Αφηρημένο

Ιστορικό

Ακτιβίνης υποδοχέα 2 (

ACVR2

) είναι συχνά μεταλλάσσεται σε μικροδορυφορικού ασταθής (MSI) καρκίνοι του παχέος εντέρου, με αποτέλεσμα την απώλεια της πρωτεΐνης, αναστάτωση, και μεγαλύτερους όγκους σηματοδότησης. Εδώ, εξετάσαμε ακτιβίνης αναστάτωση στην μικροδορυφορικού σταθερή (MSS) καρκίνοι του παχέος εντέρου σηματοδότησης.

Μέθοδοι

Πενήντα ένα πληθυσμό με βάση το MSS καρκίνων του παχέος εντέρου αξιολογήθηκαν για ACVR1, ACVR2 και πρωτεΐνες pSMAD2. Συναίνεση μετάλλαξη επιρρεπείς τμήματα του

ACVR2

αλληλουχήθηκαν σε πρωτογενείς καρκίνους και όλες τις εξόνες σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Απώλεια της ετεροζυγωτίας (ΑΕ) αξιολογήθηκε για

ACVR2

και

ACVR1

, και

ACVR2

μεθυλίωση προαγωγού με μεθυλίωση-ειδική PCR και όξινο θειώδες αλληλουχίας και χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) φαινότυπο μέσω φθορισμού ανάλυση ΑΕ 3 διπλές δεικτών.

ACVR2

μεθυλίωση προαγωγού και έκφραση ACVR2 αξιολογήθηκαν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω qPCR και IP-Western blots. Re-έκφραση του ACVR2 μετά απομεθυλίωση με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα) προσδιορίστηκε. Ένα επιπλέον 26 MSS καρκίνων του παχέος εντέρου αξιολογήθηκαν για την απώλεια ACVR2 και το μηχανισμό της, και την απώλεια ACVR2 σε όλες τις ελεγχόμενες καρκίνους σχετίζεται με κλινικοπαθολογικών κριτήρια.

Αποτελέσματα

51 MSS όγκους του παχέος εντέρου, 7 (14% ) έχασε ACVR2, 2 (4%) ACVR1, και 5 (10%) έκφραση pSMAD2. Όχι σωματικά

εντοπίστηκαν ACVR2

μεταλλάξεις. Η απώλεια της έκφρασης ACVR2 συνδέθηκε με ΑΕ στο

ACVR2

(p & lt? 0.001) και

ACVR2

υπερμεθυλίωση προαγωγού (p & lt? 0,05).

ACVR2

ΑΕ, αλλά όχι υπερμεθυλίωση προαγωγού, συσχετίζονται με την κατάσταση CIN. Στην άνω και κάτω τελεία καρκινικές κυτταρικές σειρές με πλήρως μεθυλιωμένο

ACVR2

υποστηρικτής, απώλεια

ACVR2

έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης αποκαταστάθηκε με τη θεραπεία με 5-Aza. Απώλεια ACVR2 σχετίστηκε με αύξηση του πρωτογενούς όγκου καρκίνου του παχέος εντέρου (p & lt? 0,05).

Συμπεράσματα

Μόνο ένα μικρό ποσοστό των καρκίνων του παχέος εντέρου MSS χάνουν την έκφραση των μελών της σηματοδότησης ακτιβίνης. απώλεια ACVR2 γίνεται μέσω ΑΕ και

ACVR2

υπερμεθυλίωση προαγωγού, αποκαλύπτοντας διακριτούς μηχανισμούς για ACVR2 αδρανοποίηση και στις δύο MSI και MSS υποτύπους του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Jung Β, Γκόμεζ J, Chau Ε, Καμπράλ J, Lee JK, Anselm A, et al. (2009) Ακτιβίνης Σηματοδότησης στο Μικροδορυφορικοί Καρκίνοι Σταθερό Colon διαταράσσεται από ένα συνδυασμό γενετικών και στην επιγενετική. PLoS ONE 4 (12): e8308. doi: 10.1371 /journal.pone.0008308

Επιμέλεια: Ειρήνη Oi-Lin Ng, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 18 του Ιουνίου 2009? Αποδεκτές: 20 Νοέμβρη, 2009? Δημοσιεύθηκε: 14 του Δεκεμβρίου 2009

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. με την υποστήριξη του Πανεπιστημίου του Σαν Ντιέγκο Ακαδημαϊκή Σύγκλητος να BJ, οι ΗΠΑ Δημόσιας Υπηρεσίας Υγείας DK074019 να BJ? DK067287, η Υπηρεσία VA Έρευνας, και η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία Θεσμικών Research Grant # 70-002 σε J.M.C., και τις ασθένειες UCSD Πεπτικό Κέντρο Έρευνας & Ανάπτυξης (DK080506). της αλληλουχίας του DNA έγινε από το DNA αλληλουχίας κοινόχρηστο πόρο, UCSD Κέντρο Καρκίνου, η οποία χρηματοδοτείται εν μέρει από NCI Κέντρο Καρκίνου Υποστήριξη Grant # 2 P30 CA023100-23. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνων του παχέος εντέρου με υψηλή συχνότητα μικροδορυφορική αστάθεια (MSI-H) σχετίζονται με μεταλλάξεις σε αρκετά γονίδια που κωδικοποιούν με επαναληπτικές ακολουθίες, όπως

αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού β υποδοχέα 2 (TGFBR2)

και

υποδοχέα τύπου ακτιβίνης 2 (ACVR2)

[1] – [3]. Μικροδορυφορικού σταθερό (MSS) καρκίνοι του παχέος εντέρου έχουν άθικτο επιδιόρθωση του DNA αναντιστοιχία, αλλά μπορεί να φιλοξενούν

TGFBR2

μεταλλάξεις της περιοχής της κινάσης [4]. Άλλα συστατικά του καταρράκτη κανονική σηματοδότηση TGFβ, όπως SMAD2 και Smad4, αδρανοποιούνται ειδικά σε μια μειοψηφία των καρκίνων του παχέος εντέρου [5] – [7]. Συστηματική αδρανοποίηση της αδελφής της οδού ΤΘΡβ, ακτιβίνης, δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως στο MSS καρκίνων του παχέος εντέρου.

