Αφηρημένο

Ιστορικό

Παρά την εντατική έρευνα στην έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου, υπάρχει έλλειψη βιοδεικτών για την αξιόπιστη ανίχνευση των κακοήθων όγκων, συμπεριλαμβανομένων των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). αλλαγές μεθυλίωσης του DNA είναι κοινά και σχετικά σταθερά σε διάφορους τύπους καρκίνων, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικός ή προγνωστικός βιοδείκτες.

Μέθοδοι

Πραγματοποιήσαμε μεθυλίωσης του DNA των χαρακτηριστικών των δειγμάτων από 48 ασθενείς με σταδίου Ι NSCLC και 18 που ταιριάζουν δείγματα καρκίνο του πνεύμονα χωρίς τη χρήση μικροσυστοιχιών που καλύπτει τις περιοχές υποκινητή πάνω από 14.500 γονίδια. Εμείς συσχετίζονται αλλαγές μεθυλίωσης του DNA με τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων και πραγματοποιείται ανάλυση επιβίωσης.

Αποτελέσματα

Παρατηρήσαμε υπερμεθυλίωση 496 CpGs σε 379 γονίδια και υπομεθυλίωση των 373 CpGs σε 335 γονίδια σε NSCLC. Σε σύγκριση με τα δείγματα αδενοκαρκινώματος, δείγματα πλακώδες καρκίνωμα είχε 263 CpGs σε 223 υπερμεθυλίωση γονίδια και 513 CpGs σε 436 μεθυλιωμένος γονίδια. 378 από 869 (43,5%) CpG θέσεις διακρίσεις τα δείγματα NSCLC και ελέγχου έδειξε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ CpG ιστοσελίδα μεθυλίωσης και των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων. Ως αποτέλεσμα της ανάλυσης επιβίωσης, βρήκαμε 10 CpGs σε 10 γονίδια, στα οποία το επίπεδο μεθυλίωσης διαφέρει σε διαφορετικές ομάδες επιβίωσης.

Συμπεράσματα

Έχουμε εντοπίσει ένα σύνολο γονιδίων με αλλαγμένη μεθυλίωση σε NSCLC και διαπίστωσε ότι μια μειοψηφία αυτών, έδειξε μια αντίστροφη συσχέτιση με τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Βρήκαμε επίσης ένα σύνολο γονιδίων τα οποία σχετίζονται με την επιβίωση των ασθενών. Αυτά τα πρόσφατα εντοπίστηκαν οι υποψήφιοι δείκτη για το μοριακό έλεγχο του NSCLC θα χρειαστεί περαιτέρω ανάλυση προκειμένου να διαπιστωθεί κλινική χρησιμότητα τους

Παράθεση:. Lokk K, Vooder T, Kolde R, Valk Κ, VOSA U, Roosipuu R, et al. (2012) Η μεθυλίωση Μαρκαδόροι αρχικών σταδίων μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (6): e39813. doi: 10.1371 /journal.pone.0039813

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 6 Νοέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 28η Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Lokk et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Ευρωπαϊκή Ένωση μέσω του Ευρωπαϊκού Ταμείου Περιφερειακής Ανάπτυξης, Κέντρο αριστείας στη Γονιδιωματική και προβάλει 245536 OpenGene. Πρόσθετη στήριξη λήφθηκε από Υπουργείο εσθονική Παιδείας και Επιστημών SF0180142s08 πυρήνα επιδότηση, υποτροφίες του Ιδρύματος εσθονική Science 7473, 9293 και Πανεπιστήμιο του Tartu Έργου Ταμείο Ανάπτυξης της Translational Genomics. LM έχει υποστηριχθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου, υποτροφία MJD71. NT έχει υποστηριχθεί από την υποτροφία από το Ίδρυμα Αλέξανδρος von Humboldt. KL, ΜΚ και ΝΤ έχουν λάβει ταξιδιωτικά επιδόματα από Κρίστιαν-Jaak Ιδρύματος. Ιστοσελίδα του έργου OpenGene: www.geenivaramu.ee/opengene/. Ιστοσελίδα του Ιδρύματος εσθονική Επιστήμη: www.etf.ee. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στον κόσμο. Επιγενετικές γεγονότα είναι νωρίς και συχνές στην καρκινογένεση [1], [2], [3], η οποία καθιστά το DNA μεθυλίωση μια ελκυστική βιοδείκτης για τον καρκίνο. Επιγενετικές γεγονότα θα μπορούσε επίσης να παρέχει ένα προσιτό σύνδεσμο μεταξύ του γονιδιώματος και το περιβάλλον, με το επιγονιδίωμα χρησιμεύει ως βιοχημική ιστορικό σχετικών γεγονότα της ζωής, π.χ. κάπνισμα τσιγάρων [4].

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μορφολογικά διαιρείται σε μη-μικροκυτταρικού καρκίνου και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC και SCLC). NSCLC αντιπροσωπεύει περίπου το 80% των καρκίνων του πνεύμονα και είναι ένα ετερογενές κλινική οντότητα με σημαντικές ιστολογικές υποτύπους όπως καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC), αδενοκαρκίνωμα (AC) και καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου [5]. Ένα κοινό χαρακτηριστικό των διαφορετικών υποτύπων του NSCLC είναι η κάπως βραδύτερη ανάπτυξη και εξάπλωση σε σύγκριση με SCLC, επιτρέποντας χειρουργική εξάλειψη της στα πρώτα της στάδια. Μόνο ένα μικρό κλάσμα των περιπτώσεων NSCLC σήμερα διαγιγνώσκεται σε κλινικά στάδια I έως IIb, όπου η χειρουργική αφαίρεση είναι η θεραπεία εκλογής.

