Αφηρημένο

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο συχνή κακοήθεια και η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Ενώ το κάπνισμα είναι μακράν η κύρια αιτία του καρκίνου του πνεύμονα, άλλων περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων επηρεάζουν την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Από το μοναδικό μεταλλάξεις μοτίβα έχουν παρατηρηθεί σε μεμονωμένα δείγματα του καρκίνου, την ταυτοποίηση και το χαρακτηρισμό του διακριτικού καρκίνου του πνεύμονα μοριακό προφίλ είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών, προσαρμοσμένες θεραπείες. Μέχρι πρόσφατα, εξατομικευμένη αλληλουχίας του DNA για τον εντοπισμό γενετικών μεταλλάξεων στον καρκίνο ήταν ανέφικτη και δαπανηρή. Οι πρόσφατες τεχνολογικές εξελίξεις στον προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA επόμενης γενιάς, όπως η ημιαγωγών-based πλατφόρμα αλληλουχίας Ion Torrent, έχει κάνει το κόστος της αλληλουχίας του DNA και του χρόνου αποτελεσματική με πιο αξιόπιστα αποτελέσματα. Χρησιμοποιώντας το Ion Torrent Ampliseq Panel Cancer, έχουμε αλληλουχία 737 loci από 45 γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο για τον εντοπισμό γενετικές μεταλλάξεις σε 76 ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Η ανάλυση αλληλουχίας αποκάλυψε μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος σε KRAS, EGFR, και τα γονίδια ΤΡ53 στα δείγματα καρκίνου του μαστού διαφόρων ιστολογικών τύπων. Έτσι, η μελέτη αυτή καταδεικνύει την αναγκαιότητα προσδιορισμού αλληλουχίας μεμονωμένων ανθρώπινων καρκίνων, προκειμένου να αναπτύξουν εξατομικευμένα φάρμακα ή συνδυασμό θεραπειών με στόχο την αποτελεσματική άτομο, καρκίνο του μαστού, συγκεκριμένες μεταλλάξεις

Παράθεση:. Cai Χ, Sheng J, Tang C, Nandakumar V, Ye Η, Ji H, et al. (2014) συχνές μεταλλάξεις στο EGFR, KRAS και TP53 γονιδίων στα ανθρώπινα καρκίνο του πνεύμονα όγκοι Εντοπίστηκε από Ion Torrent DNA αλληλουχίας. PLoS ONE 9 (4): e95228. doi: 10.1371 /journal.pone.0095228

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 25 Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 25, Μαρτίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 23, Απρ, 2014

Copyright: © 2014 Cai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, το Ίδρυμα Wu Jieping, και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (R01 CA90427 & amp? R01 AI084811 να SY Chen). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Chuanning Tang, Hua Ye, Feng Lou, Dandan Zhang, το Χονγκ Sun, Haichao Dong , Guangchun Zhang, Zhiyuan Liu, Zhishou Dong, Baishuai Guo, Ο Yan, Chaowei Yan, Lum Wang, Ζιγί Su, και Yangyang Li είναι υπάλληλοι του Σαν Valley Biotechnology, Inc. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλα τα PLoS One πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο συχνή κακοήθεια σε όλο τον κόσμο, καθώς επίσης και η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους. Το 2008, εκτιμάται ότι περίπου 1.610.000 νέα κρούσματα έχουν αναφερθεί σε παγκόσμιο επίπεδο, αντιπροσωπεύοντας το 12,7% του συνόλου των νέων κρουσμάτων καρκίνου [1]. Επιπλέον, περίπου 1.380.000 θανάτους (18,2% του συνόλου των θανάτων από καρκίνο) έχουν αναφερθεί σε όλο τον κόσμο [2]. Στην Κίνα, ο καρκίνος του πνεύμονα έχει την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης όλων των νέων κρουσμάτων καρκίνου στους άνδρες και στις γυναίκες (21,7% το 2008), με περισσότερο από ένα ποσοστό θνησιμότητας 24,9% [2]. Οι γυναίκες στην Κίνα ανέφεραν μόνο μια ελαφρώς υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του πνεύμονα κατά του καρκίνου του μαστού αυτό το ίδιο έτος? Ωστόσο, το ποσοστό θνησιμότητας από καρκίνο του πνεύμονα είναι περισσότερο από 3 φορές υψηλότερη από εκείνη του καρκίνου του μαστού (20,2% έναντι 6,1%, αντίστοιχα) [2]. Ο καρκίνος του πνεύμονα παρουσιάζει συχνά μη ειδικά συμπτώματα και η διάγνωση συχνά εμφανίζεται σε προχωρημένο στάδιο ή μετά την μετάσταση έχει ήδη συμβεί [3]. Ενώ οι προσπάθειες εξακολουθούν να βελτιωθεί η έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα, το συγκλονιστικό επίπτωση, κακή πρόγνωση και σημαντική θνησιμότητα επικρατεί.

