Αφηρημένο

Μετανάστευση και την εισβολή των κακοήθων κυττάρων αποτελούν προϋποθέσεις για την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση. Η οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών αποτελείται από περίπου 25 μέλη και έχει μελετηθεί εκτενώς στο πλαίσιο της απόπτωσης. Παρά το γεγονός ότι τα μικρά μόρια στόχευσης πρωτεϊνών Bcl-2 έχουν ήδη εισέλθει κλινικές δοκιμές, πολύ λίγες μελέτες διερευνήθηκε ένα ρόλο αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 δίπλα κυτταρικό θάνατο στο πλαίσιο της μετάστασης. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να τεμαχίσει ένα δυνητικό ρόλο των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L για τη μετανάστευση και την εισβολή του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων ανεξάρτητη από τη λειτουργία ελέγχου κυτταρικού θανάτου τους. Χρησιμοποιήσαμε τη μετανάστευση και εισβολή προσδιορισμούς καθώς επίσης και τρεις καλλιέργειες διαστάσεων κύτταρο για την ανάλυση του ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (ΗΤ29 και SW480) μετά siRNA knockdown μεσολάβηση ή υπερέκφραση του Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L. Παρατηρήσαμε ούτε αυθόρμητη επαγωγή κυτταρικού θανάτου ούτε εξασθενημένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων που στερούνται Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L. Αντίθετα, νοκ ντάουν των Mcl-1 οδήγησε σε αυξημένο πολλαπλασιασμό. Εντυπωσιακά, δείχνουμε μια βαθιά δυσλειτουργία και των δύο, τη μετανάστευση και την εισβολή, του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων μετά Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L knockdown. Αυτός ο φαινότυπος αναμορφώθηκε πλήρως σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Mcl-1, Bcl-2 ή Bcl-x

L. Παρατηρήθηκε Η πιο έντονη επίδραση από τις πρωτεΐνες διερευνηθεί για Bcl-2. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται δείχνουν έναν κεντρικό ρόλο του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L για τη μετανάστευση και την εισβολή του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων ανεξάρτητη των γνωστών αντιαποπτωτικών αποτελέσματά τους. Έτσι, η μελέτη μας δείχνει νέα αντικαρκινικά μηχανισμούς της πρωτεΐνης Bcl-2 που στοχεύουν

Παράθεση:. Koehler π.Χ., Scherr Α-L, Lorenz S, Urbanik Τ, Kautz Ν, Elssner C, et al. (2013) Πέρα κυτταρικού θανάτου – Αντι-αποπτωτική Πρωτεΐνες Bcl-2 Ρυθμίστε τη Μετανάστευση και την διείσδυση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου

In Vitro

. PLoS ONE 8 (10): e76446. doi: 10.1371 /journal.pone.0076446

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 14 του Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 23 Αύγ. 2013? Δημοσιεύθηκε: 3 Οκτ 2013

Copyright: © 2013 Koehler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια μεταδιδακτορική-υποτροφία χορηγείται σε BCK από την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Χαϊδελβέργης, στη Γερμανία (https://www.medizinische-fakultaet-hd.uni-heidelberg.de), καθώς και επιχορηγήσεις προς HSB από το γερμανικό Ίδρυμα Ερευνών (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG SCHU 1443 /4-1) και από τη Merck Serono GmbH (Darmstadt, Γερμανία). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Henning Schulze-Bergkamen λάβει επιχορηγήσεις για την έρευνα καθώς και την επιστροφή των εξόδων ταξιδίου συνεδρίων και αμοιβές από τη Merck Serono GmbH. Κανένας από τους συγγραφείς σχετίζεται με τη Merck Serono με την απασχόληση, την παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας και τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή την αγορά προϊόντων. Κανένα προϊόν της Merck Serono έχει χρησιμοποιηθεί ή ερευνηθεί στο χειρόγραφο. Η Merck Serono GmbH δεν συμμετείχε στα πειράματα ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC) είναι η δεύτερη πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες και η τρίτη σε άνδρες σε όλο τον κόσμο με αυξανόμενη συχνότητα. Επιπλέον, CRC είναι η τέταρτη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο. Ακόμα κι αν προόδους στην ανάπτυξη φαρμάκων και χειρουργική επέμβαση οδήγησε σε αυξημένη συνολική επιβίωση, η πρόγνωση των ασθενών με μεταστάσεις CRC (στάδιο UICC IV) εξακολουθεί να είναι περιορισμένη [1], [2]. Metastasation είναι μια σημαντική αιτία θανάτου σε ασθενείς με καρκίνο και περιλαμβάνει μια διαδικασία πολλών σταδίων από τεράστια πολυπλοκότητα. Παρά την αυξανόμενη κατανόηση των υποκείμενων οδών, πολλές πτυχές της μετάστασης παραμένουν άλυτα [3], [4].

Η Β-λέμφωμα κυττάρων-2 (Bcl-2) οικογένεια πρωτεϊνών αποτελείται από περίπου 25 μέλη και έχει μελετηθεί εκτεταμένα σε σχέση με σηματοδότηση της αποπτώσεως. Η λεπτή ισορροπία των πρωτεϊνών Bcl-2 ρυθμίζει την τύχη των κυττάρων κατά τη μιτοχονδριακή επιφάνεια. Οι προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 (δηλ Βαχ και Bak) δεσμεύονται από αντιαποπτωτικών συγγενείς τους (δηλ Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L). Σε περίπτωση μιας αλλαγής αυτής της ισορροπίας προς το θάνατο, οι προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 που απελευθερώνεται από αντιαποπτωτικού ομολόγους τους. Μόλις οι προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 ελεύθερος, μιτοχόνδρια ενεργοποιούνται και κυτταρικό θάνατος επέρχεται [5]. Επιπλέον, η συμβολή των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών σε νέκρωση και autophagy έχει δειχθεί [6], [7]. Σε autophagy, αντιαποπτωτικό πρωτεΐνες Bcl-2 δρουν απομόνωσης proautophagic πρωτεΐνες όπως Beclin1 [8], [9].

