Αφηρημένο

Για να κατανοήσουμε τις συνέπειες της αλληλεπίδρασης μεταξύ του Mycoplasma και τα κύτταρα για την φιλοξενήσει κυτταρική λειτουργία, είναι σημαντικό για τη διαλεύκανση των επιδράσεων της μόλυνσης των κυττάρων με Mycoplasma για την πυρηνική ένζυμα όπως DNA τοποϊσομεράση τύπου Ι (Τορο Ι). Ανθρώπινα Τορο I συμμετέχει σε διεργασίες συναλλαγή DNA και είναι ο στόχος των φαρμάκων κατά του καρκίνου, οι καμπτοθεκίνες (CPT που). Εδώ ερευνήσαμε το μηχανισμό με τον οποίο μόλυνση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων με

Mycoplasma fermentans

επηρεάζει τη δραστικότητα και την έκφραση των κυτταρικών Τορο Ι, και η αποτελεσματικότητα αντικαρκινικών της CPT. Ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν ή σε επεξεργασία με ζωντανά ή σε υπερήχους

M. fermentans

και η δραστηριότητα και η έκφραση των Τορο ήμουν αποφασισμένος.

M. fermentans

μειωθεί σημαντικά (κατά 80%) δραστηριότητα Τορο Ι των μολυσμένων /αγωγή καρκινικά κύτταρα χωρίς να επηρεάζει το επίπεδο των Τορο Ι πρωτεΐνη. Δείχνουμε ότι αυτή η μείωση στη δραστικότητα του ενζύμου προέκυψαν από την ADP-ριβοσυλίωση της πρωτεΐνης Τορο Ι με Poly-ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP-1). Επιπλέον, pERK ενεργοποιήθηκε σαν αποτέλεσμα της επαγωγής της οδού μεταγωγής σήματος ΜΑΡΚ από

M. fermentans

. Από PARP-1 φαίνεται να ενεργοποιούνται από pERK, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι

M. fermentans

τροποποίησε την δραστικότητα κυτταρικής Τορο Ι με ενεργοποίηση της PARP-Ι μέσω της επαγωγής του μονοπατιού μεταγωγής σήματος ΜΑΡΚ. Επιπλέον, η μόλυνση των κυττάρων του όγκου με

M. fermentans

μείωσε την ανασταλτική δράση της CPT. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι η τροποποίηση της δραστηριότητας Τορο Ι με

M. fermentans

μπορεί να μεταβάλλει την έκφραση κυτταρικού γονιδίου και την απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε αναστολείς topo Ι, που επηρεάζουν την ικανότητα αντικαρκινικών ανταγωνιστών Τορο Ι

Παράθεση:. Afriat R, Horowitz S, Priel Ε (2013)

Mycoplasma fermentans

αναστέλλει τη δράση της Κυτταρικής DNA τοποϊσομεράσης Ι από την ενεργοποίηση των PARP1 και μεταβάλλει την αποτελεσματικότητα του Αντικαρκινικού Αναστολέας του. PLoS ONE 8 (8): e72377. doi: 10.1371 /journal.pone.0072377

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Απριλίου, 2013? Αποδεκτές: 9 του Ιούλη 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Afriat et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχεται από το ταμείο Έρευνας Σπόρων, Πανεπιστήμιο Μπεν Γκουριόν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μυκοπλάσματα, τα οποία ανήκουν στην κατηγορία Mollicutes, είναι τα μικρότερα αυτοαναπαραγόμενους ευβακτήρια, στερείται ενός κυτταρικού τοιχώματος και περιβάλλεται μόνο από μια μεμβράνη πλάσματος. μικρό τους μέγεθος γονιδιώματος (που κυμαίνονται από 580 να 1380 kbp) οδηγεί σε περιορισμένη μεταβολική ικανότητες και παρασιτισμός [1], [2]. Τα μυκοπλάσματα μπορεί να βρεθεί ως παράσιτα σε ένα ευρύ φάσμα ξενιστών συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, των ζώων, των εντόμων, φυτών, και τα κύτταρα αναπτύσσονται σε καλλιέργεια ιστού.

Στους ανθρώπους, ορισμένα είδη Mycoplasma βρεθεί ως συμβιωτικών κατοίκους, ενώ άλλα απεδείχθη να συνδέεται με μολυσματικές ασθένειες και παθολογίες μετά τη μόλυνση [3], [4].