Η κύρια αιτία του καρκίνου του πνεύμονα είναι το κάπνισμα τσιγάρων, καθώς και η αυξημένη έκθεση συσχετίζεται άμεσα με μια αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα [4]. 85-90% των θανάτων από καρκίνο του πνεύμονα σχετίζονται με το κάπνισμα, και νυν καπνιστές είναι 15 φορές πιο πιθανό να πεθάνουν από καρκίνο του πνεύμονα παρά ποτέ καπνιστές [5]. Υπάρχουν δύο κύριες μορφές καρκίνου του πνεύμονα: καρκίνος μη-μικρού κυττάρου πνεύμονα (NSCLC) και καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC). NSCLC, η οποία αντιπροσωπεύει περίπου το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα, μπορεί να διαιρεθεί περαιτέρω σε τρεις μεγάλες υποτύπους ιστολογική: ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC), αδενοκαρκίνωμα, και καρκίνο του πνεύμονα μεγάλου-κυττάρου. Ενώ το κάπνισμα μπορεί να αποδοθεί σε όλες τις μορφές του καρκίνου του πνεύμονα, είναι πιο συχνά συνδέεται με SCLC και SCC. Ποτέ καπνιστές, από την άλλη πλευρά, τα πιο συχνά διαγιγνώσκονται με αδενοκαρκίνωμα [3], [5]. Είναι ενδιαφέρον, μόνο 10-24% των καπνιστών να αναπτύξουν καρκίνο του πνεύμονα, επισημαίνει τη σπουδαιότητα άλλων περιβαλλοντικών και των ατομικών γενετικών παραγόντων [6], [7]. έχουν Εκτός από το κάπνισμα, άλλοι αιτιολογικοί παράγοντες και παράγοντες κινδύνου έχουν εντοπιστεί, συμπεριλαμβανομένων κατοχή, η έκθεση σε παθητικό κάπνισμα, τον αμίαντο, το αέριο ραδόνιο, και την ατμοσφαιρική ρύπανση, εκτός από τους γενετικούς παράγοντες [8] – [10]. Περίπου 10-15% των καρκίνων του πνεύμονα να προκύψουν σε ασθενείς που αναφέρουν ότι ποτέ δεν έχουν καπνίσει και αυτοί οι καρκίνοι πράξουν αυθόρμητα με τη συσσώρευση των γενετικών και επιγενετικών αλλαγών [5].

Παρά τις συνεχιζόμενες προσπάθειες για τη βελτίωση της διαλογής και της επεξεργασίας των πνευμόνων καρκίνους, η πρόγνωση των ασθενών με τις περισσότερες μορφές καρκίνου του πνεύμονα παραμένει φτωχή [3]. Επειδή οι γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες που προκαλούν καρκίνο του πνεύμονα ποικίλει ευρέως, κάθε όγκος έχει τη δυνατότητα να επιδεικνύουν ένα μοναδικό προφίλ γονιδιακής μετάλλαξης. Ως εκ τούτου, συσσωρεύοντας στοιχεία δείχνουν ότι εξατομικευμένες, προσαρμοσμένες θεραπείες είναι απαραίτητες για την αποτελεσματική θεραπεία κατά των καρκίνων του πνεύμονα. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με profiling γονιδίωμα του καρκίνου του ατόμου, ώστε να αναλύσουμε την ογκογόνο μηχανισμούς που ρυθμίζουν την εξέλιξη του καρκίνου. Πρόσφατα, μια νέα τεχνολογία που βασίζεται σε αλληλούχιση ημιαγωγών που ονομάζεται Ion Torrent αλληλουχίας [11] αντιμετωπίζει πολλά από τα θέματα που σχετίζονται με άλλες μεθόδους αλληλούχισης, δηλαδή το κόστος, το χρόνο, και τη γενική πρακτικότητα της εξατομικευμένης γονιδιώματος. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε χρησιμοποιήσει αλληλουχίας Ion Torrent να αναλύσουν 76 κλινικά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα για να εντοπίσει τις γενετικές μεταλλάξεις σε 737 τόπους των 45 γνωστά γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο.

Αποτελέσματα

ανάλυση μετάλλαξης του ανθρώπινου καρκίνο του πνεύμονα όγκους με Ion Ampliseq Panel καρκίνου

Ένα σύνολο των 76 δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα (Πίνακας 1) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Ion Torrent Ampliseq Panel καρκίνο να εντοπίσει μεταλλάξεις σε 737 τόπους των 45 ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα . Αυτά τα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα ήταν όλοι από Κινέζους ασθενείς που κυμαίνονται 28-80 ετών εκπροσωπείται από 40 άνδρες με μέση ηλικία 62 ετών και 36 γυναίκες με μέση ηλικία των 59 ετών.

Η

Η ακολουθία δεδομένων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν με τη χρήση v3.0 Ion Torrent σουίτα λογισμικού με ένα plug-in «παραλλαγή του καλούντος». Προκειμένου να εξαλειφθούν βάσης λάθος κλήση, τρία βήματα φιλτράρισμα χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία αξιόπιστων παραλλαγή κλήση όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Το διαβάσει διανομή Sequence απέναντι 189 αμπλικόνια που παράγεται από 76 δείγματα FFPE ομαλοποιήθηκαν σε 300.000 διαβάζει ανά δείγμα (Σχ. 1). Χρησιμοποιώντας ένα αυστηρό πρότυπο παραλλαγή κλήση, εντοπίσαμε μεταλλάξεις στα παρακάτω γονίδια που παρατίθενται στον Πίνακα 1:. BRAF, EGFR, erbB2, KRAS, PIK3CA, PTEN, Smad4 και TP53

Α. Κατανομή των μέσων κάλυψης του κάθε αμπλικονίου. Τα δεδομένα έδειξαν ως μέση τιμή ± SD. B. Αριθμός αμπλικονίων με ένα δεδομένο διαβάσετε βάθος, ταξινομημένα σε κάδους 100 διαβάζει. (Μπλε γραμμές σημερινό αριθμό των αμπλικονίων στόχου εντός βάθος ανάγνωσης, κόκκινη γραμμή παρουσιάζει% του στόχου αμπλικονίων & gt? = Διαβάσει βάθος)

