Αφηρημένο

Κατά την τελευταία δεκαετία, αρκετές μελέτες έχουν εκτενώς αναφερθεί ότι τα ενεργοποιημένα κύτταρα φυσικοί φονείς (ΝΚ) μπορεί να σκοτώσει αυτόλογα ανώριμα δενδριτικά κύτταρα (DCS) in vitro, ενώ τα ανταλλακτικά ενεργοποιηθεί πλήρως ΑΧ. Αυτό οδήγησε στην πρόταση ότι τα ενεργοποιημένα κύτταρα ΝΚ μπορεί να επιλέξει μια πιο ανοσογόνο υποσύνολο των DCs κατά τη διάρκεια μιας προστατευτικής ανοσοαπόκρισης. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία απόδειξη ότι τα αυτόλογα DC θανάτωση από ΝΚ κυττάρων είναι ένα γεγονός που συνέβη

in vivo

και, ως εκ τούτου, η λειτουργική σημασία αυτής της θανάτωσης παραμένει άπιαστο. Εδώ αναφέρουμε ότι μία σημαντική μείωση του CD11c

+ DCs παρατηρήθηκε σε λεμφαδένες παροχέτευσης των ποντικών που εμβολιάστηκαν με MHC-άνευ κύτταρα ως στόχους ΝΚ κύτταρο ικανό να επάγει την ενεργοποίηση κυττάρων ΝΚ. Αυτό το

in vivo

DC επεξεργασία από τα κύτταρα ΝΚ ήταν περφορίνης-εξαρτώμενη και ήταν λειτουργικά σχετική, αφού υπολειμματική λέμφου ΑΧ κόμβο εμφανίζεται μια βελτιωμένη ικανότητα να επάγουν τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων. Επιπλέον, σε ένα μοντέλο του εμβολιασμού κατά του καρκίνου, η χορήγηση των MHC-άνευ κύτταρα μαζί με κύτταρα όγκου αύξησε τον αριθμό των ογκο-ειδικών CTLs και οδήγησε σε μια σημαντική αύξηση στην επιβίωση των ποντικών μετά από πρόκληση με θανατηφόρο δόση κυττάρων όγκου . Η εξάντληση των κυττάρων ΝΚ ή η χρήση περφορίνης knockout ποντικών μειώθηκε έντονα την ογκο-ειδικό CTL και επέκταση προστατευτικό ρόλο του έναντι πρόκλησης κυττάρου όγκου. Ως σύνολο, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι ΝΚ μεσολάβηση κυττάρων DC θανάτωση γίνεται

in vivo

και είναι σε θέση να προωθήσει την επέκταση του καρκίνου-ειδικών CTLs. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι τα εμβόλια καρκίνου θα μπορούσε να βελτιωθεί με τις στρατηγικές που στοχεύουν στην ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ

Παράθεση:. Morandi Β, Mortara L, Chiossone L, Accolla RS, Mingari MC, Moretta L, et al. (2012) δενδριτικά κύτταρα Επιμέλεια από ενεργοποιημένα Natural Killer Cells αποτέλεσμα μια πιο Προστατευτική Cancer-ειδική ανοσολογική απόκριση. PLoS ONE 7 (6): e39170. doi: 10.1371 /journal.pone.0039170

Επιμέλεια: Francesco Dieli, Πανεπιστήμιο του Παλέρμο, Ιταλία

Ελήφθη: 19 Μάρτη 2012? Αποδεκτές: 16η Μάη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 19 Ιουνίου 2012 |

Copyright: © 2012 Morandi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο έχει υποστηριχθεί από Associazione Italiana Ricerca sul Cancro https://www.airc.it) IG5624 και IG11650 να GF και IG 8862 σε RSA? από Ministero della Salute Italiano – Programma Strategico Ricerca Oncologica (https://www.ministerosalute.it/) να GF? από το Ίδρυμα Cariplo 2008-2230 (www.fondazionecariplo.it) και Ministero Italiano dell ‘Istruzione, Universita’, Ricerca, – Progetto Rilevanza Nazionale (https://prin.miur.it/) 2008-WXF7KK στο RSA. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κύτταρα φυσικοί φονείς (ΝΚ), τα οποία είχαν αρχικά ταυτοποιηθεί ως κύτταρα λεμφοειδούς ικανό λύσης ορισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές σε απουσία προηγούμενης διέγερσης

in vivo

ή

in vitro

[1] – [3], τώρα εκτιμάται ως πολυλειτουργικών έμφυτη κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος [4] – [6]. ενεργοποίησή τους καθοδηγείται από την ισορροπία των σημάτων δίνεται από διάφορες ομάδες της ενεργοποίησης [7] και ανασταλτικούς υποδοχείς [8] -. [11], η τελευταία αναγνώριση MHC τάξης Ι μόρια στα κύτταρα-στόχους

Πρόσφατα, το πλήκτρο ρόλος για ένα συνεργατικό διάλογο μεταξύ των φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚ) ΑΧ και στην ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης έχει αναδειχθεί [12] – [17]. Έχει αποδειχθεί ότι η αλληλεπίδραση των αποτελεσμάτων τους σε μια αμφίδρομη ενεργοποίηση και στην ανάπτυξη μιας Th1 και CTL διαμεσολαβούμενη απόκριση [18] – [21]. Στους ανθρώπους, τουλάχιστον

in vitro

, αυτό το cross-talk έχει επίσης ως αποτέλεσμα τη λύση των ανώριμων DCs, ενώ τα ώριμα δενδριτικά κύτταρα προστατεύονται [13], [15]. Ο υποδοχέας ενεργοποίησης NKp30 και DNAM-1 είναι κρίσιμα υποδοχείς για DC λύση, ενώ η αντίσταση σε λύση διαμεσολαβείται από τα πάνω ρύθμιση του MHC τάξης Ι μορίων κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης DC [15], [22] – [24].

