διαφοροποίηση διεξήχθη σύμφωνα με προηγουμένως καθιερωμένα πρωτόκολλα [23]. ΤΗΡ-1 κύτταρα (5 × 10

6) σπάρθηκαν σε 75-cm

2 φιάλες καλλιέργειας ιστού και καλλιεργήθηκαν με 320 ηΜ φορβόλη 12-μυριστικό 13-οξικό άλας (ΡΜΑ? Sigma) για 4 ώρες. Για τη διαφοροποίηση των μακροφάγων Μ2 τύπου, κύτταρα ΤΗΡ-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 320 ηΜ ΡΜΑ, 20 ng /mL ιντερλευκίνη (IL) -4 και 20 ng /ml IL-13 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) για ένα άλλο 20 h. Για τη δημιουργία των μακροφάγων Μ1-τύπου, κύτταρα ΤΗΡ-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 320 ηΜ ΡΜΑ επί 4 ώρες, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 320 ηΜ ΡΜΑ, 20 ng /mL ιντερφερόνη (IFN) -γ (PeproTech), και 100 ng /mL λιποπολυσακχαρίτη ( LPS) από

Escherichia coli

ορότυπος 0111: Β4 (Sigma) για 20 ώρες. Μετά από διέγερση, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) δύο φορές και καλλιεργήθηκαν με φρέσκο ​​μέσο για 24 ώρες, και στη συνέχεια CM συλλέχτηκε.

PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα σπάρθηκαν σε 5 × 10

5 σε 6 φρεατίων 1 ημέρα πριν από την θεραπεία. Για τη θεραπεία κύτταρα, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μέσο που περιέχει διαφορετικές συγκεντρώσεις του ΕΡΑ, DHA (0, 25, και 50 μΜ) ή 10 μΜ GW9662 για 24 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CM που περιέχει την ίδια συγκέντρωση των λιπαρών οξέων για άλλες 24 h. κύτταρα PC-3 συλλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

δοκιμασίες

Μετανάστευση και την εισβολή

Τα μεταναστευτικά και επεμβατικές δυνατότητες του PC-3 κύτταρα (2 × 10

4 για τη δοκιμασία της μετανάστευσης και 10

5 κυττάρων για τη δοκιμασία εισβολής) έχουν αντίστοιχα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας πλάκες 24 φρεατίων με ένθετα Millicell Culture Plate (8-μm μέγεθος πόρου? Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) για 12 ώρες και επικαλυμμένα με Matrigel (BD Biosciences, Bedford , MA, USA) ένθετα για 24 ώρες. Εν συντομία, PC-3 κύτταρα προστέθηκαν στα ανώτερα διαμερίσματα σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, και ΤΗΡ-1 κύτταρα (10

5) διαφοροποιήθηκαν σε μακροφάγους Μ2 τύπου στα κάτω θαλάμους. Αφού τα κύτταρα PC-3 είχε προσαρτημένη, μέσο από την άνω και κάτω θάλαμος αντικαταστάθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις του ΕΡΑ, DHA, ή GW9662 (10 μΜ) χωρίς ορό RPMI 1640 που περιέχει. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επί της άνω ένθετο επιφάνεια της μεμβράνης αφαιρέθηκαν με μπατονέτες μετά την επώαση. Μετά τη σταθεροποίηση με παραφορμαλδεΰδη 4%, μεταναστεύουν και επεμβατικές κύτταρα βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες σε 2% μεθανόλη. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, και η χρωστική εκλούεται με 30% οξικό οξύ. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 595 nm με αναγνώστη μικροπλάκας. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα για κάθε ανάλυση.

δραστηριότητες δέσμευσης DNA του PPAR-γ και NF-κΒ ρ65

πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το NE-PER Κυτταροπλασματικά και Πυρηνικής κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δραστικότητα δέσμευσης του DNA του PPAR-γ προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) -με βάση Trans-ΑΜ Transcription Factor Assay Kit PPAR-γ (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Ένα ολιγονουκλεοτίδιο που περιείχε μία περοξυσώματος στοιχείο απόκρισης του πολλαπλασιαστή (PPRE) (5′-AACTAGGTCAAAGGTCA-3 ‘) επικαλύφθηκε πάνω φρεάτια των ταινιών μικροτιτλοδότησης παρέχονται. PPAR περιέχεται στο πυρηνικό εκχύλισμα δεσμεύεται ειδικά με το PPRE. Το πρωτογενές αντίσωμα PPAR-γ αναγνωρίζει έναν επίτοπο επί προσδιορίσιμος τον ΡΡΑΚ-γ πρωτεΐνη κατά τη δέσμευση του DNA και στη συνέχεια προστέθηκε ένα δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP). Η απορρόφηση διαβάστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο στα 450 nm.