τα περισσότερα από τα γνωστά είδη Mycoplasma ανευρίσκονται επιφάνεια της μεμβράνης παράσιτα, και πρόσφατα, μερικοί έδειξαν να εισέλθει στα κύτταρα και να γίνει ενδοκυτταρική κατοίκους [5].

Mycoplasma μπορεί να προκαλέσει χρόνιες λοιμώξεις που οφείλονται σε εξελιγμένους μηχανισμούς για την φοροδιαφυγή από το ανοσοποιητικό επιτήρησης (π.χ., μοριακό μιμητισμό, ένα μοναδικό είδος της αντιγονική παραλλαγή), up-ρύθμιση ή κάτω-που ρυθμίζει την έκκριση κυτοκινών, μόρια προσκόλλησης έκφρασης, έκφραση μεταγραφικών παραγόντων, MAP κινασών δραστηριότητα, αποπτωτικά μονοπάτια, και πιο [2], [3].

Πρόσφατα, πολλές εκθέσεις έχουν υποστηρίξει σθεναρά την ικανότητα του Mycoplasma να προκαλέσουν ή να προωθήσουν τον ογκογόνο μετασχηματισμό [6 ] – [9]., και η αναζήτηση για τη σχέση μεταξύ Mycoplasma και του καρκίνου εξετάζεται επί του παρόντος [10]

Οι λιποπρωτεΐνες (LPMf) του

Mycoplasma fermentans

, ένα ανθρώπινο παθογόνο, ήταν διερευνώνται διεξοδικά κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας. LPMf δείχθηκε να μεταβάλλουν τις λειτουργίες των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος με διέγερση έκφρασης των ογκογονιδίων [1], που επηρεάζουν αρκετούς παράγοντες που συμμετέχουν σε πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος [11] – [13], η μεταγραφή [14], και η αποπτωτική διαδικασία [11], [15], [16].

M. fermentans

δείχθηκε να αναστέλλει τη διαδικασία της απόπτωσης που επάγεται από παράγοντα νέκρωσης όγκου α (TNFa) [17], [18]. Όλα αυτά οδήγησαν στην υπόθεση ότι η μόλυνση των κυττάρων όγκου από Mycoplasma μπορεί να επηρεάσει τη δραστηριότητα και την έκφραση των βασικών πυρηνικών ενζύμων όπως τοποϊσομεράσες, που είναι οι στόχοι πολλών αντικαρκινικών φαρμάκων και επομένως παρεμβαίνουν στην αποτελεσματικότητα αντικαρκινικά αυτών των φαρμάκων. τοποϊσομεράσες DNA είναι μία οικογένεια ουσιωδών πυρηνικών ενζύμων που είναι υπεύθυνα για τον έλεγχο της τοπολογική κατάσταση των μορίων του DNA. Συμμετέχουν σε περισσότερες συναλλαγές DNA όπως αντιγραφή, μεταγραφή, ανασυνδυασμό, και αναδιαμόρφωσης χρωματίνης [19] – [21]. τοποϊσομεράσες DNA ταξινομούνται είτε ως τύπου Ι (διασπά ένα κλώνο του DNA) ή ΙΙ (διασπά δύο κλώνους DNA) τύπου. Και οι δύο τύποι ενζύμου κατηγοριοποιούνται περαιτέρω σε υποομάδες σύμφωνα με δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά. Τα μέλη κάθε οικογένειας των ενζύμων είναι διακριτές σε αλληλουχία, δομή και τις λειτουργίες [22].