με βάση αυτά τα in vitro ευρήματα, έχει προταθεί ότι η θανάτωση των ανώριμων DCs από ΝΚ κύτταρα θα πρέπει να προωθήσει την επιβίωση των πιο ανοσογόνα DCs (δηλαδή ώριμα DCs), που ευνοεί την έναρξη μιας αποτελεσματικής και προστατευτική ανοσολογική απόκριση [25] – [27].

In vivo

, DC /ΝΚ-κύτταρο αλληλεπιδράσεις θα μπορούσε να συμβεί σε λεμφοειδή όργανα, καθώς και σε μη λεμφοειδείς ιστούς [28]. Υιοθεσίας μεταφέρεται,

ex vivo

δημιουργούνται, έχουν ανώριμα DCs έχουν αναφερθεί να εξαλειφθούν ταχέως από τα κύτταρα ΝΚ μέσω TNF που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) [29], [30]. Παρομοίως, έχει δειχθεί ότι η μεταμόσχευση αλλοαντιδραστικών κυττάρων ΝΚ μπορεί να καταστείλει Τ-κύτταρα μοσχεύματος έναντι ξενιστή, εξαλείφοντας DCs ξενιστή [31], [32]. Κατά τη διάρκεια χρόνιες ιογενείς λοιμώξεις, μια παρεκκλίνουσα DC ευαισθησία σε μεσολάβηση κυττάρων ΝΚ λύση είχε ως αποτέλεσμα την συσσώρευση λίγο ανοσογονικά DCs στους λεμφαδένες, προκαλώντας προοδευτική δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού [33]. Από την άλλη πλευρά, DC λύση από κύτταρα ΝΚ θα μπορούσε επίσης να ρυθμίσουν αρνητικά τη διάρκεια των αποκρίσεων Τ κυττάρων ειδικών για ιό

in vivo από

τον περιορισμό της έκθεσης των κυττάρων Τ σε μολυσμένα κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου [34].

Ωστόσο, DC θανάτωση από αυτόλογα κύτταρα ΝΚ

in vivo

δεν έχει άμεσα αποδειχθεί μέχρι σήμερα και την πιθανή σημασία αυτής της λύσης κατά τη διάρκεια μιας φυσιολογικής ανοσολογικής απόκρισης μένει να αξιολογηθεί.

αριθμός

in vivo

μοντέλα έχουν παράσχει αποδείξεις ότι ΝΚ αναγνώρισης των κυττάρων του MHC κατηγορίας Ι-ελλειμματικά κύτταρα στόχους ως αποτέλεσμα μια ενισχυμένη παραγωγή των CTLs έναντι των όγκων [21], [35]. Σε αυτά τα πειραματικά μοντέλα, τα ενεργοποιημένα κύτταρα ΝΚ να παράγουν κυτοκίνες, οι οποίες, με τη σειρά του, φαίνεται να προωθήσει την πρώτη ενεργοποίηση DC και ακολούθως μια προστατευτική ανταπόκριση CTL εναντίον γονικών όγκων. Αυτό μας ώθησε να ερευνήσει εάν, κατά τη διάρκεια μιας προστατευτικής ανοσοαπόκρισης έναντι όγκων, ενεργοποιημένα ΝΚ κύτταρα μπορεί επίσης να επιλέξει μια πιο ανοσογόνο υποσύνολο των DCs. Δείχνουμε εδώ ότι συμβαίνει μοντάζ DC

in vivo

και ότι το φαινόμενο αυτό παίζει ένα ρόλο κλειδί για ογκο-ειδικά CTL ανάπτυξη και η επιβίωση των ποντικών σε ένα μοντέλο ποντικού του εμβολιασμού όγκου.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Ενεργοποίηση της ΝΚ κύτταρα στους περιφερικούς ιστούς αποτελέσματα σε περφορίνης δοσοεξαρτώμενη μείωση της DC περιεχομένου σε λεμφαδένες

τα ποντίκια εμβολιάστηκαν sc με ΥΑΟ-1, ένα MHC-στερείται κυτταρική γραμμή, ως στόχος ΝΚ κυττάρων είναι σε θέση να επάγει την ενεργοποίηση κυττάρων ΝΚ. Μετά από 36 ώρες, δενδριτικά κύτταρα που προέρχονται από αναλύθηκαν τόσο αποστράγγιση και controlateral LN. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, τόσο το ποσοστό και ο απόλυτος αριθμός των CD11c

+ DCs μειώθηκαν δραματικά σε αποστράγγιση LNs σύγκριση με controlateral LNs (p = 0.0029 για το ποσοστό και ρ = 0,007 για απόλυτος αριθμός).