Για να ποσοτικοποιηθεί η δραστικότητα δέσμευσης DNA του ΝΡ-κΒ ρ65, 5 μg του πυρηνικού εκχυλίσματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ELISA που βασίζεται Trans-ΑΜ Μεταγραφή Factor Δοκιμασία ΝΡ -κB Kit p65 (Active Motif). Τα φρεάτια των κιτ ELISA ακινητοποιήθηκαν με ένα ολιγονουκλεοτίδιο που περιείχε την ρ65 συναινετική θέση ΝΡ-κΒ (5′-GGGACTTTCC-3 ‘). Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, 10 μg του πυρηνικού εκχυλίσματος προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και στη συνέχεια επωάζεται με ένα ειδικό πρωτεύον αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του ΝΡ-κΒ που αναγνωρίζει έναν επίτοπο σε ρ65 που είναι προσβάσιμη μόνο όταν ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται και δεσμευμένο στο DNA στόχο αυτού. Μετά από επώαση με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα, η χρωματομετρική αντίδραση προσδιορίσθηκε ποσοτικά με τη χρήση φασματοφωτομετρίας στα 450 nm.

εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση Western blot

Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και αποξέστηκαν σε ρυθμιστικού λύσης (50 mM Tris σε ρΗ 7,4, 1% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), 1% Nonidet Ρ-40, 0.5% Na-δεοξυχολικό, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, και 50 mM NaF) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης ( Πλήρης, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) για την παρασκευή προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου. Για τη συλλογή των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τη χρήση της ΝΕ-PER Κυτταροπλασματικά και κιτ εκχύλισης πυρηνική πρωτεΐνη (Pierce Biotechnology) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης του υπερκειμένου προσδιορίστηκαν με ένα κιτ πρωτεΐνης Bradford Assay Reagent (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Οι πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε 4% -12% ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE), και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου σε μία συσκευή υγρής μεταφοράς. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε TBS-Tween (ΤΒδ-Τ) για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάζεται με ένα ειδικό πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με ΤΒδ-Τ και επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα για 1 ώρα, και κηλίδες αναπτύχθηκαν με ενισχυμένη αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, ΜΑ, USA) και εκτίθεται σε φιλμ ακτίνων-Χ. Σχετικές εντάσεις μετρήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus λογισμικό (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Όλα τα στυπώματα ποσοτικοποιήθηκαν και εξομαλύνθηκαν σε έναν εσωτερικό έλεγχο για τη ρύθμιση για το ποσό των πρωτεϊνών που έχει τοποθετηθεί.

εκχύλιση RNA και σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) ανάλυση

Το ολικό RNA από κύτταρα εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). Οι συγκεντρώσεις του RNA προσδιορίστηκαν και ποσοτικά με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 και 280 nm σε φασματοφωτόμετρο. Συμπληρωματικά (γ) DNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA). Ένα πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του ΑΒΙ 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) με Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Foster City, CA, USA) για τον προσδιορισμό κάθε mRNA έκφραση. Εναρκτήρες για CD36, CD163, PPAR-γ, ΜΜΡ-9, αναστολέας ιστού μεταλλοπρωτεϊνάσης (ΤΙΜΡ) -1, VEGF, κυκλοοξυγενάσης (COX) -2, μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών (Μ-CSF), και β-ακτίνη αναφέρονται στον πίνακα 1. οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα συνολικό όγκο 25 μΐ που περιείχε 1 χ Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, 400 ηΜ του κάθε εκκινητή και 100 ng του cDNA. Οι συνθήκες των κύκλων είχαν ως εξής: 50 ° C για 2 λεπτά και 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. εκφράσεις mRNA προσδιορίστηκαν ποσοτικά εις διπλούν. Τα δεδομένα υπολογίστηκαν από την εξίσωση 2

-ΔΔCT και παρουσιάζονται ως οι πολλαπλάσιες του αλλαγή στην έκφραση γονιδίου κανονικοποιήθηκε σε β-ακτίνη.