Οι αντιαποπτωτικό πρωτεΐνες Bcl-2 υπερεκφράζεται ευρέως σε ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου CRC. Για παράδειγμα, μια αυξημένη έκφραση του Bcl-x

L και Mcl-1 έχει δειχθεί για CRCs και συσχετίζεται με κακή διαφοροποίηση, ανώτερο στάδιο του όγκου και κακή πρόγνωση των ασθενών [10] – [12]. Σε αντίθεση, μία άλλη μελέτη παρουσιάζει δεδομένα συσχέτιση υψηλού έκφραση Bcl-2 με την καλή κλινική πορεία των ασθενών με CRC [13]. Αυτές οι αντιφατικές εκθέσεις επισημαίνουν μη περιττές λειτουργίες αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2 και τη διαλεύκανση την ανάγκη για μια βαθύτερη διερεύνηση της δέσμευσης και τη συνάφεια αυτών των πρωτεϊνών στο CRC.

Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις για το ρόλο της αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών πέρα από τη ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου. Για παράδειγμα, Mcl-1 και παραλλαγές συρραφής του έχουν δειχθεί ότι αλληλεπιδρούν με το οξειδωτικό μεταβολισμό [14] και αναπνευστική αλυσίδα. Bcl-x

L και Bcl-2 έχουν συνδεθεί με σηματοδότηση εμπλέκονται σε αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή [15], [16]. Οι επιδράσεις των πρωτεϊνών Bcl-2 επί του πολλαπλασιασμού εξακολουθούν να διευκρινιστούν. Υπάρχουν κάποια στοιχεία για αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις της Bcl-2, Bcl-x

L και Mcl-1 στο φυσιολογικό περιβάλλον [17]. Σε αυτή την περίπτωση, ένα όφελος επιβίωσης των κυττάρων λιγότερο επιρρεπείς σε απόπτωση διατηρείται τουλάχιστον εν μέρει από την έξοδο του πολλαπλασιασμού. Ωστόσο, είναι σημαντικό να αντιμετωπιστεί το ζήτημα, εάν οι ρυθμιστικές επιδράσεις των πρωτεϊνών Bcl-2 επί του κυτταρικού θανάτου του κυτταρικού κύκλου και είναι ανεξάρτητες φαινόμενα. Μέχρι στιγμής, μόνο λίγα είναι γνωστά σχετικά με μια πιθανή δέσμευση της αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών Bcl-2 για τη μετανάστευση και τη διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων. Bcl-x

L έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στην metastasation του καρκίνου του μαστού και της μετανάστευσης CRC, αλλά ο ρόλος του Bcl-2 και Mcl-1 ως εξάπλωση του όγκου παραμένει άλυτο [18], [19]. Στη μελέτη μας με στόχο τη διερεύνηση επαγωγή κυτταρικού θανάτου, τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC μετά την απαλοιφή του Bcl-2, Bcl-x

L ή Mcl-1 έκφρασης. Είναι σημαντικό ότι, ένα knockdown του αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2 απευθείας ανέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC ανεξάρτητη από την επαγωγή κυτταρικού θανάτου ή των αποτελεσμάτων επί του πολλαπλασιασμού. Συνοπτικά, η μελέτη μας παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τις κατά του όγκου αποτελέσματα του Bcl-2 πρωτεΐνης σε αναστολή του ορθοκολικού καρκίνου πέραν σηματοδότηση κυτταρικό θάνατο και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και Κυτταρικές Γραμμές

κυτταρικές σειρές CRC ΗΤ29, SW480, Caco2 και ΟοΙο205 αγοράστηκαν από την ATCC. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγρή ατμόσφαιρα (37 ° C, 5% CO

2) σε RPMI + GlutaMAX ™ (Gibco, Καρλσρούη, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% FCS (ΡΑΑ Laboratories, Cölbe, Γερμανία), 1% Pen /Strep (ΡΑΑ Laboratories), 1% HEPES (Gibco) και 1% μη-βασικά αμινοξέα (ΝΕΑΑ, Gibco). Όλες οι κυτταρικές σειρές τακτικά σε διαλογή για μολύνσεις και δεν υπερβαίνει ένα πέρασμα 10. αντιδραστηρίων Χημειοθεραπευτικοί 5-φθοροουρακίλη, οξαλιπλατίνη και ιρινοτεκάνη αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Αμβούργο, Γερμανία).

Βιωσιμότητα Test

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων και 24 ώρες μετά την σπορά επιμολυσμένα ή να αντιμετωπίζονται όπως υποδεικνύεται. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα χρωματομετρικό (, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ 4) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ) 3- όπως περιγράφηκε πριν από [20]. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 550 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός (άπειρη 200 pro? Tecan, Männedorf, Ελβετία).