Η καταλυτική δραστικότητα του τοποϊσομεράσες DNA περιλαμβάνει το σχηματισμό παροδικά ομοιοπολικών γεφυρών συμπλοκών ενζύμου-ϋΝΑ. Μια ομάδα τυροσυλ στη δραστική θέση του ενζύμου επιτίθεται σε ένα δεσμό φωσφοδιεστέρα επί της ραχοκοκαλιάς του DNA και παραμένει ομοιοπολικά συνδεδεμένο με μία πλευρά της διακοπής, αφήνοντας ένα αντίθετο ελεύθερο υδροξύλιο (ΟΗ) άκρο που επιτρέπει τη βαθμίδα επανασύνδεση, μετά την τοπολογία του DNA έχει επιλυθεί, από ένα δεύτερο πυρηνόφιλη προσβολή του ομοιοπολικού δεσμού φωσφοτυροσίνης ένζυμο-DNA, απελευθερώνοντας το ένζυμο για τον επόμενο καταλυτικό κύκλο. Η συμμετοχή αυτών των ενζύμων σε βασικές κυτταρικές διεργασίες χαρακτηρισμένες τοποϊσομεράσες ως σημαντικοί στόχοι για αντικαρκινικές αγωγές και για την ανάπτυξη ισχυρών, πιο αποτελεσματική, αντικαρκινικά φάρμακα [22], [23]. Η κυτταροτοξικότητα των αναστολέων τοποϊσομεράσες όπως καμπτοθεκίνη (CPT) και τα παράγωγά του TPT και CPT-11 (τα οποία έχουν εγκριθεί για κλινική χρήση), πηγάζει από την ικανότητά τους να σταθεροποιούν το διασπάσιμο συγκρότημα Τορο-DNA, η οποία εισάγει μονά και διπλά σπασίματα στα σκέλη το DNA [21], [24], [25]. δραστικότητα τοποϊσομεράσης επηρεάζεται από διάφορους μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, μεταξύ των οποίων η φωσφορυλίωση, πολυ-ΑϋΡ-ριβοζυλίωσης, και ουβικιτινίωση. Πρόσφατες εργασίες στο εργαστήριο μας απέδειξε την O-GlcNAcylation του Τορο ΙΒ, η οποία επηρεάζει τη δραστηριότητά της [26].

Η φωσφορυλίωση του DNA τοποϊσομεράσης Ι από την κινάση καζεΐνης II (CK II) και πρωτεϊνική κινάση C (PKC) up-ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του ενζύμου DNA χαλάρωση, ενώ αποφωσφορυλίωση με αλκαλική φωσφατάση ανέστειλε αυτή τη δραστηριότητα. Επιπλέον, το πολυ-ADP ριβοσυλίωση με πολυ-ΑϋΡ ριβόζης πολυμεράσης (PARP-1) του ενζύμου πρωτεΐνη βρέθηκε να μειορυθμίζουν δραστικότητα του [20], [27]. ΡΑΚΡ-1 είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται από διαλείμματα DNA? Ωστόσο πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι PARP-1 μπορεί να ενεργοποιηθεί με φωσφορυλιωμένη ERK2 εν απουσία συνθηκών στρες ή βλάβη του DNA [28]. Σε πρόσφατες μελέτες Mycoplasma αποδείχθηκε ότι είναι ικανά να ενεργοποιούν διάφορα MAPKs, όπως SAPK /JNK, ρ38, NF-kB, ΑΡ-1, και ERK 1/2 σε απόκριση σε λιποπρωτεΐνες Mycoplasma προερχόμενο μεμβράνη [11], [29] – [31]. Έτσι, είναι σημαντικό να διερευνηθεί η πιθανότητα ότι η κυτταρική Τορο Ι και η αποτελεσματικότητα των καθοδικών λυχνιών ως αντικαρκινικών παραγόντων μπορεί να επηρεαστεί από τη μόλυνση Mycoplasma.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

ανθρώπινου καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές -MCF7 (American Type Culture Collection, ΗΤΒ-22) και ανθρώπινου γλοιοβλαστώματος U251 κύτταρα- (ΗΤΒ-17) ευγενώς έλαβε από Porgador Α, Πανεπιστήμιο Ben-Gurion. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες σε DMEM και μέσο RPMI 1640 (Biological Industries, Beith Haemek, Israel), αντίστοιχα, συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 50 IU πενικιλλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη (0.29 μγ /κ.εκ ). Οι κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή συμπληρωμένο με 5% CO

2 στους 37 ° C.

ένζυμα, αντισώματα, και οι Ενώσεις

Στοκ διαλύματα καμπτοθεκίνη (Sigma, Ισραήλ) σε 20 mM (διαλυμένα σε 100% DMSO) φυλάχθηκαν σε δείγματα στους -70 ° C και αραιώνεται σε DMSO πριν από την προσθήκη στο μίγμα της αντίδρασης ή στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Υπερελικωμένο DNA πλασμιδίου pUC19 αγοράστηκε από την ΜΒΙ Fermentas (Hanover, MD, USA). PD98059 και 3-αμινοβενζαμίδιο (3AB) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)

Ο πρωταρχικός αντιοροί ήταν ως εξής:. Ποντικού μονοκλωνικό αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (ΜΡ Biomedicals, LLC)? κατσίκα πολυκλωνικό IgG (C-15) αντι-ΤΟΡΟ Ι, μονοκλωνικό IgG ποντικού antiphospho-ΕΚΚ (Ε-4), και πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού IgG αντι-ERK (C-16) (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)? αντι-πολυ-ADP αντισώματα ριβόζη μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, (Serotec, Oxford, UK)? και κατσίκας αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού IgG δεύτερα αντισώματα (Biolabs Inc., Ipswich, ΜΑ, USA). Για προσδιορισμούς ανοσοκαθίζησης, αντι-Τορο Ι αντίσωμα που προέρχεται από τον ορό του ασθενούς με σκληροδερμία χρησιμοποιήθηκε (TopoGene, Florida, USA).