Η

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

επίπεδα του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) -α, IL-1β και IL-6, αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF) -β, χημειοελκτική πρωτεΐνη μονοκυττάρων (MCP) -1, και IL-8 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ELISA (eBioscience San Diego, CA, USA). Οι επιφάνειες των μικροπλακών επικαλύφθηκαν με ένα ανθρώπινο μονοκλωνικό αντίσωμα MCP-1 ή IL-8. Η προσταγλανδίνη συγκεντρώσεις (PG) Ε2 υποβλήθηκαν σε δοκιμασία με ένα ανταγωνιστικό σάντουιτς ELISA kit (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA). Διαδικασίες που ακολουθούνται οδηγίες του κατασκευαστή. Η PGE2 ELISA είχε intraplate συντελεστή μεταβλητότητας (CV) εύρος 5,9% ~10.3% με μέση οριακή δοκιμασία ανίχνευσης του 27,5 pg /mL.

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό GraphPad Prism 5. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από δοκιμασία post-hoc κατά Tukey. Ένα

σ

αξία των & lt?. 0,05 θεωρήθηκε σημαντικά διαφορετικό

Αποτελέσματα

Έκφραση των δεικτών επιφανείας και τα επίπεδα κυτοκινών στο CM από PMA-επεξεργασία ΤΗΡ-1 μακροφάγα

Για να καθοριστεί εάν ΤΑΜ-όπως μακροφάγων Μ2 τύπου παρήχθησαν επιτυχώς, τα κύτταρα ΤΗΡ-1 συν-κατεργασία με ΡΜΑ και κυτοκίνες ΤΗ2 (IL-4 και IL-13). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι, σε σύγκριση με PMA-αγωγή μόνο και Μ1-πολωμένο ΤΗΡ-1 μακροφάγα, μακροφάγα Μ2 τύπου παράγονται σημαντικά υψηλότερες εκφράσεις mRNA του Μ2 δείκτες μακροφάγων CD36 και CD163 (Σχήμα 1). Δεδομένου ότι τα μακροφάγα M2 τύπου παράγουν σχετικά χαμηλότερα επίπεδα του TNF-α, IL-1β και IL-6 και τα υψηλότερα επίπεδα του ΤΟΡ-β σε σύγκριση με μακροφάγα Μ1-τύπου. Τα επίπεδα αυτών των κυτοκινών σε CM μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αξιολογηθεί η πόλωση του ΤΗΡ-1 μακροφάγου. Βρήκαμε ότι CM από τις ομάδες PMA και Μ2 είχαν σημαντικά χαμηλότερες ΤΝΡ-α, IL-1β, και τα επίπεδα IL-6 από την ομάδα Μ1. Επιπλέον, το CM από τις ομάδες Μ2 είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του ΤΟΡ-β από ότι στις ομάδες ΡΜΑ και M1 (Σχήμα 2).

έκφραση mRNA αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. Πολλαπλάσια των αλλαγών του mRNA ποσοτικοποιούνται με τη μέθοδο της συγκριτικής CT. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD,

n

= 6. Μέσα με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05).

Η

CM από ΡΜΑ κατεργασία ΤΗΡ-1 μακροφάγα και Μ2-πολωμένο ΤΗΡ-1 μακροφάγα και τα δύο είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) -α (Α), η ιντερλευκίνη (IL) -1β (Β), και IL-6 (Γ) και ένα υψηλότερο επίπεδο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού (TGF) -β (D) σε σύγκριση με εκείνα του Μ1-πολωμένου μακροφάγων ΤΗΡ-1. TNF-α, IL-1β, IL-6, και ΤΟΡ-β μετρήθηκαν με ELISAs. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD,

n

= 6. Μέσα με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05)

Η

PC-3. καρκίνο του προστάτη κυτταρικής βιωσιμότητας

Οι επιδράσεις του ΕΡΑ και DHA στο PC-3 η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με έναν μπλε δοκιμασία Alamar, και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3. Η βιωσιμότητα των PC-3 κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη κατά ένα 24-h έκθεση σε EPA και DHA σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο πάνω από 150 και 100 μΜ, αντιστοίχως.