RNAi, πλασμίδια και διαμόλυνση

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) που στοχεύουν Bcl-x

L, Bcl-2, Mcl-1 mRNA ή DNA πλασμιδίου χορηγήθηκε την ημέρα 1 μετά την σπορά των κυττάρων σε 12 ή 6 φρεατίων με μια συρροή 70-80% κατά τη στιγμή της διαμόλυνσης. Οι ακόλουθες αλληλουχίες siRNA εφαρμόστηκαν (MWG Biotech, Ebersberg, Germany): Bcl-x

L 5′-gcuuggauaaagaugcaaTT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-uugcaucuuaucccaagcAG-3′ (antisense), Mcl-1 5’- aaguaucacagacguucucTT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-gagaacgucugugauacuuTT-3′ (antisense), Bcl-2 5’-uaauaacgugccucaugaaTT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-uucaugaggcacguuauuaTT-3′ (antisense). siRNA κατά της GFP χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος: GFP 5’-ggcuscguccaggagcgcaccTT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-ggugcgcuccuggacgguagccTT-3’ (antisense). Πεζά γράμματα αντιπροσωπεύουν ριβονουκλεοτίδια και κιονόκρανα δεοξυριβονουκλεοτίδια. Κύτταρα επιμολύνθηκαν σε OptiMEM® (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) χωρίς συμπληρώματα χρησιμοποιώντας RNAiMAX ™ (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Το πλασμίδιο διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας LipofectAMINE® LTX (Invitrogen) σε OptiMEM® για SW480 κύτταρα ή peqFECT DNA (Peqlab, Erlangen, Germany) σε πλήρες RPMI για τα κύτταρα ΗΤ29 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα ακόλουθα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν: ανθρώπινη Mcl-1 κλωνοποιήθηκε σε φορέα PEF4. Ανθρώπινο Bcl-2 και Bcl-x

L κλωνοποιήθηκαν σε ένα φορέα pcDNA3. pcDNA3-hBCL-2 ήταν ένα είδος δώρο του W. Roth (Ινστιτούτο Παθολογίας, Χαϊδελβέργη). pcDNA3-hBCL-x

L παρασχέθηκε ευγενώς από τον Μ Li-Weber και Ρ.Η. Krammer (γερμανικά Cancer Research Center, Heidelberg, Germany). Αντίστοιχες κενούς φορείς χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Παράλληλα, η αποδοτικότητα διαμόλυνσης ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας GFP επιμόλυνσης με κυτταρομετρία ροής. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ήταν τουλάχιστον 70% σε όλα τα πειράματα (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και περαιτέρω αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Ανίχνευση του πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου

Μετά την κατεργασία , το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε σωλήνες FACS και τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας ήπια Accutase ™ (ΡΑΑ) και συγκεντρώθηκαν με την αντίστοιχη υπερκείμενο. Μετά από φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ένα υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0,1% (w /v) κιτρικό νάτριο, 0,1% (ν /ν) Triton Χ-100 και 50 μg ml /ιωδιούχου προπιδίου (Sigma-Aldrich). Μετά από 1 ώρα επώασης στους 4 ° C συνολικό περιεχόμενο DNA των κυττάρων μετρήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του Nicoletti

et al.

[21] χρησιμοποιώντας ένα ροής CANTO II κυτταρόμετρο (Becton Dickinson [BD], Franklin Lakes, NJ USA). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε χρησιμοποιώντας FACS Diva 6 (BD) και FlowJo 7.6.5. (Δέντρο Αστέρι Inc., Ashland, Ή ΗΠΑ). Τα κύτταρα που αντιπροσωπεύουν το κλάσμα subG1 αποτυπώθηκαν ως αποπτωτικά.

Για να καθορίσετε περαιτέρω την επαγωγή κυτταρικού θανάτου και τον πολλαπλασιασμό, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά χρησιμοποιώντας CellCycle και κιτ διάδοσης για κυτταρομετρία ροής (BD) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σημάνθηκαν για 1 ώρα με 20 μΜ βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) για τη διάκριση που στηρίζεται από πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Εφεξής, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, μονιμοποιήθηκαν, γίνανε διαπερατά και έπειτα refixed ακολουθήθηκε από χρώση με φθορόχρωμα συζευγμένα αντισώματα έναντι διασπασμένης ΡΑΚΡ (Asp214, συζευγμένο με ΡΕ) ως δείκτη για την απόπτωση, BrdU (συζευγμένο με PerCP-Cy ™ 5.5) για τον πολλαπλασιασμό και phosphorylated- H2AX (pS139, σε συνδυασμό με την Alexa Fluor® 647) για βλάβες του DNA, αντίστοιχα. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Κυττάρου Λύσης, SDS-PAGE και Western Blotting

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων, καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Η κυτταρική λύση, SDS-PAGE και στύπωμα Western διεξήχθησαν. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοανίχνευση: αντι-Mcl-1 (Santa Cruz Biotechnology, Χαϊδελβέργη, Γερμανία), αντι-ΒοΙ-Χ

L (Cell Signaling, Boston, ΜΑ USA), αντι-ΒοΙ-2 (Abcam, Cambridge, UK), αντι-αTubulin (Sigma), αντι-διασπασμένη PARP (ASP214, Cell Signaling).

κυττάρων Μετρώντας

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με ειδικές siRNA μετά 24 h. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν και στη συνέχεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν θάλαμο Neubauer 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Trypane μπλε χρώση χρησιμοποιήθηκε για να αποκλείσει νεκρούς και κατακερματισμένη κύτταρα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας καταμέτρησης.