Η ακτιβίνη είναι μέλος της υπερ-οικογένειας TGFβ που ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των κυττάρων σε πολλούς ιστούς [8]. Παρόμοια με ΤΟΡβ, ακτιβίνη χρησιμοποιεί δύο υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας, υποδοχέων ακτιβίνης 1 (ACVR1) και ακτιβίνη υποδοχέα 2 (ACVR2), ακολουθούμενη από ενεργοποίηση SMAD. Ένας άλλος υποδοχέας τύπου 2, ACVR2B, δεν μπορούν να υποκαταστήσουν τις λειτουργίες και τη σηματοδότηση της ACVR2 [9].

ACVR2

βρέθηκε μεταλλαχθεί στην πλειοψηφία των MSI-H του παχέος εντέρου [10], [ ,,,0],11], κυρίως λόγω της μετατόπισης πλαισίου στην Α

8 οδού από το εξώνιο 10. Αποκατάσταση της ακτιβίνης σηματοδότησης και η καταστολή της ανάπτυξης συμβαίνουν σε απάντηση

ACVR2

συμπληρωματικότητα στο

ACVR2

μεταλλαγμένου του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα [12], [13]. Έχουμε δείξει προηγουμένως υψηλή συχνότητα

ACVR2

μεταλλάξεις σε καρκίνων του παχέος εντέρου MSI-H, σε συνδυασμό με την απώλεια της πρωτεΐνης έκφρασης ACVR2 [2] και σύνδεσης με μεγαλύτερους όγκους του παχέος εντέρου και φτωχότερη ιστολογική βαθμολογία [14]. Επίσης, βρήκαμε ένα υποσύνολο των MSS καρκίνων του παχέος εντέρου που έχασαν την έκφραση ACVR2 [2], σαν να

TGFBR2

απώλεια βρίσκονται στο MSS καρκίνων του παχέος εντέρου [4].

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε ακτιβίνη σηματοδότησης αναστάτωση οδός και οι πιθανοί μηχανισμοί στην πρωτοβάθμια MSS δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Βρήκαμε ότι η απώλεια της έκφρασης ACVR2 εμφανίζεται σε ένα υποσύνολο των MSS όγκων, η οποία συνδέεται συχνά με συγκρατείται pSMAD2, την επόμενη καθοδικός τελεστής του τόσο TGFβ και σηματοδότηση ακτιβίνης. Σε αντίθεση με εκείνη του TGFBR2, απώλεια ACVR2 σε όγκους MSS γίνεται μέσω ενός συνδυασμού των ΑΕ σε

ACVR2

και διακριτή

ACVR2

μεθυλίωση προαγωγού, αλλά όχι γενετική μετάλλαξη. Σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, οι μηχανισμοί για την απώλεια ACVR2 διαχωρίζουν επίσης σύμφωνα με μικροδορυφορικών κατάσταση, με κυτταρικές σειρές MSI-H που δείχνει

ACVR2

μετάλλαξη polyadenine οδού και MSS καρκινικά κύτταρα κόλου αποδεικνύοντας υπερμεθυλίωση προαγωγού. Έτσι δείχνουμε ότι η διάσπαση της σηματοδότησης ακτιβίνης εμφανίζεται σε MSI και MSS καρκίνων του παχέος εντέρου κατά διακριτούς μηχανισμούς, αποκαλύπτοντας σηματοδότηση ακτιβίνη ως ένα σημαντικό στόχο των δύο πιο κοινές γονιδιωματική υποτύπους του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

ακτιβίνης μονοπάτι σηματοδότησης μέλη έχουν επιλεγεί για αδρανοποίηση σε υποομάδες της πρωτοβάθμιας MSS καρκίνων του παχέος εντέρου

προηγούμενα δεδομένα μας πρότειναν τουλάχιστον μερική απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης ACVR2 σε ένα υποσύνολο των πρωτογενών δειγμάτων καρκίνου του παχέος εντέρου MSS παρά άγριου τύπου

ACVR2

εκτάσεις polyadenine [2]. Εξετάσαμε αυτό περισσότερο και προσπάθησε να καθορίσει τα πρότυπα έκφρασης των δύο ACVR2, ACVR1 καθώς και οι μεταγενέστεροι τελεστή του, pSMAD2, σε 51 διαφορετικά δείγματα πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου με μικροδορυφόρων σταθερή γενωμική υπόβαθρο που λαμβάνονται από την ίδια ομάδα του παχέος εντέρου Βόρεια Καρολίνα Cancer Study (NCCCS ) [15], [16]. Ενώ η έκφραση του υποδοχέα ACVR1 χάθηκε μόνο 4% (2/51) των δειγμάτων όγκου του ασθενούς (Εικόνα 1AB, επάνω σειρά), η απώλεια του πρωτογενούς υποδοχέα, ACVR2, συνέβη στο 14% (7/51) (Σχήμα 1CD, μεσαία σειρά). Επιπλέον, η απώλεια της έκφρασης pSMAD2 κατάντη της ενεργοποίησης ACVR2 και ACVR1 με ακτιβίνη συνέβη στο 10% (5/51) των δοκιμαζόμενων περιπτώσεις (Σχήμα 1 ° CEF, κάτω σειρά), και παρατηρείται συνήθως σε όγκους αποκαλύπτοντας πλήρως εκφράζονται υποδοχείς (Πίνακας 1).