Η βιοδεικτών με γνώμονα την προσέγγιση σε preinvasive φάσεις θα μπορούσε να βοηθήσει στη διάγνωση ή τον αποκλεισμό του καρκίνου του πνεύμονα. Τρέχουσες δείκτες, συμπεριλαμβανομένων των πλακωδών αντιγόνο καρκινώματος, καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο, κυτοκερατίνη 19 αντιγόνο θραύσμα 21-1 και νευρώνα ενολάση δείχθηκαν να στερούνται ικανοποιητικής διαγνωστική δύναμη. Σε μια πρόσφατη μελέτη, μόνο το 37,3% των καρκίνων του πνεύμονα πρώιμου σταδίου μπορεί να διαγνωστεί χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες συνδυασμό των προαναφερθέντων δεικτών όγκου [6].

Η μελέτη μας είχε ως στόχο του γονιδιώματος σε επίπεδο ταυτοποίηση του DNA μεθυλίωση με βάση υποψηφίων βιοδεικτών σε πρώιμο στάδιο NSCLC. Μεθυλίωσης του DNA λαμβάνει χώρα κατά πολύ στο πλαίσιο της κυτοσίνης-γουανίνης δινουκλεοτίδια (CpGs) [7]. Τα CpG πλούσιων σε μικρά μήκη (CpG νησίδων) συνήθως βρίσκεται στην περιοχή προαγωγού των γονιδίων και συνήθως διατηρούνται σε απομεθυλιωμένου κατάσταση [8]. Στον καρκίνο, CpG νησίδες που βρίσκεται στην περιοχή προαγωγού των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και γονιδίων «οικοκυρική» γίνονται υπερμεθυλιωμένων, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη έκφραση αυτών των γονιδίων. Ταυτόχρονα, το γονιδίωμα είναι παγκοσμίως απομεθυλιώνεται, η οποία με τη σειρά της μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση των ογκογονιδίων [9], [10]. Η μεθυλίωση των CpG νησί ακτές – περιοχές με χαμηλότερη πυκνότητα CpG μέσα σε περίπου 2 kb των CpG νησίδων – συνδέεται επίσης στενά με την μεταγραφική αδρανοποίηση [11]

Πρόσφατα, σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στο γονιδίωμα-ευρεία μεθυλίωσης του DNA. ανάλυση. Οι μέθοδοι περιλαμβάνουν όξινο θειώδες μετατροπή του DNA, ανοσοκαταβύθιση ή καθαρισμό συγγένειας του μεθυλιωμένου DNA που ακολουθείται από ανάλυση μικροσυστοιχιών ή αλληλούχιση υψηλής διεκπεραιωτικότητας [12]. Έχει αποδειχθεί ότι όσον αφορά την ακρίβεια, οι μέθοδοι θειώδους που βασίζονται εκτελούν ελαφρώς καλύτερα από ό, τι οι μέθοδοι εμπλουτισμού που βασίζεται και δεν απαιτούν μια στατιστική διόρθωση για CpG προκατάληψη [13].

Έχουμε εκτελέσει μια γονιδιώματος-ευρεία DNA μεθυλίωση μελέτη του σταδίου Ι NSCLC για να ληφθεί μια εικόνα σε πρώιμα στάδια επιγενετικές μεταβολές στον καρκίνο του πνεύμονα και τον εντοπισμό πιθανών διαγνωστικών ή προγνωστικών βιοδείκτες. Στη μελέτη μας χρησιμοποιήσαμε τις HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, Inc) που επιτρέπουν αποδοτική ποσοτικές συγκρίσεις μεταξύ πολλών δειγμάτων.

Αποτελέσματα

CpG Ανάλυση μεθυλίωσης

Σε γενικές γραμμές, εντοπίσαμε 496 CpGs σε 379 γονίδια υπερμεθυλίωση και 373 CpGs σε 336 γονίδια μεθυλιωμένος σε NSCLC (Σχήμα S1, Πίνακας S1). Ένα θερμικός χάρτης των 100 πιο διαφορετικά μεθυλιωμένα γονίδια σε NSCLC σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου φαίνεται στο Σχήμα 1.

Τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA παρουσιάζεται για τις άνω των 100 CpG θέσεις με τις υψηλότερες τιμές δέλτα βήτα (FDR διορθωμένη) του DNA μεθυλίωση μεταξύ ιστού καρκίνου και φυσιολογικό πνευμονικό ιστό. Οι βήτα-τιμές μεθυλίωση εκπροσωπήθηκαν ως σειρά Z-score. Ένας θερμικός χάρτης δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ανεξέλεγκτους 2D ιεραρχική ανάλυση συστάδων. Κόκκινο δείχνει υψηλή μεθυλίωση και το μπλε δείχνει χαμηλή μεθυλίωσης σε σχέση με την σειρά σημαίνει.

Η

Σε σύγκριση με τα δείγματα AC, δείγματα SCC είχε 263 CpGs σε 223 υπερμεθυλίωση γονίδια και 513 CpGs σε 436 μεθυλιωμένος γονίδια (Σχήμα S2, Πίνακας S2).

Δύο δείγματα DNA (IDs 33 και 107) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις διπλούν ως εσωτερικό έλεγχο της αναπαραγωγιμότητας της δοκιμασίας του. συντελεστή συσχέτισης Pearson για τις δύο αντίγραφα ήταν 0.998. επίπεδα μεθυλίωσης προσδιορίζεται από την δοκιμασία Infinium επικυρώνονταν με Sanger αλληλούχισης του με όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA για 11 CpGs (έξι CpGs από NSCLC έναντι ανάλυση δειγμάτων ελέγχου και πέντε CpGs από την ανάλυση επιβίωσης). Η μέση συσχέτιση μεταξύ των δύο μεθόδων ήταν 83% (εύρος 48,9%? 97.4%). (Σχήμα S3)

Οι θέσεις CpG αναλύθηκαν με τη δοκιμασία HumanMethylation27 βρίσκονται μέσα σε 1,5 kb ανάντη προς 1 kb κατάντη της TSS του τους αντίστοιχα γονίδια. Βρήκαμε μια σημαντική διαφορά στην θέση των υπερμεθυλιωμένων εναντίον μεθυλιωμένος CpGs σε σχέση με την πλησιέστερη TSS (p = 0,0001, Welch δύο υποδείγματα t-test). Υπερμεθυλίωση CpGs είχαν προτίμηση βρίσκεται σε TSSs, 3 ‘κατάντη του TSS ή σε νησίδες CpG. Σε αντίθεση, μεθυλιωμένος CpGs βρέθηκε συχνά 5 ‘ανάντη του αντίστοιχου TSSs ή σε CpG νησί ακτές [11] (Πίνακας 1, Εικόνα 2).