Η

Τα δείγματα ανάλογα με την προέλευσή τους, όπως αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, του πνεύμονα μεγάλων κυττάρων. καρκίνωμα, πνευμονικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων και καρκίνωμα πνεύμονα νευροενδοκρινείς. Τα διάφορα στάδια οι καρκίνοι έχουν προχωρήσει σε βαθμολογήθηκαν με βάση την «αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο μέγεθος /όγκο, λεμφαδένες επηρεάζονται, Μεταστάσεις (AJCC /TNM)« σύστημα (Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb) και ως μεταστατικοί και μη-μεταστατικά καρκίνων του πνεύμονα. Επίσης, οι καρκίνοι έχουν διευθετηθεί από τις βαριές καπνίστριες, το φως-καπνιστές και μη-καπνιστές να ελέγξετε τη συσχέτιση του καπνίσματος με τη συσσώρευση αυτών των μεταλλάξεων. Ο αναλυτικός κατάλογος του σημείου εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις, παρεμβολές και διαγραφές προφίλ για 737 θέσεις δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα 76 παρέχεται στον Πίνακα S1.

Εκτός από τις μεταλλάξεις που προσδιορίζονται στο σύνολο του δείγματος μας, BRAF (2,6%), EGFR (42,1%), erbB2 (1,3%), KRAS (5,3%), PIK3CA (2,6%), PTEN (1,3%), Smad4 (1,3%), και TP53 (22,4%) να έχουν πραγματοποιηθεί τα υψηλότερα ποσοστά μεταλλάξεων (Πίνακας 2 ). Οι συχνότητες μετάλλαξης σε διάφορα επίπεδα τους διαφοροποίηση (Πίνακας 3), σε διαφορετικές AJCC στάσης (Πίνακας 4), των μεταστατικών και μη-μεταστατικών καρκίνων του πνεύμονα (Πίνακας 5) και από ασθενείς με διαφορετικές συνήθειες καπνίσματος (Πίνακας 6) που περιγράφονται στην ενότητα πίνακες. Λεπτομερής ανάλυση αλληλουχίας στα εξώνια και τη λειτουργική ικανότητα αυτών των γονιδίων, ως εκ τούτου πραγματοποιήθηκε.

Η

Η

Η

διανομής παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στα εξόνια και λειτουργικές περιοχές του EGFR

από 76 ακολουθία δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα, το 36,1% των μεταλλάξεων του EGFR ήταν εσφαλμένου νοήματος μαζί εξόνιο 19, 50,0% ήταν παρερμηνεύσιμη μαζί εξόνιο 21, 5,6% κατά μήκος εξόνιο 20 και 8,3% κατά μήκος εξόνιο 18 (Εικ. 2Α). Αυτές οι μεταλλάξεις ήταν στην και γύρω από την περιοχή της κινάσης της τυροσίνης του EGFR (Σχ. 2Β-3C). Ενεργοποίηση μεταλλάξεις στο πεδίο κινάσης τυροσίνης του

EGFR

γονίδιο διεγείρει πρωτεϊνική κινάση της τυροσίνης, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση των μονοπατιών που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση σηματοδότησης. Μεταλλάξεις στην εξωκυτταρική περιοχή του EGFR συχνά σχετίζεται με την ενίσχυση των γονιδίων σε άλλους καρκίνους [12]. 57.7% του EGFR σχετίζεται με καρκίνους του πνεύμονα ήταν αδενοκαρκινώματα (Πίνακας 2) και 86,7% των μεταλλάξεων του EGFR που σχετίζονται με καρκίνους «υψηλή διαφοροποίηση» (Πίνακας 3). Στο δείγμα μας, που το 50% του EGFR που σχετίζονται με καρκίνους του πνεύμονα κάνει μετάσταση σε τοπικές περιοχές, 27,3% για την λύμφες και 46,2% των καρκίνων μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα στο σύνολο του δείγματος μας (Πίνακας 5).

Α. Συχνότητες ανιχνεύονται μεταλλάξεις σε διαφορετικά εξώνια. διανομής Β μετάλλαξη στα εξόνια. κατανομής Γ Μετάλλαξη σε λειτουργικές περιοχές.

Η

Α. Συχνότητες ανιχνεύονται μεταλλάξεις σε διαφορετικά εξώνια. διανομής Β μετάλλαξη στα εξόνια. κατανομής Γ Μετάλλαξη σε λειτουργικές περιοχές.

Η

διανομής παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στα εξόνια και λειτουργικές περιοχές του KRAS

Από 76 αλληλουχία δείγματα καρκίνου του πνεύμονα, το 100% των μεταλλάξεων KRAS ήταν εσφαλμένου νοήματος μαζί εξόνιο 2 (Σχ. 3Α). Το 34G & gt? Τ μεταλλάξεις οδηγούν σε υποκατάσταση αμινοξέος στην θέση 12 σε KRAS, από γλυκίνη (G) σε ένα κυστεΐνη (C) ή βαλίνη (V). Η 64C & gt? Μία μετάλλαξη έχει ως αποτέλεσμα την υποκατάσταση αμινοξέος στη θέση 22 από ένα γλουταμίνη (Q) σε μία λυσίνη (Κ) σε KRAS. Όλες αυτές οι αντικαταστάσεις αμινοξέων εμφανίστηκε κατά μήκος της περιοχής δέσμευσης GTP του KRAS (Σχ. 3Α-Γ). KRAS συνδέεται με GTP στην ενεργή κατάσταση και έχει μια εγγενή ενζυματική δραστηριότητα, η οποία διασπά το τερματικό φωσφορικό του νουκλεοτιδίου, μετατρέποντάς το στο ΑΕΠ. Μετά την μετατροπή του GTP σε GDP, KRAS είναι απενεργοποιημένη [13]. Το αποτέλεσμα αυτών των μεταλλάξεων είναι συστατική ενεργοποίηση του

