Abstract

Επιτυχής γονιδιακής θεραπείας εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την επιλεκτική εισαγωγή θεραπευτικών γονιδίων στα κατάλληλα καρκινικά κύτταρα-στόχους. Μια από τις πιο αποτελεσματικές και πολλά υποσχόμενες προσεγγίσεις για τη στόχευση του ιστού όγκου κατά την διάρκεια απελευθέρωσης γονιδίου είναι η χρήση ιικών φορέων, τα οποία επιτρέπουν την απελευθέρωση γονιδίου υψηλής απόδοσης. Ωστόσο, η χρήση των ιικών φορέων δεν είναι χωρίς κινδύνους και ανησυχίες για την ασφάλεια, όπως τοξικότητες, μια ανοσοαπόκριση ξενιστή έναντι των ιικών αντιγόνων ή των δυνητικών ιικής ανασυνδυασμού στο χρωμόσωμα του ξενιστή? Οι κίνδυνοι αυτοί περιορίζουν την κλινική εφαρμογή της ιικών φορέων. Η Ωραία Κοιμωμένη (SB) σύστημα μεταθετό στοιχείο που βασίζεται είναι ένα ελκυστικό, μη-ιικά εναλλακτική λύση για ιικά συστήματα χορήγησης. SB μπορεί να είναι λιγότερο ανοσογονικά από ό, τι το σύστημα ιικού φορέα λόγω της έλλειψης των ιικών αλληλουχιών. Το σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου που βασίζεται SB μπορεί σταθερώς ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή για να παράγουν το θεραπευτικό προϊόν γονιδίου κατά τη διάρκεια ζωής ενός κυττάρου. Ωστόσο, σε σύγκριση με φορείς ιών, το σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου μη-ιικά SB-based ακόμα έχει περιορισμένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα λόγω της έλλειψης της μακράς διάρκειας έκφραση γονιδίου δυναμικού και των κυττάρων του όγκου μεταφοράς ειδικό γονίδιο ικανότητα. Οι περιορισμοί αυτοί θα μπορούσαν να ξεπεραστούν με την τροποποίηση του συστήματος SB μέσω της εισαγωγής του προωθητή hTERT και του ενισχυτή SV40. Σε αυτή τη μελέτη, ένα τροποποιημένο σύστημα παροχής SB, υπό τον έλεγχο του υποκινητή hTERT σε συνδυασμό με τον ενισχυτή SV40, ήταν σε θέση να μεταφέρει επιτυχώς το γονίδιο αυτοκτονίας (HSV-ΤΚ) σε πολλαπλούς τύπους των καρκινικών κυττάρων. Το τροποποιημένο SB επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν ένα σημαντικά αυξημένο ειδικό ποσοστό θανάτου των καρκινικών κυττάρων. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η τροποποιημένη SB-based σύστημα παράδοσης γονιδίων μας μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα ασφαλές και αποτελεσματικό εργαλείο για συγκεκριμένα καρκινικών κυττάρων μεταφορά θεραπευτικό γονίδιο και σταθερή μακροχρόνια έκφραση

Παράθεση:. Χονγκ IS, Lee ΗΥ, Kim HP (2014) Μυθιστόρημα Θεραπευτικές Προσεγγίσεις για διάφορους τύπους καρκίνου με τη βοήθεια ενός τροποποιημένου Sleeping Beauty-Based System Gene Delivery. PLoS ONE 9 (1): e86324. doi: 10.1371 /journal.pone.0086324

Επιμέλεια: Eduard Ayuso, Πανεπιστήμιο της Nantes, Γαλλία

Ελήφθη: 11 Ιούλ 2013? Αποδεκτές: έκτης Δεκεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Hong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (Κωδικός Έργου αρ, Ζ-1541745-2012-13-09) από ζώων και φυτών Υπηρεσίας καραντίνας, Υπουργείο Γεωργίας, Τροφίμων και Αγροτικών Υποθέσεων. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ενζυμική θεραπεία προφαρμάκου Gene-κατευθυνόμενη (GDEPT) είναι μία από τις πολλά υποσχόμενες εναλλακτικές λύσεις για συμβατική χημειοθεραπεία? GDEPT ελαχιστοποιεί συστηματικές τοξικότητες μέσω της εισαγωγής καταλυτικών ενζύμων που μετατρέπουν χαμηλή ή μη-τοξικά προφάρμακα σε τοξικά μεταβολίτες στα καρκινικά κύτταρα [1]. Αυτό το θεραπευτικό σύστημα αποτελείται από ανενεργές χαμηλή ή μη-τοξικά προφάρμακα και ένα γονίδιο που κωδικοποιεί ένα ένζυμο [2]. Μετά γενετική τροποποίηση των κυττάρων όγκου για να εκφράσουν τα ένζυμα και τη συστημική χορήγηση του προφαρμάκου, το προφάρμακο τοπικά μετατρέπεται από το ένζυμο σε τοξικών μεταβολιτών, που οδηγεί στην εκλεκτική θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Επειδή ο τοξικός μεταβολίτης μόνο παράγεται και απελευθερώνεται στην τοπική θέση του όγκου όπου το γονίδιο έχει παραδοθεί, με αποτέλεσμα ένα πολύ μειωμένο κυκλοφορούσα συγκέντρωση του ελεύθερου τοξικού φαρμάκου, αυτό το θεραπευτικό σύστημα ονομάζεται τοπική χημειοθεραπεία. Υπάρχουν αρκετές γονίδια που κωδικοποιούν ένζυμα ενεργοποίησης προφαρμάκου. Μεταξύ αυτών, η πιο κοινή γονίδιο είναι ιού του απλού έρπητα-1 κινάση θυμιδίνης (HSV-ΤΚ), ένα καλά χαρακτηρισμένο γονίδιο αυτοκτονίας που μπορεί να απομονωθεί από το ιός του απλού έρπητα ή

E. coli

[3], [4]. HSV-TK μετατρέπει την συστηματικά χορηγούμενη gancyclovir προφάρμακο (GCV) σε ένα τοξικό μεταβολίτη που σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα [5]. Αυτή η μέθοδος συνδυασμός έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε πολλές κλινικές τομείς, όπως η γονιδιακή θεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου [6] και μοσχεύματος έναντι ξενιστή (GVHD) [7].

Επιτυχής GDEPT εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την επιλεκτική εισαγωγή του γονιδίου αυτοκτονίας στα κατάλληλα καρκινικά κύτταρα-στόχους. Μια από τις πιο αποτελεσματικές και πολλά υποσχόμενες προσεγγίσεις για απελευθέρωση γονιδίου στον ιστό του όγκου-στόχου είναι η χρήση ιικών φορέων, τα οποία επιτρέπουν την μεταφορά γονιδίων υψηλής απόδοσης [8], [9]. Ωστόσο, αυτοί οι φορείς έχουν επί του παρόντος κινδύνους και ανησυχίες για την ασφάλεια, όπως τοξικότητες, άνοσο αποκρίσεις ξενιστή έναντι των ιικών αντιγόνων ή των δυνητικών ιικής ανασυνδυασμού στα χρωμοσώματα του ξενιστή, τα οποία περιορίζουν την κλινική εφαρμογή τους [10]. Ένα άλλο πρόβλημα με τη χρήση ιικών φορέων για γονιδιακή θεραπεία είναι ότι η προετοιμασία ιικού φορέα είναι επίπονη και δαπανηρή [11], [12] Ως εκ τούτου, μια καλύτερη εναλλακτική λύση μπορεί να είναι να αναπτυχθεί μια μέθοδος απελευθέρωσης γονιδίου που θα κατευθύνει θεραπευτικούς παράγοντες σε κατάλληλους χώρους και συστατικώς εκφράζουν θεραπευτικά γονίδια εντός ή κοντά στην περιοχή του όγκου, χωρίς τους περιορισμούς αυτούς.

το σύστημα βασιζόμενο σε τρανσποζόνιο που είναι ένα ελκυστικό, μη-ιικά εναλλακτική λύση για τις ιικά συστήματα χορήγησης. Τρανσποζόνια είναι διακριτά τμήματα του DNA που έχουν την εγγενή ικανότητα να κινείται από θέση σε θέση και μπορούν να αντιγράφονται εντός του γονιδιώματος χρησιμοποιώντας οργανίδια του κυττάρου-ξενιστή και άλλα μηχανήματα. Ωστόσο, σε σύγκριση με φορείς ιών, τρανσποζόνια δεν είναι μολυσματικά, και ως εκ τούτου οι δραστηριότητές τους περιορίζονται σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα με συγκεκριμένες λειτουργίες. Σε ασπόνδυλα, αρκετά διαφορετικά είδη ενδογενούς transposons έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς, όπως η ναυτικός στοιχείου μορφής Tc1 σε ποσοστό

Caenorhabditis elegans

και το στοιχείο Ρ στο

Drosophila

[13], [14] . Δυστυχώς, δεν υπάρχουν τέτοιες δραστικές και ενδογενών μεταθετόνια είναι διαθέσιμα σε σπονδυλωτά λόγω συσσωρευμένων μεταλλάξεις εντός της αλληλουχίας transposon [15]. Μία προσέγγιση για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα στα σπονδυλωτά ήταν η μοριακή ανακατασκευή ενός γενετικά ενεργό μεταθετό στοιχείο σπονδυλωτά /ναυτικός τύπου Tc1 ονομάζεται Ωραία Κοιμωμένη (SB) από τους αρχαίους «νεκρό» απολιθώματα μεταθετό στοιχείο βρέθηκαν σε γονιδιώματα των ψαριών [16]. SB δείχνει αποτελεσματική μεταθετική δράση σε κύτταρα ποντικού εμβρυϊκών βλαστικών (ES) [17], ποντίκι σωματικό ιστό [18], και βλαστικής ποντικού [19]. Επιπλέον, SB έχει δείξει τεράστια επιτυχία ως αποτελεσματικό έκδοχο απελευθέρωσης γονιδίου σε μοντέλα ποντικών της ανθρώπινης νόσου [20] – [23]. Σε προηγούμενες μελέτες, Song et al. Βρέθηκε ότι SB τρανσποζόνιο διαμεσολαβούν την έκφραση του γονιδίου αυτοκτονίας σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα που προκαλεί απόπτωση [24] και μεταφορά γονίδιο της τελομεράσης για την προστασία από χημικά (t-BH, CCl4, ή d-GalN) -. επαγόμενη οξεία κυτταρική βλάβη [25]

Ωστόσο, σε σύγκριση με φορείς ιών, το σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου μη-ιικά SB βασίζονται ακόμα έχει περιορισμένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα λόγω της έλλειψης μακρόχρονη γονιδιακής έκφρασης και των καρκινικών κυττάρων ικανότητα μεταφοράς ειδικό γονίδιο. Το γονίδιο hTERT συχνά επανενεργοποιείται σε περίπου 90% των αθανατοποιημένων ανθρώπινων κυττάρων και καρκινικών κυττάρων διαφόρων προελεύσεων [26] – [28]. προωθητή hTERT έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε στοχευμένη γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου [29] – [31]. Επιπλέον, ο ενισχυτής SV40 έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για τη βελτίωση της δραστηριότητας υποκινητών για την προώθηση μακράς διαρκείας γονιδιακής έκφρασης [32]. Ετσι, για να αυξηθεί η αντοχή υποκινητή, διατηρώντας παράλληλα την ειδικότητα του ιστού, χρησιμοποιήσαμε ένα ανασυνδυασμένο ενισχυτή SV40 που περιέχει ένα όγκου-ειδικό προαγωγό hTERT [33]. Ενώ το τραγούδι et al. έχουν αναφέρει σύνδεσης μεταξύ τροποποιημένων SB και την καταστολή της ανάπτυξης του όγκου [24], η μελέτη τους έχουν περιοριστεί σε εκείνους του ενιαίου κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (Hep3B) στον οποίο απουσιάζουν univeral επιδράσεις κατά του όγκου σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων. Ομοίως, αν και έχουν προταθεί όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα των τροποποιημένων SB, αυτές οι επιδράσεις επιβεβαιώνονται από ένα και μόνο in vitro δοκιμασία (ΑΤΡ δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας), στην οποία μια πιο περιεκτική εικόνα των αντικαρκινικών επιδράσεων των τροποποιημένων SB λείπει ακόμη [24]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, το τροποποιημένο σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου SB-based χρησιμοποιήθηκε για να μεταφέρει το γονίδιο αυτοκτονίας (HSV-ΤΚ) σε πολλαπλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των H358 (καρκίνος του πνεύμονα), Η1299 (καρκίνος του πνεύμονα), PC3 (προστάτης καρκίνο), DU145 (καρκίνος του προστάτη), και OVCAR3 (καρκίνος των ωοθηκών) κύτταρα με διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις, συμπεριλαμβανομένων TUNEL δοκιμασία, δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, ανάλυση FACS, και in vivo πείραμα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τροποποιημένο σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου που βασίζεται SB μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα ασφαλές και αποτελεσματικό εργαλείο για την ειδική των καρκινικών κυττάρων μεταφορά θεραπευτικού γονιδίου και σταθερή μακροπρόθεσμη έκφραση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυττάρων καλλιέργεια

Η ανθρώπινη φυσιολογική ινοβλάστη, WI-38 και IMR-90 κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM (GIBCO BRL, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% ορό θανατηφόρα μόσχου (FCS) (HyClone, Logan, USA), πενικιλλίνη (50 μονάδες /ml), και στρεπτομυκίνη (50 μg /ml) παρουσία 5% CO

2. Η358 (καρκίνος του πνεύμονα), Η1299 (καρκίνος του πνεύμονα), PC3 (καρκίνος του προστάτη), DU145 (καρκίνος του προστάτη), και OVCAR3 (καρκίνος των ωοθηκών) αναπτύχθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FCS, πενικιλίνη (50 μονάδες /ml), και στρεπτομυκίνη (50 μg /ml) σε 5% CO2. Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την Κορέα Κυτταρική Γραμμή Τράπεζα (Σεούλ, Κορέα).

Τα πειράματα σε ζώα

Ο καρκίνος του πνεύμονα κυττάρων (H358), καρκίνου του προστάτη κυτταρική σειρά (DU-145), και καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα (OVCAR3) συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, και 1 × 10

5 βιώσιμα κύτταρα (όπως προσδιορίζεται με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου) σε συνολικό όγκο 200 μΐ ενέθηκαν υποδορίως σε 6 έως 10 εβδομάδων, NOD /SCID ποντίκια. Δύο ημέρες μετά τη σπορά του όγκου, τα ζώα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως μέσω των φλεβών της ουράς με 100 mg /kg γανκυκλοβίρη (GCV) μαζί με είτε 25 μg του κενού πλασμιδίου (Pt. HTP. Con) ή τροποποιημένο σύστημα SB (pT.hTp.HSV-tk. Ενάντιος). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 28 ημέρες μετά την ένεση του όγκου, και η επίδραση του τροποποιημένου συστήματος SB στην ανάπτυξη του όγκου εκτιμήθηκε με μέτρηση του μεγέθους του όγκου. Για την ελαχιστοποίηση πόνου, όλοι χειρουργική διαδικασία εκτελέστηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου. πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας για τα πειράματα σε ζώα του Πανεπιστημίου Jungwon (Αριθμός Άδειας: 2013 έως 0610).

RT-PCR ανάλυση

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από κάθε κύτταρα χρησιμοποιώντας την Απολύτως RNA Microprep κιτ (Stratagene, La Jolla, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και υπέστη επεξεργασία με ϋΝάση Ι για την πρόληψη της μόλυνσης γονιδιωματικού DNA. cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με 1 μg RNA χρησιμοποιώντας το SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen, Calsbad, USA) με ολίγο (dT) εκκινητή (Promega, Madison, USA) σε τελικό όγκο 20 ul. 1 υΙ κλάσματα cDNA χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν το cDNA σε 20 μΐ συνολικού αντίδρασης. Οι συνθήκες PCR για την ενίσχυση ήταν: 94 ° C για 5 λεπτά? 30 κύκλους στους 94 ° C για 1 λεπτό, στους 55 ° C για 1 λεπτό, και στους 72 ° C για 90 sec? και τέλος, 72 ° C για 10 λεπτά). hTR cDNA ενισχύθηκε με συγκεκριμένο σύνολο hTR εκκινητή (5′-tttgtctaaccctaactgagaagg-3 ‘ως προς τα εμπρός και 5′-tgtgagccgagtcctgggtgcacg-3′ ως αντίστροφη). hTERT cDNA ενισχύθηκε με πρόσθιο εκκινητή (5’-cggaagagtctggagcaa-3 ‘) και αντίστροφος εκκινητής (5′-ggatgaagcggagtctgga-3′). Οι διαφορές στην έκφραση από κάθε δείγμα κανονικοποιείται στη GAPDH (προς τα εμπρός 5’-aacgagcggttccgatgccctgag-3 ‘? Αντίστροφη 5′-tgtcgccttcaccgttccagt t-3’). Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% που περιέχει 0,5 μg /ml βρωμιούχου αιθιδίου.