In vivo

εξάντληση των ΝΚ κυττάρων με ένεση αντι-ασιαλο-GM 1 μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) επανήλθε αυτό το φαινόμενο, επιβεβαιώνοντας το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζουν οι ΝΚ κυττάρων. Σε αποστράγγιση LNs από ποντίκια ΝΚ κυττάρων εξαντληθεί, τόσο το ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των CD11c

+ ΑΧ ήταν συγκρίσιμες με controlateral LNs, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα ΝΚ πρέπει να συμμετέχουν στη μείωση της ΑΧ. Αντι-ασιαλο GM1 mAb θεραπεία οδήγησε σε μείωση τουλάχιστον κατά 80% των κυττάρων ΝΚ (Σχήμα 1, Β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η μείωση του αριθμού DC παρατηρήθηκε σε αποστράγγιση LN ήταν ΝΚ κυττάρων-εξαρτώμενη και προφανώς επακόλουθη στην ενεργοποίηση ΝΚ κυττάρων κατά την αναγνώριση των MHC-άνευ κυττάρων

Α:. Αντιπροσωπευτική αναλύσεις των μονοπύρηνων κυττάρων που απομονώθηκαν από είτε την αποστράγγιση ή controlateral (Control LN) λεμφαδένες ποντικών εξαντλημένο ή όχι των ΝΚ κυττάρων (Αποστράγγιση LN + αντι-ασιαλο GM1). Β: Τα κύτταρα ΝΚ αποτελεσματικά εξαντλούνται σε ποντίκια κατά τη χορήγηση των αντι-ασιαλο GM1 mAbs. C: το ποσοστό (αριστερά) και ο απόλυτος αριθμός (δεξιά) του DCs μεταξύ μονοπύρηνων κυττάρων που απομονώθηκαν από λεμφαδένες. Μπαρ αντιπροσωπεύει μέσες τιμές και SD από πέντε ανεξάρτητα πειράματα (τρία ποντίκια ανά ομάδα). ** = Ρ & lt? 0001? * = P & lt? 0,005.

Η

Μια πιθανή εξήγηση για την παρατηρούμενη μείωση του αριθμού των κυττάρων DC με την ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ είναι η απελευθέρωση συγκεκριμένων κυτοκινών, από τα κύτταρα ΝΚ, μπορούν να επηρεάσουν την επιβίωση των DC ή την ικανότητά τους να μεταναστεύουν από την περιφέρεια προς το LN. Εναλλακτικά, τα κύτταρα ΝΚ μπορεί να επηρεάσει τον αριθμό των ΑΧ στην αποστράγγιση LN με άμεση λύση

Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός στηρίζεται η μείωση του αριθμού των DC, επαναλάβαμε το ίδιο πείραμα σε περφορίνης νοκ-άουτ (pFN

-. /- ) ποντίκια, αφού περφορίνης είναι ένα ουσιαστικό μόριο για την κυτταροτοξικότητα κυττάρων ΝΚ. Στο pFN

– /- ποντίκια, δεν υπήρχαν διαφορές στον αριθμό και το ποσοστό των CD11c

+ ΑΧ βρέθηκαν σε αποστράγγιση και controlateral LNs (δεν απεικονίζεται). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η περφορίνης-εξαρτώμενη κυτταροτοξικότητα μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα μονοπάτι μέσα στο κύτταρο-εξαρτώμενη μείωση ΝΚ LN ΑΧ.

ΝΚ κυττάρων Ενεργοποίηση Επιλέγει λεμφαδένων DC με τον Ανώτερο Τ κυττάρων Ενεργοποίηση Δυνατότητα

ΝΚ κυττάρων έχουν δειχθεί να σκοτώσουν ανώριμα DCs

in vitro

[13], [15]. Μία ερμηνεία για την ειδική θανάτωση υγιών αυτόλογων κυττάρων από κύτταρα ΝΚ ήταν ότι τα κύτταρα ΝΚ μπορεί να δράσει για να ελέγχει την ποιότητα των DCs υποβάλλονται σε ωρίμανση [26]. Αυτή η υπόθεση συνεπάγεται ότι τα κύτταρα ΝΚ θα παρεμπόδιζε την επιβίωση των λιγότερο ανοσογόνα ανώριμων DCs, η οποία θα επάγει ακατάλληλη, χαμηλής συγγένειας αστάρωμα των Τ-κυττάρων, με αποτέλεσμα τελικά σε μια κατάσταση ανοχής. Το τελικό αποτέλεσμα αυτής της διαδικασίας επεξεργασίας DC διαμεσολαβείται από τα κύτταρα ΝΚ θα μπορούσε, επομένως, να είναι η επιλογή των πιο ανοσογόνες ΑΧ, λόγω της απομάκρυνσης των ΑΧ που θα αποτύχει να μεσολαβήσει βέλτιστη πλήρωση των Τ κυττάρων.