KRAS

μονοπάτια σηματοδότησης. Μόλις ενεργοποιηθεί, προσλαμβάνει και ενεργοποιεί τις πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για τη διάδοση του αυξητικού παράγοντα και το σήμα άλλους υποδοχείς », όπως c-Raf και PI3-κινάσης [13]. 7,7% του KRAS που σχετίζονται με καρκίνους του πνεύμονα ήταν αδενοκαρκινώματα (Πίνακας 2) και 6,1% του KRAS μεταλλάξεις που σχετίζονται με καρκίνους «χαμηλής διαφοροποίησης» και το 7,4% των μεταλλάξεων KRAS ήταν καρκίνοι »μέσα διαφοροποίησης» (Πίνακας 3). Στο δείγμα μας που 6,3% του KRAS που σχετίζονται με καρκίνους του πνεύμονα κάνει μετάσταση σε τοπικές περιφέρειες, 9,1% στην λύμφες και 5,1% των καρκίνων μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα στο σύνολο του δείγματος μας (Πίνακας 5).

διανομής παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο εξόνια και λειτουργικά πεδία του ΤΡ53

ανωμαλία του γονιδίου ΤΡ53 είναι μία από τις πιο σημαντικές εκδηλώσεις σε καρκίνους του πνεύμονα και παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα. Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο ρ53 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17p13 και εκτείνεται 20 kb γονιδιωματικού DNA που περιέχει 11 εξόνια που κωδικοποιεί για μια φωσφοπρωτεϊνη 53KD [14]. Οι περισσότεροι ΤΡ53 μεταλλάξεις συγκεντρώνονται στον τομέα ΤΡ53 δέσμευσης DNA, η οποία περιλαμβάνει τα εξώνια 5 έως 8 και εκτείνεται περίπου 180 κωδικόνια ή 540 νουκλεοτίδια και δεν περιορίζεται σε μερικές συγκεκριμένες αλληλουχίες ή κωδικόνια κατά μήκος αυτού του γονιδίου [15]. ΤΡ53 πραγματοποιήθηκαν αρκετές επιβλαβείς μεταλλάξεις σε σειρά δείγμα μας των 76 καρκίνων του πνεύμονα, κυρίως κατά μήκος της περιοχής δέσμευσης του DNA που κωδικοποιούνται από το εξόνιο 5 (27.8%), 6 (16,7%), 7 (33.3%), 8 (16,7%), και κατά μήκος η περιοχή ολιγομερισμού που κωδικοποιείται από το εξόνιο 10 (15,6%) (Σχ. 4Α-C). Οι περισσότερες μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος ΤΡ53 να οδηγήσει στην σύνθεση ενός σταθερού πρωτεΐνη, η οποία στερείται ειδική λειτουργία δέσμευσης DNA και διενεργοποίησης του και συσσωρεύεται στον πυρήνα των κυττάρων. Τέτοιες μεταλλαγμένες πρωτεΐνες καθίστανται ανενεργά και δεν έχουν την ικανότητα να διαενεργοποιούν τα κατάντη γονιδίων στόχων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση [16]. Εκτός από αυτές τις μεταλλάξεις που επηρεάζουν το ρόλο του ΤΡ53 ως μια πρωτεΐνη καταστολής όγκων, ΤΡ53 μεταλλάξεις προσδίδουν επίσης την μεταλλαγμένη πρωτεΐνη με «κέρδος-of-λειτουργίας» (GOF) δραστηριότητες, η οποία μπορεί να συμβάλλει ενεργά σε διάφορα στάδια της προόδου των όγκων, περιλαμβανομένων απομακρυσμένες μεταστάσεις , και σε αυξημένη αντίσταση σε αντικαρκινικές θεραπείες [17] – [19]. 50,0% των ΤΡ53 σχετιζόμενη καρκίνων του πνεύμονα ήταν καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (Πίνακας 2) και 20,0% του ΤΡ53 μεταλλάξεων που σχετίζονται με καρκίνους «υψηλή διαφοροποίηση» και 25,9% των μεταλλάξεων ΤΡ53 ήταν καρκίνοι ‘μέσα διαφοροποίησης »(Πίνακας 3). Στο δείγμα μας που 25,0% των TP53 που σχετίζονται με καρκίνους του πνεύμονα κάνει μετάσταση σε τοπικές περιοχές, 54,5% για την λύμφες και 12,8% των καρκίνων μετάσταση σε απομακρυσμένα όργανα στο σύνολο του δείγματος μας (Πίνακας 5).

Α. Συχνότητες ανιχνεύονται μεταλλάξεις σε διαφορετικά εξώνια. διανομής Β μετάλλαξη στα εξόνια. κατανομής Γ Μετάλλαξη σε λειτουργικές περιοχές.

