Αφηρημένο

Ιστορικό

Withaferin Α, το οποίο είναι ένα φυσικά προερχόμενο στεροειδές λακτόνη, έχει βρεθεί για την πρόληψη της αγγειογένεσης και της μετάστασης σε διάφορα μοντέλα όγκου. Επίσης, έχει αναγνωριστεί από διάφορες ομάδες για εξέχοντα αντι-καρκινογόνες ρόλους. Ωστόσο, παρά αυτές τις μελέτες σχετικά με withanolides, λεπτομερής αντι-μεταστατική ο μηχανισμός δράσης τους παραμένει άγνωστος. Η τρέχουσα μελέτη έχει έτοιμη να αντιμετωπίσει το μηχανήματα που εμπλέκονται στην ρύθμιση εισβολή από σταθερές παράγωγο της Withaferin Α, 3-αζιδο Withaferin Α (3-azidoWA) σε ανθρώπινο τραχηλικό PC-3 κύτταρα HeLa και του προστάτη.

Μέθοδοι και Principal Εκτίμηση

Υπο-τοξική συγκέντρωση του 3-azidowithaferin Α (3-αζιδο WA) ανέστειλε τον καρκίνο κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή στην επούλωση των πληγών και Boyden εισβολή θάλαμος με καταστολή δραστικότητα ΜΜΡ-2 σε ζυμογραφία ζελατίνης και η έκφρασή της έχει αποδειχθεί είναι ένα σημαντικό εμπόδιο στην χημειο-ευαισθησία. Έχουμε αποκάλυψε ένα νέο μηχανισμό 3-azidoWA επαγόμενη εξωκυτταρικό προ-αποπτωτικών καταστολέα υποψήφιος όγκων Par-4 διέγερση πρωτεΐνης σε ρυθμισμένα μέσα και επίσης παρατηρήσει μια συνακόλουθη μείωση σημειώνονται σε pAkt και pERK σηματοδότησης με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ζυμογραφία 3-azidoWA επαγόμενη αναστολή ΜΜΡ-2 προκαλείται μέσω εκκριτικής Par-4. Η αναστολή της απόπτωσης από 3-azidoWA δεν θα μπορούσε να αποκαταστήσει ΜΜΡ-2 δραστικότητα ζελατινάσης. Εκτός από αυτό, μας

in vivo

δεδομένων των πειραμάτων σε ζώα έδειξαν 3-azidoWA καταργηθεί νεοαγγείωση στην εξαρτώμενη από τη δόση τρόπο προσδιορισμού βύσματος Matrigel ποντίκι.

Συμπέρασμα /Σημασία

Για το σκοπό αυτό έκθεση, βρήκαμε ότι 3-azidoWA κατέστειλε κινητικότητα και την εισβολή των HeLa και PC-3 κύτταρα σε ΜΜΡ-2 εξαρτώμενο τρόπο. Μας

in vitro

αποτέλεσμα υποδηλώνει έντονα ότι υπο-τοξικές δόσεις των 3-azidoWA ενίσχυσε την έκκριση της εξωκυττάριας Par-4 που καταργούνται εκκριτική έκφραση και δραστηριότητα ΜΜΡ-2. Η εξάντληση της εκκριτικής Par-4 αποκαθίσταται ΜΜΡ-2 έκφρασης και εισβολή ικανότητα των HeLa και κύτταρα PC-3. Περαιτέρω, τα ευρήματά μας άφησε να εννοηθεί ότι 3-azidoWA εξασθενημένο εσωτερική φωσφο-ΕΚΚ και την έκφραση φωσφο-Akt σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην αναστολή της αγγειογένεσης του ποντικιού από 3-azidoWA

Παράθεση:. Rah Β, Αμίν H, Γιουσούφ Κ, Khan S, Jamwal G, Mukherjee D, et al. (2012) A Novel MMP-2 αναστολέα 3-azidowithaferin Α (3-azidoWA) καταργεί Cancer Cell εισβολή και αγγειογένεση διαμορφώνοντας Εξωκυττάρια Par-4. PLoS ONE 7 (9): e44039. doi: 10.1371 /journal.pone.0044039

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 23, 2012? Δεκτές: 1 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 4 Σεπτεμβρίου, 2012

Copyright: © Rah et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι Εξωκυττάρια εκκριτικά μονοπάτια θεωρείται ότι διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην. ανθρώπινη φυσιολογία. Οι ζωτικές ορμόνες του σώματος και αυξητικοί παράγοντες που εκκρίνονται και που ελέγχουν την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση των οργάνων στις κανονικές φυσιολογικές συνθήκες. Ομοίως, η συστηματική (εξωκυτταρικό) πρωτεΐνες αποδίδουν σημαντική

in vivo

λειτουργία κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των ιστών και την απόπτωση [1]. Προστάτη αποπτωτική απόκριση 4 (Par-4) εκφράζεται παντού και εξελικτική διατηρημένη προ-αποπτωτική πρωτεΐνη της οποίας η έκφραση κυρίως συσχετίζονται με τα κύτταρα που υφίστανται απόπτωση λόγω εξωγενών προσβολών [2]. Εκτός από την ενδοκυτταρική λειτουργία της, η νέα προοπτική εξωκυτταρική έκκριση σε διαφορετικά καρκινικά κύτταρα έχει αυξηθεί το θεραπευτικό δυναμικό του Par-4 [3]. Πρόσφατα, Burikhanov et al. έχουν δείξει ότι τα κύτταρα θηλαστικών γενικά προκαλείται έκκριση του Par-4. Ωστόσο, η αποπτωτική επαγωγή από εξωκυτταρικό Par-4 που συμβαίνουν μέσω κύτταρο- επιφάνεια GRP-78 βρέθηκε να προάγουν κυτταρική εισβολή και την ογκογένεση [3]. Η σταθεροποίηση των προ-αγγειογενετική GRP-78 με Par-4 έχει χαρακτηρισθεί ένα αντι-επεμβατική ρόλος εξωκυτταρικού Par-4.