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση εμπεδωθεί με παραφίνη καρκίνων του παχέος εντέρου πρωτογενούς αξιολογείται έκφραση της πρωτεΐνης-στόχου (καφέ) σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Α και Β (Επάνω σειρά): ACVR1 έκφραση έχει χαθεί σε ένα υποσύνολο των όγκων MSS. Παράδειγμα όγκου με έκφραση τόσο σε φυσιολογικούς όσο και καρκινικό ιστό κόλον (αριστερό πάνελ) και επιλεκτική απώλεια σε ένα υποσύνολο των όγκων, αλλά όχι παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του παχέως εντέρου (δεξί πάνελ). Συνολικά, η απώλεια ACVR1 παρατηρήθηκε σε 2/51 ή 4% όλων των καρκίνων του παχέος εντέρου MSS αναλύονται. Γ και Δ (Μέση σειρά): ACVR2 έκφραση έχει χαθεί σε ένα υποσύνολο των όγκων MSS. Δύο παραδείγματα επιλεκτική απώλεια ACVR2 σε όγκου κόλου, αλλά όχι σε φυσιολογικά κολικού ιστού (αριστερά και δεξιά πάνελ) απεικονίζεται. Συνολικά, η απώλεια ACVR2 παρατηρήθηκε σε 7/51 ή 14% όλων των καρκίνων του παχέος εντέρου MSS αναλύονται. Ε και F (κάτω σειρά): έκφραση pSMAD2 χάνεται σε ένα υποσύνολο των όγκων MSS. Παράδειγμα της έκφρασης τόσο σε φυσιολογικά όσο και καρκινικό ιστό κόλον (αριστερό πάνελ) και επιλεκτική απώλεια σε ένα υποσύνολο των όγκων, αλλά όχι κανονικά κολικού ιστού (δεξιά πάνελ). Συνολικά, η απώλεια pSMAD2 παρατηρήθηκε σε 5/51 ή 10% όλων των καρκίνων του παχέος εντέρου που αναλύθηκαν.

Η

Όλα τα δείγματα με την απώλεια τουλάχιστον ενός ακτιβίνης συστατικό μονοπάτι του υποδοχέα αποκάλυψε την έκφραση τόσο του συνολικού SMAD2 και TGFBR2 (Πίνακας 1, Σχήμα 2). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η απώλεια ACVR2 πρωτεΐνη έχει τη μεγαλύτερη συχνότητα μεταξύ των όγκων MSS, ακολουθούμενη από την απώλεια pSMAD2, και στη συνέχεια από την απώλεια ACVR1. απώλεια ACVR2 και την απώλεια pSMAD2 φαίνεται να συμβαίνουν σε συμπληρωματικές υποομάδες, γεγονός που υποδηλώνει περισσότερα από ένα στόχο για την απενεργοποίηση σηματοδότησης ακτιβίνης στο MSS καρκίνων του παχέος εντέρου. Αντίθετα, όλα τα δείγματα MSS καρκίνου του παχέος εντέρου με την απώλεια ακτιβίνης συστατικό σηματοδότησης εξέφρασε TGFBR2.

Από τα 51 MSS καρκίνους του παχέος εντέρου από την ομάδα NCCCS ελέγχονται για ACVR2 και ACVR1 απώλεια, 8 αποκάλυψε απώλεια είτε του υποδοχέα (7 χάσει ACVR2 και 2 έχασε ACVR1 με έναν όγκο να χάσει και τα δύο, βλέπε πίνακα 1). Από αυτά τα 8, 1 χαθεί pSMAD2. Από τις 7 όγκους με απώλεια ACVR2, 3 αποκάλυψε LOH και 3 είχαν επιλεκτική υπερμεθυλίωση ACVR2 υποκινητή, ενώ δεν βρέθηκαν μεταλλάξεις σε οποιοδήποτε από τα τρία ενεργά σημεία πεδίο κινάσης ή την κωδικοποίηση polyadenine οδού του εξονίου 10, κοινώς μεταλλάσσεται σε όγκους κόλον MSI. Κανένα από τα δύο όγκων με την απώλεια ACVR1 αποκάλυψε ΑΕ στο

ACVR1

τόπο. Αντίθετα, από τις 43 όγκων που εκφράζουν τόσο ACVR2 και ACVR1, 4 ή 9% έχασε έκφραση pSMAD2, διατηρώντας παράλληλα συνολική έκφραση SMAD2 και TGFBR2, υπογραμμίζοντας απώλεια της ικανότητας φωσφορυλίωσης SMAD2 ως πρόσθετη πρωταρχικό συμβάν για να διαταράξει σηματοδότηση ακτιβίνης.

Η

ΑΕ, αλλά δεν μετάλλαξη, συνδέεται με την απώλεια της ACVR2 έκφρασης στην Πρωτοβάθμια MSS καρκίνου του παχέος εντέρου Δείγματα

για να εκτιμηθεί κατά πόσον η απώλεια της έκφρασης του υποδοχέα ήταν λόγω της απώλειας της ετεροζυγωτίας (ΑΕ), ένα κοινό γονιδιωματική μηχανισμό ογκοκατασταλτικό αδρανοποίηση στο MSS καρκίνων του παχέος εντέρου, που προσδιορίστηκαν για ΑΕ στο

ACVR2

και

ACVR1

γονιδιακούς τόπους. Από τα 51 MSS όγκων προσδιορίστηκαν, 4 αποκάλυψε απώλεια αλληλομόρφων. ΑΕ σε

ACVR2

συνδέθηκε έντονα με την απώλεια της έκφρασης ACVR2 πρωτεΐνης (p = 0,006, ακριβής δοκιμασία του Fisher), και 3/7 (43%) των MSS όγκων με την απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης ACVR2 επίσης εμφάνισαν ΑΕ (Σχήμα 2), σε σύγκριση με τους όγκους που εκφράζουν 1/44 ACVR2. Δεν ΑΕ βρέθηκε στο

ACVR1

τόπου είτε ACVR1 έκφραση ή μη εκφράζοντας όγκους. Για περισσότερες συσχέτιση της έκφρασης ACVR2 με ΑΕ, επεκτείναμε τον αριθμό των όγκων των ασθενών 51 έως 77 δείγματα, τα οποία αποκάλυψαν 5 επιπλέον όγκων με την απώλεια πρωτεΐνης ACVR2, ανεβάζοντας τον συνολικό αριθμό σε 12/77 ή 16% (Πίνακας 2). Σε αυτήν την διευρυμένη ομάδα, 6/12 (50%) των MSS όγκων με την απώλεια ACVR2 εμφάνισαν ΑΕ (Πίνακας 2).

Η

Στη συνέχεια η αλληλουχία της κωδικοποίησης μικροδορυφορικού καθώς και 3 ξεχωριστές hot spots στην κινάση τομέα των

ACVR2

(παρόμοια με αντίστοιχες μεταλλάξεις στο

TGFBR2

σε όγκους MSS) [4]. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το εξώνιο 10 A

8 οδού σε

ACVR2

έγκειται στην περιοχή της κινάσης του υποδοχέα αυτού, και μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου καθώς και άλλες μεταλλάξεις στην περιοχή της κινάσης καταργήσει την ικανότητα φωσφορυλίωσης του ACVR2. Ωστόσο, δεν βρήκε ειδικών μεταλλάξεων όγκου που αντιστοιχεί με την απώλεια της έκφρασης πρωτεΐνης ACVR2. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι και άλλοι μηχανισμοί αδρανοποίησης παίζουν ρόλο στην απώλεια της έκφρασης ACVR2.