PC-3 κύτταρα επωάστηκαν με EPA (Α) και DHA (Β) για 24 ώρες που ακολουθείται από ένα Alamar blue δοκιμασία εκτελέστηκε εις τετραπλούν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD,

n

= 6. * Σημαντικά διαφέρει από τον έλεγχο (

σ

& lt? 0,05)

Η

μεταναστευτικών και επεμβατική. ικανότητες σε PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα Μ2 τύπου

Για να προσδιορισθεί αν EPA και DHA εμπλέκονται σε Μ2 τύπου μακροφάγων που επάγεται κύτταρα καρκίνου προστάτη μετανάστευση και εισβολή, τα κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν με Μ2 -τύπου μακροφάγα σε ανέπαφα συσκευή. Μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητες ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα M2 τύπου. EPA και DHA και τα δύο μείωσαν σημαντικά τα μεταναστευτικά και επεμβατική ικανότητες του PC-3 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα Μ2 τύπου σε μόδες δοσοεξαρτώμενη. Περίπου το 80% της μείωσης των μεταναστευτικών και επεμβατικές κύτταρα αντιστράφηκε με την παρουσία του GW9662, υποστηρίζοντας την ενεργοποίηση του PPAR-γ που εμπλέκονται στην αναστολή των μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητες του PC-3 κύτταρα συν-καλλιεργήθηκαν με μακροφάγα Μ2-τύπου (Σχήμα 4, 5 ).

PC-3 κύτταρα σπάρθηκαν στα ανώτερα θαλάμους και συν-καλλιεργήθηκαν με M2-πολωμένο ΤΗΡ-1 μακροφάγα παρουσία 50 μΜ EPA, DHA, ή GW9662 (10 μΜ) για 24 ώρες. Εισβολή κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Οι μεμβράνες πλύθηκαν και η χρωστική εκλούεται με ένα διάλυμα εκχύλισης ιώδες (50% αιθανόλη, 0,1% οξικό οξύ, και 49,9% DDH

2O). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας μικροτίτλου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD,

n

= 3. Μέσα με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05).

Η

Για την εισβολή προσδιορισμό, κύτταρα PC-3 σπάρθηκαν σε άνω θαλάμους επικαλυμμένα με Matrigel και συν-καλλιεργήθηκαν με M2-πολωμένο ΤΗΡ-1 μακροφάγα παρουσία 50 μΜ EPA, DHA, ή GW9662 (10 μΜ) για 24 ώρες. Εισβολή κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Οι μεμβράνες πλύθηκαν, και η χρωστική εκλούεται με ένα διάλυμα εκχύλισης ιώδες (50% αιθανόλη, 0,1% οξικό οξύ, και 49,9% DDH

2O). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 595 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας μικροτίτλου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD,

n

= 3. Μέσα με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05).

Η

EPA και DHA ρυθμίζεται αυξητικά δέσμευσης DNA δραστικότητα, και η πρωτεΐνη και mRNA έκφραση του PPAR-γ σε PC-3 κύτταρα επωάζονται με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου

EPA και DHA τόσο είναι συνδετήρες του ΡΡΑΚ-γ. Για να καθοριστεί εάν EPA και DHA μειώνεται μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητες των PC-3 κυττάρων μέσω ενεργοποίησης PPAR-γ, αναλύσαμε την δραστικότητα δέσμευσης DNA PPAR-γ, mRNA και πρωτεΐνης εκφράσεις σε κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου . δραστικότητα δέσμευσης DNA PPAR-γ κατεστάλη σε PC-3 κύτταρα επωάζονται με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου. Η θεραπεία με ΕΡΑ και DHA και τα δύο αύξησε σημαντικά τη δραστικότητα δέσμευσης DNA, και του mRNA και της πρωτεΐνης εκφράσεις PPAR-γ σε κύτταρα PC-3 σε σύγκριση με το PC-3 κύτταρα μαζί με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου. GW9662 ενεργοποίηση μερικώς μπλοκαριστεί PPAR-γ σε κύτταρα PC-3 (Σχήμα 6).

Η δραστικότητα PPAR-γ-δέσμευσης αναλύθηκε με ένα παράγοντα μεταγραφής ELISA (Α). PPAR-γ επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western (Β). Ίση φόρτωση πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας β-ακτίνης. έκφραση mRNA του PPAR-γ αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR (C). μεταβολές του mRNA ποσοτικοποιούνται με τη μέθοδο συγκριτικής CT. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD,

n

= 3, και τα μέσα με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05).