Για να εξακριβωθεί αν αυτή η μηχανισμός είναι λειτουργικά σχετική in vivo, ελέγξαμε εάν ΑΧ επίμονη στο LN αποστράγγιση μετά την επεξεργασία των κυττάρων ΝΚ ήταν phenotipically και λειτουργικά πιο ανοσογόνο. Ομάδες ποντικών που ήταν είτε ΝΚ κυττάρων εξαντληθεί ή δεν εμβολιάστηκαν s.c. με κύτταρα ΥΑΟ-1. Μετά από 36 ώρες DCs από τους κόμβους αποστράγγιση και controlateral λέμφου αναλύθηκαν για την έκφραση συν-διεγερτικών μορίων και των δεικτών ωρίμανσης όπως CD40, CD80, CD83, CD86 με κυτταρομετρία ροής και για IL12p35, IL-12ρ40 και IL23p19 mRNA με πραγματικού χρόνου PCR . Επιπλέον, θα εκτιμηθεί κατά πόσον ΑΧ επίμονη στην αποστράγγιση LN κατά την επεξεργασία των κυττάρων ΝΚ παρουσίασε υψηλότερη ικανότητα ενεργοποίησης των Τ κυττάρων. Σπληνοκύτταρα από ποντίκια C57BL /6 διεγέρθηκαν με DCs διαλέγεται από λεμφαδένες ποντικών BALB /c ενέθηκαν με YAC-1 κύτταρα 24 ώρες πριν από την απομάκρυνση των λεμφαδένων. Έξι ημέρες αργότερα, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού εκτιμήθηκε ως απώλεια CFSE βαφής. Αν και σημαντικές διαφορές για τις αναλύθηκαν επιφανειακά μόρια ή κυτοκίνες δεν ήταν ορατή (δεν φαίνεται), αλλογενή πολλαπλασιασμό κυττάρων Τ μειώθηκε σημαντικά όταν DCs από ποντικούς ΝΚ κύτταρο-εξαντλημένο χρησιμοποιήθηκαν ως ερέθισμα (Σχήμα 2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι κύτταρα ΝΚ-μεσολαβούμενη μείωση του αριθμού DC αντιπροσωπεύει ένα λειτουργικώς σχετική

in vivo

μηχανισμό με τον οποίο οι περισσότερο ανοσογόνα DCs αποτελεσματικά επιλεγεί. Πράγματι, μετά την ενεργοποίηση περιφερικών κυττάρων ΝΚ, δενδριτικά κύτταρα που περιέχονται στα αποξηραντικά LNs μειώθηκαν σε αριθμό, αλλά προικισμένη με ισχυρές ιδιότητες περισσότερο την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων.

αποστράγγιση λεμφαδένων DCs ποντικών εγχύθηκαν υποδορίως με MHC

negcells ταξινομήθηκαν και καλλιεργήθηκαν παρουσία αλλογονικών σπληνοκυττάρων προηγουμένως σημανθεί με CFSE. Α: σπληνοκύτταρα καλλιεργήθηκαν μόνο (αριθ ερέθισμα) ή με το 10% της υψηλής καθαρότητας DCs λεμφαδένων από ποντίκια ΝΚ κυττάρων εξαντλημένο (10% DC αποστράγγιση LN + αντι-ασιαλο GM1) ή τον έλεγχο (10% DC αποστράγγιση LN) πριν από τη χορήγηση του MHC -αρνητικοί κύτταρα-στόχους. αραίωση CFSE των σπληνοκυττάρων σε 6 ημέρες καλλιέργειας εμφανίζεται. εξάντληση των κυττάρων ΝΚ θέτει σε κίνδυνο την επαγωγή του πολλαπλασιασμού από LN ΑΧ. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων συνοψίζονται στον πίνακα Β: ▪ = 10% DC αποστράγγιση LN? ▴ = 10% DC αποστράγγιση LN + αντι-ασιαλο GM1. * = P & lt?. 0,02

Η

Η επεξεργασία των ΑΧ από ΝΚ κύτταρα Προωθεί Αντιγόνου Ειδική Επέκταση Τ κυττάρων και μια πιο προστατευτική ανοσολογική απόκριση Κατά Cancer Cell εμβολιασμός

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η

in vivo

ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων καταλήγει σε μία περφορίνης δοσοεξαρτώμενη μείωση των δενδριτικών κυττάρων LN, η οποία συνδέεται με την παρουσία περισσοτέρων ανοσογόνων DCs σε αποστράγγιση LN. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε κατά πόσον αυτό οδηγεί σε μια πιο προστατευτική προσαρμοστική ανοσολογική απόκριση σε ένα μοντέλο εμβολιασμού καρκινικών κυττάρων. Ομάδες ποντικών, τα οποία είχαν υποβληθεί είτε εξάντληση των κυττάρων ΝΚ ή ψευδο θεραπεία, ενέθηκαν s.c. με τα MHC-άνευ κυττάρων (δηλαδή κύτταρα ΥΑΟ-1) και τα κύτταρα TS /A, ένα κύτταρο ανθεκτικό μαστικού αδενοκαρκινώματος όγκου κυτταρική γραμμή ΝΚ. Ως έλεγχοι, ομάδες ποντικών εγχύθηκαν είτε με TS /A ή κύτταρα ΥΑΟ-1 μόνο. Μετά από τρεις εβδομάδες, οι σπλήνες συλλέχθηκαν και τα κύτταρα επαναδιεγέρθηκαν σε καλλιέργεια με έναν όγκο κύτταρα TS /ή του πεπτιδίου AH1, το οποίο είναι ένα ανοσοκυρίαρχο MHC τάξης Ι περιορισμένο επίτοπο της TS /A αντιγόνου gp70env [36], [37]. Σπληνοκύτταρα από ποντικούς που είχαν ενεθεί με κύτταρα TS /A συν YAC-1 έδειξαν σημαντικά υψηλότερους αριθμούς ΙΡΝ-γ κύτταρα που παράγουν κατά τη διέγερση σε σύγκριση με ποντικούς στερούμενους ΝΚ κυττάρων ή ποντίκια ελέγχου (ρ & lt? 0,05 και & lt? 0,01) (Σχήμα 3 ,ΈΝΑ). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η λύση των DCs από ενεργοποιημένα ΝΚ κύτταρα υποστηρίζει την επέκταση των αντιγονο-ειδικών Τ λεμφοκυττάρων

in vivo

. Καμία αύξηση σε κύτταρα που παράγουν ΙΡΝ-γ παρατηρήθηκε όταν οι καλλιέργειες επαναδιεγέρθηκαν με κύτταρα ΥΑΟ-1, δείχνοντας ότι η αύξηση των κυττάρων που παράγουν IFN-γ δεν συνδέθηκε με την ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ. Επιπλέον, επαναδιέγερση είτε με TS /A ή ανοσοκυρίαρχο MHC τάξης τους Ι-περιορισμένο επίτοπο AH1 προκάλεσε μια παρόμοια αύξηση των σπληνοκυττάρων που παράγουν ΙΡΝ-γ, υποδεικνύοντας ότι είχαν αντιπροσωπεύεται κυρίως από MHC κατηγορίας Ι-περιορισμένων κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων (CTL).