ACVR2

Ανάδοχος υπερμεθυλίωση συνδέεται με την απώλεια της ACVR2 έκφρασης στην Πρωτοβάθμια MSS καρκίνου του παχέος εντέρου Δείγματα

για να μελετήσει κατά πόσον οι επιγενετικές αλλαγές που σχετίζονται με την απώλεια έκφρασης ACVR2, αξιολογήσαμε εάν η

ACVR2

προαγωγός υπερμεθυλίωση στον ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με το φυσιολογικό και, εάν ναι, κατά πόσον ένα συγκεκριμένο μοτίβο μεθυλίωσης του

ACVR2

συσχετίζονται με την απώλεια πρωτεΐνης ACVR2 στην πρωτογενή δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου MSS. Αρχικά διαίρεσε το

ACVR2

υποστηρικτής σε τρεις περιοχές, περιοχή 1 (142 έως -603), περιοχή 2 (-607 έως -958), και την περιοχή 3 (-958 έως -1484). διθειώδες αποτελέσματα αλληλούχισης μας έδειξαν ότι δεν υπήρχε μεθυλίωσης στην περιοχή 1 και ελάχιστη μεθυλίωσης στην περιοχή 2, αλλά οι 46 CpG δινουκλεοτίδια μεταξύ -958 έως -1484 να νουκλεοτιδίων σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής (περιοχή 3) (Σχήμα 3Α) μεθυλιώνεται τόσο κυτταρικές σειρές και κλινικά δείγματα (Εικόνα 3Β), αλλά που δεν ανταποκρίνεται παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Λόγω της δυσκολίας στην ενίσχυση των μεγαλύτερων αμπλικονίων από ενσωματωμένα σε παραφίνη DNA ιστού, εκτελέσαμε μεθυλίωσης ειδικές όξινο θειώδες αλληλουχίας ενός ελαφρώς μικρότερη περιοχή (-603 έως -1297 θέσεις) του

ACVR2

υποκινητή στα κλινικά δείγματα.

Α) ACVR2 υποκινητή με χάρτη της θέσης του ΘΧΣ εκκινητών Β) Χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα νησιά αναζήτηση CpG, εντοπίσαμε τα νησιά CpG εντός του

ACVR2

υποστηρικτής βασίζεται ακόλουθα αυστηρά κριτήρια: ποσοστό ~CG & gt? 55%? παρατηρούμενη CpG /αναμένεται CpG & gt? 0,65? Μήκος & gt? 500 bp. Ολες οι αλληλουχίες CpG δινουκλεοτιδίου αντιπροσωπεύονται από κάθετες μπάρες κατά μήκος της οριζόντιας γραμμής που απεικονίζει την αλληλουχία υποκινητή. Κάθε κύκλος στον κάτω πίνακα παρουσιάζει μια ειδική τοποθεσία CpG που αντιστοιχούν στις κάθετες μπάρες που απεικονίζεται στο άνω φύλλο. Με βάση θειώδους αλληλουχίας, κάθε θέση CpG είχε σκοράρει ποσοτικά ως 100% μεθυλιωμένες (μαύροι κύκλοι), & gt? 50% μεθυλιωμένο (σκούρο γκρι κύκλους), & lt? 50% μεθυλιωμένο (ανοιχτό γκρι κύκλοι) ή μη μεθυλιωμένα (λευκοί κύκλοι). Όπως υποδεικνύεται, 3 από 7 ACVR2 αρνητικών CRCs κατέδειξε πλήρη μεθυλίωση της κρίσιμης περιοχής ACVR2 προαγωγού, ενώ κανένας από τους όγκους που εκφράζουν ACVR2 έδειξαν καμία απόδειξη για υψηλού βαθμού /πλήρης μεθυλίωση του υποκινητή ACVR2. Ένα πρότυπο μεθυλίωσης παρόμοια με αυτή που παρατηρείται σε καρκίνους ACVR2 αρνητική κόλου παρατηρήθηκε στην κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου ΗΤ29 MSS με γονιδιωματικό DNA από ΗΤ-29 που επιτρέπει την αλληλούχιση μιας ελαφρώς μεγαλύτερη περιοχή του

ACVR2

υποκινητή. C) Έξι κόλον καρκινικές κυτταρικές γραμμές με υπόβαθρα αστάθεια μικροδορυφόρου διαφορετικές (βλέπε Πίνακα 3) αναλύθηκαν για έκφραση της πρωτεΐνης ACVR2 χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοκαθίζησης. Δύο κυτταρικές σειρές, HCT116 (μια MSI παχέος εντέρου κυτταρική σειρά καρκίνου με διαλληλικούς μεταλλάξεις πλαισίου στο

ACVR2

) και ο καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά MSS ΗΤ29 (με

ACVR2

υπερμεθυλίωση προαγωγού), αποκάλυψε απώλεια ACVR2 έκφραση πρωτεΐνης. Δ) Απώλεια έκφρασης πρωτεΐνης ACVR2 συσχετίζεται με μείωση της μεταγραφής του mRNA ACVR2 μέσω ποσοτικής PCR σε κύτταρα ΗΤ29 σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή που εκφράζει ACVR2 FET χρησιμοποιώντας GAPDH για τυποποίηση. Αυτό το πείραμα εκτελέστηκε τρεις φορές εις τριπλούν, και το γράφημα ράβδος αναπαριστά ένα πείραμα με * υποδεικνύει στατιστικά σημαντική διαφορά με ένα ρ & lt? 0.001. έκφραση της πρωτεΐνης Ε) ACVR2 επανιδρύθηκε μετά τη θεραπεία απομεθυλίωση με 5’Aza.

Η

Στο ACVR2 μη εκφράζοντας πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου από το αρχικό μέγεθος του δείγματος των 51 όγκων MSS, 3/7 των καρκίνων απέδειξαν πλήρη μεθυλίωση (100% μεθυλιωμένων αλληλόμορφα) μέσα σε περιοχή 3 του

ACVR2

υποκινητή, ενώ κανένας από τους 13 ACVR2 εκφράζοντας πρωτογενείς καρκίνους του παχέος εντέρου ιστούς προσδιορίστηκαν έδειξε πλήρη

ACVR2

μεθυλίωση, υποστηρίζοντας ένα αιτιολογικό ρόλο για την μεθυλίωση και η έλλειψη έκφρασης ACVR2 (p = 0.03, ακριβής δοκιμασία του Fisher) (Πίνακας 2, Εικόνα 3Β). Bisulfite αποτελέσματα αλληλούχισης ήταν σύμφωνα με τις παρατηρήσεις MSP (τα δεδομένα δεν φαίνονται), όπου 3/7 ACVR2 αρνητικά CRCs έδειξε την παρουσία ειδικά μεθυλιωμένα αλλήλια. Αν και χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης (& lt? 50% μεθυλιωμένων αλληλίων) βρέθηκαν επίσης σε 7/13 των CRCs ACVR2 εκφράζουν, κανένα από τα CRCs κατέδειξε πλήρη μεθυλίωση των οποιωνδήποτε δινουκλεοτιδίων CpG, η οποία ήταν σύμφωνη με επιτρέπουν έκφραση ACVR2 σε αυτούς τους όγκους ( Σχήμα 3Β).

ACVR2

Ανάδοχος υπερμεθυλίωση συσχετίζεται με ACVR2 μεταγραφής και έκφρασης πρωτεΐνης σε Colon Γραμμές Cancer Cell

Για να επιβεβαιωθούν τα ευρήματά μας από κλινικά δείγματα

in vitro

, θα αξιολογούνται οι μηχανισμοί του

ACVR2

απώλεια του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα γραμμές με βάση την αστάθεια μικροδορυφόρου. Δοκιμάσαμε 3 3 MSS καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές για MSI-Η και: 1) μετάλλαξη στην κωδικοποιητική polyadenine οδού του εξονίου 10 του

ACVR2

, 2)

ACVR2

υπερμεθυλίωση προαγωγού, 3) ποσοτική RT-PCR του

ACVR2

mRNA, και 4) πρωτεϊνική έκφραση ACVR2 με ανοσοκαταβύθιση. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [2], [12], διαλληλικοί μετάλλαξη στην polyadenine οδό

ACVR2

(Α

8 έως A

7) στο κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου MSI-H HCT116 προκαλεί απώλεια πρωτεΐνης ACVR2 (Εικόνα 3C και τον πίνακα 3).

η

στις κυτταρικές σειρές MSI-H SW48 και RKO, ACVR2 πρωτεΐνη είναι παρούσα, καθώς είναι στο MSS κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου CaCo2 και FET ( Εικόνα 3C). Τόσο RKO και SW48 περιέχουν μια ετερόζυγη μετάλλαξη σε

ACVR2

, αποκαλύπτοντας άγριου τύπου A

8 καθώς και τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα (Πίνακας 3). Το A

8

ACVR2

αλληλόμορφο επιτρέπει την έκφραση της πρωτεΐνης ACVR2. Η MSS καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή ΗΤ29 εκφράζει μειωμένα επίπεδα ACVR2 mRNA και της πρωτεΐνης (Σχήμα 3C, D και Ε), σε αντίθεση με τους ομολόγους MSS CaCo2 και FET της, κανένα από τα οποία φιλοξενούν κάθε εξονικές

ACVR2

μετάλλαξη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται ). κύτταρα ΗΤ29 αποκάλυψε μια ξεχωριστή

ACVR2

μοτίβο υπερμεθυλίωση προαγωγού (Εικόνα 3Β) σε συνδυασμό με το mRNA και την απώλεια της πρωτεΐνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι το συγκεκριμένο πρότυπο μεθυλίωσης προκαλεί την απώλεια του

ACVR2

έκφρασης. Η απομεθυλίωση του

ACVR2

υποκινητή με την 5-Αζα οδήγησε σε αποκαθίσταται έκφραση ACVR2 mRNA και πρωτεΐνης (Εικόνα 3D και Ε). Πραγματοποιήσαμε μια πρόσθετη οθόνη 11 παχέος εντέρου καρκινικές κυτταρικές σειρές είτε με MSI (DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174, SNU175, SNU407), ή MSS (SNU81, SNU503, SW480, και Τ84) υπόβαθρο αποκαλύπτοντας παρόμοια επίπεδα ACVR2 mRNA και για την ίδρυση ΗΤ29 ως η μόνη παρατηρούμενη μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου MSS με ξεχωριστή απώλεια ACVR2.

Για να συσχετίζονται έκφραση ACVR2 με το μέγεθος του όγκου, το βαθμό και το στάδιο, αναλύσαμε η διευρυμένη ομάδα των 77 όγκων, η οποία περιείχε 12 όγκων με την απώλεια ACVR2 ( Πίνακας 2). Από αυτούς, 69 είχαν στοιχεία για το φύλο και τη φυλή, 46 για τον καρκινικό όγκο, 59 για το στάδιο του όγκου, και 65 στο βαθμό (βλέπε Πίνακα 4) επιτρέποντας subanalyses. Παρόμοια με καρκίνους του παχέος εντέρου MSI-H [14], η απώλεια της έκφρασης ACVR2 συσχετίζεται με μεγαλύτερους όγκους (ρ = 0,024), ενώ το στάδιο ήταν ανεπηρέαστη σε σύγκριση με ACVR2 εκφράζουν όγκους (Πίνακας 4). Αυτό παραλληλίζει προηγούμενο εύρημα μας σε καρκίνους του παχέος εντέρου MSI-H, όπου η απώλεια της ACVR2 πρωτεΐνης που σχετίζεται με μεγαλύτερα, πιο φτωχά διαφοροποιημένοι όγκοι σε ένα στάδιο-ανεξάρτητο τρόπο [14].