Η

EPA και DHA μειωμένη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα PC-3 επωάζονται με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου

ενεργοποίηση PPAR-γ μπορεί να μειώσει την δραστικότητα δέσμευσης DNA του ΝΡ-κΒ ρ65. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 7Α, η δραστικότητα δέσμευσης DNA ρ65 ΝΡ-κΒ ρυθμίζεται αυξητικά σε απουσία EPA /DHA, και μειώθηκε με τη χορήγηση του ΕΡΑ /DHA. Η θεραπεία με ΕΡΑ και DHA μειωθεί τόσο σημαντικά ΝΡ-κΒ έκφραση πυρηνική πρωτεΐνη ρ65 και αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης του κυτοσολίου ΙκΒα με τρόπους δοσοεξαρτώμενη. Η χορήγηση του GW9662 αντιστραφεί σημαντικά την τις ΣΟΕΣ ή DHA μεσολάβηση απενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2-τύπου (Σχήμα 7Β, C).

Ο ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA δραστηριότητα αναλύθηκε με ένα παράγοντα μεταγραφής ELISA (Α). Τα επίπεδα πρωτεΐνης της υπομονάδας ΙκΒα (Β) και NF-κΒ ρ65 (C) προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. Ίση φόρτωση των πρωτεϊνών απεικονίζεται από μπάντες τουμπουλίνης στο κυτοσολικό κλάσμα. έκφραση της ιστόνης Η1 εμφανίζεται ως εσωτερικός έλεγχος σε πυρηνικά εκχυλίσματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD,

n

= 3, και μέσα με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05).

Η

Angiogenic- που σχετίζονται με τις εκφράσεις παράγοντας σε PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με CM από Μ2 τύπου μακροφάγων

ΤΑΜ μπορεί να ενισχύσει την αγγειογενετική δυναμικό των καρκινικών κυττάρων. Αναλύσαμε αγγειογόνους παράγοντες που συνδέονται σε PC-3 κύτταρα επωάζονται με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου. ΤΑΜ επαγωγή του mRNA εκφράσεις ΜΜΡ-9, VEGF, COX-2, και τα υψηλότερα επίπεδα της PGE2 και IL-8 βρέθηκαν σε PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2-τύπου (Σχήμα 8). Αυτές οι αγγειογόνοι παράγοντες που συνδέονται ρυθμίστηκαν προς τα κάτω με την παρουσία ΕΡΑ /DHA. Η θεραπεία με EPA /DHA απορυθμίζεται αποτελεσματικά mRNA έκφραση του ΤΙΜΡ-1. Ρύθμιση των αγγειογενετικών παραγόντων που σχετίζονται με εκφράσεις από την EPA /DHA στο PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου καταργήθηκε από της ταυτόχρονης θεραπείας με GW9662.

εκφράσεις mRNA αναλύθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. μεταβολές του mRNA ποσοτικοποιούνται με τη μέθοδο συγκριτικής CT. Επίπεδα PGE2 και IL-8 αναλύθηκαν με ELISAs. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD,

n

= 6, και τα μέσα με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05).

Η

Η γονιδιακή έκφραση του M-CSF και επίπεδο MCP-1 σε κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου

οι αυξητικοί παράγοντες και χημειοκινών είναι σημαντικές για τη ρύθμιση στρατολόγηση μακροφάγων στις θέσεις του όγκου. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η γονιδιακή έκφραση του M-CSF και τις συγκεντρώσεις της MCP-1 σε κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου είχαν απορυθμίζεται (Σχήμα 9). Γονιδιακή έκφραση του M-CSF και την παραγωγή της MCP-1 μειώθηκαν κατά τη χορήγηση EPA /DHA. Ωστόσο, η θεραπεία με GW9662 ήταν σε θέση να αντιστρέψει την EPA /DHA μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση του M-CSF και MCP-1.

Το επίπεδο MCP-1 αναλύθηκε με ELISA. M-CSF αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. μεταβολές του mRNA ποσοτικοποιούνται με τη μέθοδο συγκριτικής CT. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD,

n

= 6, και τα μέσα με διαφορετικά γράμματα διαφέρουν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη με την επαγωγή απόπτωσης. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τους πιθανούς μηχανισμούς των ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα στη ρύθμιση της PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου. Η μελέτη μας είναι η πρώτη που αναφέρει ότι σε σύγκριση με κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου, η χορήγηση ΕΡΑ /DHA μειώνεται μεταναστευτικών και επεμβατικές ικανότητες μέσω της ενίσχυσης της PPAR-γ δραστικότητα δέσμευσης DNA, προς τα κάτω ρύθμιση ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ, και την καταστολή της έκφρασης του NF-κΒ-στόχευση γονιδίων.