Η

Πολλαπλές μεταλλάξεις και μετάλλαξης hot spots σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα

Η κλινική επιτυχία με την εξατομικευμένη θεραπεία συνδυασμού βασίζεται στην ταυτοποίηση των μεταλλάξεων συνδυασμούς και τα πρότυπα για συνεργασία -administration ενός μόνο ή συνδυασμό των παραγόντων στόχων κατά των μεταλλάξεων ανιχνεύονται συνδυασμούς. Μερικές από τις μεταλλάξεις που ανιχνεύονται στην ομάδα του όγκου μας, μέσω της ανάλυσης αλληλουχίας δεν ήταν μόνο επαναλαμβανόμενες και συχνές, αλλά εμφανίστηκε επίσης σε συνδυασμό με άλλες μεταλλάξεις. καρκίνους του πνεύμονα σε σετ δείγμα μας περιλαμβάνει τα εξής: 64,5% των δειγμάτων είχαν τουλάχιστον μία ή περισσότερες μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος, 19,7% είχαν τουλάχιστον δύο ή περισσότερες μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος, 3,9% είχαν τουλάχιστον τρεις ή περισσότερες μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος, 1,3% είχαν τουλάχιστον τέσσερις ή περισσότερες μεταλλάξεις απουσίας, και το 35,5% των δειγμάτων που πραγματοποιούνται δεν συνεπάγονται μεταλλάξεις σε οποιοδήποτε από τα προβλήθηκε 13.500 τόπους των δυνητικών ογκοκατασταλτικών και ογκογονίδια (Πίνακας 7).

η

Συζήτηση

όπως ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ο συχνότερος καρκίνος και η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, οι συνεχιζόμενες προσπάθειες για τη βελτίωση της πρόληψης, διάγνωσης, και αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Επί του παρόντος, υπάρχουν μια σειρά από επιλογές θεραπείας για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, με χειρουργική επέμβαση είναι η πιο αποτελεσματική για τη θεραπεία της NSCLCs, και χημειοθεραπεία με ή χωρίς θεραπείες ακτινοβολίας, όπως το πρότυπο θεραπείας για SCLCs. Επειδή οι περισσότεροι SCLCs μεταστάσεις νωρίς σε απομακρυσμένα όργανα, η χειρουργική επέμβαση είναι συχνά αναποτελεσματικά στην θεραπεία αυτού του καρκίνου. NSCLCs, από την άλλη πλευρά, είναι πιο πιθανό να παραμείνει εντοπισμένη κατά την ανάπτυξη, και είναι έτσι είναι πιο αποτελεσματική θεραπεία με χειρουργική επέμβαση. Επιπλέον, SCLCs είναι συνήθως πολύ πιο ευαίσθητα στη χημειοθεραπεία και /ή ακτινοθεραπεία απ ​​’ότι είναι NSCLCs [20], [21]. Μία πρόκληση στη σωστή ταξινόμηση και θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα είναι η ακραία ετερογένεια προκαλείται από διαφορετικές γενετικές, βιολογικές, και κλινικές ιδιότητες, συμπεριλαμβανομένης της ανταπόκρισης στη θεραπεία, με πάνω από 50 ιστολογικές παραλλαγές που αναγνωρίζονται από το σύστημα πληκτρολόγησης ΠΟΥ [22], [23]. Εξαιτίας αυτού, η ορθή κατάταξη των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα είναι απαραίτητη για να εξασφαλιστεί ότι οι ασθενείς λαμβάνουν τη βέλτιστη διαχείριση [24].

Λόγω αυτών των διαφόρων επιπέδων της ετερογένειας, η γενικευμένη θεραπείες μπορεί να είναι λιγότερο αποτελεσματική. Εναλλακτικά στοχευμένη θεραπεία, η οποία περιλαμβάνει τη χρήση ειδικά σχεδιασμένων φαρμάκων για την επιλεκτική στόχευση μοριακών οδών συσχετίζεται με την κακοήθη φαινότυπο των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, μπορεί να είναι πιο χρήσιμη [25]. Αρκετά γονίδια που βρίσκονται συνήθως πρόκειται να μεταλλαχθεί σε διάφορους καρκίνους του πνεύμονα έχουν αναφερθεί, συμπεριλαμβανομένης της ALK σύντηξης /ELM4, Κ-

ras

, EGFR, VEGF, και ρ53, αλλά το ολόκληρο το γενετικό προφίλ κάθε μορφή εξακολουθεί να μην έχει πλήρως καθορισμένη [3]. Αυτό δείχνει την αναγκαιότητα των μεμονωμένων αλληλούχισης ανθρώπινων καρκίνων του πνεύμονα, ώστε να ταιριάζει με την χρήση ενός μόνο φάρμακο που στοχεύει ή δύο ή περισσότερα φάρμακα που στοχεύουν σε συνδυασμό κατά ατομικών πνεύμονα καρκίνο συγκεκριμένες μεταλλάξεις. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε χρησιμοποιήσει Ion Ampliseq Panel Καρκίνος στην αλληλουχία 13.500 τόπους σε 45 γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο, κυρίως ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, των 76 ανθρώπινων δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα. Ταυτοποιήσαμε συχνές μεταλλάξεις σε μια ομάδα γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των EGFR, KRAS, και ΤΡ53 (Πίνακας 2). Αν και τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια ήταν ήδη γνωστό ότι σχετίζονται με καρκίνους του πνεύμονα, τα μεταλλαγμένα σημεία και οι μεταλλάξεις που σχετίζονται με άλλα γονίδια ήταν διαφορετική σε σύνολο δείγματος μας (Πίνακες 7).

Δεδομένου ότι υπάρχει αύξηση της ευαισθητοποίησης σχετικά με τις αλλαγές στον πνεύμονα καρκινικά κύτταρα τα τελευταία χρόνια, έχουν νεότερα φάρμακα που στοχεύουν ειδικά αυτές τις αλλαγές έχουν αναπτυχθεί. Αυτά τα στοχευμένα φάρμακα είτε συνεργαστεί με τους φάρμακα χημειοθεραπείας ή από τις ίδιες με πολύ μικρότερο τοξικότητα οφείλεται σε μια επιλεκτική δράση ως εναλλακτική λύση σε μια πιο συστηματική διαφοροποίηση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με ογκογένεση. Οι αναστολείς EGFR (Afatinib, Η erlotinib, και Gefitinib) και αναστολείς VEGF (Bevacizumab) που χρησιμοποιούνται σήμερα για θεραπείες στόχος για τους ασθενείς με NSCLC με μεταλλάξεις στο VEGF και EGFR [26]. Η erlotinib είναι ένα φάρμακο που μπλοκάρει EGFR από σηματοδότησης του κυττάρου να μεγαλώνει. Εμποδίζει την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα, ειδικά στις γυναίκες το κάπνισμα, και χρησιμοποιείται κυρίως σε προηγμένες θεραπεία NSCLC που δεν ήταν ανταποκρίνεται στη χημειοθεραπεία. Είναι, επίσης, χρησιμοποιείται ως πρώτη θεραπεία σε ασθενείς των οποίων καρκίνοι έχουν μία μετάλλαξη εις το

EGFR

γονίδιο [27]. Το cetuximab είναι ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που στοχεύει EGFR το οποίο χρησιμοποιείται επίσης σε προχωρημένο NSCLC σε συνδυασμό με την κλασική χημειοθεραπεία, ως μέρος της θεραπείας πρώτης γραμμής [28]. Όπως erlotinib, afatinib είναι ένα φάρμακο που μπλοκάρει το σήμα ανάπτυξης από EGFR και χρησιμοποιούνται για τις προηγμένες NSCLCs που έχουν μεταλλάξεις στο

EGFR

γονίδιο [29]. Ορισμένα νεότεροι, μη-καπνιστές με αδενοκαρκινώματα βρέθηκε να έχει μία /EML4 ογκογονίδιο σύντηξης ALK οποία είναι σήμερα ένας στόχος για το φάρμακο Crizotinib [30]. Άλλα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα δεν είναι ειδικά για το γονίδιο, και αντί να στοχεύσετε γενικά μοριακά μονοπάτια όπως anitmetabolites φολικού οξέος (μεθοτρεξάτη και πεμετρεξίδη), μιτωτικούς αναστολείς (docetaxel, piclitaxel, και βινορελβίνη), αναστολείς τοποϊσομεράσης (ΕΤΟΡΟΡΗΟδ και τοποτεκάνη), και νουκλεοσιδικών ανάλογα τα οποία παρεμβαίνουν στη σύνθεση του DNA (καρβοπλατίνη, σισπλατίνη, και gemciabine) [31], [32]. Οι αναστολείς του EGFR-σκηνοθεσία της τυροσινικής κινάσης δημιουργήθηκε για να είναι μια αποτελεσματική θεραπευτική επιλογή για προχωρημένο NSCLC που δεν ανταποκρίνονται στη χημειοθεραπεία. Ωστόσο, EGFR-σκηνοθεσία μονοκλωνικά αντισώματα σε συνδυασμό με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής, το cetuximab σε συνδυασμό με σισπλατίνη /βινορελβίνη και bevacizumab σε συνδυασμό με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία είχε ως αποτέλεσμα την καλύτερη επιβίωση σε σύγκριση με τη χημειοθεραπεία μόνο σε ασθενείς με προχωρημένη EGFR-θετικό NSCLC [ ,,,0],33]. Άλλες στοχευμένες θεραπείες συμπεριλαμβανομένης της διπλής και πολυ-αναστολείς κινάσης βρίσκονται σε προγενέστερα στάδια της κλινικής ανάπτυξης [34].

Με τη συσσώρευση γνώσης και εμπειρίας σε τεχνολογίες επόμενης γενιάς, είναι απαραίτητο να επεκτείνει την κατανόησή μας όσον αφορά την ευαισθησία της συγκεκριμένες μεταλλάξεις σε εξατομικευμένη θεραπεία. Ως εκ τούτου, συγκεντρώνοντας ένα πλήρες προφίλ των μεταλλάξεων σε καρκίνους του πνεύμονα για την εφαρμογή εξατομικευμένων και προσαρμοσμένη στοχευμένη θεραπεία είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη μελλοντικών θεραπείες για τον καρκίνο. Πιστεύουμε ότι μια ταχύτερη και οικονομικά αποτελεσματικό εργαλείο του γονότυπου, όπως η τεχνολογία αλληλουχίας Ion Torrent θα είναι πολύ επωφελής για την εκχώρηση των εν λόγω ειδικών θεραπευτικών στο εγγύς μέλλον να χρησιμοποιήσετε για καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Ερευνών του Ανθρώπου Δεοντολογίας του πρώτου Affiliated Νοσοκομείο Dalian Medical University, την Κίνα. Για σταθερές Φορμόλης και ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα (FFPE) όγκου από την τράπεζα ιστό του όγκου στο Τμήμα Παθολογίας του νοσοκομείου, η επιτροπή θεσμικών ηθικής παραιτηθεί από την ανάγκη για συναίνεση. Όλα τα δείγματα και τα ιατρικά δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη έχουν αμετάκλητα ανώνυμα.