Ενισχυμένη χημειοφωταύγειας (ECL) αντιδραστήρια αγοράστηκαν από Biological Industries (Beit Haemek, Ισραήλ).

Mycoplasma Ανάπτυξης

M. στέλεχος fermentans

K7 καλλιεργήθηκε σε ζωμό SP4 στους 37 ° C και 5% CO

2 μέχρι λογαριθμικής φάσης. Κλάσματα ενός ml που περιέχει 2 × 10

8 μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU) διατηρήθηκαν κατεψυγμένα στους -70 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Για κάθε πείραμα, ένα δείγμα επανατήχθηκε, καλλιεργήθηκε σε ζωμό SP4 σε αραίωση 1/10 για 24 ώρες (37 ° C, 5% CO

2), που ακολουθείται από περαιτέρω αραίωση του 1/50 μέχρι ένα λογαριθμική φάση ήταν παρατηρηθεί (μετά από περ. 24 ώρες). Η ακριβής ποσότητα του

M. fermentans

προσδιορίστηκε μετρώντας CFUs, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32], [33].

μυκοπλασματικής Πρωτεΐνη Απόσπασμα Προετοιμασία

M. fermentans

καλλιεργήθηκε όπως παραπάνω? η καλλιέργεια 500 ml σφαιροποιήθηκε (13.000 χ g, 30 λεπτά στους 4 ° C) και πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Το δισκίο ακολούθως εναιωρείται εκ νέου εντός PBS. CFU /ml προσδιορίστηκε, και η εκ νέου αιωρήματος του ιζήματος αποθηκεύθηκε στους -70 ° C για περαιτέρω πειράματα. Κατεψυγμένα σφαιρίδια του

M. fermentans

αποψύχθηκαν και επεξεργασία με υπερήχους σε 4 ° C για 4 χ 30 sec σε 80% της ισχύος (κύκλος 50%? Heat Systems Ultrasonics, Inc.) παρουσία του αναστολέα πρωτεάσης φενυλμεθυλσουλφονυλ φθορίδιο (PMSF? 0.001 Μ). Αυτές οι συνθήκες της κατεργασίας με υπερήχους είχε σαν αποτέλεσμα ένα παρασκεύασμα μη ζωντανού μυκοπλασματικής (όχι ανάπτυξη παρατηρήθηκε σε επαναλαμβανόμενων διαδικασιών καλλιέργειας). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης του σε υπερήχους

M. fermentans

προσδιορίστηκε με το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad (Richmond, CA)? 1 × 10

8 CFU αντιστοιχούσαν σε 10 μg μυκοπλασματικής πρωτεΐνη.

θεραπεία κακοηθών κυτταρικών γραμμών με το Live

Μ.

fermentans

ή

M. fermentans

Συνολική πρωτεΐνη

MCF7 και U251 κύτταρα, προπλυμένο μία φορά με PBS (1200 rpm, 5 λεπτά στους 4 ° C) και επαναιωρήθηκαν σε ένα νέο μέσο καλλιέργειας σε συγκέντρωση 2 × 10

5 κύτταρα /ml, καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων αποστειρωμένες πλάκες (Corning Inc., Corning, ΝΥ) σε μια τελική συγκέντρωση 4 × 10

4/200 μl /φρεάτιο. Ζήστε

M. fermentans

σε λογαριθμική φάση, προπλυμένο μία φορά σε PBS (13.000 χ g, 30 λεπτά στους 4 ° C), και επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% απενεργοποιημένο FCS, 1% πενικιλλίνη και 1% γλουταμίνη, προστέθηκαν στις κυτταρικές καλλιέργειες σε ΜΟΙ 1000:1 (4 × 10

7 CFU /φρεάτιο). Οι συν-καλλιέργειες επωάστηκαν για πέντε ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2. Για τα πειράματα με το

M. fermentans

συνολικής πρωτεΐνης, μια συγκέντρωση 20 μg /ml (που αντιστοιχεί σε 2 χ 10

8 CFU) προστέθηκε στα κύτταρα του όγκου που εξετάστηκαν (2 × 10

5 κύτταρα /ml) για 24 ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2.