Τα μακροφάγα έχουν πολλαπλούς υποτύπους και μπορεί να πολωθεί με διακριτά ερεθίσματα. μακροφάγων Μ1-τύπου έχουν αντικαρκινικές ιδιότητες και χαρακτηρίζονται από υψηλό επίπεδο παραγωγής του TNF-α, IL-1β και IL-6. μακροφάγα Μ2-τύπου παρουσιάζουν όγκο-προαγωγής ανάπτυξης ιδιότητες και εκφράζουν υψηλότερα ανοσοκατασταλτικές κυτοκίνες, όπως ΤΟΡ-β. Αυτοί οι δείκτες κυτοκίνες χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν Μ1 και Μ2 μακροφάγων τύπου πόλωση. Παρατηρήσαμε ότι ΡΜΑ-, IL-4 και IL-13-κατεργασμένα κύτταρα ΤΗΡ-1 έδειξε Μ2 τύπου επιφανειακούς δείκτες μακροφάγων του CD36 και CD163 και προφίλ μακροφάγων κυτοκίνης Μ2-τύπου (χαμηλότερες συγκεντρώσεις του TNF-α, IL-1β και IL-6, και μια υψηλότερη συγκέντρωση του ΤΟΡ-β). Εντός του μικροπεριβάλλον του όγκου, ΤΑΜ εμφανίζουν κυρίως ένα μακροφάγα Μ2 τύπου λειτουργικό προφίλ, και αυτή η προτιμώμενη πόλωση οφείλεται σε διέγερση από ΤΗ2 κυτοκίνες [24], [25]. ΤΗ2 κυτοκίνες που προέρχονται, IL-4 και IL-13, επάγει M2 πόλωση του ΤΑΜ οδηγούν σε προώθηση και ανάπτυξη [26] του όγκου, [27]. στρατολόγηση και τη διαφοροποίηση των μακροφάγων Μ2 τύπου μακροφάγων ρυθμίζονται από παράγοντες ανάπτυξης όπως ο M-CSF και χημειοκινών συμπεριλαμβανομένων των MCP-1 [28]. Η υπερέκφραση του M-CSF και MCP-1 σε διάφορους τύπους καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, αυξάνει την πρόσληψη μακροφάγων και την εξέλιξη του όγκου, και επιταχύνει το ρυθμό των μεταστάσεων [29] – [32]. M-CSF πρόσδεσης στον υποδοχέα διέγερσης αποικίας παράγοντας-1 μπορεί να διεγείρει την διαφοροποίηση των μακροφάγων και την πρόβλεψη της μετάστασης Caner. Ένα πιο αργό ρυθμό της εξέλιξης του όγκου και αναστολή της μετάστασης βρέθηκαν στον καρκίνο του μαστού μετά γενετική εκτομή του M-CSF [33]. Επίσης, η μείωση του ρυθμού αύξησης και μακροφάγων στρατολόγηση βρέθηκαν σε κύτταρα PC-3 μετά την εξουδετέρωση MCP-1 αντίσωμα [30]. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι EPA /DHA μπορεί να μειώσει την ικανότητα της πρόσληψης μακροφάγων σε κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν με CM από τα μακροφάγα Μ2 τύπου με προς τα κάτω ρύθμιση M-CSF και MCP-1.

Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι M2-πολωμένο μακροφάγων ΤΗΡ-1 μπορεί να διεγείρει την εισβολή και την αγγειογένεση των κυττάρων ανθρώπινου καρκινώματος βασικών [23]. Βρήκαμε επίσης ότι η TAM-όπως μακροφάγων M2 τύπου αυξημένα τη μετανάστευση και την εισβολή του PC-3 καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Επιπλέον, η χορήγηση του ΕΡΑ /DHA κατέστειλε τις μεταναστευτικές και επεμβατική ιδιότητες των PC-3 κυττάρων που επάγεται από ΤΑΜ-όπως μακροφάγων Μ2-τύπου, ενώ περίπου 80% αυτού του αποτελέσματος έχει αποκλειστεί από την ταυτόχρονη αγωγή με GW9662, ένα PPAR-γ-ειδικό ανταγωνιστής. Τα στοιχεία δείχνουν ότι το ενδογενές συνδεσμικό PPAR-γ, 15-δεοξυ-Δ