Α: τα ποντίκια εμβολιάστηκαν με ανοσογόνο κύτταρα TS /A, κύτταρα TS /A αναμιγνύεται με MHC-άνευ κυττάρων (YAC-1) ή κυττάρων YAC-1 μόνο. Σε μια ομάδα ποντικών, αντι-ασιαλο GM1 mAbs χορηγήθηκαν ε.π. 48 ώρες πριν από τη χορήγηση των εμβολίων κυττάρου σε καταστρέφουν κύτταρα ΝΚ. Μετά από 21 ημέρες, τα σπληνοκύτταρα διεγέρθηκαν πάλι είτε με κύτταρα TS /A, ο TS /A MHC κατηγορίας Ι-περιορισμένων ανοσοκυρίαρχο πεπτίδιο AH1 ή με YAC-1 κύτταρα και τις συχνότητες των κυττάρων που παράγουν ΙΡΝγ προσδιορίστηκε με δοκιμασία ELISPOT. Μια σημαντική αύξηση των κυττάρων που παράγουν ΙΡΝγ αντιγόνου-ειδική ήταν ανιχνεύσιμη σε ποντίκια εμβολιασμένα με TS /A αναμιγνύεται με κύτταρα ΥΑΟ-1 (TS /A + YAC-1). Η αύξηση των αντιγονο-ειδικών CTL καταργήθηκε όταν τα ποντίκια είχαν εξαντληθεί από κύτταρα ΝΚ πριν από τον εμβολιασμό (TS /A + YAC-1 + αντι ασιαλο GM1). Β: Παρόμοια πειράματα διεξήχθησαν σε περφορίνης ΚΟ ποντικούς (pFN

– /-) και παράλληλα με άγριου τύπου ποντικούς (WT). Ένας σημαντικός μικρότερος αριθμός TS /A όγκου-ειδικά CTL προκλήθηκε με εμβολιασμό σε περφορίνης ΚΟ ποντικούς όταν συγκρίνεται με ποντικούς άγριου τύπου. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές και SEM των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα (τρία ποντίκια ανά ομάδα). ** = Ρ & lt? 0001? * = P & lt? 0005

Η

Για να διαλευκανθεί αν ΝΚ κυττάρων βοήθεια για την επέκταση CTL ήταν στην πραγματικότητα συνδέεται με ΝΚ κυττάρων με τη μεσολάβηση DC λύση, θέτουμε το ίδιο πείραμα χρησιμοποιώντας ομάδες pFN

-. /- Ποντίκια, τα οποία η έλλειψη δραστηριότητας των κυττάρων ΝΚ κυτταρολυτική. Σπληνοκύτταρα από pFN

– /- ποντίκια ενέθηκαν με TS /A συν τις MHC-αρνητικά κύτταρα ΥΑΟ-1 περιείχε ένα σημαντικά χαμηλότερο αριθμό παραγωγής IFN-γ Τ κυττάρων όταν συγκρίνονται με ποντικούς άγριου τύπου που ενέθηκαν επίσης με TS /Α συν YAC-1 (Σχήμα 3, Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΝΚ κυττάρων με τη μεσολάβηση, περφορίνη εξαρτώμενη, λύση των DCs έχει ένα ρόλο στη βέλτιστη δημιουργία αντιγόνου-ειδικών Τ κυττάρων. Ωστόσο, τα παρόντα αποτελέσματα προσφέρουν επίσης, τουλάχιστον εν μέρει, μια εναλλακτική ερμηνεία, δηλαδή ότι τα κύτταρα ΝΚ μπορούν να διεγείρουν άμεσα την ωρίμανση των DC, πιθανότατα με την απελευθέρωση προ-φλεγμονωδών κυτοκινών (π.χ. ΤΝΡ-α), όπως αποδείχθηκε προηγούμενα [21], [ ,,,0],35]. Πράγματι, σε περφορίνη-ανεπαρκή ποντίκια, η ενεργοποίηση των αντι-καρκινικών κυττάρων Τ δεν ήταν τόσο χαμηλή όπως παρατηρείται σε ποντικούς ΝΚ κυττάρων-εξαντλημένο χρησιμοποιώντας θεραπεία αντι-ασιαλο (Εικόνα 3, Α). Έτσι, η βελτιωμένη αντιγονο-ειδική απόκριση Τ κυττάρου, ανιχνεύσιμη μετά τη μεσολάβηση κυττάρων ΝΚ επεξεργασίας DC θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει το αποτέλεσμα τόσο της DC θανάτωσης και κυτοκίνης-μεσολαβητική ενεργοποίηση DC.