DNA ενίσχυση της

M. fermentans

με αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR) χρησιμοποιώντας αλληλουχία νουκλεοτιδίων εντός της Insertion Sequence στοιχείου μορφής

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα μολυσμένα κύτταρα MCF7 και U251 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRI (T9424? Sigma- Aldrich, Rehovot, Israel) και στη συνέχεια μεταγράφηκε ανάστροφα με τη χρήση 1 μ§ ολικού RNA από τα κύτταρα που εξετάστηκαν με ολίγο-άΤ εκκινητή, χρησιμοποιώντας RevertAid Kit (K1621? Fermentas, Βίλνιους, Λιθουανία). Διάφορα cDNA που απομονώθηκε από το

M. fermentans

μολυνθέντα κύτταρα για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (1,5, 3, 6, 12, και 24 ώρες) ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας REDTaq Ready Mix (R2523? Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Ακολουθίες του συνθετικού ζεύγους ολιγονουκλεοτιδικό έναυσμα (RWO04 και RWO05) που χρησιμοποιούνται για ειδική ενίσχυση του DNA του

M. fermentans

και οι θέσεις τους στο Insertion Sequence στοιχείου μορφής (IS-σαν στοιχείο) έχουν περιγραφεί προηγουμένως [34]. Οι αλληλουχίες εκκινητή και τα μεγέθη των προϊόντων PCR ήταν ως εξής: RW004 Primer (24 nt): 5’GGA CTA TTG TCT ΑΑΑ CAA ΤΤΤ CCC και RW005 Primer (24 nt): 5’GGT ΤΑΤ TCG ΑΤΤ TCT ΑΑΑ ΤΕΕ ΚΔ. Το μέγεθος της ζώνης διαγνωστική DNA είναι 206 bp. Το προφίλ θερμικού κύκλου ενίσχυσης περιελάμβανε 40 κύκλους στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα (240 δευτερόλεπτα στο πρώτο κύκλο), 62 ° C για 60 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 60 δευτερόλεπτα (αυξημένη έως 10 λεπτά για τον τελικό κύκλο). Τα προϊόντα PCR κατέστησαν ορατά σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1% που βάφτηκε με βρωμιούχο αιθίδιο.

πυρηνική πρωτεΐνη Εκχυλίσματα Παρασκευή

πυρηνικά εκχυλίσματα για δοκιμασίες τοποϊσομεράσης και ανάλυση κηλίδας Western από τα κύτταρα MCF7 και U251 παρασκευάστηκαν ως περιγράφηκε προηγουμένως [27], [35] – [40] και ένα μίγμα από αναστολείς πρωτεάσης (τελικές συγκεντρώσεις: 2 μg /ml απροτινίνη, 2 μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη α, 2 μg /ml αντιπαΐνη, 100 μg /ml PMSF) προστέθηκε στα ρυθμιστικά διαλύματα εκχύλισης. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτείνης Bio-Rad (Bio-Rad Lab, CA, USA).

Προσδιορισμός του επιπέδου του Τορο Ι πρωτεΐνης με Western Blot ανάλυση

Ίσες ποσότητες πυρηνικών πρωτεϊνών που προέρχονται από Mycoplasma επεξεργασμένο ή MCF7 και U251 κύτταρα, αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας είτε αντι-Τορο Ι αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology Inc.) ή αντι-β-ακτίνης αντισώματα (ΜΡ Biomedicals, LLC) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36], [39], [41]. Τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL).

Τορο I Δοκιμασία

δοκιμασία Τορο Ι διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26], [37]. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις πυρηνικών πρωτεϊνών προστέθηκαν σε ένα μίγμα αντίδρασης Τορο Ι που περιέχει, σε ένα τελικό όγκο 25 μι: 20 mM Tris-HCl (ρΗ 8.1), 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 20 mM KCl, 10 mM MγCl