Μετρήσαμε CpGs «απόσταση από τη θέση έναρξης μεταγραφής (TSS) . α) απόσταση από το TSS όλων των CpGs της συστοιχίας μεθυλίωση. β) Απόσταση από το TSS του υπερμεθυλιωμένων CpGs (διακεκομμένη γραμμή) και την απόσταση από το TSS του μεθυλιωμένος CpGs (συνεχής γραμμή). Από την x-άξονα, η απόσταση από το TSS μετριέται σε bp-s, και στον y-άξονα Ν αντιπροσωπεύει τον αριθμό των CpGs.

Η

Διαφορετικές CpGs του

HSPA12B

,

PABPC5

και

TP73

ήταν είτε υπερ- ή υπο-μεθυλιωμένα σε NSCLC. Στην

TP73

γονίδιο, το υπερμεθυλιωμένων τοποθεσία CpG στο δείγμα του όγκου βρισκόταν ανοδικά του TSS του ισόμορφου mRNA πλήρους μήκους. Μεθυλιωμένος

TP73

CpGs βρίσκονταν κοντά στο TSSs των μικρότερων ισομορφών. Υπερμεθυλίωση CpGs του

HSPA12B

και

PABPC5

βρίσκονταν στο 5 ‘CpG τα νησιά τους, ενώ μεθυλιωμένος CpGs βρίσκονταν ανάντη, εκτός των νήσων CpG.

γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών Επικύρωση από qRT-PCR

η γονιδιακή έκφραση εγκατάσταση συστοιχίας και τα αποτελέσματα αναφέρονται στο πρόσφατο έγγραφο [14]. 10 γονίδια και οκτώ ζευγών δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία qRT-PCR. Όλα τα γονίδια έδειξαν την ίδια κατεύθυνση υπερβολικής ή υποέκφραση στα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα, χρησιμοποιώντας και τα δύο τεχνολογιών (Σχήμα 3). Επτά γονίδια έδειξαν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης fold-αλλαγές καθορίζεται από qRT-PCR και μικροσυστοιχιών (p & lt? 0,05, R & gt? 0,7). (Σχήμα S4)

Από την y-άξονα εμφανίζεται κατά μέσο όρο log2fold- αλλάξετε καθορίζεται από σειρά Illumina και qRT-PCR (8 ζεύγη δειγμάτων). Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM).

Η

που σχετίζονται με την έκφραση γονιδίων μεθυλίωση Αλλάζει

Χρησιμοποιώντας ανάλυση συσχέτισης του Pearson, ήμασταν σε θέση να καθορίσει την αναμενόμενη αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του διαφορικού επίπεδα μεθυλίωσης και αξίες γονιδιακής έκφρασης για 378 (43,5%) των 869 διαφορικά μεθυλιωμένα CpGs μεταξύ NSCLC και των δειγμάτων ελέγχου. Σε διαφορετικές ιστολογικές ομάδες ήμασταν σε θέση να βρείτε 337 780 CpGs (43,2%), τα επίπεδα μεθυλίωσης του οποίου ήταν αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης.

Πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση qPCR των διαφόρων

TP73

ισομορφές για να ελέγξετε αν διαφορική μεθυλίωση δίπλα στο TSSs διαφορετικών ισομορφών επηρεάζει το επίπεδο έκφρασης τους. Η ανάλυση qPCR δεν έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p-value 0,36, paired t-test) μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των δύο ισομορφών σε δείγματα όγκων μας.

Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση

εκτελούνται

in silico

λειτουργική και η αλληλεπίδραση αναλύει τα διαφορικά μεθυλιωμένων γονιδίων χρησιμοποιώντας Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (ΜΠΒ), το λογισμικό (Ingenuity Systems, Redwood City, CA), και βρήκε 78 γονίδια δίκτυο επιλέξιμες και 451 Λειτουργίες /Pathways επιλέξιμα γονίδια. Με τη συμπερίληψη των γνωστών άμεσες και έμμεσες αλληλεπιδράσεις, η πιο ευδιάκριτα εκπροσωπείται δίκτυο γονίδιο που σχετίζονται με παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF, Σχήμα S5). Τα περισσότερα από τα γονίδια (n = 22) στο δίκτυο ήσαν υπο-μεθυλιωμένα, αλλά ορισμένα γονίδια (n = 7) επίσης υπερμεθυλίωση.

μεθυλίωσης του DNA που σχετίζονται με την καπνιστική συμπεριφορά

Με βάση το πακέτο καπνίσματος -years δεδομένων, ρωτήσαμε αν κάπνισμα επηρεάζει τα μοτίβα μεθυλίωσης του DNA σε έναν όγκο. Ένας ασθενής που δεν είχαν δεδομένων κάπνισμα αποκλείστηκε. ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης διεξήχθη με τη χρήση του πακέτου Bioconductor Limma. Ανάλυση εντός δείγματα όγκων δεν έδειξαν καμία διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια που σχετίζονται με την έκταση του καπνίσματος. Συγκρίνοντας τον περιορισμένο αριθμό των μη καπνιστών (n = 3, 6,4%) με τους καπνιστές (n = 44, 93,6%) βρήκαμε τέσσερα διαφορικά μεθυλιωμένες CpG-sites σε τρία γονίδια (ρ & lt? 0,05, FDR προσαρμοσμένη), τα οποία είναι όλα μεθυλιωμένος στην ομάδα των καπνιστών:.