Τέλος, παρατηρήσαμε επίσης ότι ο εμβολιασμός με ακτινοβολημένα TS /κυττάρων Α συν κύτταρα ΥΑΟ-1 οδήγησε σε μια σημαντική αύξηση της επιβίωσης των ποντικών μετά από πρόκληση με θανατηφόρο δόση των κυττάρων TS /A (Σχήμα 4). 60% των ποντικών προ-ενεθεί με ακτινοβολημένα TS /A συν YAC-1 επέζησαν 8 εβδομάδες μετά την πρόκληση όγκου, ενώ, στο ίδιο χρονικό διάστημα, μόνο το 20% των είτε κυτταρο-εξαντλημένο ποντικούς ΝΚ ή ποντίκια προ-ενεθεί με ακτινοβολημένα TS /A κύτταρα μόνο επιβίωσαν την πρόκληση όγκου. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι η ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ που προκαλείται από MHC-αρνητικά κύτταρα μπορεί να προωθήσει μια πιο προστατευτική ανοσολογική απόκριση κατά τη διάρκεια των καρκινικών κυττάρων εμβολιασμού.

Ποντίκια εμβολιάστηκαν με κύτταρα ανοσογονικός όγκος μόνο (TS /A) , καρκινικά κύτταρα αναμεμιγμένα με MHC-αρνητικά κύτταρα μόνο (YAC-1) (πέντε ποντικοί ανά ομάδα) MHC-αρνητικό ells (TS /A + YAC-1) ή. Σε μια ομάδα ποντικών, αντι-ασιαλο GM1 mAbs χορηγήθηκαν ε.π. 48 ώρες πριν από τη χορήγηση των εμβολίων κυττάρου σε καταστρέφουν κύτταρα ΝΚ. Μετά από 21 ημέρες, τα ποντίκια προκλήθηκαν με μια θανατηφόρο δόση κυττάρων όγκου και παρακολουθήθηκαν για ανάπτυξη όγκου δύο φορές την εβδομάδα για δύο μήνες. Ποντικοί που εμβολιάστηκαν με καρκινικά κύτταρα αναμεμιγμένα με MHC-αρνητικά κύτταρα (TS /A + YAC-1) επέδειξαν μία καθυστέρηση στην ανάπτυξη του όγκου και μια εντυπωσιακή επιβίωση σε TS /A πρόκληση καρκινικών κυττάρων. Αυτή η προστατευτική επίδραση καταργείται όταν τα ποντίκια είχαν εξαντληθεί από κύτταρα ΝΚ (TS /A + ΥΑΟ-1 + αντι-ασιαλο GM1).

Η

Καταληκτικές Παρατηρήσεις

Έχουμε εδώ δείξει ότι ΝΚ κύτταρα μπορεί να προκαλέσει επεξεργασίας DC

in vivo

. ΝΚ κύτταρα, μετά την ενεργοποίηση από MHC τάξης Ι στερείται κυττάρων, αποκτούν τη δυνατότητα να επιλέξετε τις πιο ανοσογόνες μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα στην αποστράγγιση LNs μέσω περφορίνης-εξαρτώμενο μηχανισμό. Παρά το γεγονός ότι τα τρέχοντα δεδομένα μας δεν αποτελούν την επίσημη απόδειξη της άμεσης μεσολάβηση κυττάρων κυτταροτοξικότητα ΝΚ εναντίον ΑΧ, την κατάργηση του φαινομένου σε pFN

– /-. Ποντίκια μπορεί να υποδεικνύουν μια άμεση λύση DC από τα κύτταρα ΝΚ

Είναι αξιοσημείωτο ότι αυτή η υποθετική θανάτωση οδηγεί στην επιλογή του περισσότερο ανοσογόνα DCs, που χαρακτηρίζεται από μια υψηλότερη ικανότητα να επάγει τον πολλαπλασιασμό των αλλογενών κυττάρων Τ. Έτσι, εκτός από την άμεση διέγερση των DCs που προκαλούνται από κύτταρο-απελευθερώνονται κυτοκίνες ΝΚ, κύτταρα ΝΚ μπορούν να συμβάλλουν στην ενεργοποίηση των κυττάρων Τ με την επιλογή των πιο ανοσογόνες DCs.

Η αναγνώριση του τύπου των κυττάρων ΝΚ υπεύθυνα για την διαδικασία του μοντάζ, καθώς και οι περιοχές όπου εμφανίζεται δήθεν DC δολοφονία, παραμένει ακόμη να προσδιοριστεί. Στο πλαίσιο αυτό, είναι πιθανό ότι αυτό το γεγονός θα μπορούσε να λάβει χώρα στην περιφέρεια, όπου τα κύτταρα ΝΚ είναι εξοπλισμένα με ένα υψηλότερο κυτταρολυτική δράση σε σύγκριση με εκείνα που ανιχνεύθηκαν στους λεμφαδένες. Από την άλλη πλευρά, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι, κάτω από ορισμένες συνθήκες (για παράδειγμα μια καταιγίδα κυτοκίνη), λεμφαδένα ΝΚ κύτταρα θα μπορούσαν να αλλάξουν λειτουργικό φαινότυπο τους και να αποκτήσουν υψηλότερη κυτταρολυτικό δυναμικό, όπως προτείνεται προηγουμένως [38]. Μια εναλλακτική δυνατότητα είναι ότι τα περιφερικά κύτταρα ΝΚ εμφανίζουν υψηλή κυτταρολυτική δραστηριότητα θα μπορούσε να μεταναστεύσουν σε λεμφαδένες μετά την ενεργοποίηση και την απόκτηση των κατάλληλων υποδοχέων χημειοκινών, όπως προτείνεται από πρόσφατες εκθέσεις [39] – [41]