Αναλύσεις Μετανάστευσης

2 × 10

6 κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων, αναπτύχθηκαν σε συρροή περίπου 70-80% και διαμολύνθηκαν όπως υποδεικνύεται. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση η κυτταρική μονοστιβάδα ήταν γδαρμένο χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη πιπέτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται με μέσο και εικόνες αμέσως συλλαμβάνονται χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (CKX41, Όλυμπος Inc., Αμβούργο, Γερμανία) εξοπλισμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή χρώματος (XC30, Όλυμπος Inc.). Η ακριβής τοποθεσία της εικόνας εντός της μονοστιβάδας σημαδεύτηκε να προσδιορίσει το ίδιο διάκενο κατά την επόμενη 72 ώρες. Το κλείσιμο της ψαλίδας μετρήθηκε κάθε 24 ώρες ως ακολούθως χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης CellSense® (Olympus Inc.): αποστάσεις Gap του μηδέν μεταξύ μία πλευρά και από την άλλη μετρήθηκαν σε ορισμένα διαστήματα κατά μήκος της ακμής της παραγόμενης μηδέν (κάθε 200 μm). Η μέση τιμή των μετρούμενων αποστάσεων υπολογίζεται στη συνέχεια και συγκρίθηκε με τη μέση απόσταση του διακένου κατά την εκκίνηση χρονικό σημείο του πειράματος [22].

Εισβολή Δοκιμασία

BIOCOAT ™ Matrigel ™ εισβολή Chambers (μέγεθος πόρων 8 μικρομέτρων, BD) χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της εισβολής των κυττάρων SW480. θάλαμοι εισβολής Matrigel ™ ενυδατώθηκαν σε FCS RPMI ελεύθερο σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα για 2 ώρες. Εφεξής, οι θάλαμοι εισβολή μεταφέρθηκαν σε φρεάτια πλάκας σύντροφος (BD) που περιέχει 750 μΙ RPMI συμπληρωμένο με 10% FCS. FCS χρησιμεύει ως χημειοελκτικό για διηθητική κύτταρα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκες και διαμολύνθηκαν όπως περιγράφεται. 24 κύτταρα ώρες μετά την επιμόλυνση συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας Accutase ™ (ΡΑΑ), ομαδοποιήθηκαν και μετρήθηκαν. 3 × 10

5 κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ FCS ελεύθερο RPMI και μεταφέρεται στο άνω μέρος του θαλάμου εισβολής. Μετά από 72 ώρες, η άνω επιφάνεια του θαλάμου εισβολής καθαρίζεται για την απομάκρυνση μη εισβάλλοντα κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα βαμβάκι στυλεό. Εισβολή κύτταρα στην κάτω επιφάνεια του ενθέματος μονιμοποιήθηκαν με 80% EtOH για 30 λεπτά που ακολουθείται από χρώση των πυρήνων με χρήση Hoechst 33342 (Invitrogen) για 15 λεπτά. Ένθετα στη συνέχεια πλύθηκαν σε PBS. Πέντε φωτογραφίες από κάθε ένθετο ελήφθησαν και ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μετρήθηκε με γυμνό μάτι.

3D Cell Culture

Χρησιμοποιήσαμε Alvetex® ικριώματα κατασκευασμένα από ένα αδρανές, εξαιρετικά πορώδη και πολλαπλή συνδέονται ικρίωμα πολυστυρένιο, χωρισμένο σε μεμβράνη πάχους 200 μm για να εκτελέσει κατάλληλα τρία πειράματα διαστάσεων κυτταρικής καλλιέργειας. Alvetex® ικριώματα χρησιμοποιήθηκαν σε 12 μορφή φρεατίων (Reinnervate AVP002, Sedgefield, UK) υπό στείρες συνθήκες. Σκαλωσιές επωάστηκαν με στείρο διηθημένο EtOH (80%) για 5 λεπτά ως μία προεπεξεργασία, πλύθηκαν δύο φορές με μέσο και αριστερά στο μέσο. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας Accutase ™, όπως περιγράφεται, μετρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε πλήρες RPMI. 1 × 10

6 κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται στην κορυφή του δίσκου ένθετου σε έναν συνολικό όγκο 200 μΙ μέσου. 3 ώρες μετά τη σπορά, ικριώματα είχαν πλημμυρίσει απαλά από κάτω μέχρι να επιτευχθεί πλήρης κάλυψη. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 48 ώρες.

Τομές και ανοσοϊστοχημεία του 3D-ικριώματα

Οκτώβριο μέσον

Μετά από 72 ώρες, ικριώματα πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, κομμένα σε φέτες και αμέσως μεταφέρθηκε σε Cryomolds® περιέχουν τοποθέτηση (Science Services, Μόναχο, Γερμανία) και σταδιακά καταψύχθηκαν σε αέρια φάση υγρού αζώτου. Μετά από 24 ώρες στους -80 ° C, τα ικριώματα είχαν υποβλήθηκαν σε κρυοτομή (Κρυοστάτης, Θέρμο) και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια HistoBond®. Τμήματα (πάχος 9 μm) σταθεροποιήθηκαν σε 4% PFA και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για μορφολογικές μελέτες, του ολικού αριθμού των κυττάρων και τη μέτρηση του βάθους εισβολής. Επιπλέον, immunhistochemistry διεξήχθη χρησιμοποιώντας σύστημα ανίχνευσης NovoLink Polymer (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή μετά PFA-στερέωση και τη θερμότητα που προκαλείται ανάκτησης επιτόπου (hier) σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6). Αντισώματα έναντι Κί67 (Abcam), και Bcl-x

L (Cell Signaling) χρησιμοποιήθηκαν και τα πλακίδια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας CellSense® και ImageJ λογισμικού.