CXorf38

,

MTHFD2

και

TLL2

Η

Altered μεθυλίωση και τη μακροπρόθεσμη επιβίωση

Πραγματοποιήσαμε δύο είδη επιβίωσης αναλύσεις για να βρουν πιθανούς προγνωστικούς δείκτες της μεθυλίωσης. Οι ασθενείς με μόνο μέχρι ένα μήνα επιβίωση μετά τη χειρουργική επέμβαση (n = 2) αποκλείστηκαν για να αποφευχθεί οποιαδήποτε πιθανή σύγχυση επιρροή των μετεγχειρητικών επιπλοκών.

Πρώτον, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier για καθεμία από τις θέσεις CpG διαιρώντας τις τιμές Beta σε χαμηλής, μέσης και υψηλής ομάδες μεθυλίωσης. Αναφέρουμε μόνο τα αποτελέσματα, όπου όλες οι ομάδες ήταν μεγαλύτερα από πέντε ασθενείς. Ως αποτέλεσμα, βρήκαμε 10 CpGs σε 10 γονίδια, με διαφορές επίπεδο μεθυλίωσης σε διαφορετικές ομάδες επιβίωση (Σχήμα 4). Ασθενείς με ένα μέσο επίπεδο μεθυλίωσης του

UGT1A7, GPR171, P2RY12, FLJ35784

και

C20orf185

είχαν καλύτερη επιβίωση από τους ασθενείς με υψηλού επιπέδου μεθυλίωσης. Ασθενείς με ένα μέσο επίπεδο μεθυλίωσης του

CLEC11A

και

GRIK3

είχαν καλύτερη επιβίωση σε σύγκριση με χαμηλού επιπέδου μεθυλίωσης. Οι ασθενείς με χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης του

CYP1A1

και

INGX

είχαν καλύτερη επιβίωση από ό, τι τα άτομα με μεσαίου επιπέδου μεθυλίωσης. Οι ασθενείς με υψηλό επίπεδο μεθυλίωσης για

PIK3R5

είχαν καλύτερη επιβίωση από ό, τι τα άτομα με μεσαίου επιπέδου μεθυλίωσης.

Πραγματοποιήσαμε μια δοκιμή επιβίωσης για κάθε μία από τις περιοχές CpG. Οι τιμές μεθυλίωση χωρίζονται σε 3 ομάδες: χαμηλή (0-0,25), μέσης (0,25-0,75) και υψηλή (0,75-1). Ως αποτέλεσμα βρήκαμε 10 CpG περιοχές των οποίων το επίπεδο μεθυλίωσης διαφέρει σε διαφορετικές ομάδες επιβίωσης. Το x-άξονας δείχνει την επιβίωση σε χρόνια και ο y-άξονας δείχνει τη συνολική επιβίωση.

Η

Δεύτερον, πραγματοποιήσαμε την ανάλυση διαφορική μεθυλίωση συνδυάζοντας Cox ανάλυση αναλογικών κινδύνων και Wilcoxon τεστ rank-sum. Βρήκαμε 18 CpGs σε 15 γονίδια σε ασθενείς με 1 στους 24 μήνες επιβίωση (η = 12) έναντι των ασθενών με 60 μήνες και περισσότερο επιβίωση (n = 15), ρ & lt? 0,05, και η διαφορά μεθυλίωσης αποκοπής που εφαρμόζεται. Από τα διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια,

DXS9879E

(

LAGE3

),

RTEL1

και

MTM1

ήταν υπερμεθυλίωση, και

SCUBE3

,

SYT2

,

KCNC3

,

KCNC4

,

GRIK3

,

CRB1

,

SOCS2

,

ACTA1

,

ZNF660

,

MDFI

,

ALDH1A3

και

SRD5A2

ήσαν υπο-μεθυλιωμένα στην ομάδα με κακή επιβίωση (Σχήμα S6).

Συζήτηση

Έχουμε πραγματοποιηθεί μια μελέτη της μεθυλίωσης του DNA του γονιδιώματος-ευρεία σε 48 στάδιο Ι NSCLC ασθενείς και 18 μακροσκοπικά καρκίνου δωρεάν δείγματα ελέγχου, χρησιμοποιώντας την ανάλυση διασποράς για να αναζητήσετε τα γονίδια που κάνουν διάκριση μεταξύ της καρκινικής και φυσιολογικό ιστό πνεύμονα και σε σύγκριση επίπεδα μεθυλίωσης αυτών των γονιδίων ‘με τα επίπεδα έκφρασής τους. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε

in silico

λειτουργική και αλληλεπίδραση ανάλυση διαφορετικό μεθυλιωμένων γονιδίων χρησιμοποιώντας το λογισμικό IPA. Γραμμική παλινδρόμηση για να βρουν γονίδια που σχετίζονται με το κάπνισμα, και την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier διεξήχθη για να προσδιοριστεί η διαφορική μεθυλίωση των γονιδίων που σχετίζονται με την επιβίωση του ασθενούς.

Ως αποτέλεσμα, εντοπίσαμε 496 CpGs σε 379 υπερμεθυλιωμένο γονιδίων και 373 CpGs σε 336 γονίδια που ήσαν υπο-μεθυλιωμένα σε NSCLC. Ένα τέλειο διαχωρισμό των δειγμάτων ελέγχου πνευμονικού ιστού από δείγματα NSCLC δεν ελήφθη, ως ένα φυσιολογικό δείγμα πνεύμονα συγκεντρωμένα μαζί με τα δείγματα καρκίνου και έξι δείγματα καρκίνου (ένα στην επανάληψη) έδειξε προτύπων μεθυλίωσης κάπως μοιάζει με το χωρίς-όγκο πνευμονικού ιστού. Από τη στιγμή που χρησιμοποιούνται δείγματα μη-εκτομής του όγκου, αυτό το εύρημα μπορεί να είναι τουλάχιστον προκαλείται εν μέρει από την επίδραση της σύγχυσης μη νεοπλασματικό ιστό παρόντα σε αυτά τα δείγματα. Παθολογική εξέταση των δειγμάτων NSCLC με προφίλ μεθυλίωσης DNA παρόμοια με τα φυσιολογικά δείγματα πνευμόνων αποκάλυψε είτε χαμηλή περιεκτικότητα όγκου (10 έως 30%) ή μια πολύ ετερογενής σύνθεση των καρκινικών κυττάρων στα δείγματα. Ως εκ τούτου, αυτά τα δείγματα καρκίνου του συν-ομαδοποίησης και δείγματα καρκίνο του πνεύμονα χωρίς αποκλείστηκαν από περαιτέρω αναλύσεις.