2, 1 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), /mL λευκωματίνης βοείου ορού 30 μg, και 250 ng pUC19 υπερελικωμένο πλασμιδιακό DNA (ΜΒΙ? Fermentas, Hanover, MD). Μετά την επώαση στους 37 ° C για 30 λεπτά, η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη 5 μί διακοπή ρυθμιστικού (τελική συγκέντρωση: 1% δωδεκυλοθειικό νάτριο, 15% γλυκερόλη, 0,5% κυανό βρωμοφαινόλης, και 50 mM EDTA, ρΗ 8). Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα 1% αγαρόζης χρησιμοποιώντας τρις ​​/βορικού ρυθμιστικού /EDTA (89 mM Tris-HCI, 89 mM βορικό οξύ, και 62 mM EDTA) στο 1 V /cm, χρωματισμένο με βρωμιούχο αιθίδιο (1 μg /mL) και φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μία λυχνία UV βραχέως μήκους κύματος (ChemiImager ™ 5500 εξοπλισμός, η Alpha Inotech Corporation, San Leandro, CA). Η πυκνομετρική ανάλυση των αποτελεσμάτων διεξήχθησαν με το λογισμικό EZ-Quant-Gel ανάλυση (ΕΖ-Quant, Rehovot, Israel), και το ποσοστό της δραστηριότητας Τορο I υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: (1 – (δείγμα /έλεγχος)) × 100 [37].

Ανοσοκαταβύθιση Δοκιμασία

ποντίκι μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-πολυ-ADP ριβόζη (PAR) αντίσωμα (MCA 1480) αγοράστηκε από την Serotec (Οξφόρδη, Ηνωμένο Βασίλειο). Ίσες ποσότητες των πυρηνικών πρωτεϊνών (200 μg), τα οποία ήταν προ-ζέση για 5 λεπτά, υποβλήθηκαν σε ανοσοκαθίζηση με αντι-ανθρώπινο Τορο Ι αντίσωμα (SC) σε τελικό όγκο 100 μL του πυρηνικού ρυθμιστικού διαλύματος (10 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl

2, και αναστολείς πρωτεάσης: 2 μg /mL απροτινίνης, 2 μg /mL λευπεπτίνη, 1 μg /mL πεπστατίνη Α, 2 μg /mL αντιπαϊνη, 100 μg /mL PMSF) . Το μίγμα περιστράφηκε σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Πρωτεΐνη Α-Sepharose (0,1 g /mL) σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (10 mM Tris-HCl, ρΗ 8, 1 mM EDTA) προστέθηκε για επιπλέον 1 ώρα. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 10,000 χ g για 2 λεπτά και τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό ΤΕ. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 25 μί ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος (τελική συγκέντρωση: 7,5% γλυκερόλη, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 6,8, 2,5% β-μερκαπτοαιθανόλη και 0.025% κυανό βρωμοφαινόλης), έβρασαν για 5 λεπτά, και φυγοκεντρήθηκε. Τα δείγματα φορτώθηκαν σε 7.5% SDS-PAGE, και ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας κατσίκας πολυκλωνικό IgG (C-15) αντι-Τορο I ή αντι-πολυ-ΑΟΡ ριβόζης (PAR) αντισώματα.

απογύμνωσης του Αντισώματα από Η νιτροκυτταρίνη Membrane

Η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα απογύμνωσης (100 mM 2-β-μερκαπτοαιθανόλη, 2% SDS, και 62.5 mM Tris-HCl, ρΗ 6.7) που ακολουθείται από επώαση στους 50 ° C για 30 λεπτά με περιστασιακή ανάδευση. Η μεμβράνη πλύθηκε δύο φορές με TPBS (31.25 mM Na

2ΗΡΟ4, 12.5 mM Na

2HPO

4, 13.7 mM NaCl, 0,1% Tween) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.

Κυττάρων κυτταροτοξικότητα Δοκιμασία

τα κύτταρα (5000 /καλά, εις τριπλούν) μολύνθηκαν με

M. fermentans

στα 2 × 10

1-2 × 10

3 ΜΟΙ για 6 ώρες που ακολουθείται από κατεργασία με 30 μΜ CPT ή 0,01% DMSO για επιπλέον 12, 24, ή 36 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας την Neutral Red δοκιμασία [42].

Στατιστική Ανάλυση

Φοιτητής

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία μεταξύ των πειραματικών δειγμάτων και των ελέγχων.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές (*)?