Στατιστική Ανάλυση

Τα στοιχεία που λαμβάνονται στα πειράματα εισβολή και 3D-ικριώματος αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student (ζεύγη, δύο όψεων) με βάση κανονική κατανομή των δεδομένων. Μετανάστευσης Οι δοκιμασίες, η σχέση μεταξύ gapclosure ως ανταπόκριση και το χρόνο και τη θεραπεία ως επεξηγηματικές μεταβλητές ερευνήθηκε με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Η ανάλυση της αλληλεπίδρασης μεταξύ του χρόνου και η θεραπεία δεν ήταν ένας στόχος της παρούσας μελέτης και δεν περιλαμβανόταν στο μοντέλο διακύμανσης. SPSS 20 στατιστικών (IBM, NY USA) λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για όλες τις στατιστικές αναλύσεις. Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-xL Έκφραση σε Ανθρώπινα καρκίνο του παχέος εντέρου Γραμμές κυττάρων

Με σκοπό να διερευνηθεί η έκφραση των πρωτεϊνών αντιαποπτωτικών Bcl-2 Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC, μετρήσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης σε τέσσερις ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές. CaCo2, ΟοΙο205, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα χρησιμοποιούνται ευρέως και καλά χαρακτηρισμένες [23], [24]. Τα κύτταρα CaCo2 γνωστό ότι είναι ανεπαρκώς ογκογονικά σε ποντίκια. SW480 και ΟοΙο205 κύτταρα είναι τοπικά επεμβατικές σε ορθοτοπική μοντέλα όγκων. κύτταρα ΗΤ29 μεταστάσεις στο ήπαρ και πνεύμονα όταν εγχέεται στο υποδόριο [24]. Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

έκφραση L ήταν ανιχνεύσιμη σε κυτταρικές σειρές CRC (Εικ. 1Α). Caco2 κύτταρα παρουσίασαν σημαντικές ποσότητες Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L, με το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης για Bcl-2. κύτταρα ΟοΙο205 είχε μια μειωμένη ποσότητα του Bcl-x

L. SW480 κύτταρα είχαν περίπου ίση ποσότητα όλων των πρωτεϊνών Bcl-2. ΗΤ29 κύτταρα έδειξε μια κυρίαρχη έκφραση του Bcl-2 και ένα χαμηλό επίπεδο του Bcl-x

L. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν ότι το πρότυπο έκφρασης του αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών διέφεραν στις κυτταρικές γραμμές που CRC που χρησιμοποιείται στη μελέτη μας. Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ ογκογονικότητα μιας κυτταρικής γραμμής και ένα ορισμένο πρότυπο έκφρασης (Εικ. 1Α). Αποφασίσαμε να επικεντρωθεί σε κύτταρα SW480 και ΗΤ29 για περαιτέρω πειράματα με Bcl-2 knockdown, διότι και οι δύο κυτταρικές σειρές μοιράζονται την ικανότητα να εισβάλλουν και μορφή μετάσταση σε μοντέλα ποντικών

(Α) κηλίδας Western αναλύσεις της ορθοκολικού καρκίνου. κυτταρικές σειρές CaCo2, ΟοΙο205, SW480 και ΗΤ29. Τα βασικά επίπεδα έκφρασης του Bcl-x

L, Mcl-1 και Bcl-2. Τουμπουλίνης υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα κύτταρα τοποθετημένα με την αύξηση ογκογενετικότητας από αριστερά προς τα δεξιά. Εδώ, ογκογονικότητα δείχνει την ικανότητα μιας κυτταρικής γραμμής να μεταστάσεις σε ποντικούς. Η χαμηλότερη ογκογενετικότητας ξεχωρίζει για την τοπική ανάπτυξη του όγκου λείπουν εισβολής? η υψηλότερη ογκογονικότητα δηλώνει το σχηματισμό μετάστασης μακρινό οργάνων (ήπαρ και /ή των πνευμόνων). (Β) αναλύσεις Western blot ΗΤ29 (αριστερά) και SW480 (δεξιά) κύτταρα μετά siRNA μεσολαβεί knockdown του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τουμπουλίνης υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι κηλίδες Western που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Νοκ ντάουν της Αντι-αποπτωτική Bcl-2 Πρωτεΐνες δεν προκαλεί αυθόρμητη απόπτωση αλλά ευαισθητοποιεί CRC κύτταρα στη χημειοθεραπεία

Εμείς καθορίζεται για πρώτη φορά την επίδραση της ειδικό siRNA που στοχεύει Bcl-2, Bcl-x

L ή Mcl-1 σε μια χρονική περίοδο 72 h σε ΗΤ29 και κύτταρα SW480. Εδώ, το προς τα κάτω ρύθμιση της αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών ήταν αποτελεσματική για τουλάχιστον 72 ώρες όπως παρατηρείται με ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. 1 Β). Προκειμένου να αναλύσει τον αντίκτυπο της προς τα κάτω ρύθμιση των Bcl-2, Bcl-x

L ή Mcl-1 στη βιωσιμότητα των κυττάρων που εκτελούνται ΜΤΤ δοκιμασίες 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα αποτελέσματα δείχνουν επιδράσεις του μειώθηκε αντιαποπτωτικών επίπεδα πρωτεΐνης Bcl-2 στην κυτταρική βιωσιμότητα σε ΗΤ29 και κύτταρα SW480 (Εικ. 2 Α).

(Α) ΜΤΤ-Δοκιμασία SW480 και κύτταρα ΗΤ29 μετά knockdown του Mcl- 1, Bcl-2 και Bcl-x

L. (Β) κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις και αντίστοιχες κηλίδες Western για διάσπαση της PARP 48 ώρες μετά την knockdown του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L σε ΗΤ29 (αριστερά) και τα κύτταρα SW480 (δεξιά). (Γ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των ΗΤ29 (αριστερά) και τα κύτταρα SW480 (δεξιά) για pH2AX 48 ώρες μετά knockdown του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L. θεραπεία σταυροσπορίνη 24 h (1 μΜ) χρησιμεύει ως θετικός έλεγχος για επαγωγή κυτταρικού θανάτου. (Δ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για DNA-κατακερματισμός των κυττάρων ΗΤ29 μετά knockdown του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L που ακολουθείται από 48 ώρες κατεργασία με 30 μΜ οξαλιπλατίνη και 0,2% DMSO ως όχημα. Κυτταρομετρίας ροής ανάλυση εκτελέστηκε εις τριπλούν. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Όξα = οξαλιπλατίνη).

Η

Δεύτερον, ερευνήσαμε αν αυθόρμητη επαγωγή κυτταρικού θανάτου συνέβη σε επιμολυσμένα ΗΤ29 και SW480 κυττάρων. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα κύτταρα για διασπασμένο πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με κυτταρομετρία ροής, καθώς και με κηλίδωση Western. Δεδομένου PARP είναι ένας στόχος της ενεργοποιημένης κασπάσης 3 διάσπαση του υποδεικνύει μια αποτελεσματική εκτέλεση της απόπτωσης [25]. Δεν εντοπίσαμε μια αύξηση της διασπασμένης (cl.) Επίπεδα PARP, μετά την Mcl-1 νοκ ντάουν (Εικ. 2 Β). Για Bcl-2 και Bcl-x

L νοκ ντάουν, εντοπίσαμε μια πολύ μικρή αύξηση στο cl. επίπεδα PARP με FACS, αλλά δεν μπορούσε να ανιχνεύσει ένα λογικό ποσό της διασπασμένης πρωτεΐνης σε κηλίδες Western (Εικ. 2 Β). Επιπλέον, ελέγξαμε για βλάβες του DNA, ως σήμα κατατεθέν του κυτταρικού θανάτου. Ως εκ τούτου, χρωματισμένα κύτταρα 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με φθοριόχρωμα συζευγμένο αντίσωμα που στοχεύει φωσφορυλιωμένη ιστόνη Η2ΑΧ [26]. Φωσφορυλίωση του Η2ΑΧ εμφανίζεται ως απάντηση σε διαλείμματα διπλή έλικα του DNA. Δεν υπήρχε σημαντική ποσότητα φωσφορυλιωμένου Η2ΑΧ ανιχνεύσιμη σε επιμολυσμένα κύτταρα και τους ελέγχους (Σχ. 2 C). Σταυροσπορίνη (STS) κατεργασία του ΗΤ29 και κύτταρα SW480 χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για την επαγωγή κυτταρικού θανάτου (Εικ. 2 Β και C).

Τρίτον, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει τις δυνατότητες της αντιαποπτωτικής πρωτείνης Bcl-2 knockdown να ευαισθητοποιήσει κύτταρα ΗΤ29 σε κλινικά σχετικές και χρησιμοποιούνται συνήθως χημειοθεραπευτικά. Για 5-FU και ιρινοτεκάνη δεν υπήρχαν σημαντικές ευαισθητοποίηση του siRNA μεσολαβεί knockdown του αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες, όπως εκτιμήθηκε με ανάλυση FACS του κατακερματισμού του DNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε πλήρη αντίθεση, παρατηρήσαμε μια βαθιά και ιδιαίτερα σημαντική ευαισθητοποίηση σε οξαλιπλατίνη μετά knockdown των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Bcl-2, Bcl-x

L και Mcl-1 (Σχ. 2D).

Στο σύνολό τους, Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ένα knockdown του Bcl-2, Bcl-x

L ή Mcl-1 δεν οδήγησε σε αυθόρμητη κυτταρικό θάνατο και προφανώς καλά αντισταθμίζεται σε κύτταρα CRC. Ανάμεσα στα χημειοθεραπευτικά εφαρμόζονται στην επεξεργασία CRC, μόνο το αποτέλεσμα της οξαλιπλατίνη ήταν σημαντικά αυξηθεί με νοκ ντάουν της αντιαποπτωτικού πρωτεϊνών.

Νοκ ντάουν της Αντι-αποπτωτική Bcl-2 Πρωτεΐνες δεν ασκεί αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα για CRC κύτταρα

Μετά τον αποκλεισμό της αυθόρμητης επαγωγή κυτταρικού θανάτου μετά Bcl-2, Bcl-x

L ή Mcl-1 knockdown εμείς επόμενη διερευνήθηκε πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC. Ένα υψηλό ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων ΗΤ29 (38,6%) ήταν πολλαπλασιάζονται όπως αξιολογήθηκε με ενσωμάτωση BrdU (Σχ. 3 Α και Β). Η αναλογία των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μετά Bcl-2 και Bcl-x

L knockdown (siBcl-2:37,3%? SiBcl-x

L: 37,4%). Σε αντίθεση, knockdown του Mcl-1 οδήγησε σε μια σημαντική αύξηση στην ενσωμάτωση BrdU σε σύγκριση με τους ελέγχους (47,5 έναντι 38,6%, ρ & lt? 0,05, Σχήμα 3 Α και Β.). Για SW480 κύτταρα, παρατηρήσαμε ένα χαμηλότερο βασικό επίπεδο πολλαπλασιασμού (21,1% BrdU θετικά κύτταρα). Τα αποτελέσματα για τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με siRNA έναντι Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L ήταν σύμφωνα με εκείνα που λαμβάνονται για τα κύτταρα ΗΤ29. Και πάλι, μόνο Mcl-1 νοκ ντάουν οδήγησε σε σημαντική αύξηση των BrdU θετικότητα, ενώ Bcl-2 και Bcl-x

L νοκ ντάουν δεν έδειξαν σημαντικές επιδράσεις (Mcl-1:25,6% έναντι 21,1%, p & lt ? 0,05, Σχήμα 3 C).. Για την περαιτέρω επικύρωση των αποτελεσμάτων μας επί του πολλαπλασιασμού μετά την επιμόλυνση siRNA, ακολουθήσαμε συνολικών αριθμών κυττάρων των κυττάρων SW480 πάροδο του χρόνου. Τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τα πειράματα BrdU: Μόνο διαγραφή του Mcl-1 οδήγησε σε αύξηση του συνολικού αριθμού των κυττάρων, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές για το Bcl-2 και Bcl-x

διαγραφή L (Σχήμα 3 D). . Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι δεν υπάρχει σημαντική επίδραση μιας knockdown του Bcl-2 και Bcl-x

L στον πολλαπλασιασμό. Αντιθέτως, η έλλειψη Mcl-1 οδηγεί σε αύξηση της κατάδειξης πολλαπλασιασμό σε συγκεκριμένες λειτουργίες του Mcl-1 σε αυτό το πλαίσιο.

SW480 και κύτταρα ΗΤ29 επιμολύνθηκαν με siRNA έναντι Mcl-1, Bcl-2 και Bcl- x

L. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα σημάνθηκαν με 20 μΜ BrdU και προετοιμάζονται για κυτταρομετρία ροής. (Α) Αντιπροσωπευτική πρωτότυπο κυτταρομετρία ροής δεδομένων με κύτταρα ΗΤ29 για BrdU θετικότητα μετά από χρώση με αντι-BrdU αντίσωμα συζευγμένο με PerCP-Cy5.5 φθοροφόρο. (Β) ροής αναλύει κυτταρομετρίας για ενσωμάτωση BrdU σε ΗΤ29 και (C) κύτταρα SW480. (Δ) Συνολική καταμέτρηση κυττάρων των κυττάρων SW480 μετά knockdown του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± SD. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν (κυτταρομετρία ροής) και sextuplicates (καταμέτρηση κυττάρων). Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt?. 0,05

Η

Νοκ ντάουν της Αντι-αποπτωτική Bcl-2 Πρωτεΐνες Τεράστια μειώνει τη μετανάστευση των CRC κύτταρα

Στη συνέχεια, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει επιδράσεις των Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L διαγραφή για τη μετανάστευση των κυττάρων CRC. Για να απεικονίσει κυτταρική μετανάστευση, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς γρατσουνιά σε μονοστιβάδες επιμολυσμένα ΗΤ29 και SW480 κυττάρων. απόσταση Gap μετρήθηκε κάθε 24 ώρες μετά την knockdown του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L που ακολουθείται από υπολογισμό της κλείσιμο της ψαλίδας. κλείσιμο της ψαλίδας επιβραδύνθηκε σημαντικά και στις δύο κύτταρα ΗΤ29 και SW480 μετά την νοκ ντάουν των Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L (p-τιμές για ΗΤ29: siMcl-1: & lt? 0,001? siBcl-2: & lt ? 0001? siBcl-x

L: = 0,002 P-τιμές για SW480: siMcl-1:. = 0,0011? siBcl-2:. = 0,0005? siBcl-x

L: = 0,004) (Εικ. 4 Β και C, αριστερά). Σε ΗΤ29 και SW480 κύτταρα, το πιο εντυπωσιακό αποτέλεσμα παρατηρήθηκε μετά knockdown του Bcl-2. Εδώ, η απόσταση μετανάστευσης μειώθηκε σε 56% σε SW480 και 36% σε ΗΤ29 μετά από 72 ώρες σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 4 Α?. Εικ. 4 Β και C, αριστερά). Στο σύνολό τους, έχουμε αποδείξει αρνητικές επιπτώσεις μιας Mcl-1, Bcl-x

L και Bcl-2 νοκ ντάουν για CRC μετανάστευση ανεξάρτητη από την επαγωγή κυτταρικού θανάτου και αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις.

SW480 και κύτταρα ΗΤ29 επιμολύνονται με siRNA κατά Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L και αναπτύσσονται ως μονοστοιβάδα. απόσταση Gap μετρήθηκε κάθε 200 μm κατά μήκος της άκρης του κλείσιμο της ψαλίδας και το διάκενο υπολογίζεται 24, 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. (Α) Εκπρόσωπος εικόνες συλλαμβάνονται μετά από νοκ ντάουν της Bcl-2 σε κύτταρα ΗΤ29 (γραμμή κλίμακας δείχνουν μεγέθυνση σε όλους τους πίνακες). κινητική (Β) Gap κλείσιμο των κυττάρων ΗΤ29 μετά knockdown του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L (αριστερά) και το αντίστοιχο στυπώματα Western (δεξιά). κινητική (Γ) Gap κλείσιμο των κυττάρων SW480 μετά knockdown του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L (αριστερά) και το αντίστοιχο στυπώματα Western (δεξιά). Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. (P-τιμές για ΗΤ29: siMcl-1: & lt? 0,001? SiBcl-2: & lt? 0,001? SiBcl-x