Η αλληλεπίδραση μεταξύ ενεργοποιημένη ΝΚ. κύτταρα και δενδριτικά κύτταρα είναι επίσης σημαντική για τη θέσπιση προστατευτική ανοσολογική απόκριση. Σε ένα μοντέλο του εμβολιασμού κατά του καρκίνου, η χορήγηση των καρκινικών κυττάρων μαζί με ΝΚ ενεργοποίησης MHC-άνευ κυττάρων, αύξησε την επέκταση του όγκου-ειδικά CTLs σαν αποτέλεσμα αυξημένη επιβίωση των ποντικών μετά από πρόκληση με θανατηφόρο δόση των κυττάρων όγκου. Η εξάντληση των κυττάρων ΝΚ εξασθενημένη αυτό όγκου-ειδικά Τ κυτταρικής απόκρισης, καθώς και προστατευτικό ρόλο του έναντι της πρόκλησης του όγκου. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι,

in vivo

, κύτταρα ΝΚ μπορούν να επεξεργαστούν DCs για τη βέλτιστη παραγωγή των προσαρμοστικών ανοσοαποκρίσεων με μια αποτελεσματική επιλογή των πιο ανοσογόνο ΑΧ. Τέλος, τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι τα εμβόλια καρκινικών κυττάρων θα μπορούσε να βελτιωθεί με στρατηγικές που στοχεύουν στην ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ, όπως η χρήση των ΝΚ-ευαίσθητων καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές Cell, Μοντέλο των ζώων και Προϋποθέσεις Πειραματική

Το TS /A κυτταρική σειρά αδενοκαρκινώματος του μαστού ποντικού [36] (ευγενώς από PL Lollini, Πανεπιστήμιο της Μπολόνια, Μπολόνια, Ιταλία) καλλιεργήθηκε σε DMEM /10% FCS (Cambrex, Charles City, ΙΑ, ΗΠΑ). Η YAC-1 (ATCC ΤΙΒ-160) [42] ήταν αντί καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640/10% FCS (Cambrex, Charles City, ΙΑ, ΗΠΑ). 5-8 εβδομάδων θηλυκά άγριου τύπου BALB /c (H-2K

δ) ποντίκια και άγριου τύπου C57BL /6 (Η-2

β) ποντίκια αγοράστηκαν από Harlan (Ούντινε, Ιταλία). Περφορίνης

– /-. Ποντίκια (CByJ.B6-PRF1

tm1Sdz /J) αγοράστηκαν από το The Jackson Laboratory (Bar Harbour, ΜΕ)

Τα ποντίκια υποδόρια (SC) ένεση με 2 χ 10

6 ακτινοβολημένα (20.000 rads) YAC-1 κύτταρα ή, όπου ενδείκνυται, είτε με ακτινοβολημένα TS /A καρκινικά κύτταρα μόνο (5 χ 10

5) ή ακτινοβολημένα TS /A νεοπλασματικά κύτταρα (5 χ 10

5) αναμιγνύεται με ακτινοβολημένα κύτταρα ΥΑΟ-1 (2 χ 10

6). Τα ζώα που υποβάλλονται σε

in vivo

εξάντληση των κυττάρων ΝΚ έλαβαν τρεις ενδοπεριτοναϊκές (ΙΡ) ενέσεις με αντι-ασιαλο-GM 1 αντισώματα (αντι-ΝΚ ορό κουνελιού, 200 μΙ /ποντικό 1:10 αραιωμένο μητρικό διάλυμα, Wako) κατά τις ημέρες -2 /0 /+ 1 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43] (ημέρα 0 ήταν η ημέρα της κυτταρικής εμβολιασμού. πρόκληση όγκου έγινε σε τρεις εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με ένα ογκογόνο δόση 5 χ 10

4 του TS /A καρκινικά κύτταρα. την ανάπτυξη και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο. η ένεση του YAC-1 σε BALB /c αντιπροσωπεύει ένα αλλογενή σύστημα, αλλά η απουσία τόσο MHC τάξης Ι και τάξης έκφραση II σε YAC-1 κύτταρα ελαχιστοποιεί την πιθανότητα alloresponse. τα ζώα στεγάστηκαν σε αποικία ελεύθερα παθογόνων και τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με την Εθνική κανονισμού για την Έρευνα πόροι των ζώων και έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση του Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Γένοβα.

Λεμφοειδής οργάνων κελί απομόνωσης

βουβωνικούς λεμφαδένες (LNs) χειρουργικά αποκόπηκαν και συλλέχθηκε σε RPMI 1640/10% FCS. Αυτοί κόπηκαν σε μικρά θραύσματα χρησιμοποιώντας ξυραφάκια και πέψη σε 2 mg /ml κολλαγενάση Α και 30 μg /ml ϋΝάσης Ι (Roche, Mannheim, Germany) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Ενιαία εναιωρήματα κυττάρων παρασκευάστηκαν με διήθηση μέσω κελί σουρωτήρι 70 μm (BD Labware, San Jose, CA, USA). + Κύτταρα CD11c

απομονώθηκαν με θετική επιλογή χρησιμοποιώντας μικροσφαιρίδια αντι-Οϋ11ο και ένα μαγνητικό διαχωριστή (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία). Τα σπληνοκύτταρα απομονώθηκαν με μηχανική διάσπαση και διήθημα από ένα πλέγμα κυττάρων 70 μm (BD Labware). Τα ερυθροκύτταρα στα σπληνικών σκευάσματα απομακρύνθηκαν με υποτονική λύση με ΝΗ

4Cl /KHCO

3 /EDTA.