Ο πρώτος μας στόχος ήταν να προσδιοριστούν τα γονίδια που εμπλέκονται στις αρχές γεγονότα στην όγκου-ειδικά μεθυλίωσης. Ως αποτέλεσμα, η διαλογή μας αποκάλυψε ορισμένα γνωστά δείκτες μεθυλίωση, μερικά από τα οποία έχουν δραστικότητα καταστολέα όγκων:

CDKN2A

,

MGMT

,

GATA4

,

HOXA7

,

HOXA9

,

RUNX3

,

SFRP1

. Οι περισσότερες από τις προσδιοριζόμενες γονίδια είναι καινοφανείς δείκτες μεθυλίωσης για NSCLC, αν και μερικά από αυτά έχουν περιγραφεί ως μεθυλιωθεί σε άλλους καρκίνους.

LGALS12

είναι ένα ογκοκατασταλτικό υποψήφιος που είναι σε θέση να συλλάβει τον κυτταρικό κύκλο και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό αρκετών κυτταρικών γραμμών καρκίνου [15]. Στον καρκίνο του μαστού,

LGALS12

έχει βρεθεί προς τα κάτω σε κακοήθη ιστό [16].

Ο δεύτερος στόχος της μελέτης μας ήταν να συσχετίσει τις αλλαγές επιπέδου μεθυλίωσης με τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση του Pearson, ήμασταν σε θέση να βρει την αναμενόμενη αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης και τις αξίες της γονιδιακής έκφρασης για 378 από 869 περιοχές CpG (43,5%). Οι υψηλότερες τιμές συσχέτιση αντίστροφη μεταξύ υπερμεθυλιωμένων CpGs και τις αξίες της έκφρασης αποτελέσματα για το

AGER

(-0,78),

Ε.Π.Υ.

(-0,65) και

AQP1

(-0,63) γονίδια. Η μέση απόσταση του TSS του συσχετίζεται αντίστροφα γονιδίων ήταν -65 bp (εύρος -1498? 917 bp) σε σύγκριση με -158 bp (εύρος -1474? 818 bp) του συσχετίζονται θετικά CpGs (ρ-τιμή 0,02, φοιτητές t-test). Το φάσμα των CpGs επηρεάζεται πιθανώς από το γεγονός ότι Infinium HumanMethylation27 μικροσυστοιχιών Illumina καλύπτει CpGs που βρίσκονται κατά κύριο λόγο στην περιοχή του περιοχές προαγωγέα και όχι στο σώμα γονίδιο ή 3’UTR. Ακουαπορίνη 1 (

AQP1

) έχει αναφερθεί να υπερμεθυλίωση και προς τα κάτω σε NSCLC [17].

AGER

, που κωδικοποιεί ένα υποδοχέα της υπεροικογένειας ανοσοσφαιρίνης, έχει αναφερθεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε NSCLC [18]. Οι υψηλότερες τιμές συσχέτισης αντίστροφη μεθυλιωμένος CpG θέσεις και τις αξίες της έκφρασης αποτελέσματα για

MB

(-0,63),

ADA

(-0,60) και

MAGEA6

(-0,60) γονίδια. Μυοσφαιρίνης (

MB

) σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου και βοηθά να ξεπεραστεί υποξία σε καρκινικά κύτταρα [19]. Υπερμεθυλίωση ή /και η καταστολή κάποιων από τα γονίδια που εντοπίστηκαν στη μελέτη μας (π.χ.

ALDH1A2

,

HOXA5

,

MT1E

,

SOX17

) έχουν έχουν αναφερθεί σε άλλους καρκίνους [20], [21], [22], [23], αλλά δεν έχει ακόμη τεθεί σε καρκίνο του πνεύμονα. Έχει υποτεθεί ότι για

RASSF1

δρα ως καταστολέας όγκων σε εξέλιξη καρκίνου του πνεύμονα [24]. Μεταξύ των μεθυλιωμένος και ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια, η πιο συχνά αναφερόμενη γονίδιο ήταν

SERPINB5

(Maspin). Η υπερέκφραση του

SERPINB5

έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη του καρκίνου και κακή πρόγνωση στον καρκίνο του πνεύμονα [25].

Μπορούμε να υποθέσουμε ότι τα γονίδια με ένα αντίστροφο συσχετισμό έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να ρυθμίζονται από μεθυλίωση . Ωστόσο, πολλά γονίδια ίσως γίνει μεθυλιωμένο τυχαία κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης, και αυτό δεν έχει κατ ‘ανάγκη μια σταθερή κατάσταση επίδραση στα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης.

Στην περίπτωση των διαφόρων ομάδων ιστολογίας, ήμασταν σε θέση να βρείτε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της διαφορικά μεθυλιωμένες CpG θέσεις και αξίες γονιδιακής έκφρασης για 337 780 θέσεις CpG (43,2%). Οι υψηλότερες τιμές συσχέτισης αντίστροφο ήταν για

ACOX2

(-0.75),

ARSE

(-0,70) και

SLC39A4

(-0,68), οι οποίες δεν έχουν συσχετιστεί με NSCLC ιστολογικών υποτύπων πριν. Από τα αντιστρόφως ανάλογα γονίδια, έχει αναφερθεί ότι το

PIGR

,

MUC1

και

FOLR1

είναι προς τα κάτω σε SCC σε σύγκριση με AC [26], [27], [ ,,,0],28], η οποία είναι συνεπής με τα αποτελέσματά μας.

Ανάλυση με τη χρήση λογισμικού ΙΡΑ αποκάλυψε ότι οι κυρίαρχες λειτουργίες των διαφορικά μεθυλιωμένων γονίδια ήταν κυττάρου-προς-κύτταρο σηματοδότηση και την αλληλεπίδραση, την αντιγραφή του DNA και την επισκευή, την κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, κυτταρικό θάνατο, καρκίνο, φλεγμονώδης αντίδραση, κλπ έναν αριθμό λειτουργιών γονιδίου, όπως κυτταρική αύξηση, πολλαπλασιασμό και κυτταρικό θάνατο, εμπλέκονται άμεσα στην εξέλιξη του καρκίνου, αλλά το ανοσοποιητικό σύστημα παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην καταπολέμηση καρκινικών κυττάρων. Είναι επίσης ευρέως γνωστό ότι οι ελλείψεις σε οδούς επιδιόρθωσης του DNA και ελέγχου ζημιών είναι υπεύθυνοι για τις περισσότερες ή ακόμα και όλων των ανθρώπινων καρκίνων. Μετά συμπεριλαμβανομένων των γνωστών έμμεσων σχέσεων, το πιο σημαντικό δίκτυο γονιδίων αποκάλυψε σχετιζόταν με

TNF

(Σχήμα S5).

TNF

έχει διπλό ρόλο στη βιολογία του όγκου. Είναι μια κυτοκίνη με γνωστά αντικαρκινικές ιδιότητες, αλλά μπορεί επίσης να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου και την εξέλιξη [29]. γονίδια μεθυλιωμένος εις το

TNF

δικτύου ήταν κυτοκίνες (

CCL3, CCL4, CCL7, CCL8, CCL22, IL21, IL17A, EBI3

) που μπορεί είτε να διεγείρει ή να αναστέλλει την ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Η

TNF

δίκτυο περιλαμβάνει επίσης το γνωστό ισχυρό αντιαποπτωτικού γονίδιο

BCL2

, η οποία είχε επίσης ως επί το πλείστον μεθυλιωμένος σε δείγματα NSCLC μας.

ALDH1A3

(αλδεΰδη οικογένεια αφυδρογονάση 1, τα κράτη Α3) έμμεσα ρυθμίζονται από

TNF

παίζει ένα ρόλο στην αποτοξίνωση του αλδεΰδες που παράγεται από το μεταβολισμό της αλκοόλης και την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Υπομεθυλίωση αυτού του γονιδίου σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση σε μελέτη κοόρτης μας (Σχήμα S6).

Βρήκαμε ότι

TP73

είχε τρία διαφορικά μεθυλιωμένα CpGs, δύο εκ των οποίων ήσαν υπο-μεθυλιωμένα στους καρκινικούς ιστούς και βρίσκεται κοντά στο TSS της μικρότερης ισομορφών του. Η υπερμεθυλιωμένων CpG βρισκόταν ανοδικά του TSS του ισόμορφου mRNA πλήρους μήκους. Μετρήσαμε την έκφραση διαφορετικών ισομορφών χρησιμοποιώντας ανάλυση qPCR, αλλά δεν βρέθηκε καμία στατιστικώς σημαντικές διαφορές (ρ-τιμή 0,36, paired t-test) στα δείγματα όγκου, αν και η μεγάλη ισομορφή εκφράζεται σε ελαφρώς χαμηλότερο επίπεδο από την βραχεία ισομορφή . Πραγματοποιήσαμε μια δοκιμή Kaplan-Meier επιβίωσης για CpG θέσεις, για τις οποίες διαιρούνται οι τιμές μεθυλίωση τους σε 3 ομάδες: χαμηλή (0-0,25), μεσαία (0,25-0,75) και υψηλή (0,75-1). Ως αποτέλεσμα, βρήκαμε 10 CpGs σε 10 γονίδια των οποίων το επίπεδο μεθυλίωσης διαφέρει σε διαφορετικές ομάδες επιβίωση (Σχήμα 4).

UGT1A7

είναι ένα ένζυμο που εμπλέκεται στο μεταβολισμό της (προ) καρκινογόνες ουσίες στον καπνό του τσιγάρου. Precarcinogens και οι μεταβολίτες τους θεωρούνται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση από τους καρκίνους του καπνού που σχετίζονται με τον καπνό [30]. Έχει δειχθεί ότι οι πολυμορφισμοί στο γονίδιο UGT1A7 σχετίζονται με τον καρκίνο του πνεύμονα, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι πολυμορφισμοί μειώνουν την ενζυματική δραστηριότητα [31]. Ένα υψηλό επίπεδο μεθυλίωσης θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει

UGT1A7

δραστηριότητα και να προκαλέσει μια κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με NSCLC.

CYP1A1

(που ανήκουν στην υπεροικογένεια του κυτοχρώματος Ρ450) καταλύει πολλές αντιδράσεις που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των φαρμάκων, επίσης, τη μετατροπή των πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων σε δραστικούς μεταβολίτες και detoxifications των περιβαλλοντικών καρκινογόνων ουσιών. Έχει δειχθεί ότι

CYP1A1

είναι υπερμεθυλιωμένο σε δείγματα καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με κανονικά δείγματα πνεύμονα, και αυτό συνδέθηκε με τα μειωμένα επίπεδα mRNA [32]. Στη μελέτη μας, τα υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης συσχετίστηκαν με κακή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα που υποστηρίζει την υπόθεση ότι

CYP1A1

μπορεί να έχει προστατευτικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου. Άλλα γονίδια που βρέθηκαν σε ανάλυση επιβίωσης δεν ήταν ρεπόρτερ ότι εμπλέκονται στην επιβίωση ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα.

Χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό είδος της ανάλυσης επιβίωσης, όπου η ανάλυση διαφορικής μεθυλίωσης διεξήχθη με συνδυασμό ανάλυσης αναλογικών κινδύνων Cox και του Wilcoxon δοκιμή rank-sum, ήμασταν σε θέση να αναλύσει 12 ασθενείς με επιβίωση του λιγότερο από 24 μήνες και 15 ασθενείς που επέζησαν 60 μήνες ή περισσότερο μετά το χειρουργείο. Αυτή η ανάλυση των διαφόρων ομάδων επιβίωσης αποκάλυψε 15 διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια.

RTEL1

, ο ρυθμιστής της επιμήκυνσης τελομερούς ελικάσης 1, φαίνεται να είναι η πιο ενδιαφέρουσα λειτουργικά ένα από αυτά. Αυτή είναι μια ΑΤΡ-εξαρτώμενη ελικάση DNA που απαιτείται για την καταστολή ακατάλληλη ομόλογο ανασυνδυασμό, παίζοντας έτσι έναν κεντρικό ρόλο στην επιδιόρθωση του DNA και στη διατήρηση της σταθερότητας γονιδιωματικού.

RTEL1

βρέθηκε να υπερμεθυλίωση σε φτωχές ομάδα την επιβίωσή μας.

Συγκρίνοντας τους μη καπνιστές (ν = 3, 6,4%) με τους καπνιστές (n = 44, 93,6%), τέσσερα διαφορικά μεθυλιωμένα CpG-ιστοσελίδες που σχετίζονται με τα τρία γονίδια, υπερμεθυλίωση στην ομάδα μη-καπνιστές βρέθηκαν:

CXorf38, MTHFD2

και

TLL2

. Λείπει στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα μεθυλίωσης μεταξύ των διαφόρων επιπέδων του καπνίσματος θα μπορούσε να δείξει μια φτωχή αξιοπιστία των δεδομένων των πακέτων-ετών »που λαμβάνονται.

MTHFD2

έχει αποδειχθεί ότι έχουν υψηλότερη έκφραση στους καπνιστές, ευνοώντας την ταχεία ανάπτυξη των κυττάρων. [33].

TLL2

είναι μια εξαρτώμενη από ψευδάργυρο μεταλλοπρωτεάση. Έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών απαιτείται για το μετασχηματισμό των κυττάρων, και αυτό συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου [34].

Με τη σύγκριση των μεταβολών του γονιδιώματος-ευρεία στο DNA μεθυλίωση των κανονικών και των πνευμόνων καρκινικά κύτταρα, ήμασταν σε θέση να αποκτήσουν εικόνα για το πολυπλοκότητα του προγράμματος μεθυλίωσης που απαιτείται για τα κύτταρα να καταστούν πλήρως κακοήθεις. Ως αποτέλεσμα, βρήκαμε ένα πάνελ γονιδίων που διακρίνουν κύτταρα NSCLC από γειτονικά φυσιολογικά κύτταρα του πνεύμονα και επίσης καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων από αδενοκαρκίνωμα. Η ανάλυση αποκάλυψε μια σειρά από διαφορικά μεθυλιωμένων CpG θέσεων που εμφανίζονται να ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίου και ένα άλλο σύνολο που είχαν επηρεάσει την επιβίωση των ασθενών. Αυτά τα πρόσφατα εντοπίστηκαν δείκτες μεθυλίωσης είναι υποψήφιοι για την περαιτέρω μοριακή εξέταση των NSCLC. Προκειμένου να επιβεβαιώσει αυτούς τους δείκτες των NSCLC καρκινογένεσης, οι συμπληρωματικές μελέτες και επικυρώσεις που απαιτούνται. Από τα αποτελέσματα της δουλειάς μας και από προηγούμενες διαπιστώσεις, μπορούμε να υποθέσουμε ότι αλλαγμένη μεθυλίωση του DNA είναι ένα πρώιμο συμβάν στον NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η Ηθική Επιτροπή Ανθρωπίνων Σπουδών, Πανεπιστήμιο του Tartu, έχει εγκρίνει τη μελέτη και την γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους συμμετέχοντες στη μελέτη.

δείγματα

Αναλύσαμε Ένωσης για τη Διεθνή έλεγχο του Καρκίνου (UICC) σταδίου Ι NSCLC δειγμάτων [35] από 48 ασθενείς και μακροσκοπικά «κανονική» δείγματα ελέγχου χωρίς καρκίνο του πνεύμονα από 18 ασθενείς. Όλα τα δείγματα είχαν απομονωθεί κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης του πνεύμονα στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Tartu, Εσθονία. Οι ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα (n = 6, 12,5%) και καρκίνωμα υποτύπου βρογχιολοκυψελιδικό της (n = 10, 20,8%) αναλύθηκαν ως μία ομάδα (n = 16, 33,3%). Το υπόλοιπο 32 (66,7%) από τους ασθενείς είχαν αναλυθεί καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων. Το ηλικιακό εύρος στην ομάδα μελέτης ήταν 41-80 ετών (μέση ηλικία στους άνδρες n = 40, 66,2 χρόνια και στις γυναίκες η = 8, 65,5 χρόνια) (Πίνακας S3). Οι ασθενείς που δεν υποβάλλονται σε καμία προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία.

Κατά τη χειρουργική επέμβαση, τα δείγματα ιστού κατάλληλου μεγέθους (1-2 cm

3) κόπηκαν από οιδηματώδης και μορφολογικά όγκων χωρίς πνευμονικό ιστό. Το μισό από κάθε δείγμα μονιμοποιήθηκε σε φορμαλίνη και χρησιμοποιήθηκαν για παθολογική εξέταση. Το άλλο μισό κάθε δείγματος ήταν θραύση καταψύχθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Τα δείγματα ελέγχου ελήφθησαν σε μια τοποθεσία μακριά από την καταργημένη όγκου και επιβεβαιώθηκε να είναι άνευ όγκου από τον ίδιο παθολογοανατόμο.