Η μετάσταση είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων που περιλαμβάνει την κυτταρική μετανάστευση και περικυτταρική πρωτεόλυση ECM που διαμεσολαβεί καρκινικά κύτταρα προεξοχή [4]. μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (ΜΜΡ’δ) είναι υπεύθυνες για την αποικοδόμηση των περιβαλλοντικών εμποδίων, όπως είναι η μεμβράνη εξωκυττάριας μήτρας και υπόγειο [5], [6]. Μεταξύ των μελών της οικογένειας των ΜΜΡ, ΜΜΡ-2 και -9 γενικά θεωρείται ότι είναι το κακοήθεια διαφόρων όγκων, καθώς και κακή πρόγνωση πολλών καρκίνων [6]. Έτσι, ΜΜΡ είναι ικανές τύπου διάσπασης κολλαγόνου IV βασικής μεμβράνης (ΜΜΡ-2 και -9) και να προσθέσει αξία για την ανάπτυξη φαρμάκων. Αδιάσειστα προκλινικές μελέτες από διάφορα εργαστήρια έδωσαν τη συντριπτική υποστήριξη για την άμεση σχέση μεταξύ της ΜΜΡ-2 έναντι της έκφρασης και εισβολή όγκου /μετάσταση [7], [8]. Κατά τη διάρκεια της αναπτυξιακής φάσης, πολλά από τα αναστολέων ΜΜΡ απέτυχε στις κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση, λόγω της εκτεταμένης ομολογίας μεταξύ καταλυτικών περιοχών της ΜΜΡ. Επιπλέον, τα περισσότερα από τα συνθετικά /ημι-συνθετικών αναστολέων των ΜΜΡ αποσύρθηκαν κατά τη διάρκεια κλινικών δοκιμών, λόγω απρόβλεπτων μακροπρόθεσμη δυσανεξίας του φαρμάκου μειώνεται η συμμόρφωση των ναρκωτικών [9]. Από την άλλη πλευρά, προσφάτως, τα φυσικά προϊόντα ή παράγωγα φυσικών προϊόντων έχουν θεωρηθεί εξαιρετικά δυναμικό να καταργήσει ΜΜΡ-2 και -9 μεσολαβεί εισβολή /μετάσταση είτε

in vitro

ή

in vivo

συσταθεί . Αυτές περιλαμβάνουν υδατικό εκχύλισμα κανέλας [10], εκχύλισμα πράσινου τσαγιού [11], η κουρκουμίνη [12], και στεροειδή σαπωνίνη από τριγωνέλλα [4], chitooligosacharides (COS) από τα θαλάσσια φυσικά προϊόντα [13].

Withaferin Α (WFA) είναι ένα πρωτότυπο της κατηγορίας withanolide φυσικών προϊόντων που εμφανίζουν ποικίλες φαρμακολογικές δράσεις, συμπεριλαμβανομένης της κατά των όγκων, αντιαγγειογενετικές, καρδιοπροστατευτικές, αντι-φλεγμονώδη, και ανοσορρυθμιστικά αποτελέσματα [14], [15]. Οι βιοδραστικοί ιδιότητες του Withaferin Α περιλαμβάνει κυτταροσκελετική αναδιαμόρφωση με σύνδεση προς Αηηβχίη II [16], αντιαγγειογενετικές [17], [18] και δράση κατά των όγκων [19], [20] από την αναστολή της πρωτεασώματος χυμοθρυψίνη [21] και αποπτωτική επαγωγή με αναστολή της πρωτεϊνικής κινάσης C [22]. Πρόσφατα, Oh et al κατέδειξαν την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 μέσω Withaferin A [23]. Εκτός από αντι-καρκινική δραστηριότητα, Withaferin Α έχει επίσης τεκμηριωθεί για αντι-φλεγμονώδη ιδιότητα της με καταστολή α-2-μακροσφαιρίνη [24]. Με την πρόσφατη επιτυχία μας προς την ανάπτυξη μιας βιβλιοθήκης Withaferin Α ημισυνθετικά ανάλογα, η ορθολογική στρατηγική ελέγχου οδηγήσει στη δημιουργία 3-azidoWA, η ισχυρή αντικαρκινική υποψήφιος [25]. Αν και η σημασία της α-β-ακόρεστες λειτουργικότητα του δακτυλίου Α της Withaferin Α και την αντικαρκινική δυναμικό της 3-azidoWA έγινε φανερό, ακόμα τρόπος δράσης της δεν ήταν σαφές.

Σε αυτή τη μελέτη αξιολόγησε την μηχανιστική ρόλο 3-azidoWA (3-αζιδο WA), μια αζιδο Withaferin παράγωγο στην κινητικότητα και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Θέλαμε επίσης να συσχετίσει αυτή η μελέτη με τα μονοπάτια σηματοδότησης

δηλαδή

, ΕΚΚ, Akt, τα οποία ενεργοποιούνται σε διαφορετικές μορφές καρκίνου και ενισχύει την εισβολή και τη μετάσταση διαφόρων καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών μας παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με το μηχανιστικό ρόλο της 3-azidoWA για κατάργηση της εισβολής του τραχήλου της μήτρας και του προστάτη καρκινικά κύτταρα που θα μπορούσαν να είναι en-δρομολογούνται μέσω του εξωκυττάριου Par-4.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και Αντισώματα

Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την European Collection of Cell Culture (ECACC), ορό εμβρύου μόσχου (FBS), RPMI-1640, Ελάχιστο Βασικό Μέσο (ΜΕΜ), πενικιλλίνη G , στρεπτομυκίνη, θρυψίνη-ΕϋΤΑ ελήφθησαν από την Invitrogen Corp. βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ), παραφορμαλδεϋδης, βιολετί Crystal, σταυροσπορίνη, Φαινυλομεθυλοσουλφονυλ φθορίδιο (PMSF), Dithiothretol (DTT), ΝΡ-40, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, ζελατίνη, Brij- 35, Comassie Brilliant Blue (R-250), Brefeldin Α (BFA), τουνικαμυκίνη, TRAIL, Annexin V-FITC απόπτωση κιτ δοκιμασίας ανίχνευσης, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), το αντιδραστήριο Bradford ελήφθη από τη Sigma Chemicals Co. (St. Louis, ΜΟ ) Propedium Ιωδιούχο και Ultracruz DAPI μέσο στερέωσης ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Ζ-VAD Pan αναστολέα κασπάσης, ανασυνδυασμένο ανθρώπινο VEGF-165 και ανασυνδυασμένο ανθρώπινο FGF (βασικός 146 αα) ελήφθησαν από την Κ & amp? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 /ΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου σε παρουσία 70 mg /L πενικιλλίνη και 0,1 g /L στρεπτομυκίνη και επωάστηκαν στους 37 ° C με 95% αέρα και 5,0% διοξείδιο του άνθρακα. Όλα τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα κατά τη διάρκεια της γραμμικής φάσης της ανάπτυξης. Αντισώματα ελήφθησαν από ακόλουθες εμπορικές πηγές: αντι-Par-4, αντι-ΜΜΡ-2, αντι-Akt, αντι-ERK, και αντι-ΤΙΜΡ-1 από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), αντι-ρ-Akt από και αντι-κασπάση-3 (Cell Signaling) και αντι-β-ακτίνης, αντι-ρ-ΜΑΡΚ (Sigma Chemical, St. Louis, ΜΟ).

Σύνθεση του 3-αζιδο WA

τριαιθυλαμίνη προστέθηκε σε ένα διάλυμα από TMSN

3 (1.2 ισοδ.) σε ξηρή μεθανόλη (3,0 ml) σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για να διατηρηθεί το ρΗ του 8.5. Withaferin Α (1.0 equiv., 470 mg, και 1,0 mmol) διαλύθηκε ξεχωριστά σε ξηρή μεθανόλη (2,0 ml) και το διάλυμα προστέθηκε στο μεθανολικό διάλυμα TMSN

3 και διατηρούνται για την 3,5 h. Η πρόοδος της αντίδρασης παρακολουθήθηκε μέσω TLC. Μετά την ολοκλήρωση, το μίγμα της αντίδρασης ξηράνθηκε εντελώς, διαλύθηκε σε νερό (5,0 ml) και εκχυλίζεται με χλωροφόρμιο

3 (10 ml) τρεις φορές για να ληφθεί το προϊόν 3-azidoWA. Για 3-azidoWA θεραπεία, 3-azidoWA διαλύθηκε σε 100% DMSO και αραιώνονται με μέσο καλλιέργειας έτσι ώστε η συγκέντρωση εργασίας DMSO ήταν μικρότερη από 0,2%.

κλωνογονική δοκιμασία

Ο προσδιορισμός διεξάγεται σύμφωνα με την προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [10]. Εν συντομία, τα κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε μια πυκνότητα σποράς (1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες βαθμού ιστοκαλλιέργειας 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε και νέο μέσο προστέθηκε και τα κύτταρα εξετέθησαν σε διάφορες συγκεντρώσεις 3-azidoWA /DMSO όχημα για 5 ημέρες στους 37 ° C επωαστήρα σε 5% CO

2. Αργότερα, τα ληφθέντα αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη και βάφτηκαν με διάλυμα 0,5% κρυσταλλικό ιώδες. Οι αποικίες από τις πλάκες μετρήθηκαν και ο μέσος όρος από τις παρατηρούμενες πεδία τυχαία (n = 3) και φωτογραφήθηκαν με μεγάλη 700 Μ ανεστραμμένη κάμερα μικροσκόπιο Olympus C-7070.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Το κύτταρο βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με πρότυπη μέθοδο πρόσληψης χρωστικής ΜΤΤ [10]. Εν συντομία, HeLa, PC-3, Α549 και DU-145 κύτταρα (3 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκα καλλιέργειας 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση 3-azidoWA εις τριπλούν έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του DMSO διαλύτη ήταν 0.2%. Μετά από 48 ώρες επώασης, διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 4 ώρες στους 37 ° C σε 5.0% CO

2 θερμοκοιτίδα. Η ποσότητα των έγχρωμων παράγωγο φορμαζάνης προσδιορίσθηκε με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD) χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας TECAN (άπειρη Μ200 PRO) στα 570 nm. Το ποσοστό βιωσιμότητας προσδιορίστηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται [10].

Scratch Κινητικότητα (Wound Healing) Δοκιμασία

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [4]. Εν συντομία, κύτταρα HeLa και PC-3 καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων σε συγκέντρωση (5.5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) και αφέθηκαν να σχηματίσουν συρρέουσα μονοστιβάδα για 24 ώρες, εν συνεχεία στερήθηκαν ορού για 24 ώρες . Μετά από αυτό η μονοστιβάδα γδαρμένο με μια αποστειρωμένη πιπέτα (200 μL), πλύθηκε με μέσο χωρίς ορό για αφαίρεση επιπλέει και αποκολλημένα κύτταρα και φωτογραφήθηκαν (χρόνος 0 ώρες). Τα κύτταρα διαδοχικά σε επεξεργασία σε μέσο που περιέχει χαμηλή ορού (1,0%) σε παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του 3-azidoWA (0.25, 0.50, και 0.75 μΜ) μαζί με όχημα DMSO για 24 ώρες. Πληγωμένος περιοχές προοδευτικά φωτογραφήθηκαν με Olympus C-7070 με 700M κάμερα (100x μεγέθυνση) .Το ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος υπολογίστηκε από την ακόλουθη εξίσωση: το κλείσιμο των πληγών% = [1- (περιοχή της πληγής σε t περιοχή

1 /τραύμα στο t

0) x 100%], όπου t

1 είναι ο χρόνος μετά τον τραυματισμό και t

0 είναι το χρονικό διάστημα αμέσως μετά τον τραυματισμό.

ανοσοαποτύπωσης

HeLa ή PC-3 κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα) επωάστηκαν όλη τη νύχτα και εκτίθενται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις 3-azidoWA μαζί με DMSO ως όχημα. Τα κύτταρα αναλόγως ξεπλύθηκαν με PBS, σε επεξεργασία με θρυψίνη και συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες και στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (HEPES 1.0 mM /L, ΚΟΙ 60 mM /L, ΝΡ-40 0,3%, EDTA 1,0 mM /L, DTT 1.0 mM /L, νάτριο orthovandate 1,0 mM /L, ΡΜδΡ 0.1 mM /L, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης). Οι κυτταρικές εκχυλίσεις φυγοκεντρούνται σε 12.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με την τυπική μέθοδο Bradford. Ίση ποσότητα (20 μα) της πρωτεΐνης από το κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε SDS-PAGE και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη (Millipore), αποκλείστηκαν με 5,0% (w /v) γάλα χωρίς λιπαρά σε PBS που περιέχει 0.1% Tween-20 και ανιχνεύθηκαν με σχετικών αντισωμάτων για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ή όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Ακολούθως στυπώματα πλύθηκαν και ανιχνεύθηκαν με είδη ειδικών δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα προς peroxidise χρένο. Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια συν (Amersham).

Η απόπτωση, Annexin V-FITC και ΡΙ Χρώση

Μετά θεραπείες με 3-azidoWA /φορέα DMSO, προσκολλημένα κύτταρα (HeLa και PC- 3) συλλέχθηκαν με πέψη με τρυψίνη και πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά ακολουθούμενη από επώαση με ϋΑΡΙ περιέχει μέσο στερέωσης για 15 λεπτά /RT στο σκοτάδι και απόπτωση ανιχνεύθηκε με μικροσκοπία φθορισμού (100 χ μεγέθυνση) .Η Annexin V-FITC πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της Annexin V -FITC Apoptosis Detection Kit, σύμφωνα με το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Εν συντομία, κυτταρικά σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 600 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης (10 mM HEPES [Ν-2- υδροξυαιθυλοπιπεραζινο-Ν-2-αιθανοσουλφονικό οξύ], 140 mM NaCl, και 2.5 mM CaCl2, ρΗ 7.4), και χρωματίστηκαν με 6,0 μΙ Annexin V-FITC και 10 μl διαλύματος χρώση ιωδιούχου προπιδίου για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα δείγματα διαδοχικά αναλύθηκαν με FACS (BD FACS Aria II) χρησιμοποιώντας το λογισμικό BD Diva.

ζυμογραφία ζελατίνης

Η δραστηριότητα ζελατινάσης της ΜΜΡ-2 εκτιμήθηκε με τη μέθοδο τυποποιηθεί στο παρελθόν. Κατά συνέπεια, HeLa και PC-3 κύτταρα σε υπο συρρέοντα καλλιέργεια (~70-80% κυτταρική πυκνότητα καλλιέργειας συρροή) αναπληρώνεται με νέο μέσο και διατηρήθηκαν για επώαση με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 3-azidoWA για 48 ώρες. Οι υπό όρους μέσων που λαμβάνονται και από τις δύο επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα δείγματα που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της πρωτεΐνης και ίση ποσότητα ολικών πρωτεϊνών (20 μα) αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (2.0% SDS, 25% γλυκερόλη, 0,1% βρωμοφαινόλη μπλε και 60 mM Tris-HCl, ρΗ 6.8). Ζελατίνη ζυμογραφία των δειγμάτων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 7,5% γέλες SDS-πολυακρυλαμιδίου που περιέχει 0.1% ζελατίνη σε 100V για 3 ώρες στους 4 ° C. Τα πηκτώματα αναλόγως ξεπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (2.0% Triton Χ-100 σε dd νερό) σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθεί SDS που ακολουθείται από ολονύκτια επώαση στους 37 ° C σε ρυθμιστικό TCNB (50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 10 mM ΟαΟ

2, 0,02% NaN

3). Έγινε χρώση των πηκτωμάτων με Comassie μπλε R-250 (Sigma) (0,125% Comassie blue R-250, 50% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ) για 1-1,5 ώρες και αποχρωματίζονται με διάλυμα αποχρωματισμού (20% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ, 70% dd νερό). δραστηριότητα ζελατινάσης ανιχνεύθηκε με την παρατήρηση μη χρωματισμένα λωρίδες σε μπλε φόντο για Comassie χρωματισμένο ζελέ.

Δοκιμασία Matrigel εισβολής

Το αποτέλεσμα της θεραπείας 3-azidoWA στην κυτταρική εισβολή προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας BD Biocoat Όγκων εισβολή Δοκιμασία Σύστημα (BD Bioscience, Bedford, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, HeLa και PC-3 (1,25 × 10

6) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε παρουσία 0.25, 0.50, και 0.75 μΜ 3-azidoWA ή φορέα DMSO επί 24 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού στο άνω θαλάμους /ένθετα, και οι κάτω φρεάτια πληρώθηκαν με χημειο-προσελκυστικό (πλήρες μέσο με 10% FBS). Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν στους 37 ° C. Μετά από 24 ώρες τα επικαλυμμένα με Matrigel φίλτρα πολυανθρακικού απομακρύνθηκαν, τα μη μεταναστεύοντα κύτταρα διαχωρίστηκαν από το ανώτερο θάλαμο με μια μπατονέτα και το ένθετο σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με διάλυμα 0,1% κρυσταλλικό ιώδες. Για κάθε επανάληψη (n = 3), η μετανάστευση των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με απαρίθμηση του χρωματισμένα κύτταρα (κύτταρα ανά πέντε πεδία) υπό ανεστραμμένο μικροσκόπιο.

παροδική επιμόλυνση

PC-3 και HeLa κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο μέσο όπως περιγράφεται στο τμήμα μεθόδου, επιμολυσμένα με GFP και GFP-Par-4 (πλούσια δώρα από τον Dr. Vivek Rangnekar, Πανεπιστήμιο του Kentucky, ΚΥ) χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σαρανταοκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πράσινου φθορισμού έγιναν ορατά κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού με κάμερα και ρυθμισμένο μέσο που χρησιμοποιείται για ζυμογραφία ζελατίνης.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Για ανοσοκηλίδωση HeLa και PC-3 κύτταρα απλώθηκαν σε καλυπτρίδες σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα σποράς 0,5 χ 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3-azidoWA (1,0 μΜ) ή φορέα DMSO και θετικός έλεγχος σταυροσπορίνη (25 ηΜ) σε παρουσία ή απουσία αναστολέα Pan-Κασπάση για 48 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 2.5% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS για 5.0 λεπτά και διαδοχικά αποκλείστηκε σε 0.5% BSA για 1 ώρα. Για την ανίχνευση της δραστηριότητας κασπάσης, τα κύτταρα επωάστηκαν με Caspase-3 πρωτογενές αντίσωμα (αραίωση 1:5000 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού) για 1 ώρα και κατά συνέπεια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, αυτό στη συνέχεια επωάστηκε με ερυθρό του Τέξας (Invitrogen) συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα ( 1:10000 αραίωση) για 1 ώρα και πλένεται, τοποθετείται με μέσο στερέωσης ultracruz και αναλύθηκαν με Zeiss LSM-510 metaconfocal μικροσκόπιο. Οι εικόνες που συνελήφθησαν στο 63x μεγέθυνση.

In vivo Matrigel αγγειογένεση Δοκιμασία

Τέσσερις έως 6 εβδομάδων C57 ποντίκια /BL6J (Indian Institute of Integrative Medicine κεντρική μονάδα εκτροφής ζώων, Τζαμού, Ινδία) διατηρήθηκαν

στους 20-22 ° C σε ένα κύκλο φωτός-σκότους 12 h. Οι μελέτες σε ζώα εκτελέστηκαν σύμφωνα με τα πειραματικά πρωτόκολλα που εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του ζώου Ινδικό Ινστιτούτο Integrative Medicine, Τζαμού, Ινδία. Τα ζώα ενέθηκαν υποδορίως, στα σωστά λαγόνες με 0,5 ml παγωμένου Matrigel (BD Bioscience) συμπληρωμένο με VEGF-Α (250 ng /mL) και bFGF (500 ng /mL). Τα ποντίκια ελέγχου ενέθηκαν με Matrigel χωρίς VEGF-A και bFGF. Στο τέλος της κάθε ζώα μελέτης θυσιάστηκαν για να αφαιρέσετε τα βύσματα Matrigel και φωτογραφίες που δείχνουν την έκταση της αγγείωσης ελήφθη με τη χρήση φωτογραφικών μηχανών Nikon. Η νεοαγγείωση των βυσμάτων Matrigel ποσοτικοποιήθηκε με τη χρησιμοποίηση 4 ml αντιδραστηρίου Drabkin προσθέτοντας καλά ομογενοποιείται 20 μΐ neovascularised Matrigel. Μετά από πλήρη ανάμιξη, η απορρόφηση μετρήθηκε με φασματοφωτόμετρο στα μήκος κύματος 540 nm για την εκτίμηση της αιμοσφαιρίνης. Η εκτίμηση αιμοσφαιρίνη υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο Hb (g /dl) = απορρόφηση του δείγματος /απορρόφηση του προτύπου συγκέντρωση × του προτύπου.

Μια προκαταρκτική μελέτη διεξήχθη για να προσδιοριστεί ο χρόνος για τη βέλτιστη νεοαγγείωση του Matrigel βύσματα για την ανάπτυξη . Για να γίνει αυτό, τα βύσματα απομακρύνθηκαν από ποντικούς ελέγχου (χωρίς προσθήκη VEGF-A και bFGF) στο τέλος της ημέρας 4, 7 και 11. Τα βύσματα που περιείχαν VEGF-A και bFGF αφαιρέθηκαν από τα ποντίκια στο τέλος της ημέρας 2, 4, 7 και 11 μετά την ένεση Matrigel. Τυποποίηση της βέλτιστος χρόνος για νεοαγγείωση, μία μελέτη απόκρισης δόσης με τη χρήση 3-azidoWA διεξήχθη στην οποία η ένωση χορηγήθηκε σε 1, 10, 20, 30, και 50 mg /kg /d, ε.π. για 3 ημέρες (8

ου, 9

ου, και 10

ου). Στο τέλος της διάρκειας, Matrigel βύσματα αφαιρέθηκαν για την οπτικοποίηση και ποσοτικοποίηση. Μετά τον εντοπισμό δόσεις των 3-άζιδο WA που αναστέλλει την αγγείωση, ο αριθμός των δόσεων να αναστέλλουν την νεοαγγείωση (προληπτική μελέτη) ή να διακόψει ιδρύθηκε αγγειακό σύστημα (μελέτη της θεραπείας) ερευνήθηκε. Για τα ποντίκια προληπτικά μελέτη δοσολογήθηκαν με (30 mg /kg /d, ε.π.) για 1-4 ημέρες μετά από 24 ώρες ένεση Matrigel. Επτά ημέρες μετά την ένεση του Matrigel βύσματα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα βύσματα αφαιρεθεί για την απεικόνιση και την ποσοτικοποίηση.

Για τη μελέτη της θεραπείας, νεοαγγείωση αφέθηκε να αναπτυχθεί σε μια περίοδο 7 ημερών. Ομάδες ζώων δοσολογήθηκαν με τις ενώσεις την ημέρα 8 (1 ημέρες χορήγησης) ή ημέρες 8-10 (3 ημέρες δοσολόγησης) στα 30 mg /kg /d, ε.π. Οι επιδράσεις σε καθιερωμένες αγγείωσης εκτιμήθηκαν 11 ημέρες μετά την ένεση των βυσμάτων Matrigel.

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Συγκρίσεις χρησιμοποιείται

t

test του Student. P & lt? 0,05 τιμές αποδόθηκαν σημασία

Αποτελέσματα

3-azidoWA είναι ένα αντι-πολλαπλασιαστική Agent και επάγει την απόπτωση σε PC-3 και HeLa κύτταρα

Withaferin Α είναι ένα. ισχυρός κυτταροτοξικός παράγων και έδειξε ανασταλτική της ανάπτυξης ιδιότητες σε πειράματα των καρκινικών κυττάρων καλλιέργειας [19], [26]. Όπως καλή όσο μητρικό μόριο Withaferin Α, το παράγωγο του Withaferin, 3-azidoWA (Εικ. 1, Α) σημαντικά επέδειξε αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών που δοκιμάστηκαν (έχοντας IC

50 μέσα σε μία κλίμακα από 800 ηΜ – 1,0 μΜ) [25] (Εικ. 1, Β). Για περαιτέρω επιβεβαίωση της απόπτωσης από 3-azidoWA, εκτελέσαμε Annexin V-FITC χρώση του 3-azidoWA επεξεργασμένα κύτταρα HeLa. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 1, C 59,1% πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με το 72,5% με 25 ηΜ σταυροσπορίνη, εμφανίστηκε όταν τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1,0 μΜ 3-azidoWA για 24 ώρες. Με χρώση ϋΑΡΙ παρατηρήσαμε ότι 1,0 μΜ 3-azidoWA, δεν 0,5 μΜ επαγόμενη απόπτωση σε Hela και PC-3 κύτταρα μέσα σε 24 ώρες επώασης σε σύγκριση με θετικό σταυροσπορίνη ελέγχου (εικόνα 1, D). νωρίς apoptoic κύτταρα ένα υπολειμματικό πέρασμα σχετίζονται παρατηρήθηκαν σε δεδομένα FACS (σε χαμηλότερη συγκέντρωση των 0,25 μΜ θεραπείας 3-azidoWA), ωστόσο, υψηλότερη συγκέντρωση (1,0 μΜ) 3-azidoWA, οδηγούν τα κύτταρα προς απόπτωση με συμπύκνωση χρωματίνης γύρω από την πυρηνική περιφέρεια συνοδεύεται από μείωση των πυρηνικών μεγέθους (λευκό αιχμές βελών, Σχ. 1, D). Δραστική κασπάση-3, ποσοτικά με ανάλυση κηλίδος western έδειξε διάσπαση της κασπάσης-3 σε 1,0 μΜ 3-azidoWA θεραπεία, αλλά όχι σε υπο-τοξικές δόσεις (0,5 μΜ) (Σχ. 1, E). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η 3-azidoWA είναι μια προοπτική κυτταροτοξική και την απόπτωση που επάγει παράγωγο του φυσικού προϊόντος.

(Α) Σύνθεση του 3-azidoWA. (Β) Επίδραση του 3-azidoWA επί του κυττάρου πολλαπλασιασμό των Α549 (καρκίνος του πνεύμονα), PC-3, DU-145 (καρκίνος του προστάτη) και HeLa (καρκίνος τραχήλου) κυτταρικές σειρές προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. (C) 3-azidoWA μαζί με όχημα DMSO και θετικά κύτταρα επεξεργασμένα σταυροσπορίνη ελέγχου αναλύθηκαν με FACS, (όπως αναφέρεται)? γραφική αναπαράσταση των αποτελεσμάτων δείχνουν αναλογία μη αποπτωτικών κυττάρων (Q3), πρώιμων αποπτωτικών (Q4), νεκρωτική (Q1) και κύτταρα αργά αποπτωτικά (Q2). κύτταρα (D) HeLa (5 × 10

4) καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια θαλάμου και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3-azidoWA (0.25, 0.50 και 1.0 μΜ) σε συνδυασμό με όχημα DMSO και θετικός έλεγχος σταυροσπορίνη (25 ηΜ) για 24 ώρες. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα βάφτηκαν με πυρηνική χρώση ϋΑΡΙ και φωτογραφήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (100χ μεγεθύνσεις) για τον προσδιορισμό των αποπτωτικών πυρήνων (λευκό βέλη). κύτταρα (Ε) HeLa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του 3-azidoWA όπως υποδεικνύεται, procaspase-3 και διασπασμένη κασπάση 3 εκφράσεις προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western μαζί με τον έλεγχο φόρτωσης β-ακτίνης.

Η

3- azidoWA αναστέλλει κυτταρική κινητικότητα, Invasion και σχηματισμού αποικίας

Όπως withanolides ήταν γνωστό ότι αναστέλλουν την ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων [27], σκοπεύαμε να μελετήσουμε την επίδραση του 3-azidoWA στην επεμβατική δυναμικό των HeLa και PC-3 κύτταρα

in vitro.

επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί εάν υπο-τοξική συγκέντρωση του 3-azidoWA θα μπορούσε να αναστείλει την κινητικότητα των Hela και PC-3 κύτταρα. Μετά από 48 ώρες, μονοστιβάδα κυττάρων είχαν τραυματίες, οι φορέα DMSO κατεργασμένα κύτταρα είχαν γεμίσει εντελώς στην εκκαθαρίζονται περιοχή (σχήμα 2, Α.), Ενώ η θεραπεία με 0,50 και 0,75 μΜ 3-azidoWA σημαντικά (ρ & lt? 0,05) ανέστειλε κινητικότητα των Hela και PC-3 κύτταρα, όπως έκανε θεραπεία με σταυροσπορίνη (Εικ. 2, Α και Β) (Εικ. S1, Α και Β).

κύτταρα (Α) HeLa (0,5 χ 10

5 κυττάρων /φρεάτιο) αναπτύχθηκαν σε συρροή σε έξι φρεάτων καλλιέργειας ιστού και γδαρμένο με στείρο άκρο? 3-azidoWA προστέθηκε σε καλλιέργειες όπως υποδεικνύεται. Γρατσουνισμένος περιοχές φωτογραφήθηκαν (μεγέθυνση 100χ) στην ώρα μηδέν και εν συνεχεία πάλι 24 ώρες αργότερα για να εκτιμηθεί ο βαθμός της επούλωσης του τραύματος. (Β) Οι γρατσουνιές περιοχές ποσοτικοποιήθηκαν σε τρία τυχαία πεδία σε κάθε θεραπεία, και τα δεδομένα υπολογίστηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) HeLa (1 × 10

3) κύτταρα /φρεάτιο καλλιεργήθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της ένωσης 3-azidoWA για 5 ημέρες στους 37 ° C και στη συνέχεια χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες (για λεπτομέρειες βλέπε υλικά και μέθοδοι), αριθμών των χρωματισμένων αποικίες μετρήθηκαν, φωτογραφήθηκαν (100Χ) και (Δ) δεδομένα υπολογίστηκαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Στηλών σημαίνουν? μπάρες δϋ τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με το μάρτυρα. (Ε) μετανάστευση των κυττάρων προσδιορίστηκε μέσω της τροποποιημένη δοκιμασία διαμερίσματος Boyden όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα κύτταρα HeLa (2 χ 10

5) σπάρθηκαν σε άνω θάλαμο παρουσία ή απουσία του 0,25, 0,50, και 0,75 μΜ 3-azidoWA. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες, στο οποίο σημείο μεταναστευτικά κύτταρα στην κάτω μισό του ενθέτου μεμβράνης βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν υπό μεγέθυνση 200Χ. (F) Διηθητική κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό εικόνας ως ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων ανά πεδίο υψηλής ισχύος (HPF). Πέντε πεδία μετρήθηκαν εις τριπλούν (n = 3) από κάθε ένθετο. εικόνες κυττάρων ελήφθησαν με τη χρήση μικροσκοπίου Nikon Eclipse E200 ενσωματωμένο με τη φωτογραφική μηχανή. Στηλών σημαίνουν? μπάρες δϋ τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα

Η

ικανότητα σχηματισμό αποικιών HeLa και PC-3 κύτταρα εξασθενημένα με κατεργασία 3-azidoWA κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο.. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, C υπο-θανατηφόρες δόσεις του 3-azidoWA μειωμένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων HeLa σε στατιστικώς σημαντικό τρόπο (Ρ & lt? 0,05). (Εικ. 2, D) (Εικ. S1, Γ και Δ)

Ένα κρίσιμο συμβάν στην εισβολή και μετάσταση όγκου είναι η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να εισβάλλουν μέσω της εξωκυττάριας μήτρας, επιτρέποντας τα καρκινικά κύτταρα να κινηθούν πέρα ​​από τα όρια του πρωτογενούς περιβάλλον του όγκου [28]. Για να εξεταστεί η επίδραση της 3-azidoWA στην κυτταρική εισβολή, δοκιμασία εισβολή θαλάμου Boyden διεξήχθη για να προσδιοριστεί η ικανότητα των HeLa και PC-3 κύτταρα για να εισβάλλουν μέσω βιολογικών μητρών

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, Ε και F, (Σχ S1, Ε και F, P & lt?. 0.01) κατεργασία με 3-azidoWA (0,50 και 0,75 μΜ) ανέστειλε την κυτταρική διείσδυση (Ρ & lt? 0,05) .Για παρακάμψει την δυνατότητα μεταβολής της κυτταρικής εισβολής λόγω προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, επιλέγουμε προσεκτικά τα φυσιολογικά σχετικές συγκεντρώσεις της 3-azidoWA. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι συλλογικά υπο-τοξικές δόσεις των 3-azidoWA μεταβάλλουν την κινητική ανάπτυξη των HeLa και κύτταρα PC-3. Αυτό θα μπορούσε να είναι μια θετική ένδειξη για τη δοκιμή αντινεοπλασματική δράση της στην τραχήλου της μήτρας και του προστάτη καρκινικά κύτταρα.

Η αναστολή της μεταλλοπρωτεϊνάσης 2 ζελατινάσης Δραστηριότητα και Έκφρασης από 3-azidoWA

εισβολή καρκινικών κυττάρων μέσω της μήτρας και ιστών απόφραξη χρειάζεται τις συνδυασμένες επιπτώσεις της αυξημένης κινητικότητας των κυττάρων και ελεγχόμενη πρωτεολυτική αποικοδόμηση της μήτρας. Υψηλά επίπεδα ΜΜΡ σε ιστούς όγκων έχουν συσχετιστεί με αποικοδόμηση μήτρας των καρκινικών κυττάρων, εισβολή και μετάσταση [29]. Όπως 3-azidoWA ανέστειλε κυτταρική κινητικότητα, ερευνήσαμε αν 3-azidoWA ασκεί δραστηριότητα αντι-ζελατινάσης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, Α και Β (Εικ. S2, Α), άνω σειρά, αυξανόμενη συγκέντρωση του 3-azidoWA επιλεκτικά καταργηθεί δραστικότητα ζελατινάσης και έκφραση του 72 KDa ΜΜΡ-2 μπάντα όπως επιβεβαιώνεται με ζυμογραφία ζελατίνης και ανάλυση κηλίδας Western. Η επίδραση της αναστολής ΜΜΡ-2 με 3-azidoWA ήταν πιο έντονη από γονικό μόριο withaferin Α (Εικ. 3, C) (Εικ. S2, Β) .Further εξετάσαμε αν 3-azidoWA θα μπορούσε να αναστείλει άλλα ζελατινάση (ΜΜΡ-9) και τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η 3-azidoWA μπλοκάρουν ειδικά την δραστικότητα ΜΜΡ-2 σε HeLa και κύτταρα PC-3, αλλά όχι ΜΜΡ-9 (Εικ. 3, Α μεσαία σειρά) (Εικ. S2, Α μεσαία σειρά). Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η 3-azidoWA έντονα και επιλεκτικά καταργεί ΜΜΡ-2 έκφρασης και δραστηριότητα σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

(Α) κύτταρα HeLa αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 0.50 μΜ και 0.75 μΜ του 3- azidoWA για 48 ώρες, προσαρμοσμένα μέσα αναλύθηκε για ΜΜΡ-2 & amp? -9 Δραστηριότητα ζελατινάσης. (Β) κύτταρα HeLa αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με 0,25, 0,50, 0,75 και 1,0 μΜ 3-azidoWA για 48 ώρες, ρυθμισμένα μέσα που λήφθηκε χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση Western blot που ακολουθείται από χρώση με Coomassie blue για να αποκαλύψει τη ζώνη 68 KDa BSA για τον έλεγχο φόρτωσης . (C) Τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις των μητρικών withaferin Α για 48 ώρες και της δραστηριότητας της ΜΜΡ-2 προσδιορίστηκε με ζυμογραφία ζελατίνης. (D) & amp? κύτταρα (Ε) HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL για 180 λεπτά και με Tumicamycin για 60 λεπτά (όπως υποδεικνύεται). Ρυθμισμένα μέσα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ζυμογραφία ζελατίνης για δραστικότητα ΜΜΡ-2 και ανάλυση κηλίδος Western για εξωκυτταρικό Par-4, που ακολουθείται από χρώση με Coomassie Blue για τον έλεγχο φόρτωσης.

Η

3-azidoWA Προκαλεί Εξωκυτταρική Par-4 Έκκριση από Κλασική Διαδρομή

Όπως ζευγάρια των παραγόντων επαγωγής απόπτωσης διευκολύνουν την έκκριση της εξωκυττάριας Par-4 [3], επιδιώξαμε να εξετάσει ένα πάνελ των φαρμακευτικών φυτών που προέρχονται αγνά φυσικά προϊόντα που θα μπορούσαν να προωθήσουν την απόπτωση ή /και να ενισχύσει την έκκριση της Par-4 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Απροσδόκητα βρήκαμε ότι τόσο χαμηλά όσο 0.5 μΜ (πολύ κάτω κυτταροτοξική δόση) 3-azidoWA, αλλά όχι το γονικό μόριο Withaferin Α (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) προκάλεσε την εξωκυττάρια έκκριση Par-4 σε δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 3, Β μεσαία σειρά), επαληθεύεται από κηλίδα Western. Επιπλέον, παρατηρήσαμε 3-azidoWA θεραπεία αύξησε την έκκριση της εξωκυτταρικής Par-4 στο υπό όρους μέσων που μιμείται ουσιαστικά τις επιδράσεις των 300 ng TRAIL (ΤΝΡ-συναφή απόπτωση που επάγει συνδετήρα) και 1,0 μΜ της θεραπείας τουνικαμυκίνη (Σχ. 3, D και Ε μεσαία σειρά). Για να εκτιμηθεί κατά πόσον αυτή η έκκριση της Par-4 συνέβη μέσω της κλασικής BFA-ευαίσθητη οδός που αφορούν τη διαδρομή ER /Golgi, που τερματίστηκε διακίνησης των πρωτεϊνών από το ER στο Golgi με Brefeldin Α (BFA) και βρέθηκε εκκρίνεται επίπεδο Par-4 επιβραδύνθηκε στο προσαρμοσμένο μέσο μετά από 3-azidoWA και θεραπεία TRAIL παρουσία Brefeldin Α (Σχ. 4, Α και Β ανώτερη σειρά). Εδώ, προτείνουμε 3-azidoWA προκαλεί εξωκυττάριο Par-4 έκκριση από την κλασική ευαίσθητη οδός BFA.

PC-3 κύτταρα. (Α) PC-3 Τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία ή προεπεξεργασία με BFA (1,0 μΜ) για 120 λεπτά, ακολούθως επεξεργάστηκε με 3-azidoWA όπως υποδεικνύεται για 48 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. (ΣΙ). (ΣΙ).