Τα αντισώματα και κυτταρομετρίας ροής

Τα ζώα που υποβάλλονται σε

in vivo

ΝΚ εξάντληση των κυττάρων έλαβε δύο ip ενέσεις με αντι-asilao GM1 την ημέρα -2/0 (αντι-ΝΚ ορό κουνελιού, 200 μΙ /ποντικό 1:10 αραιωμένο μητρικό διάλυμα, Wako Neuss, Germany). Μετά από 36 ώρες από την ένεση, βουβωνικό LNs συλλέχθηκαν και τα κυτταρικά εναιωρήματα που λαμβάνονται σημάνθηκαν με αντι-Οϋ11ο, αντι-DX5, αντι-CD40, αντι-CD80, αντι-CD86 και αντι-ΜΗΟ τάξης II (όλα από eBioscience, San Diego , CA) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACS Canto II, BD).

δοκιμασία πολλαπλασιασμού

Για την ανίχνευση πολλαπλασιασμού, σπληνικά κύτταρα από ποντίκια Β6 σημάνθηκαν με 5 μΜ καρβοξυφλουοροσκεϊνης ηλεκτριμιδυλεστέρας εστέρα (CFSE ) σε PBS συν 0.1% BSA για 10 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από εκτεταμένη πλύση με PBS συν 0.1% BSA, τα κύτταρα επωάστηκαν με αλλογενή DCs CD11c διαλέγεται από την αποστράγγιση LN από ποντικούς που έλαβαν ένεση με YAC-1 κύτταρα που είχαν ή δεν είχαν υποβληθεί σε εξάντληση των κυττάρων ΝΚ. Τα DCs πλύθηκαν εκτεταμένα σε PBS πριν καλλιέργεια με Τ κύτταρα. Μετά από 6 ημέρες, CFSE φθορισμός αξιολογήθηκε επί CD3

+ κύτταρα με κυτταρομετρία ροής.

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσοκηλίδας Αναλύσεις

Οι συχνότητες των IFN-γ-κύτταρα που παράγουν σπλήνας από εμβολιασμένα ζώα ήσαν προσδιορίζεται μετά από τρεις εβδομάδες από ένα ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσοκηλίδας (ELISPOT) πραγματοποιήθηκε σε σπληνοκύτταρα. πλάκες Multiscreen-ΠΕ (Millipore, Bedford, ΜΑ και BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) επικαλύφθηκαν όλη τη νύχτα με 10 μg /ml του αντι-ΙΡΝ-γ mAb σε PBS (Endogen, Woburn, ΜΑ και BD Pharmingen, San Jose , CA, USA). Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν με RPMI 1640 και δεσμεύονται επί 3 ώρες με PBS λευκωματίνης-2% βόειου ορού. Τα σπληνοκύτταρα μετρήθηκαν σε πλήρες RPMI 1640 και στη συνέχεια εμβολιάζονται σε 2-πλάσια σειριακή αραίωση, ξεκινώντας από 4 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο εις διπλούν, με την παρουσία ή απουσία του: (i) ακτινοβολημένα (20.000 rads) TS /A καρκινικά κύτταρα? (Ii) YAC-1 κύτταρα (τόσο σε 10:01 αναλογία τελεστή κυττάρων /διεγέρτης)? (Iii) ενδογενή ρετροϊική gp70 προερχόμενο AH1 πεπτιδίου, η 9-αμινο οξύ H-2L

d-περιορισμένο πεπτίδιο (SPSYVYHQF, συντίθεται με INBIOS S.r.l., Napoli, Ιταλία) σε τελική συγκέντρωση 10 μg /ml. AH1 είναι το ανοσοκυρίαρχο αντιγόνο CD8 που εκφράζεται στην επιφάνεια του TS /A κυτταρικές σειρές καρκίνου [37]. Όπου ενδείκνυται, η διέγερση των κυττάρων λήφθηκε επίσης με ΡΜΑ και ιονομυκίνη σε τελική συγκέντρωση 50 ng /ml και 500 ng /ml, αντίστοιχα (SIGMA). Μετά από 40 ώρες επώασης, οι πλάκες πλύθηκαν με PBS-0,05% Tween 20 και επωάστηκαν με 1 μg /ml βιοτινυλιωμένο δευτερογενές mAb προς ΙΡΝ-γ (Endogen και BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) σε PBS-1% βόειο ορό λευκωματίνη για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Αρμορακίας συζευγμένη με υπεροξειδάση στρεπταβιδίνη (1:5,000) προστέθηκε στη συνέχεια για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση, οι πλάκες βάφτηκαν με AEC κιτ χρώσης (Sigma και BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) και κηλίδες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας στερεομικροσκόπιο. Α & gt? 2-φορές αύξηση στον αριθμό των κηλίδων έναντι του ελέγχου (σπληνοκύτταρα καλλιεργήθηκαν χωρίς διέγερση) θεωρήθηκε ως θετική απόκριση. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ο αριθμός των κυττάρων που σχηματίζουν κηλίδες ανά εκατομμύριο κυττάρων σπλήνας.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών εκτιμήθηκε με δοκιμή Student ή δοκιμασία Mann Whitney χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism Graphpad ( GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Όλες οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM.