Αφηρημένο

Ιστορικό

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε εάν η έκφραση της πρωτεΐνης PKR συσχετίζεται με επίπεδα mRNA και αξιολογήθηκαν επίσης μοριακών βιοδεικτών που σχετίζονται με PKR, όπως φωσφορυλιωμένο PKR (ρ-PKR) και φωσφορυλιωμένου eIF2α (ρ-eIF2α).

Μεθοδολογία και Εκτίμηση

προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης PKR και mRNA σε 36 νωπά ιστούς πρωτογενούς όγκου πνεύμονα με χρήση ανάλυσης Western blot και PCR πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR), αντίστοιχα. Χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχίες ιστού για ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση της έκφρασης του ρ-PKR και πρωτεϊνών ρ-eIF2α. Έχουμε αποδείξει ότι τα επίπεδα του mRNA PKR είναι συσχετίστηκε σημαντικά με τα επίπεδα PKR πρωτεΐνη (rho Spearman είναι = 0,55,

ρ

& lt? 0.001), υποδηλώνοντας ότι τα επίπεδα PKR πρωτεΐνη σε δείγματα όγκων ρυθμίζονται από PKR mRNA. Παρατηρήσαμε επίσης ότι οι ασθενείς με υψηλά ρ-PKR ή έκφραση ρ-eIF2α είχαν σημαντικά μεγαλύτερη μέση επιβίωση από εκείνους με μικρή ή καθόλου ρ-PKR ή έκφραση ρ-eIF2α (

σ

= 0,03 και

p

= 0,032, αντίστοιχα). Αξιολογήσαμε περαιτέρω την προγνωστική επίδραση της συνδυασμένης έκφρασης p-PKR συν PKR και p-eIF2α συν PKR και διαπίστωσε ότι και οι δύο συνδυασμοί ήταν ισχυρός ανεξάρτητος προγνωστικοί δείκτες για τη συνολική επιβίωση των ασθενών στη σκηνή εγώ και όλοι οι ασθενείς σταδίου.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης PKR μπορεί να ελέγχεται από το επίπεδο της μεταγραφής. Συνδυασμένη επίπεδα έκφρασης του PKR και π-PKR ή ρ-eIF2α μπορεί να είναι νέα δείκτες για την πρόβλεψη της πρόγνωσης των ασθενών με NSCLC

Παράθεση:. Αυτός Υ, Correa AM, Ράσο MG, Hofstetter WL, Fang Β, Behrens C, et al. (2011) Ο ρόλος της PKR /eIF2α μονοπάτι σηματοδότησης στην πρόγνωση των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (11): e24855. doi: 10.1371 /journal.pone.0024855

Συντάκτης: John D. Minna, Πανεπιστήμιο του Τέξας Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Μαρτίου, 2011? Αποδεκτές: 22 του Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 10 Νοέμ, 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση: Το έργο αυτό υποστηρίζεται εν μέρει από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας μέσω MD Anderson Cancer Center της Υποστήριξης Grant CA-016672 – Lung Πρόγραμμα, μια εξειδικευμένη. πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας (SPORE) Επιχορήγηση CA-070907 (για IW), και ένα R01 Grant CA-124591 (για να BF). Περαιτέρω στήριξη ήρθε από το Τμήμα Άμυνας χορηγούν W81XWH-07-1-0306 (με IW), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30600611, 81071912) (για να YH) και «1510 του έργου» του Τρίτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Κίνας (σε YH), και από τον Όμηρο λουλούδι Gene Therapy Ταμείο, το Charles Rogers Gene Therapy Ταμείο, το Margaret Wiess Elkins Προικισμένο Ταμείο Έρευνας, της χλωρίδας και Stuart Mason καρκίνο του πνεύμονα Ταμείο Έρευνας, το Phalan θώρακος Gene Therapy Ταμείο, και το George P. Sweeney οισοφάγου Ταμείου Έρευνας (σε SS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις. LY είναι υπάλληλος της Ziren Research LLC. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η πρωτεϊνική κινάση (PKR) είναι μια ιντερφερόνη επαγόμενο σερίνης /θρεονίνης που μεσολαβεί πρωτεϊνική σύνθεση, μια αυστηρά ελεγχόμενη διεργασία που είναι κρίσιμη για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση [1] – [3]. Αυξημένη έκφραση PKR έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με την καλύτερη πρόγνωση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου και του παχέος εντέρου [2], [3], και συσσώρευση στοιχεία καταδεικνύουν ότι PKR μπορεί να δρα ως καταστολέας όγκων σε λευχαιμία και άλλες αιματοποιητικές κακοήθειες [4], [ ,,,0],5]. Η δέσμευση του είτε δίκλωνο RNA (dsRNA) ή δομημένα μονόκλωνο RNA που μπορούν να μεσολαβήσουν φωσφορυλίωση της PKR [6], [7]. Η ενεργοποιημένη PKR φωσφορυλιώνει καλά τεκμηριωμένες κατάντη στόχο της, την άλφα υπομονάδα του παράγοντα έναρξης της πρωτεϊνικής σύνθεσης eIF2 (eIF2α), οδηγώντας σε αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης και εκμαίευσης αντιική και αντικαρκινική δράση [8], [9]. Εκτός από το ρόλο της στην μεταφραστικού ελέγχου, PKR έχει ενοχοποιηθεί σε αντι-ιική έμφυτη ανοσία, απόπτωση, κυτταρικό πολλαπλασιασμό, και στρες σηματοδότηση [10]. Επιπλέον, η έκφραση PKR και αυτοφωσφορυλίωση αυξάνονται σε ορισμένα είδη καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, του καρκίνου του παχέος εντέρου, του μαστού και του καρκίνου του [11], [12]. Τα αποτελέσματα αρκετών μελετών έχουν αποδείξει την σημασία της φωσφορυλιωμένης eIF2α (ρ-eIF2α) στη θεραπεία του καρκίνου [10], [13], [14]: ενεργοποίηση του μονοπατιού φωσφορυλίωσης PKR-eIF2a είναι απαραίτητη για τις αντιπολλαπλασιαστικές και προαποπτωτική λειτουργίες του ογκοκατασταλτικό γονίδιο [15].

Πρόσφατα βρήκαμε ότι η χαμηλή έκφραση του dsRNA εξαρτώμενη PKR συσχετίστηκε σημαντικά με μικρότερη επιβίωση σε ασθενείς με NSCLC, γεγονός που υποδηλώνει ότι βιολογικές λειτουργίες του PKR ή μεταγενέστερα μόρια του θα μπορούσε να είναι πολύτιμη προγνωστικούς παράγοντες σε NSCLC [1]. Σε αυτή τη νέα μελέτη, ο στόχος μας ήταν να καθοριστεί εάν η έκφραση της πρωτεΐνης PKR σχετίζεται με τα επίπεδα του mRNA και αν κατάντη στόχοι της, όπως φωσφορυλιωμένο PKR (ρ-PKR) και ρ-eIF2a, είναι επίσης προγνωστικούς παράγοντες NSCLC. Έχουμε καθορίζεται πρώτα το επίπεδο και πρωτεΐνης έκφραση PKR mRNA σε νωπά-κατεψυγμένα ιστού NSCLC και βρήκε μια θετική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης PKR και τα επίπεδα mRNA. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση, ερευνήσαμε την έκφραση της ρ-PKR και καλώς χαρακτηρισμένα κατάντη μόριο ρ-eIF2α της σε αρχειοθετημένα δείγματα μικροσυστοιχιών ιστού. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η p-PKR και π-eIF2α είναι προγνωστικά βιοδείκτες των αποτελεσμάτων NSCLC και ότι όταν η έκφραση της PKR ήταν σε συνδυασμό με την έκφραση της p-PKR ή ρ-eIF2α, το αποτέλεσμα για την πρόβλεψη της επιβίωσης των ασθενών βελτιώθηκε.

Αποτελέσματα

έκφραση PKR πρωτεΐνη συσχετίζεται με τα επίπεδα του mRNA

Για να διερευνηθεί αν η έκφραση PKR πρωτεΐνη σχετίζεται με τα επίπεδα του mRNA, θα καθοριστεί η πρωτεϊνική έκφραση PKR και π-PKR και PKR mRNA επίπεδα σε 36 φρέσκα ιστούς πρωτογενούς όγκου πνεύμονα χρησιμοποιώντας ανάλυση Western blot και πραγματικού χρόνου RT-PCR, αντίστοιχα. Πρωτεΐνη έκφραση της β-ακτίνης και τα επίπεδα του mRNA προσδιορίσθηκαν επίσης και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων Western blotting έδειξαν ότι τα δείγματα όγκων που εκφράζονται διαφορετικά επίπεδα PKR τόσο σε πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA (Σχήμα 1Α και 1Β). Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης PKR και τα επίπεδα του mRNA. (Rho του Spearman = 0,55,

σ

& lt? 0.001? Σχήμα 1C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η γονιδιακή έκφραση PKR μπορεί να προκαλέσει τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PKR σε όγκους.

Α. Ανάλυση κηλίδας Western των PKR και πρωτείνη ρ-PKR σε δείγματα όγκων. Μια πυκνομετρική ανάλυση της αναλογίας του PKR ή PKR σε β-ακτίνη είναι αντιπροσωπεύει κανονικοποιημένα επίπεδα πρωτεΐνης. Κάθε λωρίδα αντιπροσωπεύει ένα δείγμα όγκου από έναν μεμονωμένο ασθενή. επίπεδα Β mRNA από αντίστοιχα δείγματα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Επίπεδα β-ακτίνης mRNA και πρωτεΐνη του ίδιου δείγματος χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Γ Διάγραμμα διασποράς της έκφρασης της πρωτεΐνης PKR συσχετίζεται με την έκφραση του mRNA (rho του Spearman = 0,55,

σ

& lt? 0.001).

Η

Συσχέτιση μεταξύ p-PKR και p-eIF2α έκφραση της πρωτεΐνης σε NSCLC όγκους με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά

Επειδή η βιολογική λειτουργία του PKR συνδέεται στενά με την φωσφορυλίωση του, και φωσφορυλίωση eIF2α είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της ενεργοποίησης PKR, αξιολογήσαμε την επόμενη την έκφραση της ρ-PKR και πρωτεϊνών ρ-eIF2α σε TMA δείγματα χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τις σχέσεις μεταξύ ρ-PKR ή έκφραση ρ-eIF2α και άλλα κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά. Υψηλή έκφραση ρ-PKR συνδέθηκε με τον υπότυπο αδενοκαρκινώματα (

ρ

& lt? 0.001). Καμία συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του p-PKR έκφρασης και το φύλο το φύλο, το στάδιο TNM, ή το κάπνισμα. Βρήκαμε επίσης καμία συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης p-eIF2α και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά. Αντιπροσωπευτικά εικόνες ανοσοϊστοχημική χρώση για τα αποτελέσματα ρ-PKR και π-eIF2α φαίνεται στο Σχήμα 2. Το ρ-PKR και ρ-eIF2α πρωτεΐνες που εκφράζονται στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων.

Υψηλή εκφράζουν περιπτώσεις (Α και C). Low-εκφράζουν περιπτώσεις (Β και D). Η έκφραση του ρ-PKR και ρ-eIF2α ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα.

Η

Συσχέτιση μεταξύ ρ-PKR και η έκφραση πρωτεΐνης ρ-eIF2α σε όγκους NSCLC με έκβασης της νόσου

για να αξιολογηθεί περαιτέρω εάν η έκφραση p-PKR ή ρ-eIF2α πρωτεΐνη συσχετίζεται με την κλινική έκβαση των ασθενών με NSCLC, η ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι για το στάδιο Ι και όλα τα στάδια, οι ασθενείς με σχετικά υψηλές π-PKR είχαν σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση από αυτούς με λίγη ή όχι p-PKR έκφρασης (Σχήμα 3Α και 3C). Για όλους τους ασθενείς σταδίου, ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης ήταν 105 μήνες για τους ασθενείς με υψηλά ρ-PKR έκφραση και 51 μήνες για τους με μικρή ή καθόλου ρ-PKR έκφρασης. Μια σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε επίσης ανάμεσα υψηλή έκφραση της πρωτεΐνης p-eIF2α και πλέον επιβίωσης για το στάδιο Ι και όλα τα στάδια (Σχήμα 3D και 3F). Δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ υψηλής π-PKR ή υψηλής π-eIF2α έκφραση της πρωτεΐνης και πλέον επιβίωσης για τα στάδια ΙΙ-IV (Σχήμα 3Β και 3Ε).

Α-F. καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier, σύμφωνα με τις διαφορές στην (Α, Β, C) ρ-PKR και (D, E, F) ρ-eIF2-α έκφραση σε ασθενείς με σταδίου Ι (A, D), τα στάδια II-IV ( Β, Ε) και όλα τα στάδια (C, F) NSCLC. Τα ποσοστά επιβίωσης ήταν σημαντικά χειρότερες στους ασθενείς με χαμηλή π-PKR ή έκφραση p-eIF2α ό, τι σε εκείνες με υψηλή π-PKR ή έκφραση p-eIF2α (Στάδιο Ι:

σ

= 0,01 και

p

= 0,02? Όλα τα στάδια:.

σ

= 0,03 και

σ

= 0,03, αντίστοιχα)

Η

σε μια μονοπαραγοντική ανάλυση, ένα αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλο έδειξε ότι η ρ-PKR και ρ-eIF2α είχαν προγνωστική σημασία (Πίνακας 2). Σε μία πολυμεταβλητή ανάλυση, βρήκαμε ότι το ρ-PKR και έκφραση ρ-eIF2α ήταν στατιστικά σημαντικές σχετίζονται με την επιβίωση (Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η p-PKR και την έκφραση p-eIF2α είναι ανεξάρτητες βιοδείκτες της επιβίωσης των ασθενών.

Η

Επίσης εξετάσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του PKR, π-PKR, και π-eIF2α. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση p-PKR συσχετίζεται σημαντικά με p-eIF2a έκφρασης (rho του Spearman = 0,48,

σ

& lt? 0.001). έκφραση PKR επίσης συσχετίστηκε σημαντικά με την έκφραση της p-PKR (rho του Spearman = 0,31,

σ

= 0,004) και p-eIF2α (rho του Spearman = 0,45,

σ

& lt? 0.001). Αξιολογήσαμε περαιτέρω την προγνωστική επίδραση της συνδυασμένης έκφρασης ρ-PKR συν PKR και ρ-eIF2α συν PKR και βρέθηκε ότι και οι δύο συνδυασμοί ήταν ισχυρός ανεξάρτητος προγνωστικοί δείκτες για τη συνολική επιβίωση των ασθενών στη σκηνή Ι (Σχήμα 4Α και 4Β) και όλοι οι ασθενείς σταδίου (Σχήμα 4C και 4D). Για όλους τους ασθενείς σταδίου, οι ασθενείς με υψηλά PKR και υψηλής π-PKR έκφραση είχαν διάμεσο χρόνο επιβίωσης 132 μήνες, η οποία ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των ασθενών με υψηλή PKR και χαμηλής π-PKR έκφραση (μέση επιβίωση, 80 μήνες? Σχήμα 4C ). Οι ασθενείς με μικρή ή καθόλου PKR και ρ-PKR έκφραση είχαν σημαντικά μικρότερη μέση επιβίωση (43 μήνες? Σχήμα 4C). Υπάρχει μια διαφορά στο αποτέλεσμα για PKR (H) /ρ-PKR (H) έναντι PKR (L) /ρ-PKR (H) ασθενείς σε Σχήμα 4Α. γκάμα βαθμολογία IHC μας είναι 0-300 για PKR και p-PKR. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιούμε μεσαίο cut-off (150 για την PKR και 70 για την p-PKR). Στο σχήμα 4Α, οι ασθενείς 106 το στάδιο Ι χωρίζονται σε τέσσερις ομάδες, 43 ασθενείς με υψηλή PKR και υψηλής π-PKR, 21 ασθενείς με υψηλή PKR και χαμηλής π-PKR έκφραση, 32 ασθενείς με χαμηλή PKR και έκφραση ρ-PKR και 10 ασθενείς με χαμηλή PKR και υψηλής π-PKR έκφρασης. Αυτοί οι 10 ασθενείς έχουν π-PKR φάσμα βαθμολογία 80-120, είναι πολύ κοντά στο μεσαίο cut-off βαθμολογία (70), και μπορεί επίσης να ανήκουν σε χαμηλό PKR χαμηλής ομάδα π-PKR. Για όλους τους ασθενείς σταδίου, οι ασθενείς με υψηλά PKR και υψηλής π-eIF2α έκφραση είχαν διάμεσο χρόνο επιβίωσης 132 μήνες, η οποία ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των ασθενών με υψηλή PKR συν έκφραση χαμηλού ρ-eIF2α (διάμεση επιβίωση, 80 μήνες) και εκείνους με χαμηλή PKR συν έκφραση υψηλού ρ-eIF2α (διάμεση επιβίωση, 47 μήνες? Εικόνα 4D). Τέλος, οι ασθενείς με μικρή ή καθόλου έκφραση τόσο PKR και ρ-eIF2α είχαν σημαντικά μικρή μέση επιβίωση (διάμεση επιβίωση, 35 μήνες? Εικόνα 4D).

Α και το ποσοστό επιβίωσης C. ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε ασθενείς με χαμηλό PKR ή χαμηλή π-PKR έκφρασης σε σχέση με εκείνους με υψηλή PKR ή υψηλής π-PKR έκφρασης στη σκηνή Ι (Α) και όλα τα στάδια (C) (

σ

= 0.001 και

p =

0,001, αντίστοιχα). Β και το ποσοστό D. Η επιβίωση ήταν επίσης σημαντικά χαμηλότερη σε ασθενείς με χαμηλό PKR ή χαμηλή έκφραση p-eIF2α ό, τι σε εκείνες με υψηλή PKR ή υψηλή έκφραση p-eIF2α για το στάδιο Ι (Β) και όλα τα στάδια (D) (

p

= 0.001 και

σ

= 0,001, αντίστοιχα).

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι τα επίπεδα PKR mRNA που συνδέονται με την PKR πρωτεΐνη έκφραση σε πρωτογενείς όγκους NSCLC. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης PKR μπορεί να ελέγχει τα επίπεδα μεταγραφής. Περαιτέρω, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι πραγματικού χρόνου RT-PCR, μία ευαίσθητη μέθοδος για ποσοτική ανάλυση των επιπέδων mRNA, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των επιπέδων του mRNA σε δείγματα βιοψίας και θα μπορούσε επομένως να είναι χρήσιμες για την πρόβλεψη της επιβίωσης των ασθενών. Βρήκαμε επίσης ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση ρ-PKR είχαν σημαντικά μεγαλύτερη μέση επιβίωση από εκείνους με την έκφραση της πρωτεΐνης μικρή ή καθόλου ρ-PKR. Αποτελέσματα διαφόρων μελετών των ανθρώπινων κακοηθειών έχουν δείξει ότι η υψηλή έκφραση PKR δείχνει ευνοϊκή πρόγνωση για τους ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα της κεφαλής ή του ήπατος [2], [16], υποδηλώνοντας έτσι ότι το PKR μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην καταστολή της προόδου των όγκων και επηρεάζουν απόπτωση [17]. Έχουμε επίσης μελετήσει οδούς PKR και έχουν βρεθεί να είναι σαφώς απαραίτητο για την επαγωγή απόπτωσης σε ορισμένα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, μετά από ορισμένες θεραπείες, όπως το μελάνωμα γονίδιο διαφοροποίησης σχετιζόμενη 7 (

MDA7

), E2F-1 , και TNFa [18], [19]. Πιο πρόσφατα, εμείς και άλλοι απέδειξαν ότι μερικές μικρές ενώσεις μπορούν να προκαλέσουν PKR εξαρτώμενη απόπτωση στα δύο καρκινικά κύτταρα και τα εμβρυϊκά ινοβλάστες ποντικού [20], [21], υποδεικνύοντας ότι η ρύθμιση της δράσεως PKR θα μπορούσε να είναι μια ενδιαφέρουσα προσέγγιση στην θεραπεία του καρκίνου. Η ανακάλυψή μας ότι τα καρκινικά κύτταρα NSCLC που εκφράζουν ένα υψηλό επίπεδο της ρ-PKR συσχετίζονται με ευνοϊκή πρόγνωση είναι συνεπής με προηγούμενες παρατηρήσεις ότι η ενεργοποίηση PKR σχετίζεται με την επαγωγή απόπτωσης.

Τα ευρήματά μας έδειξαν επίσης ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του τόσο PKR και p-PKR είχαν σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση από ό, τι τα άτομα με άλλους συνδυασμούς των επιπέδων έκφρασης, συμπεριλαμβανομένων εκείνων θετικό για PKR και αρνητικά για p-PKR και εκείνων αρνητικές τόσο για PKR και p-PKR. Η παρατήρησή μας ότι το 53% των δειγμάτων όγκου NSCLC εκφράζεται έντονα PKR και ότι το 61% από αυτούς εντόνως εκφρασμένων ρ-PKR [τα δεδομένα δεν απεικονίζονται] Αυτά τα αποτελέσματα μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι η έκφραση PKR (δηλαδή, PKR) και ενεργοποίηση PKR (δηλαδή, ρ -PKR) επηρεάζονται από διαφορετικές έκφραση του ενεργοποιητή PKR ή αναστολέας PKR. Άλλοι ερευνητές έχουν αναφέρει ότι η λειτουργία του PKR μπορεί να ρυθμίζεται με κυτταρικές πρωτεΐνες είτε θετικά (π.χ. MDA-7 /ιντερλευκίνης-24 και PKR ενεργοποίησης πρωτεΐνης [PACT]) ή αρνητικά (π.χ., p58IPK, nucleophosmin και πρωτεΐνες θερμικού σοκ 90 και 70) [18], [19]. Σε μελλοντικές μελέτες, θα επιδιώξει να καθορίσει ποια PKR ενεργοποιητών και αναστολέων επηρεάζουν το σηματοδοτικό μονοπάτι PKR σε δείγματα όγκων NSCLC.

Παρατηρήσαμε ότι οι όγκοι με υψηλή έκφραση p-eIF2α είχαν σημαντικά μεγαλύτερη μέση επιβίωση. Σε επιπλέον, αποδείξαμε ότι οι ασθενείς με υψηλές εκφράσεις τόσο PKR και ρ-eIF2α είχαν επίσης σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση από ό, τι εκείνοι με άλλους συνδυασμούς των επιπέδων έκφρασης. Η ανακάλυψή μας ότι το 47% των δειγμάτων του όγκου είχαν χαμηλή έκφραση PKR και 27% είχαν υψηλή έκφραση ρ-eIF2α [τα δεδομένα δεν απεικονίζονται]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση eIF2α σε μερικούς όγκους NSCLC συμβαίνει ανεξάρτητα από την οδό PKR. Εκτός από PKR, έχουν τρεις διαφορετικές κινάσες eIF2α που μπορεί να φωσφορυλιώνει eIF2α ως απάντηση σε διάφορες συνθήκες άγχους έχουν εντοπιστεί: αίμης-ρυθμίζεται αναστολέα, το ομόλογο του

Saccharomyces cerevisiae

πρωτεϊνική κινάση γενικό έλεγχο μη-αποκατασταλόμενου-2, και RNA- εξαρτώμενη-πρωτεΐνης-κινάση-όπως ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) κινάση (PERK? επίσης γνωστή ως παγκρέατος κινάση eIF2α) [13]

Εν κατακλείδι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι PKR /φωσφορυλιωμένη PKR /φωσφορυλιωμένη eIF2α μονοπατιού σηματοδότησης. διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην πρόγνωση για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). δραστηριότητες οδός PKR μπορεί να είναι χρήσιμη για την πρόβλεψη των αποτελεσμάτων NSCLC, και ρυθμίζοντας τις δραστηριότητες της οδού PKR μπορεί να είναι μια πιθανή επιλογή θεραπείας NSCLC.

Μέθοδοι

Ασθενείς και ιστοί

ασθενών με NSCLC οι οποίοι ήταν που υποβάλλονται σε ριζική εκτομή του πρωτοπαθούς καρκίνου τους στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο καρκίνου μεταξύ του 2007 και του 2008 χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη αυτή με βάση τη διαθεσιμότητα. Οι ασθενείς εξαιρέθηκαν από τη μελέτη εάν είχαν υποβληθεί προηγουμένως σε ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία για καρκίνο. Οι ασθενείς όλων παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των ιστών τους, καθώς και η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό μας Συμβούλιο Institutional Review (Πανεπιστήμιο του Τέξας, MD Anderson Cancer Κέντρο). Αφού εκτομή χειρουργικά, κάθε φρέσκο ​​όγκου αμέσως διαιρείται σε δύο μέρη? ένας ήταν αμέσως καταψύχεται και αποθηκεύεται σε υγρό άζωτο για την εκχύλιση των πρωτεϊνών και RNA, και η άλλη στερεώθηκε με φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη για τη συνήθη ιστοπαθολογική αξιολόγηση και διάγνωση. Οι ιστοί με την εκτίμηση της περιεκτικότητας των κυττάρων του όγκου κατά 70% ή περισσότερο χρησιμοποιήθηκαν για μοριακές αναλύσεις. Εκτός από τους ιστούς των ασθενών μας, πήραμε 193 NSCLC μικροσυστοιχίες ιστών (ΤΜΑ) δείγματα (114 αδενοκαρκινώματα, και 74 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα) μεταξύ 1997 και 2001 από τον καρκίνο του πνεύμονα εξειδικευμένο πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας Tissue Bank στο MD Anderson Κέντρο Καρκίνου (Χιούστον , ΤΧ). Όλα τα δείγματα είχαν ιστολογικά εξετάστηκαν και ταξινομήθηκαν με τη χρήση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας το σύστημα του 2004 ταξινόμησης [22]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, λεπτομερή κλινική και παθολογική πληροφοριών, συμπεριλαμβανομένων των δημογραφικών δεδομένων των ασθενών, το ιστορικό καπνίσματος, και τη συνολική επιβίωση συν σταδιοποίηση ΤΝΜ νόσου και τον χρόνο επανεμφάνισης, ήταν διαθέσιμο (Πίνακας 1).

Ανάλυση Western Blot

Κατεψυγμένα ιστούς όγκων αρχικά preparared με το να πλένονται δύο φορές με κρύο PBS. Περίπου 20 mg ιστού από κάθε φρέσκο ​​δείγμα ομογενοποιήθηκε σε 0,5 ml παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1% ΝΡ40, 50 mM HEPES [ρΗ 7,4], 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl

2, 100 mM NaF, 1 mM EGTA, 1 mM Na

3νο

4, 10% γλυκερόλη, και 10 mM Να πυροφωσφορικού [Roche Applied Science]), που περιέχει προσφάτως προστιθέμενου αναστολέα πρωτεάσης και φωσφορικό άλας. Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 14,000 g σε μικροφυγόκεντρο στους 4 ° C για 10 λεπτά, και τα προκύπτοντα υπερκείμενα χρησιμοποιήθηκαν ως εκχυλίσματα ιστού. Τα εκχυλίσματα, που ισοδυναμεί με 60 μg της συνολικής πρωτεΐνης, διαχωρίστηκαν με τη χρήση ενός 10% πηκτώματος SDS-πολυακρυλαμιδίου και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με TBS που περιείχε 5% άπαχο γάλα σε σκόνη και, στη συνέχεια, ανιχνεύθηκαν σε PBS που περιέχει 5% βόειο ορό. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-PKR (K-17? Santa Cruz Biotechnology) κουνελιού, κουνελιού αντι-ρ-PKR (pT446) (Epitomics), κουνελιού αντι-ρ-eIF2a (Epitomics) και ποντικού αντι-β-ακτίνης (Sigma). Ανοσοδραστικές ταινίες ανιχνεύονται και προσδιορίζονται ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης Li-Cor Οδύσσεια.

Η αντίστροφη μεταγραφή και σε πραγματικό χρόνο απόλυτη ποσοτική αντίστροφη-μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Real-Time AqRT-PCR)

Το συνολικό RNA (1 μα) από κάθε κατεψυγμένο κλινικό δείγμα εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης ΤπζοΙ (Invitrogen) και μεταγράφηκε αντίστροφα σε ένα όγκο αντίδρασης 20 μL, χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια Taqman αντίστροφης μεταγραφής (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα cDNA αραιώθηκαν και ποσοτικά για έκφραση PKR χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR (SYBR Green Ι) (εκτελείται από Ziren Research LLC, Irvine, CA). Ένα ενιαίο πρότυπο ενσωματώθηκε να προσδιοριστεί η απόλυτη αναλογία της έκφρασης του κάθε γονιδίου στόχου και αναφοράς, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Οι αλληλουχίες εκκινητών για PKR ήταν ως εξής: προς τα εμπρός, 5′-TCTTCATGTATGTGACACTGC-3 ‘, και αντίστροφη, 5′-CACACAGTCAAGGTCCTT AG-3’

χρησιμοποιούνται ανοσοϊστοχημική χρώση και Αξιολόγησης

Τα αντισώματα. για ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιήθηκαν επίσης για ανοσοϊστοχημική χρώση. Σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και τα τμήματα ιστολογίας ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη (πάχους 5-μm) αποπαραφινοποιήθηκαν, ενυδατωμένο και θερμάνθηκε σε ατμιστή για 10 λεπτά με 10 mmol /L κιτρικού νατρίου (ρΗ 6.0) για ανάκτηση αντιγόνου. Υπεροξειδάσης εμποδίστηκε με 3% Η

2O

2 σε μεθανόλη σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από επώαση σε 10% αλβουμίνη βόειου ορού σε ΤΒδ-Τ για 30 λεπτά. Τα πλακίδια επόμενα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε 1:100 αραιώσεις επί 65 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα επισημασμένο με βιοτίνη για 30 λεπτά. Τέλος, τα δείγματα επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη-υπεροξειδάση σε αραίωση 1:40 για 30 λεπτά. Τα δείγματα στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,05% 3 ‘, 3-διαμινοβενζιδίνη τετραϋδροχλωρική παρασκευάστηκε στο 0,05 mol /L ρυθμιστικό διάλυμα Tris (ρΗ 7,6) που περιείχε 0,02% Η

2O

2 και ακολούθως με αιματοξυλίνη. Ως θετικός έλεγχος, χρησιμοποιήθηκαν μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί των πνευμόνων με φυσιολογικό βρογχικό επιθήλιο. Ως αρνητικός έλεγχος, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα ιστού που δεν επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα. Ανοσοϊστοχημική χρώση ποσοτικοποιήθηκε από δύο ανεξάρτητους παθολόγους (Drs. Raso και Pataer) με σκορ ένταση τεσσάρων αξία περιγράφηκε προηγουμένως [1].

Στατιστική Ανάλυση

Ο διάμεσος χρησιμοποιήθηκε ως σημείο αποκοπής p-PKR και p-eIF2a. Οι βιοδείκτες διαχωρίστηκαν μεταξύ τους σε χαμηλού και υψηλού επιπέδου ομάδες ως εξής: π-PKR: χαμηλή (score≤70), υψηλή (βαθμολογία & gt? 70)? και p-eIF2a: χαμηλή (score≤150), υψηλή (βαθμολογία & gt? 150). Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, ανεξάρτητο δείγμα

t

και

X

2

δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση συνεχείς και κατηγορικές μεταβλητές, αντίστοιχα. Επιβίωση πιθανότητα ως συνάρτηση του χρόνου υπολογίστηκε με τη χρήση του εκτιμητή Kaplan-Meier. Η δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για συγκρίσεις μεταξύ ομάδων του χρόνου επιβίωσης των ασθενών. Η Cox μοντέλο αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της επίδρασης του π-PKR και ρ-eIF2a έκφραση στο χρόνο επιβίωσης, με προσαρμογές που γίνονται για την κλινική και ιστοπαθολογική παραμέτρους (ηλικία, φύλο, κάπνισμα και όγκου ιστολογική υποομάδα. Η δοκιμασία δύο όψεων ήταν χρησιμοποιείται για τη δοκιμή ίση αναλογία μεταξύ των ομάδων στην αμφίδρομη πίνακες έκτακτης ανάγκης Η γενικευμένη εκτίμηση προσέγγιση εξίσωση χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των διαφορών των μέσων για τα δεδομένα στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο P & lt?… 0.05

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Markeda Wade για τη συντακτική αναθεώρηση. ευχαριστούμε Denise Μ Woods και Lakshimi Kakarala για τεχνική βοήθεια τους.