P

τιμές & lt? 0.01 (**) και & lt? 0.005 (***) θεωρήθηκαν ιδιαίτερα σημαντικές

Αποτελέσματα

1.. Ζήστε

M. fermentans

Αναστέλλει την Χαλάρωση Δραστηριότητα DNA του Τορο Ι

Η επίδραση του live

M. fermentans

σχετικά με τη δραστηριότητα των κυτταρικών τοποϊσομεράση Ι εξετάστηκε σε δύο τύπους κυτταρικών σειρών: ανθρώπινου καρκίνου του μαστού (MCF7) και γλοιοβλαστώματος (U251). Τα κύτταρα μολύνθηκαν με ζωντανές

M. fermentans

σε ΜΟΙ 10

3CFU /κύτταρο, για διάφορα χρονικά διαστήματα (1,5, 3, 6, 12, και 24 ώρες). Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από μολυσμένα και μη μολυσμένα κύτταρα και δραστικότητα Τορο Ι μετρήθηκε. Ισοδύναμες ποσότητες πρωτεϊνών πυρηνικού εκχυλίσματος προστέθηκαν σε ένα μίγμα δοκιμασίας χαλάρωση Τορο Ι DNA που περιέχει υπερελικωμένο πλασμιδιακό DNA ως υπόστρωμα για το ένζυμο? τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. δραστηριότητα Τορο I μετράται από την μετατροπή του υπερελικωμένου πλασμιδίου σε μερικώς ή πλήρως χαλαρή μορφές του [19]. Και οι δύο τύποι κυττάρων μολύνονται από

M. fermentans

έδειξαν σημαντική μείωση, έως και 80%, στη δραστηριότητα χαλάρωση DNA του ενζύμου, σε σύγκριση με μη μολυσμένα κύτταρα. Η σταδιακή μείωση της δραστηριότητας Τορο Ι παρατηρήθηκε ξεκινώντας από 1,5 ώρες μετά τη μόλυνση με το

M. fermentans

, και η κορυφή της μείωσης της δραστικότητας του ενζύμου (80%) ανιχνεύθηκε στο 6 ώρες μετά τη μόλυνση. Σημαντική μείωση στη δραστηριότητα χαλάρωση DNA του Τορο Ι ανιχνεύθηκε επίσης 12 και 24 ώρες μετά τη μόλυνση (30-50% για MCF7, 25-40% για το U-251, αντιστοίχως) (Σχήμα 1Α-D). Ωστόσο, ο βαθμός της μείωσης της δραστηριότητας Τορο Ι μειώθηκε με τον χρόνο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αποτελεσματικότητα του σήματος που προκαλείται από Mycoplasma αποδυναμώνεται, όπως καταδείχθηκε προηγουμένως για οδούς Mycoplasma μεσολάβηση της μεταγωγής σήματος [31], [43]. Για να επιβεβαιωθεί ότι τα κύτταρα πραγματικά μολυνθεί και η παρατηρούμενη επίδραση οφείλεται στην παρουσία του

M. fermentans

, προσδιορίσαμε την παρουσία Mycoplasma DNA στα μολυσμένα κύτταρα με ανάστροφη αλυσιδωτή αντίδραση τρανσκριπτάσης πολυμεράσης (RT-PCR) δοκιμασία χρησιμοποιώντας

M

.

fermentans-

ειδικούς εκκινητές. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι τα υπό εξέταση κυτταρικές γραμμές όγκου πράγματι μολυνθεί με

M. fermentans

(Σχήμα 2Α).

MCF7 (Α, Β) και U251 (C, D) τα καρκινικά κύτταρα μολύνθηκαν με ζωντανές

M. fermentans

(

M.f

) για διάφορα χρονικά διαστήματα σε ΜΟΙ 10

3CFU /κύτταρο. Σύνολο πυρηνικής πρωτεΐνης (12,5 ng) προστέθηκε σε ένα ειδικό μίγμα αντίδρασης για Τορο Ι Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. (A, C) Μια αντιπροσωπευτική εικόνα (n = 4-5) της δραστηριότητας DNA-χαλάρωσης Τορο Ι. (Β, D) ποσοτική ανάλυση της δραστηριότητας Τορο Ι. Σύμβολα: R και S είναι η χαλαρή και υπερελικωμένο μορφή του DNA pUC19, αντίστοιχα? Τοπογραφικά καμία πρωτεΐνη προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης.

t-test

:. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0,005

δείγματα από το MCF7 και U251 κύτταρα μολυσμένα (που περιγράφεται στο Σχήμα 1) αναλύθηκαν για την ανίχνευση της μυκοπλασματικής DNA με PCR (Α, Β). Πυρηνικά εκχυλίσματα που προέρχονται από MCF7 και U-251 κύτταρα μολυσμένα αναλύθηκαν για επίπεδο πρωτεΐνης Τορο I χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western με αντι-Τορο I ή αντι-β-ακτίνης αντισώματα, και προσδιορίζεται ποσοτικά με πυκνομετρική ανάλυση χρησιμοποιώντας το λογισμικό EZquant (C-F).