DNA Εξαγωγή και τροποποίηση όξινου θειώδους

Το DNA που εξάγεται από 50 mg του όγκου και αντιστοιχία άνευ όγκου ιστό πνεύμονα με την Dneasy® Blood & amp? Κιτ ιστού (Qiagen GmbH., Hilden, Γερμανία) και με το κιτ ιστού Nucleospin® (Macherey-Nagel GmbH., Düren, Γερμανία). απόδοση DNA και η καθαρότητα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο NanoDrop® ND1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ). Από κάθε δείγμα, 500 ng γονιδιακού DNA ήταν όξινο θειώδες τροποποιηθεί χρησιμοποιώντας το EZ μεθυλίωσης του DNA ™ Kit (Zymo Έρευνας, Orange, CA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Η μεθυλίωση Επικύρωση από Sanger αλληλουχίας

για την επικύρωση τσιπ μεθυλίωσης 11 γονίδια επελέγησαν, πέντε από αυτά ήταν γονιδίων από ανάλυση επιβίωσης και τα υπόλοιπα έξι ήταν τα γονίδια που διακρίνονται μεταξύ του καρκίνου και του φυσιολογικού ιστού (εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη έδειξε στον πίνακα S4). Εκκινητές για κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA PCR σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας MethPrimer [36]. Ένα 20 μΙ PCR διεξήχθη σε 80 mM Tris-HCl (ρΗ 9,4-9,5), 20 mM (NH4) 2SO4, 0,02% ρυθμιστικό Tween-20 PCR, 3 mM MgCl2, 1Χ βεταΐνη, 0,25 mM μείγμα dNTP, 2 μονάδες Hot εκκίνησης Taq πολυμεράση, 50 pmol του εκκινητή, 50 pmol του εκκινητή και 20 ng του κατεργασμένου με όξινο θειώδες ϋΝΑ γονιδιώματος. συνθήκες κύκλων PCR ήταν 95 ° C 15 λεπτά για την ενεργοποίηση του ενζύμου, 95 ° C 30 δευτερόλεπτα, 62 ° C 45 δευτερόλεπτα, 72 ° C 120 δευτερόλεπτα για 17 κύκλους, touchdown από -0,5 ° C για κάθε κύκλο και 95 ° C 30 δευτερόλεπτα, 52 ° C 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C 120 δευτερόλεπτα για 21 κύκλους. Αλληλούχιση έγινε ως υπηρεσία από τη διευκόλυνση πυρήνα της εσθονικής Biocenter. Αναλύσαμε τα ίχνη αλληλουχίας με το λογισμικό Μετάλλαξη Surveyor (Softgenetics, State College, PA, USA) και R λογισμικού στατιστικούς υπολογισμούς (https://www.r-project.org/).

RNA Εξόρυξη και Γονιδιακής Έκφρασης Ανάλυση

Λεπτομερής περιγραφή της διαδικασίας εκχύλισης RNA και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης δίνεται στο πρόσφατο έγγραφο [14].

χρησιμοποιήθηκαν 10 γονίδια και οκτώ ζευγών δειγμάτων (όγκου και γειτονικό φυσιολογικό δείγμα) για την επικύρωση τα δεδομένα μικροσυστοιχιών. Για την ποσοτική RT-PCR (qPCR), cDNAs συντέθηκαν από 700 ng ολικού RNA χρησιμοποιώντας το κιτ First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Βίλνιους, Λιθουανία) και ολίγο dT εκκινητές σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. αντιδράσεις τριπλούν qPCR πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες 384 φρεατίων χρησιμοποιώντας μίγμα SYBR Green ΚΟΧ (AbGene, Epsom, Ηνωμένο Βασίλειο ή Fermentas, Βίλνιους, Λιθουανία) και ΑΒΙ 7900HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του SDS 2.2.2 (Applied Biosystems) και R λογισμικού στατιστικούς υπολογισμούς (https://www.r-project.org/).

Η γεωμετρική μέση έκφραση των δύο γονιδίων αναφοράς (

ESD

και

S18RNA

) χρησιμοποιήθηκε ως αναφορά. αλλαγή φορές έκφρασης μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCt μέθοδο. αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η σύμφωνα ανάμεσα φορές αλλαγές προσδιορίζονται από qRT-PCR και πειράματα συστοιχίας Pearson συσχέτιση.

Επιπλέον, qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η

TP73

επίπεδο έκφρασης. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για το

Οι TP73

qPCR ενισχύσεις που αναφέρονται στον πίνακα S5.

μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση

ανάλυση μεθυλίωσης πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Infinium® HumanMethylation27 RevB BeadChips (Illumina Inc.). Η ανάλυση καλύπτει 27.578 CpGs σε 14.495 γονίδια που βρίσκονται κυρίως στα νησιά CpG εντός των περιφερειών εγγύς υποκινητή, μεταξύ 1,5 kb ανάντη και 1 kb κατάντη των θέσεων έναρξης της μεταγραφής (TSS). Ένα νησί CpG σε αυτόν τον προσδιορισμό ορίζεται ως μια αλληλουχία νουκλεοτιδίων του (1), 200 bp ή μεγαλύτερο σε μήκος, (2) 50% ή μεγαλύτερη σε GC-τοις εκατό, και (3) 0,60 ή μεγαλύτερη σε αναλογία των παρατηρούμενων CpG θέσεων πάνω αναμενόμενες θέσεις CpG στην περιοχή αυτή [10]. Η HumanMethylation27 beadchips επίσης να καλύπτει θέσεις CpG στις ρυθμιστικές περιοχές του 1000 γνωστών καρκινικών γονιδίων, 150 διαφορικά μεθυλιωμένα γονίδια σε διάφορους καρκίνους και 110 γονίδια miRNA.