Η

Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε γονιδιωματικής υποτύπου ανάλυση όλων ACVR2 μη καρκίνων που εκφράζουν και διαπιστώθηκε ότι η έλλειψη της χρωμοσωμικής αστάθειας (CIN) φαινοτύπου συσχετίζεται με το

ACVR2

υπερμεθυλίωση προαγωγού (Πίνακας 2), προτείνοντας ξεχωριστές οδούς για MSI- /LOH + και MSI- /ΑΕ -. καρκίνων του παχέος εντέρου

στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι οι κλινικο-παθολογικές επιδράσεις της απώλειας πρωτεΐνης ACVR2 μπορεί να είναι παρόμοια και στις δύο MSI και MSS του παχέος εντέρου παρά τις διαφορετικές υποκείμενων μηχανισμών της απώλειας, που εμπλέκουν την απώλεια ACVR2 ως ένα σημαντικό βήμα στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου.

Συζήτηση

Η διακοπή της σηματοδότησης ακτιβίνης είναι κοινή σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές MSI-H μέσω μετάλλαξης του

ACVR2

σε ένα από τα κομμάτια polyadenine της [10] , προκαλώντας απώλεια της ACVR2 πρωτεΐνης [2]. Η απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης ACVR2 παρατηρήθηκε επίσης σε ένα μικρό υποσύνολο των MSS καρκίνων του παχέος εντέρου [2]. Εδώ, εκτιμήσαμε την εμφάνιση και το μηχανισμό της διαταράσσεται σηματοδότησης ακτιβίνης στο MSS καρκίνους του παχέος εντέρου και αποδεικνύουν ότι η σηματοδότηση ακτιβίνη έχει ως στόχο για διακοπή σε πολλαπλά επίπεδα στους όγκους του παχέος εντέρου MSS. Συνηθέστερα,

ACVR2

έκφρασης χάνεται μέσω ενός συνδυασμού των ΑΕ και των επιγενετικών σίγηση του

ACVR2

υποκινητή. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία των καταργηθεί σηματοδότησης ακτιβίνης στην ογκογένεση του παχέος εντέρου, όπως διατάραξη της εμφανίζεται σε δύο MSI και MSS υποτύπους του καρκίνου του παχέος εντέρου από διαφορετικές διακριτούς μηχανισμούς.

Στους καρκίνους του παχέος εντέρου MSI-H, τόσο TGFβ και ακτιβίνη καταργούνται λόγω της μετατόπισης πλαισίου μεταλλάξεις στον υποδοχέα τύπου II [2], [17]. Η απώλεια και των δύο αυτών οδών σηματοδότησης μπορεί να είναι επωφελής για την ανάπτυξη του όγκου [12], [18]. Τόσο TGFβ και ακτιβίνης χρησιμοποιούν τις ίδιες ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες SMAD (SMAD 2 και 3) να μεταδίδουν το σήμα τους. Έχουμε στο παρελθόν παρατηρήθηκε μεγαλύτερη από 50% επικάλυψη μεταξύ των

ACVR2

και

TGFBR2

μεταλλάξεις σε πρωτοπαθείς όγκους του παχέος εντέρου MSI [2], πιθανώς λόγω των αθροιστικών επιδράσεων στη μεσολάβηση της ανταπόκρισης ανάπτυξης, οι οποίες βρίσκονται υπό διερεύνηση .

φαίνεται ότι το MSI καρκίνων του παχέος εντέρου

ACVR2

μεταλλάξεις μπορεί να συμβεί νωρίς στην ογκογένεση και συνδέονται με την αύξηση της τοπικής ανάπτυξης [14]. Σε MSS καρκίνων του παχέος εντέρου, απώλεια ACVR2 συσχετίζονται με μεγαλύτερους όγκους, συνεπής με διαταραχή της ακτιβίνης που προκαλείται καταστολή της ανάπτυξης. Η χρονική στιγμή της

ACVR2

μεταλλάξεις σε καρκίνο του παχέος εντέρου MSI μπορεί να είναι παρόμοια με εκείνη του

TGFBR2

στην οποία οι μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου συμβαίνουν σε υψηλού βαθμού δυσπλασία στη διεπαφή σε κακοήθεια [17].

Θα δείξουμε ότι το MSS καρκίνων του παχέος εντέρου τουλάχιστον τρία μέλη της ακτιβίνης καταρράκτη σηματοδότησης, ACVR2, ACVR1 και pSMAD2 διαταράσσονται. Ένα σημαντικό υποσύνολο όγκων του παχέος εντέρου εμφανίζεται μια μείωση στη φωσφορυλιωμένη SMAD με άθικτα ACVR2 και TGFBR2, υποδεικνύοντας μία ξεχωριστή πρωτογενές γεγονός κατάντη των πρωτογενών υποδοχέων. Μία περίπτωση απώλειας ACVR1, ACVR2 και pSMAD2 ταυτοποιήθηκε, η οποία ήταν χρώση TGFBR2 θετικό (Πίνακας 2). Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε πρωτογενή αδρανοποίηση των pSMAD2 και ξεχωριστή στόχευση των δύο ακτιβίνης υποδοχέων, ή IHC θετικών κολοβωμένη TGFBR2, οδηγώντας απώλεια pSMAD2. Η επίδραση της απώλειας των πολλαπλών στόχων του ίδιου καταρράκτη σηματοδότησης πρέπει ακόμη να διερευνηθούν προσεκτικά και να προτείνει διακριτές λειτουργίες του κάθε μέλους.

Διαπιστώσαμε ΑΕ κατά το

ACVR2

τόπο σε 6% του MSS όγκων του παχέος εντέρου, η αύξηση σε 50% σε όγκους με απώλεια της έκφρασης πρωτεΐνης ACVR2. Αυτό το συνολικό ποσοστό είναι ελαφρώς χαμηλότερη από τη συχνότητα του

ACVR2

ΑΕ έχει ήδη αναφερθεί σε μια ομάδα με άγνωστη

ACVR2

κατάσταση [19], αν και έχουμε παρατηρήσει στο παρελθόν ομάδα που εξαρτώνται από τις συχνότητες για έκφραση ACVR2 ότι μπορεί να είναι το στάδιο ή τη φυλή-εξαρτώμενη [14].