Πληροφορίες για τον ασθενή

δείγματα όγκων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη συλλέχθηκαν από την Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο Dalian Medical University, την Κίνα. Συνολικά 76 δείγματα όγκων FFPE από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα αναλύθηκαν. Η μέση ηλικία των 76 ασθενών ήταν 61 έτη (εύρος: 28-80 έτη). Από αυτούς, 40 ασθενείς ήταν άνδρες με μέση ηλικία τα 61 έτη (εύρος: 28 – 80 ετών), και 36 ασθενείς ήταν γυναίκες με μέσο όρο ηλικίας 61 (εύρος: 36-75 έτη). δείγματα όγκων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη συλλέχθηκαν από την Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο Dalian Medical University, την Κίνα. Συνολικά 76 δείγματα όγκων FFPE από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα αναλύθηκαν. Η μέση ηλικία των 76 ασθενών ήταν 61 έτη (εύρος: 28-80 έτη). Από αυτούς, 40 ασθενείς ήταν άνδρες με μέση ηλικία τα 61 έτη (εύρος: 28 – 80 ετών), και 36 ασθενείς ήταν γυναίκες με μέσο όρο ηλικίας 61 (εύρος: 36-75 έτη). 33 από τους 76 ασθενείς (20 άνδρες, 13 γυναίκες) βαθμολογήθηκαν ως χαμηλή παθολογική διαφοροποίηση? 27 (14 άνδρες, 13 γυναίκες) στο μέσον, 15 (6 άνδρες, 9 γυναίκες) σε υψηλή, και 1 γυναικών άγνωστης διαφοροποίησης. AJCC σταδιοποίηση του καρκίνου είναι ως εξής: 0 ασθενείς σε Ι ή Ια? 18 (10 άνδρες, 8 γυναίκες) στο στάδιο Ib? 3 (2 άνδρες, 1 γυναίκα) σε IIa στάδιο? 9 (5 άνδρες, 4 γυναίκες) στο στάδιο IIb? 26 (14 άνδρες, 12 γυναίκες) κατά το στάδιο IIIa? 8 (4 άνδρες, 4 γυναίκες) στο στάδιο IIIb? 0 ασθενείς στο στάδιο IIIc? και 12 (5 άνδρες, 7 γυναίκες) στο στάδιο IV. Από το σύνολο των 76 ασθενών, 16 από τους 40 άνδρες ανέφεραν κανένα ιστορικό καπνίσματος, ενώ καμία από τις 36 γυναίκες ανέφεραν ότι είναι καπνιστές? 6 άνδρες ανέφεραν φως το κάπνισμα? 17 άνδρες ανέφεραν βαρύ κάπνισμα, και 1 άντρας με ένα άγνωστο ιστορικό καπνίσματος.

προετοιμασία του DNA

Το DNA απομονώθηκε από δείγματα FFPE μετά αποπαραφινώσεως και εξόρυξη 3-5 μm τομές πάχους παραφίνης σε ξυλόλιο, με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ion torrent PGM προετοιμασία της βιβλιοθήκης και αλληλούχιση

Ένα Ion torrent βιβλιοθήκη προσαρμογέα-προσδέθηκε έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για την Ion AmpliSeq Βιβλιοθήκη Kit 2.0 (Life Technologies) (Part # 4475345 Rev. Α). Εν συντομία, 50 ng ομαδοποιήθηκαν αμπλικόνια ήταν επισκευάστηκε στο άκρο, και της DNA λιγάσης χρησιμοποιήθηκε για απολίνωση Ion Torrent προσαρμογείς Ρ1 και A. Μετά από καθαρισμό με χάντρες AMPure (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), προσαρμογέας-συνδεδεμένα προϊόντα nick-μεταφρασμένο και ΡΟΚ-ενισχυμένο για ένα σύνολο 5 κύκλων. σφαιρίδια AMPure (Beckman Coulter) χρησιμοποιήθηκαν για τον καθαρισμό της προκύπτουσας βιβλιοθήκης, και ένα Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies) και Agilent BioAnalyzer DNA υψηλής ευαισθησίας LabChip (Agilent Technologies) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση και το μέγεθος της βιβλιοθήκης.

γαλάκτωμα Δείγμα PCR, διάσπαση του γαλακτώματος, και τον εμπλουτισμό διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Ion PGM Kit Template 200 Xpress (Part # 4474280 Rev. Β), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, μια συγκέντρωση εισόδου του ένα αντίγραφο εκμαγείου DNA /Ίων Sphere Σωματίδια (ISP) προστέθηκε στο γαλάκτωμα PCR κύριο μείγμα και το γαλάκτωμα που παράγεται χρησιμοποιώντας ένα μίξερ IKADT-20 (Life Technologies). Στη συνέχεια, οι ISP ανακτήθηκαν και το πρότυπο θετικών ISPs εμπλουτίστηκαν για χρήση με Dynabeads MyOne Στρεπταβιδίνη C1 σφαιρίδια (Life Technologies). ISP εμπλουτισμός επιβεβαιώθηκε με τη χρήση του φθορισμού qubit 2.0 (Life Technologies). 316 chips χρησιμοποιήθηκαν για αλληλούχιση στην Ion Torrent PGM για 65 κύκλους και τα δείγματα έχουν γραμμικό κώδικα. Ion PGM 200 Sequencing Kit χρησιμοποιήθηκε για αντιδράσεις αλληλούχισης, σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο (Part # 4474004 Rev. Β). Το σύνολο δεδομένων έχει κατατεθεί στην Διαβάστε Αρχείο NIH Ακολουθία, και ο αριθμός είναι SRP028756 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP028756).

Variant καλώντας

τα δεδομένα από τις πίστες του PGM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας αρχικά την συγκεκριμένη πλατφόρμα λογισμικού αγωγού Ion Torrent Torrent Suite για να δημιουργήσετε ακολουθία διαβάζει, κόψτε ακολουθίες μετασχηματιστή, φίλτρο, και αφαιρέστε φτωχό σήμα-προφίλ διαβάζει. Αρχική παραλλαγή ζητώντας από τα δεδομένα αλληλουχίας Ion AmpliSeq δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας v3.0 Torrent σουίτα λογισμικού με ένα πρόγραμμα plug-in «παραλλαγή του καλούντος». Προκειμένου να εξαλειφθούν οι εσφαλμένες βάση calling, τρία βήματα φιλτράρισμα χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν την τελική παραλλαγή κλήση. Το πρώτο φίλτρο τέθηκε σε ένα μέσο συνολικό βάθος κάλυψη & gt? 100, κάθε παραλλαγή κάλυψη & gt? 20, η συχνότητα παραλλαγή του κάθε δείγματος & gt? 5, και P-value & lt? 0,01. Προκειμένου να εξαλειφθούν σφάλμα βάσης κλήσης, αρκετά βήματα φιλτραρίσματος χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν τελική παραλλαγή κλήση (Εικ. S1.). Το πρώτο φίλτρο καθορίστηκε σε ένα μέσο βάθος της συνολικής κάλυψης των & gt? 100, η ​​κάθε παραλλαγή κάλυψη & gt? 20, η συχνότητα παραλλαγή του κάθε δείγματος & gt? 5 και P-value & lt? 0,01. Το δεύτερο φίλτρο είχε προσληφθεί από την οπτική εξέταση των μεταλλάξεων χρησιμοποιώντας Ολοκληρωμένες Genomics Viewer (IGV) λογισμικό (http //www.broadinstitute.org /IGV) ή Samtools λογισμικού SAMtools λογισμικού (https://samtools.sourceforge.net), καθώς και από φιλτράροντας το δυνατόν σκέλος-συγκεκριμένα σφάλματα, δηλ. μια μετάλλαξη ανιχνεύθηκε μόνο σε είτε «+» ή «-» κλώνου, αλλά όχι και στα δύο σκέλη του DNA. Το τρίτο βήμα φιλτραρίσματος ορίστηκε ως παραλλαγές μέσα σε 727 hotspots, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το τελευταίο βήμα φίλτρου ήταν εξαλείψει τις παραλλαγές σε αμπλικόνιο AMPL339432 (PIK3CA, exon13, CHR3: 178938822 έως 178.938.906), η οποία δεν είναι μοναδικό ταιριάζουν στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Από αλληλούχιση μας τρέχει με τη χρήση του Ion Ampliseq Panel Cancer, ψευδή στοιχεία διαγραφή παρήχθησαν από τον τόπο γονίδιο JAK2 και έτσι τα δεδομένα αλληλούχισης από αυτό το τόπο αποκλείστηκαν από περαιτέρω ανάλυση.

Σωματικές μεταλλάξεις

Εντοπίστηκε μεταλλάξεις σε σύγκριση με παραλλαγές στα Γενώματα Έργου 1000 [35] και 6500 exomes του το Εθνικό Ινστιτούτο Καρδιάς, πνευμόνων και αίματος Ινστιτούτο exome Sequencing Έργου [36] για τη διάκριση σωματικές μεταλλάξεις και μεταλλάξεις βλαστικής σειράς.

Βιοπληροφορική και πειραματική επιβεβαίωση εφαρμοσμένη

Χρησιμοποιήσαμε το COSMIC [37] (έκδοση 64), βάση δεδομένων MyCancerGenome (https://www.mycancergenome.org/) και κάποιες δημοσιεύσεις για την εκτίμηση μεταλλάξεων επανεμφάνιση του καρκίνου του πνεύμονα (Πίνακας S1). Επιπλέον, ορισμένα ανιχνεύθηκαν μεταλλάξεις απουσίας επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση του Sanger (Εικ. S2).

Η στατιστική ανάλυση

Επιλέγουμε επανεμφάνιση σωματικά παρερμηνεύσιμη /in-del μεταλλάξεις του καρκίνου του πνεύμονα για να κάνει την στατιστική ανάλυση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

διαδικασία Φίλτρο παραλλαγές. Σημείωση: (α) παραλλαγές Strand-προκατειλημμένη είχαν εξαλειφθεί χρησιμοποιώντας Ολοκληρωμένες Genomics Viewer (IGV) λογισμικό (http //www.broadinstitute.org /IGV)? (Β) Οι παραλλαγές σε AMPL339432 πρέπει να εξαλειφθούν, διότι αυτό αμπλικόνιο δεν είναι μοναδική ταιριάζει με PIK3CA στο ανθρώπινο γονιδίωμα? (Γ) Όλα τα στατιστικά μας ανάλυση βασίστηκε στα δεδομένα σε μπλε κουτί

doi:. 10.1371 /journal.pone.0095228.s001

(DOCX)

Εικόνα S2.

Sanger επικυρώσεις των 15 παραλλαγές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0095228.s002

(DOC)

Πίνακα S1.

συχνότητες των σημειακών μεταλλάξεων, εισαγωγή και διαγραφή μεταλλάξεις σε 737 τόπους των 76 ανθρώπινων καρκίνων του πνεύμονα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0095228.s003

(DOCX)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Rong Shi στο Ίδρυμα Wu Jieping, Δρ Haibo Wang, Zhi Yu, Ying Li και άλλα μέλη του San Valley Βιοτεχνολογίας Inc. Πεκίνο για τη βοήθειά τους στο δείγμα και τη συλλογή δεδομένων. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω το προσωπικό του Πεκίνου Στρατιωτικό Νοσοκομείο για τη γενναιόδωρη υποστήριξή τους για την αλληλούχιση του DNA και τη συλλογή δεδομένων.