12,14-προσταγλανδίνη J

2 (15d-PGJ

2) κατέστειλαν πολλαπλασιασμό και τη σηματοδότηση των ανδρογόνων από τα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη [34] , [35]. Επίσης, η θεραπεία με 15d-PGJ

2 και το συνθετικό συνδετήρα, πιογλιταζόνη, αναφέρθηκε ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και εισβολή ικανότητα των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου [36]. PPAR-γ εκφράζεται στον ανθρώπινο επιθήλιο προστάτη. Αν και καρκινώματα του προστάτη βρέθηκε να υπερεκφράζουν PPAR-γ [13], η ενεργοποίηση του PPAR-γ αποδείχθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και την πρόοδο του καρκίνου [37].

Η μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ είναι κυρίως διαμορφώνεται από φωσφορυλίωση και πυρηνική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ ρ65 [38] – [40]. Ανώμαλη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ ταυτοποιήθηκε σε καρκινικά κύτταρα, τα οποία προωθούνται εισβολή και τη μετανάστευση μέσω της αύξησης εκφράσεις των MMPs και αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF) στον καρκίνο του προστάτη PC-3 κύτταρα [41]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι PPAR-γ ανταγωνίζεται με ΝΡ-κΒ να δεσμεύει συν-ενεργοποιητών του υποδοχέα στεροειδών συν-ενεργοποιητή (SRC) -1 ή cAMP-απόκρισης στοιχείων σύνδεσης (CREB) πρωτεΐνη η οποία αναστέλλει ΝΡ-κΒ-διαμεσολαβούμενη γονιδιακή έκφραση [ ,,,0],42]. Επίσης, η ενεργοποίηση του PPAR-γ μπορούν να επάγουν την σύνθεση του ΙκΒα, η οποία συνδέεται άμεσα με ρ65 που περιέχει ΝΡ-κΒ διμερή στο κυτταρόπλασμα και αναστέλλει την πυρηνική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ [43], [44]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι το ΕΡΑ και DHA αυξήθηκαν κυτοσολικά έκφραση ΙκΒα σε PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε CM. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι EPA και DHA ρυθμίζουν τα μεταναστευτικά και επεμβατική ιδιότητες των PC-3 κυττάρων που επάγεται από τα μακροφάγα Μ2 τύπου εν μέρει με την ενίσχυση της δραστικότητας δέσμευσης DNA PPAR-γ και μείωση της μεταγραφικής δραστηριότητας του ΝΡ-κΒ ρ65. Πρόσφατα, η-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν αναφερθεί να ενεργοποιούν πρωτεΐνη G-συζευγμένο υποδοχέα (GPR) 120 και αναστέλλουν τη δραστικότητα του ΝΡ-κΒ που μπορεί, κατά συνέπεια, εξασθενούν την έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών και να ρυθμίζουν τη φλεγμονή του λιπώδους ιστού [45]. Εμείς δεν θεώρησε την ανασταλτική δράση του NF-kB με η-3 PUFA μέσω GPR120 επειδή η ευεργετική επίδραση της η-3 PUFA ήταν σχεδόν καταργήθηκε με την ταυτόχρονη αγωγή με GW9662. Αν και η αλληλεπίδραση μεταξύ των n-3PUFA και GPR120 δεν μπορεί να αποκλειστεί, η μελέτη μας μπορεί να αποδείξει, τουλάχιστον, ότι η ενεργοποίηση του PPAR-γ είναι ένας από τους μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για τη μείωση των μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητες των καρκινικών κυττάρων του προστάτη που προκαλείται από ΤΑΜ.

η μειωτική ρύθμιση των κατάντη στόχοι ΝΡ-κΒ όπως ΜΜΡ-9, COX-2, VEGF, και IL-8 παίζει σημαντικούς ρόλους στην αναστολή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, και μετάσταση [46], [47]. ΜΜΡ-9 είναι ένα από τα πιο κρίσιμα MMPs που υποβαθμίζουν την εξωκυττάρια μήτρα (ECM) και περαιτέρω διεγείρουν άλλους παράγοντες ανάπτυξης για να διευκολύνει την μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων [48]. Ο κύριος φυσικός αναστολέας της ΜΜΡ-9 είναι ΤΙΜΡ-1. Το Ο-τερματικό πεδίο της ΤΙΜΡ-1 συνδέεται με την όμοια της αιμοπηκτίνης της ΜΜΡ-9 [49].