μεταλλάξεων ανάλυσή μας επικεντρώθηκε σε hotspots παρόμοια με αυτά που εμπλέκονται στην αδρανοποίηση του

TGFBR2

αδρανοποίηση τομέα κινάσης [4], αλλά δεν βρήκαμε οποιεσδήποτε μεταλλαγές που σχετίζονται με όγκους όταν αλληλούχιση όλα τα εξώνια σε ACVR2 εκφράζουν και μη κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Είναι πιθανό ότι μεταλλάξεις εκτός των hotspots μπορεί να συμβάλει στην απώλεια της ACVR2 στην πρωτογενή δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου, αν και υπό το φως των αποδεικτικών στοιχείων για LOH καθώς και επιγενετικών αποσιώπηση, αυτό είναι πιθανό να είναι λιγότερο σημαντικό ογκογόνο μηχανισμό. Ωστόσο, μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στις τρεις όγκους με την απώλεια της ACVR2 όπου βρήκαμε καμία γενετική ή επιγενετική μηχανισμός που εξηγεί άμεσα την απώλεια αυτή.

Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που περιγράφει την απώλεια ACVR2 στο MSS καρκίνους του παχέος εντέρου και

ACVR2

υπερμεθυλίωση προαγωγού ως μηχανισμός, και έρχεται σε αντίθεση με τους μηχανισμούς του

ACVR2

απώλεια στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου MSI [12]. Σε αμφότερες τις πρωτογενείς όγκους του παχέος εντέρου MSS και σε καρκινικά κύτταρα του κόλου ΗΤ29, η περιοχή της υπερμεθυλίωσης προαγωγέα που συνδέεται με την απώλεια του

ACVR2

έκφρασης είναι μεταξύ των νουκλεοτιδίων -1297 να -958. Μεταξύ των γονιδίων που είναι στόχοι για επιγενετικές σίγηση,

hMLH1

είναι το καλύτερα μελετημένο για μεθυλίωση, και έχει προταθεί ότι η περιοχή υποκινητή γειτονικό προς τη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) είναι κρίσιμη για την μεταγραφική σίγηση του γονιδίου αυτού [ ,,,0],20]. Υπάρχει έλλειψη παρόμοιων στοιχείων για τα περισσότερα άλλα γονίδια, αλλά

hMLH1

δεδομένα περιοχή προαγωγού χρησιμοποιείται συχνά ως ένα παράδειγμα, και πιστεύεται ότι για τα περισσότερα γονίδια, η ανάλυση ενός παρόμοιου περιοχή προαγωγού είναι κρίσιμη να συσχετίζονται DNA μεθυλίωση ευρήματα με απώλεια της έκφρασης του γονιδίου. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναλύσει & gt? 1500 bp κοντά στο TSS, και βρήκε καλή συσχέτιση μεταξύ

ACVR2

μεθυλίωση προαγωγού (σε περιοχές -958 έως -1.297) και η απώλεια της έκφρασης της πρωτεΐνης από την IHC. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι, αντί της απλής γειτνίαση με το TSS, διαφορική πρόσβαση σε μεθυλίωση συν-ενεργοποιητές ή καταστολείς σε έναν προαγωγό καθορίζει αδρανοποίηση των γονιδίων, καθώς και για

ACVR2

μπορεί να συμβεί μια τέτοια περιοχή πάνω από 900 bp από το TSS.

Είμαστε επίγνωση ότι ο συνολικός αριθμός των ασθενών MSS με την απώλεια ACVR2 που ερευνήθηκαν στην παρούσα μελέτη δεν είναι μεγάλη, υπογραμμίζοντας ότι αυτό είναι ένα σχετικά σπάνιο γεγονός [15]. Εμείς δεν είχε την πρόθεση να καθοριστούν οι συνολικές συχνότητες αυτών των γεγονότων, αλλά και να δείξει έναν εναλλακτικό μηχανισμό της απώλειας πρωτεΐνης ACVR2 στο MSS καρκίνων του παχέος εντέρου. 51 πρωτοβάθμια, δείγματα όγκων MSS βάσει πληθυσμού, 7 έδειξαν απώλεια της έκφρασης ACVR2. Σύμφωνα με τα 51 θέματα που επιλέγονται τυχαία από την ομάδα, μεταξύ 7% και 21% των MSS όγκων στον πληθυσμό θα πρέπει να δείχνουν παρόμοια απώλεια της έκφρασης ACVR2 με 95% εμπιστοσύνη (διάστημα εμπιστοσύνης ακριβή Clopper-Pearson). Η αύξηση του μεγέθους του δείγματος για 77 αποκάλυψε απώλεια ACVR2 σε 12/77 ή 16% και μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση της απώλειας ACVR2 με αυξημένη μεγέθους του όγκου. Περαιτέρω, γονιδιωματική ανάλυση υποτύπου αποκάλυψε ότι ΑΕ στο

ACVR2

σχετίστηκε με το φαινότυπο CIN, ενώ

ACVR2

υπερμεθυλίωση συσχετίζονται με το φαινότυπο CIMP. Αν και αυτές οι κατηγοριοποιήσεις επιτρέπουν απόδοση της απώλειας του

ACVR2

έκφραση στην υπερμεθυλίωση προαγωγού και /ή χρωμοσωμική αστάθεια ως μηχανισμός σε καρκίνους MSS, εναλλακτικοί μηχανισμοί, όπως η τροποποίηση των ιστονών ή /και microRNAs μπορεί να είναι στο παιχνίδι, ιδιαίτερα στην ΑΕ αρνητική /μεθυλίωση αρνητικών καρκίνων. Τα δεδομένα μας όμως, δείχνουν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της απώλειας της έκφρασης ACVR2 και ΑΕ /επιγενετική αποσιώπηση. Έτσι παρέχουμε αποδεικτικά στοιχεία για την ύπαρξη είτε χρωμοσωμικής αστάθειας ή επιγενετική τροποποίηση του

ACVR2

στον καρκίνο του παχέος εντέρου και να προσδιορίσει ένα μοντέλο κυττάρων για την επιγενετική αποσιώπηση των

ACVR2

. Η πλήρης κλινική σημασία αυτών των δεδομένων θα απαιτήσει περαιτέρω επιβεβαίωση σε μελλοντικές μελέτες με μεγαλύτερα δείγματα ασθενών.

Εν κατακλείδι, η απώλεια της έκφρασης ACVR2, ACVR1 και pSMAD2 εμφανίζεται σε ένα υποσύνολο των όγκων MSS, καθώς και τα στοιχεία υποστηρίζει ότι αυτό έχει ως αποτέλεσμα την κατάργηση της κανονικής δραστηριότητας κατασταλτική ανάπτυξη του σηματοδότηση ακτιβίνης. Μειωμένη pSMAD2 συνήθως συνδέεται με άγριου τύπου ACVR2 και ACVR1. Μηχανισμοί για

ACVR2

απώλεια περιλαμβάνουν ΑΕ στο

ACVR2

και

ACVR2

υπερμεθυλίωση προαγωγού μεταξύ των νουκλεοτιδίων -1297 και -958, τα οποία συνδέονται με CIN και CIMP φαινοτύπων, αντίστοιχα. Απώλεια ACVR2 συνδέεται με το αυξημένο μέγεθος του όγκου. Ως εκ τούτου, σηματοδότηση ακτιβίνη μπορεί να αδρανοποιηθεί με διακριτικό μηχανισμούς MSI και MSS καρκίνους του παχέος εντέρου, γεγονός που υποδηλώνει τη σημασία αυτής της οδού στον έλεγχο της ανάπτυξης Κολονοκύτταρο.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας νοσοκομεία. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των δειγμάτων, ως μέρος της IRB έγκρισης βάσει του ως μέρος της Βόρειας Καρολίνας του παχέος Μελέτης του Καρκίνου (NCCCS) δείτε παρακάτω. Ανάλυση ως μέρος αυτής της μελέτης ήταν εντελώς de-εντοπίστηκαν και δεν τον προσδιορισμό των πληροφοριών ήταν στη διάθεση του PI, την πραγματοποίηση αυτής της μελέτης απαλλάσσονται από ένα ξεχωριστό συναίνεση.

Δείγματα Ασθενών

Σποραδικές όγκων του παχέος εντέρου προοπτικά συλλέγονται υπό IRB έγκριση ως μέρος του παχέος μελέτη Βόρεια Καρολίνα Καρκίνο (NCCCS), ένα, case-control μελέτη βασισμένη στον πληθυσμό που περιλαμβάνει 503 ασθενείς [15], [16]. μικροδορυφορική ανάλυση διεξήχθη από εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό όπως περιγράφηκε προηγουμένως [2], διαχωρίζουν την ομάδα σε 54 MSI-H, και 449 ασθενείς MSS /MSI-L. Για τη μελέτη αυτή, 51 δείγματα ασθενών MSS με άφθονο όγκο και φυσιολογικό ιστό επιλέχθηκαν τυχαία.

τηλέφωνα Γραμμές

Η MSI καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα γραμμές HCT116, SW48, DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174T, SNU175, SNU407, SW48, και RKO, καθώς και οι MSS καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές CaCo2, ΗΤ29, SNU81, SNU503, SW480, και Τ84 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Iscove κατά Dulbecco (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) και FET ήταν διατηρήθηκαν σε F12 /Modified Eagles Medium Dulbeco κατά τις συνθήκες που περιγράφονται προηγουμένως [12]. Όλες οι κυτταρικές σειρές είναι διαθέσιμες από την ATCC εκτός από τα FET (ευγενική δωρεά του Μιχαήλ Brattain, Ιατρικό Κολέγιο του Οχάιο, Τολέδο, OH) [21].

Ιστός μικροανατομίας, εξαγωγή DNA και RNA Extraction

DNA από το σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη υλικό εκχυλίζεται εξής μικροδιατομής χρησιμοποιώντας το κιτ Takara DEXPAT (Takara Bio Inc., Japan). Γονιδιωματικό DNA από κυτταρικές σειρές λήφθηκαν χρησιμοποιώντας QIAamp DNA μίνι κιτ (Qiagen, Valencia, CA). RNA από κυτταρικές σειρές λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Life Technologies Inc. Carlsbad, CA).

Αντισώματα

Rabbit anti-TyrGly mACVR2 (482-494) (γενναιόδωρο δώρο από τον W. Vale , Salk Institute), με επιτόπιο στόχο του στο Ο-άκρο περιοχή του ACVR2 (πέραν του προκύπτοντος κολόβωση από μετατόπιση πλαισίου στο εξώνιο 10) χρησιμοποιήθηκε για ανοσοϊστοχημεία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [2], [12]? αντι-TyrGly ACVR1 (474-494) χρησιμοποιήθηκε σε 1:800? pSMAD2 (Cell Signaling) σε 1:250? συνολικής SMAD2 (Epitomics) σε 1:400? και TGBR2-C16 (Santa Cruz) σε 1:300.

Ανοσοϊστοχημεία για ACVR1, ACVR2, pSMAD2, TGFBR2 και SMAD2 Έκφραση Πρωτεΐνης

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [2]. Η χρώση ομαδοποιούνται σε απώλεια ή 0 (απουσία ή σημαντική μείωση σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό), μειωμένη ή 1+ (λεπτή μείωση σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό), αμετάβλητο ή 2+ (καμία αλλαγή σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό), και αυξημένη ή 3+ (αύξηση σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό ιστό). Τρεις ανεξάρτητοι ερευνητές στα τυφλά σκόραρε όλες τις διαφάνειες. Και οι τρεις ερευνητές έπρεπε να είναι σε συμφωνία για έναν όγκο που θα ονομάζεται 0 ή απώλεια της έκφρασης.

Η απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) Ανάλυση

Αξιολόγηση της ΑΕ στο

ACVR2

και

ACVR1

loci διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22] χρησιμοποιώντας 2 μικροδορυφορικών δεικτών (D2S1353 και D2S1399) συνοδευτικά

ACVR2

[19], καθώς και ένας δείκτης για ενδογονικοί

ACVR1

(D2S2686) (βλέπε πίνακα S1).

CIN Ανάλυση

Ανάλυση για CIN διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, τα εμπρός εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων ήταν φθορίζουσα σήμανση με FAM στο 5 ‘άκρο (Applied Biosystems) και ένα σύνολο 6 πολυμορφικών δεικτών μικροδορυφορικού (D5S346, D5S409 D17S261 D17S250 D18S81, D18S91, και D18S69) (βλέπε πίνακα S1) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό ΑΕ στο χρωμόσωμα 5q, 17q και 18q.