Κατασκευή των πλασμιδίων

πλασμίδια για την Sleeping σύστημα Beauty-μεταθετονίου, pCMV-SB και ρΟΜν MSB (α τρανσποζάσης που έχει μία παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο Ο-τερματικό Asp-Asp-Glu μοτίβο της) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Joonseok Song (University of Pittsburgh) [25]. Για την κατασκευή του πλασμιδίου τρανσποζόνιο, pGL3-ΗΤ-Con και pGL3-ΗΤ-ΤΚ-Con πλασμίδια κόπηκαν με ΚρηΙ και BamHI ένζυμα περιορισμού. Ένα λουσιφεράσης και το γονίδιο Ηδν-ΤΚ συνδέθηκαν με φορέα pT-MCS, που οδήγησε στην pT.hTp.Con και φορείς pT.hTp.HSV-tk.Con αντίστοιχα (Εικ. 1). Ο προαγωγός hTERT και η περιοχή ενισχυτή SV40 ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας Ex Taq DNA πολυμεράση (Takara, Shiga, Japan) και υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα pGL3-ΗΤ-Con. Ο υποκινητής hTERT εμπρός (5′-accaggtagtggattcgcgggcacaga-3 ‘) και ανάστροφα (5′-agatctagggcttcccacgtgcgcag-3′) εκκινητές, και το SV40E εμπρός (5’-gcattcgatggagcgg-3 ‘) και ανάστροφα (5′-ggatccgctgtggaatg-3’) χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές. PCR διεξήχθη για 35 κύκλους στους 94 ° C για 1 λεπτό, στους 60 ° C για 1 λεπτό, και στους 72 ° C για 1 λεπτό.

Για την κατασκευή του πλασμιδίου μεταθετονίου, το pGL3-ΗΤ-Con και pGL3-ΗΤ-ΤΚ-Con πλασμίδια κόπηκαν με ΚρηΙ και BamHI? τα άκρα της κασέτας λουσιφεράσης και της κασέτας HSV-ΤΚ συμπληρώθηκαν με τη χρήση DNA πολυμεράσης Ι και αμβλύ άκρο συνδέθηκε εντός του φορέα pT-MCS, με αποτέλεσμα την pT.hTp.Con και φορείς pT.hTp.HSV-tk.Con, αντίστοιχα. Το πλασμίδιο pT.hTp.nori.Con δομήθηκε από το πλασμίδιο pTnori μέσω της εισαγωγή του προαγωγού ανθρώπινης τελομεράσης (hTERTp) και τον ενισχυτή SV40. Ο προαγωγός SV40 αντικαταστάθηκε με hTERTp με πέψη του πλασμιδίου με pTnori SexAI και ΒσΙΙΙ. Ο ενισχυτής SV40 εισήχθη μεταξύ των θέσεων BsmI και BamHI του pTnori. Ο προαγωγός hTERT και η περιοχή ενισχυτή SV40 ενισχύθηκαν με PCR από τον φορέα pGL3-ΗΤ-Con χρησιμοποιώντας Ex-πολυμεράση Taq.

Η

Λουσιφεράσης δοκιμασία

δοκιμασίες λουσιφεράσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λουσιφεράση Σύστημα δοκιμασίας (Promega, Madison, USA) και AutoLumat LB953 φωτόμετρο (Berthold, Wildbad, Γερμανία) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Εν συντομία, 3 χ 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 16-mm δίσκο καλλιέργειας ιστού διαμολύνθηκαν με 1 μg λουσιφεράσης πλασμίδια ανταποκριτές και 0,25 ug του πλασμιδίου ελέγχου φορέα pSV-β-γαλακτοσιδάσης. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με την προσθήκη 100 υΙ ρυθμιστικού λύσης ανταποκριτή λουσιφεράσης και οι δραστηριότητές τους μετρήθηκαν. Ο υποκινητής πλασμίδιο που περιέχει SV40 pGL3-Promoter χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Η δραστικότητα της λουσιφεράσης του πλασμιδίου pGL3-Promoter σε κάθε κυτταρική σειρά θεωρήθηκε 1, και η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης υπολογίστηκε. Όλες οι δοκιμασίες λουσιφεράσης έγιναν εις τριπλούν.

Το πλασμίδιο επιμόλυνση με θεραπεία GCV in vitro

Καρκίνος και φυσιολογικά κύτταρα (10

5 κύτταρα ανά δίσκο) τοποθετήθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 35-mm πριν την επιμόλυνση, και επιμολύνθηκαν με ρΟΜν-SB ή pCMV-MSB πλασμίδιο με το πλασμίδιο pT.hTp.HSV-TK.Con χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Invitrogen, Carlsbad, USA). Μετά από επώαση στους 37 ° C για 3 ημέρες, 2 ml μέσου που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις γανκικλοβίρης (GCV? InvivoGen, San Diego, USA) προστέθηκαν στα κύτταρα. Όλα τα δεδομένα που δείχνονται στην παρούσα έκθεση ελήφθησαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

δοκιμασία TUNEL

διαλείμματα κλώνου DNA σε αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν με τη δοκιμασία TUNEL χρησιμοποιώντας το In-situ κιτ ανίχνευσης (Roche Molecular Biochemicals, Γερμανία). Τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS για 15 λεπτά και επωάστηκαν σε Triton Χ-100 διαλύματος παγωμένου 0,1% για διαπερατοποίηση για 10 λεπτά σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κυττάρων μετά πλύθηκαν 3 φορές με PBS και αντέδρασαν με 50 μΐ του μίγματος της αντίδρασης TUNEL στους 37 ° C για 60 λεπτά σε ένα σκοτεινό, υγροποιημένο θάλαμο. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS. Σύμφωνα με μικροσκοπία φθορισμού, ο αριθμός των TUNEL-θετικών κυττάρων μετρήθηκε.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα αποπτωτικά ποσοστά σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα μετρήθηκαν με μία αννεξίνης V-FITC Kit (Invitrogen, Carlsbad, ΗΠΑ). Εν συντομία, τα pT.hTp.HSV-TK.Con και pCMV-SB επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GCV (50 μg /ml, 3 ώρες στους 37 ° C) μετά από 10 ημέρες από την επιμόλυνση. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ξεπλύθηκαν με ρυθμιστικό αννεξίνης δέσμευσης 1 × και μετά επαναιωρήθηκαν με 100 μΐ ενός ρυθμιστικού αννεξίνης δέσμευσης 1 ×. Μετά την προσθήκη 5 μΙ FITC αννεξίνης V και 1 μΙ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ? 100 μg /ml), τα κύτταρα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Η αναλογία των βιώσιμων κυττάρων αναλύθηκαν με κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) και ποσοτικοποιούνται με FlowJo λογισμικού (Tree αστεριών Inc., Ashland, USA).

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Ένας αριθμός 5 × 10

3 pT.hTp.HSV-TK.Con και pCMV-SB επιμολυσμένα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Η πλάκα στη συνέχεια επωάστηκε στους 37 ° C και 5% CO2 για 24 ώρες. GCV προστέθηκε στο επίπεδο συγκέντρωσης των 10, 30, 50 μg /ml εις τριπλούν για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 3 ώρες και προστέθηκαν με ΜΤΤ, όπου τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 4 ώρες. Το υπερκείμενο στη συνέχεια απομακρύνθηκε και προστέθηκε DMSO για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης ΜΤΤ. τιμή OD στα 570 nm ανιχνεύτηκε από έναν αναγνώστη μικροπλάκας. ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων ήταν υπολογίζονται: ποσοστό επιβίωσης (%) = A /B × 100 (Α:?: τιμή OD του pT.hTp.Con τιμή OD του pT.hTp.HSV-TK.Con και pCMV-SB επιμολυσμένα κύτταρα Β και pCMV-SB). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. καμπύλη επιβίωσης παράχθηκε με μέσες βιωσιμότητες κάθε κυτταρικών γραμμών ως τεταγμένη άξονας και οι συγκεντρώσεις των GCV ως τετμημένη άξονας

Στατιστική ανάλυση

Κάθε σύνολο πειραμάτων διεξήχθη εις διπλούν ή εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα από κάθε επανάληψη πείραμα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Τα δεδομένα αξιολογήθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και σημαντικά αποτελέσματα περαιτέρω αξιολογήθηκαν από πολλαπλές δοκιμές σύγκρισης του Tukey. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο επίπεδο P & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

hTERT είναι ένας υποσχόμενος στόχος για το SB-μεσολάβηση γονιδιακή θεραπεία

Η επιτυχής γονιδιακή θεραπεία εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό η επιλεκτική έκφραση ενός γονιδίου αυτοκτονίας σε κατάλληλα καρκινικά κύτταρα-στόχους, αλλά όχι στα κανονικά περιβάλλοντα κύτταρα. Η ανθρώπινη ανάστροφη μεταγραφάση τελομεράσης γονίδιο (hTERT), το οποίο κωδικοποιεί την καταλυτική υπομονάδα της τελομεράσης, εκφράζεται έντονα σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και είναι προοδευτικά ρυθμισμένα προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, με αποτέλεσμα την πλήρη αποσιώπηση σε πλήρως διαφοροποιημένα σωματικά κύτταρα. hTERT συχνά επανενεργοποιείται σε περίπου 90% των αθανατοποιημένων ανθρώπινων κυττάρων και καρκινικών κυττάρων διαφόρων προελεύσεων [26] – [28]. Ως εκ τούτου, μπορεί να είναι ένα υποσχόμενο στόχο για γονιδιακή θεραπεία σε μια ποικιλία τύπων όγκου. Πρώτον, εξετάσαμε τα προφίλ έκφρασης των συστατικών ανθρώπινης τελομεράσης RNA (hTR) και hTERT χρησιμοποιώντας RT-PCR σε ινοβλάστες και διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου. hTR ήταν συστατικώς εκφράζεται τόσο στις ινοβλάστες και καρκινικές κυτταρικές σειρές, οι οποίες ήταν συνεπές με προηγούμενες παρατηρήσεις [34]. Η έκφραση του hTERT ανιχνεύθηκε σε όλα τα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων και δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (Η358 και Η1299), δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη (PC3 και DU145), και ένα καρκινικό κύτταρο ωοθηκών γραμμή (OVCAR3), αλλά δεν ανιχνεύθηκε σε οι κυτταρικές σειρές ινοβλαστών δύο (WI-38 και IMR-90) (Εικ. 2). Ως εκ τούτου, η έκφραση των hTERT φάνηκε να συνδέεται στενά με την ανάπτυξη όγκων, και hTERT θα μπορούσε να είναι ένας ελπιδοφόρος στόχος για το SB-μεσολαβούμενη γονιδιακή θεραπεία των διαφόρων τύπων καρκίνου.

Επίπεδα έκφρασης hTERT

hTR και σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και φυσιολογικούς ινοβλάστες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας RT-PCR. Ολικό RNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας hTR και hTERT ειδικούς εναρκτήρες (άνω και μεσαία, αντίστοιχα). έκφραση GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την εξομάλυνση των hTR και hTERT έκφρασης. hTR ήταν συστατικώς εκφράζεται τόσο στις ινοβλάστες και καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η έκφραση του hTERT ανιχνεύθηκε σε όλα τα καρκινικά κύτταρα, ενώ δεν ανιχνεύθηκε στα δύο κυτταρικές σειρές ινοβλαστών. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα (Η358 και Η1299)? καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3 και DU145)? καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (OVCAR3)? κυτταρικές σειρές ινοβλαστών (WI-38 και IMR-90).

Η

Όγκου ειδική ενεργοποίηση του υποκινητή hTERT από τον ενισχυτή SV40

Επειδή η κανονική ή φυσικό προαγωγό δεν ήταν αρκετά ισχυρή για να επάγουν αποτελεσματική έκφραση των θεραπευτικών γονιδίων σε ορισμένα κύτταρα όγκων, ένα ισχυρό ογκοειδικό υποκινητής είναι απαραίτητη για την επίτευξη επιτυχούς μακρόχρονη θεραπευτική γονιδιακή έκφραση. Ιού πιθήκου 40 (SV40) ενισχυτής έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα για τη βελτίωση της δραστηριότητας υποκινητών [32] και το 3 πολυ (Α) ουρά είναι σημαντική για τη σταθερότητα και τη μετάφραση του mRNA [35]. Ετσι, για να αυξηθεί η αντοχή υποκινητή, διατηρώντας παράλληλα την ειδικότητα του ιστού, κατασκευάσαμε ένα ανασυνδυασμένο hTERT υποκινητή που περιείχε τον ενισχυτή SV40 και SV40 πολυΑ (Simian virus 40 ΡοΙγΑ, που ονομάζεται επίσης ΡοΙγΑ). Η αλληλουχία ενισχυτή SV40 ενισχύθηκε και εισάγεται εντός του κλώνου θέση πολλαπλής (MCS) καθοδικά του προαγωγέα hTERT. Η δραστηριότητα μεταγραφή μετά από επιμόλυνση με το πλασμίδιο pT-HTP-Con (με ενισχυτή SV40 και SV40 πολυΑ) ή το PT-HTP-Pro πλασμίδιο (χωρίς ενισχυτή SV40 και SV40 πολυΑ) ανιχνεύθηκε και συγκρίθηκε στις κανονικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές, και η επίδραση του ενισχυτή SV40 επί της δραστικότητας του προαγωγού ειδικού όγκου hTERT αξιολογήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, το πλασμίδιο ρΤ-HTP-Con, το οποίο περιέχει τον ενισχυτή SV40 και SV40 πολυΑ, έδειξαν σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα μεταγραφής στα τελομεράσης θετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου, ενώ δεν υπήρχε μεταβολή στις δύο κανονικές κυτταρικές σειρές ινοβλαστών. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο υποκινητής hTERT παρουσίασε υψηλή σχετικά μεταγραφική δραστηριότητα στις περισσότερες από τις καρκινικές κυτταρικές σειρές ενώ επιδεικνύουν μικρή δραστηριότητα στους φυσιολογικούς ινοβλαστών κυτταρικές σειρές, και ο ενισχυτής SV40 και SV40 πολυΑ αύξησε σημαντικά τη δραστικότητα του προαγωγού hTERT αποκλειστικά στο καρκινικό κύτταρο γραμμές.

Μετά την επιμόλυνση είτε του πλασμιδίου ρΤ-HTP-Con (με ενισχυτή SV40 και SV40 πολυΑ) ή το pT-HTP-Pro πλασμίδιο (χωρίς ενισχυτή SV40 και SV40 πολυΑ), η δράση της λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε και συγκρίνονται σε κανονική και καρκινικές κυτταρικές σειρές. Σε τελομεράση θετικά καρκινικές κυτταρικές σειρές, ο ενισχυτής SV40 και SV40 πολυΑ ενεργοποιήσει το προαγωγό γονιδίου hTERT με τουλάχιστον 7 φορές σε σύγκριση με τη δραστηριότητα του γονιδίου hTERT υποκινητή χωρίς αυτές τις αλληλουχίες. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης τυποποιήθηκε για την επιμόλυνση του πλασμιδίου ελέγχου pGL3-υποκινητή. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα (Η358 και Η1299)? καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3 και DU145)? καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (OVCAR3)? κυτταρικές σειρές ινοβλαστών (WI-38 και IMR-90). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 και *** P & lt?. 0.001

Η

Μακροπρόθεσμη βιωσιμότητα του τροποποιημένου συστήματος παροχής SB σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων

η επιτυχής γονιδιακή θεραπεία εξαρτάται από τη μακροπρόθεσμη βιωσιμότητα των θεραπευτικών γονιδιακής έκφρασης για να θεραπεύσει ή να επιβραδύνει την εξέλιξη της ανάπτυξης του καρκίνου. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη εξέτασε κατά πόσο το σύστημα παροχής SB τροποποιημένο με τον υποκινητή hTERT και ο ενισχυτής SV40 υπέστη μακράς διάρκειας θεραπευτική γονιδιακή έκφραση σε διάφορους τύπους καρκινικών κυτταρικών σειρών. Επειδή η μεταθετάση παράγουν βοηθητικό πλασμίδιο είναι απαραίτητη για την εισαγωγή του SB στα γονιδιώματα του ξενιστή, εμείς συνεπιμολύνονται κανονική ινοβλαστών και καρκινικές κυτταρικές σειρές με μια λουσιφεράσης που εκφράζουν εκδοχή του πλασμιδίου ρΤ-HTP-Con μαζί με είτε το δραστικό βοηθητικό πλασμίδιο ( pCMV-SB) ή το ανενεργό βοηθητικού πλασμιδίου (pCMV-MSB). Όλες οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου που υπέστη σχετικά υψηλότερα επίπεδα δραστικότητας μακροπρόθεσμης λουσιφεράσης με τη χρήση του συστήματος παροχής SB υπό τον έλεγχο του υποκινητή hTERT και τον ενισχυτή SV40 σε σύγκριση με τις κανονικές ινοβλάστες? δεν υπήρξε καμία αλλαγή στις δύο κανονικές κυτταρικές σειρές ινοβλαστών 10 ημέρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. 4). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το τροποποιημένο σύστημα παροχής SB είναι ένας πολλά υποσχόμενος τρόπος για να ενισχυθεί η θεραπευτική αποτελεσματικότητα όταν απαιτείται μακροπρόθεσμη έκφραση των θεραπευτικών προϊόντων.

λουσιφεράσης δοκιμασίες χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των δραστηριοτήτων υποκινητή της έκφρασης λουσιφεράσης πλασμίδιο pT-HTP-Con ακόλουθες συν-επιμόλυνση με είτε το δραστικό βοηθητικό πλασμίδιο (pCMV-SB) ή το ανενεργό βοηθητικό πλασμίδιο (pCMV-MSB) σε Η358, Η1299, PC3, DU145, OVCAR3, WI-38, και IMR-90 κύτταρα . Όλες οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου που περιείχε το σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου που βασίζεται SB, υπό τον έλεγχο του προωθητή hTERT και ο ενισχυτής SV40, υπέστη σχετικά υψηλότερα επίπεδα δραστικότητας μακροχρόνιας λουσιφεράσης από τις κανονικές ινοβλάστες 10 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης τυποποιήθηκε για την επιμόλυνση του πλασμιδίου ελέγχου pGL3-υποκινητή. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα (Η358 και Η1299)? καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3 και DU145)? καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (OVCAR3)? κυτταρικές σειρές ινοβλαστών (WI-38 και IMR-90). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 και *** P & lt?. 0.001

Η

Τροποποιημένο σύστημα παροχής SB αυξάνει ειδική κυτταροτοξικότητα καρκινικών κυττάρων

Η επιτυχής θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση γονιδιακής θεραπείας σε μεγάλο βαθμό εξαρτάται από την ειδική παράδοση του θεραπευτικού προϊόντος στα κατάλληλα καρκινικά κύτταρα-στόχους. ενζυμική θεραπεία προφαρμάκου Gene-κατευθυνόμενη (GDEPT) είναι μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση στην συμβατική χημειοθεραπεία? GDEPT ελαχιστοποιεί τις συστημικές τοξικότητες των συμβατικών φαρμάκων χημειοθεραπείας εισάγοντας καταλυτική ένζυμα σε καρκινικά κύτταρα? Αυτά τα ένζυμα στη συνέχεια να μετατρέψει χαμηλής ή μη-τοξικά προφάρμακα σε τοξικούς μεταβολίτες [1]. Μετά γενετική τροποποίηση των κυττάρων όγκου για να εκφράσουν τα καταλυτικά ένζυμα, συστημική χορήγηση του προφαρμάκου, το οποίο είναι τοπικά μετατρέπεται από το ένζυμο σε κυτταροτοξικούς μεταβολίτες, οδηγεί στην εκλεκτική θανάτωση των κυττάρων του όγκου. Για τον προσδιορισμό της καρκινικού κυττάρου ειδικό τοξικό αποτέλεσμα του SB-based σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου μας, τα καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά ινοβλάστες συν-επιμολύνθηκαν με το τροποποιημένο σύστημα SB (pT.hTp.HSV-tk.Con) μαζί με το δραστικό βοηθητικό πλασμίδιο (pCMV -SB) μετά τη χορήγηση 50 μg /mL γανκυκλοβίρη (GCV). Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς TUNEL σε κύτταρα 10 ημέρες μετά την επιμόλυνση για τον εντοπισμό των αποπτωτικών κυττάρων, οι οποίες χαρακτηρίζονται από την παρουσία πυκνά βάφονται κυκλικών φορέων που αντιπροσωπεύουν το κατακερματισμένο DNA των αποπτωτικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, οι δοκιμασίες TUNEL έδειξαν ότι τα τροποποιημένα SB επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν ένα σημαντικά αυξημένο ποσοστό θανάτου σε σύγκριση με τις κανονικές ινοβλάστες παρουσία 50 μg /mL GCV. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αυτή όγκου ειδικό κυτταρικό θάνατο από το σύστημα παροχής γονιδίου SB-based, μία δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της ειδικής κυτταροτοξικότητας καρκινικών κυττάρων στους φυσιολογικούς ινοβλάστες και καρκινικές κυτταρικές γραμμές που έλαβαν θεραπεία με GCV με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. GCV μόνο είχε αμελητέα επίδραση επί της κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ. 6Α), ενώ διαμόλυνση του τροποποιημένου συστήματος SB (pT.hTp.HSV-tk.Con) μετά τη χορήγηση GCV μειώθηκε σημαντικά η βιωσιμότητα των κυττάρων καρκίνου σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ . 6Β). Επιπλέον, ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίστηκε επίσης με κυτταρομετρία ροής για τον εντοπισμό κυττάρων τα οποία χρωματίστηκαν με αμφότερα Annexin V /FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Τα δεδομένα από τις δοκιμασίες TUNEL και η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν συνεπή με τη ροή μας κυτταρομετρία αποτελέσματα (Εικ. 7). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το σύστημα απελευθέρωσης γονιδίου SB-based μας μεσολάβηση ειδικών θεραπευτικών απελευθέρωσης γονιδίου κυττάρου όγκου, το οποίο με τη σειρά του επάγεται όγκου-ειδικά απόπτωση. in vitro δεδομένα μας πρότεινε ότι η τροποποιημένη SB επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν ένα σημαντικά αυξημένο ποσοστό θανάτου σε σύγκριση με τις κανονικές ινοβλάστες. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε αν η ανάπτυξη του όγκου θα μπορούσε να κατασταλεί με τροποποιημένο σύστημα διανομής SB in vivo. Σε ορισμένες πειραματικές ομάδες, η ανάπτυξη του όγκου κατεστάλη με επιτυχία από τροποποιημένο σύστημα παροχής SB, ενώ οι άλλες ομάδες δεν έδειξαν εμφανή επίδραση κατά των όγκων (Σχ. 8).

Τα επίπεδα κυτταρικής απόπτωσης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το TUNEL δοκιμασία μετά από επιμόλυνση του συστήματος SB (pT.hTp.HSV-tk.Con με ενεργό βοηθητικό πλασμίδιο) και μετά τη χορήγηση 50 μg /mL GCV στο 3 ημέρα μετά την επιμόλυνση. TUNEL θετικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από πυκνά βάφονται κυκλική φορείς που αντιπροσωπεύουν την κατακερματισμένο DNA των αποπτωτικών κυττάρων. SB επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα έδειξαν σημαντικά αυξημένο αριθμό TUNEL-θετικών κυττάρων σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ινοβλάστες παρουσία 50 μg /mL GCV. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα (Η358 και Η1299)? καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3 και DU145)? καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (OVCAR3)? κυτταρικές σειρές ινοβλαστών (WI-38 και IMR-90). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, και *** Ρ & lt?. 0.001

Η

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την ΜΤΤ, με ή χωρίς την επιμόλυνση του συστήματος SB (pT.hTp.HSV- tk.Con με ενεργό βοηθητικό πλασμίδιο) μετά από χορήγηση 10, 30, ή 50 μg /mL GCV στο 3 ημέρα μετά την επιμόλυνση. GCV μόνο είχε αμελητέα επίδραση στο αποτέλεσμα στην βιωσιμότητα των κυττάρων (Α), ενώ διαμόλυνση του συστήματος SB (pT.hTp.HSV-tk.Con με ενεργό βοηθητικό πλασμίδιο) μετά από χορήγηση του GCV ελάττωσε σημαντικά την βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σε ένα δοσο εξαρτώμενο τρόπο (Β). κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα (Η358 και Η1299)? καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3 και DU145)? καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (OVCAR3)? κυτταρικές σειρές ινοβλαστών (WI-38 και IMR-90). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01, και *** Ρ & lt?. 0.001

Η

Καρκινικές κυτταρικές γραμμές και κανονικές ινοβλάστες διαμολύνθηκαν με το σύστημα SB (pT.hTp.HSV-tk.Con με ενεργό βοηθητικό πλασμίδιο). Τα κύτταρα στη συνέχεια προκλήθηκαν με 50 μg /mL GCV, ακολουθούμενη από Annexin V-FITC χρώση /ΡΙ και ανάλυση FACS σε 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα (Η358 και Η1299)? καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3 και DU145)? καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή (OVCAR3)? κυτταρικές σειρές ινοβλαστών (WI-38 και IMR-90).

Η

πνεύμονα καρκινικά κύτταρα (Η358) (Α), του καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή (DU-145) (Β), και τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ( OVCAR3) (C) συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, και 1 × 10

5 βιώσιμα κύτταρα (όπως προσδιορίζεται με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου) σε συνολικό όγκο 200 μΐ ενέθηκαν υποδορίως. Δύο ημέρες μετά τη σπορά του όγκου, τα ζώα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως μέσω των φλεβών της ουράς με 100 mg /kg γανκυκλοβίρη (GCV) μαζί με είτε συν-επιμόλυνση του κενού πλασμιδίου (Pt. HTP. Con) με την ενεργό βοηθητικό πλασμίδιο (pCMV-SB) ή συν-επιμόλυνση του συστήματος SB (pT.hTp.HSV-tk.Con) με την ενεργό βοηθητικό πλασμίδιο (pCMV-SB). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 28 ημέρες μετά την ένεση του όγκου, και η επίδραση του τροποποιημένου συστήματος SB στην ανάπτυξη του όγκου εκτιμήθηκε με μέτρηση του μεγέθους του όγκου.

Η

Συζήτηση

Πολλά φάρμακα που χρησιμοποιούνται συχνά χημειοθεραπεία έλλειψη ειδικότητας όγκου , και οι δόσεις που απαιτούνται για την επίτευξη θεραπευτικών επιπέδων στον όγκο είναι συχνά τοξικά για τα περιβάλλοντα φυσιολογικούς ιστούς. Ως εκ τούτου, τα συστήματα ενεργοποίησης προφαρμάκου που περιλαμβάνουν γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας είναι ελπιδοφόρες εναλλακτικές λύσεις για συμβατική χημειοθεραπεία? Αυτά τα συστήματα ελαχιστοποιούν τις συστηματικές τοξικότητες των συμβατικών φαρμάκων χημειοθεραπείας. Για κλινική εφαρμογή, τα γονίδια αυτοκτονίας πρέπει να πληρούν τα ακόλουθα κριτήρια: α) τα γονίδια αυτά πρέπει να είναι είτε δεν εκφράζεται είτε υπάρχουν σε εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα στη χώρα υποδοχής?