L:. = 0,002 P-τιμές για SW480: siMcl-1: = 0,0011? SiBcl -2: = 0,0005? siBcl-x

L:. = 0,004)

Η

Η υπερέκφραση του Αντι-αποπτωτική Bcl-2 Πρωτεΐνες Επιταχύνει Μετανάστευσης της CRC κύτταρα

Επιπλέον, ελέγξαμε εάν η αυξημένη έκφραση του Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L σε ΗΤ29 και κύτταρα SW480 επιρροές μετανάστευση και ενδεχομένως επανέρχεται το φαινότυπο των knockdown πειραμάτων. Και πάλι, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς μηδέν και χρησιμοποιημένα κύτταρα επιμολυσμένα με αντίστοιχα πλασμίδια έκφρασης των πρωτεϊνών Bcl-2. Εντυπωσιακά, παρατηρήσαμε μία σημαντικά επιταχυνόμενη μετανάστευση κυττάρων SW480 υπερεκφράζουν Bcl-x

L και Bcl-2 (ρ & lt? 0001, Σχήμα 5 Β, αριστερά).. Κύτταρα που υπερεκφράζουν Bcl-2 σχεδόν διπλασίασε μετεγκατεστημένα απόσταση μετά από 72 ώρες (999 μm έναντι 526 μm σε ελέγχους, Εικ. 5 Α). Για Mcl-1 που υπερεκφράζουν SW480 κύτταρα παρατηρήσαμε μια μικρότερη, αλλά σημαντική αύξηση της μετανάστευσης (p & lt?. 0,01, Σχήμα 5 Β, αριστερά). Αυτές οι παρατηρήσεις έγιναν επίσης για ΗΤ29 κύτταρα με υπερέκφραση του Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, δεν υπήρχε αυξημένος πολλαπλασιασμός ανιχνεύσιμη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνοπτικά, δείξαμε ότι αντιαποπτωτικό πρωτεΐνες Bcl-2 είναι ικανά να ενεργοποιούν μετανάστευση των κυττάρων CRC.

κύτταρα SW480 επιμολύνονται με πλασμίδια που εκφράζουν ανθρώπινο Mcl-1, Bcl-2 ή ΒοΙ-χ

L και καλλιεργούνται ως μονοστιβάδα. Κενά που δημιουργούνται και μετρήθηκαν κλείσιμο της ψαλίδας, όπως περιγράφεται. (Α) Εκπρόσωπος εικόνες για SW480 κύτταρα που υπερεκφράζουν Bcl-2 (γραμμή κλίμακας δείχνει μεγέθυνσης για όλους τους πίνακες). (Β) Gap κινητική κλείσιμο των κυττάρων SW480 υπερεκφράζουν Mcl-1, Bcl-2 και Bcl-x

L (αριστερά) και το αντίστοιχο στυπώματα Western (δεξιά). Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. p-τιμές: Mcl-1: = 0,0006? Bcl-2: = 0,0002? Bcl-x

L:. & Lt? 0,0001

Η

Νοκ ντάουν της Αντι-αποπτωτική Bcl-2 Πρωτεΐνες Ρυθμίζουν εισβολής CRC κύτταρα

Για να διερευνήσουν περαιτέρω ρυθμιστικές επιδράσεις των Mcl-1 , Bcl-x

L και Bcl-2 για τις διαδικασίες που αφορούν CRC μετάσταση, αξιολογήσαμε επίσης εισβολή των κυττάρων του CRC μετά χειραγώγηση των πρωτεϊνών Bcl-2. Κύτταρα με διαγράφεται Bcl-x

L έδειξε σημαντικά μειωμένη επεμβατική ακίνητα σε Boyden προσδιορισμούς εισβολής θάλαμο σε σύγκριση με κοροϊδεύει επιμολυσμένα κύτταρα (70% σε σύγκριση με τους μάρτυρες, p & lt? 0,05? Εικ. 6 Α και Β). Πιο εντυπωσιακά, ένα knockdown του Bcl-2 κατήργησε σχεδόν εντελώς την ικανότητα των κυττάρων SW480 να εισβάλουν (38% σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ρ & lt? 0001). Επιπλέον, Mcl-1 knockdown προκάλεσε επίσης ένα βαθύ μείωση της εισβολής (37% σε σύγκριση με τους μάρτυρες, ρ & lt? 0001? Εικ. 6 Α και Β). Αυτές οι παρατηρήσεις υπογραμμίζουν το ρόλο της αντιαποπτωτικής-Bcl 2 πρωτεϊνών για τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων CRC και προσδιορίζουν έναν προεξέχοντα ρόλο του Bcl-2 στο πλαίσιο της διεισδυτικότητας.

SW480 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και επιμολύνθηκαν ως περιγραφεί. 24 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν μέσα στο ανώτερο θάλαμο ενός transwell. 48 ώρες μετά την σπορά, οι πυρήνες στην κάτω επιφάνεια οπτικοποιήθηκαν με χρώση Hoechst. (Α) Εκπρόσωπος εικόνες της κάτω ένθετο επιφάνεια μετά από χρώση Hoechst (γραμμή κλίμακας δείχνει μεγέθυνσης για όλους τους πίνακες). (Β) πέντε οπτικά πεδία ανά ένθετο μετρήθηκαν. n = 5 ανά ομάδα. Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Δοκιμασίες είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ** P & lt? 0,01.