η

Για να εξεταστεί κατά πόσον η μείωση της δραστηριότητας Τορο Ι σε μολυσμένα κύτταρα του όγκου είναι μια συνέπεια της μείωσης του επιπέδου της πρωτεΐνης Τορο Ι, πυρηνικά εκχυλίσματα προερχόμενα από δύο μολυσμένα και μη μολυσμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κηλίδα Western με το κατάλληλα αντισώματα αντι-Τορο Ι. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 2C-F, το επίπεδο της Τορο Ι πρωτεΐνης σε μολυσμένα κύτταρα ήταν παρόμοια με αυτή που βρέθηκε σε μη μολυσμένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μείωση της δραστηριότητας Τορο I δεν οφείλεται σε μείωση της ποσότητας του ενζύμου πρωτεΐνη.

2. Αναστολή της Χαλάρωσης DNA Δραστηριότητα του Τορο Ι με κατεργασία με υπερήχους

M. fermentans

Η

Για να προσδιορίσετε αν το αποτέλεσμα Mycoplasma για Τορο Ι ασκείται από τα υλικά που εκκρίνονται από ζωντανά Mycoplasma ή δομικές πρωτεΐνες αυτού βακτηρίων, εξετάσαμε δραστηριότητα Τορο Ι σε καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με μη-live, σε υπερήχους ,

M. fermentans

. Κύτταρα (MCF7 και U251) υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με αυξανόμενη συγκέντρωση πρωτεΐνης (5, 10, και 20 μg /ml) που προέρχεται από κατεργασία με υπερήχους

M. fermentans

. Πυρηνική εκχύλισμα παρασκευάστηκε από τα κατεργασμένα και μη κατεργασμένα κύτταρα και δραστηριότητα χαλάρωσης Τορο Ι DNA μετρήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, D, μία σημαντική μείωση της δραστηριότητας Τορο Ι παρατηρήθηκε, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, σε κύτταρα κατεργασμένα με

M. fermentans

πρωτεΐνες (υπερηχείται). Ποσοτικοποίηση της δραστηριότητας Τορο Ι [37] από πολλαπλά πειράματα (η = 4) εκτελέσθηκε. Μια μείωση κατά 40-80% (

ρ

& lt? 0,05) σε δραστηριότητα Τορο Ι παρατηρείται σε κύτταρα επεξεργασμένα με 5-20 μg /ml του σε υπερήχους

M. fermentans

πρωτεΐνες για 24 ώρες (Σχήμα 3Β, E). Αν και παρατηρήθηκε μείωση της δραστηριότητας Τορο Ι σε κύτταρα επεξεργασμένα με κατεργασία με υπερήχους Mycoplasma, το επίπεδο της Τορο Ι πρωτεΐνη δεν επηρεάστηκε (Σχ. 3C, F).

MCF7 (A-C) και U251 (D-F ) καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις

M. fermentans

πρωτεΐνες. Σύνολο πυρηνικές πρωτεΐνες (12,5 ng) προστέθηκαν σε ένα ειδικό μίγμα αντίδρασης για Τορο Ι Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. (Α, D) Μια αντιπροσωπευτική εικόνα (n = 4-5) της δραστηριότητας χαλάρωσης Τορο Ι DNA. (Β, Ε) ποσοτική ανάλυση της δραστηριότητας Τορο Ι. επίπεδο πρωτεΐνης (C, F) Τορο Ι εξετάστηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. Σύμβολα: R και S είναι η χαλαρή και υπερελικωμένο μορφή του DNA pUC19, αντίστοιχα, τοπογραφικά καμία πρωτεΐνη προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης.

t-test

:. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0,005

Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι είτε ζωντανά ή μη-live (σε υπερήχους)

M. fermentans

ασκείται παρόμοια αποτελέσματα με το κινητό Τορο Ι ένζυμο.

3.

M. fermentans

Μειωμένη η CPT Αναστολή Επιπτώσεις στον Χαλάρωση DNA Δραστηριότητα του Τορο Ι

Θα ήταν ενδιαφέρον να εξεταστεί η επίδραση της λοίμωξης Mycoplasma στην ανασταλτική ικανότητα των γνωστών ανταγωνιστών Τορο Ι όπως CPT. Αρχικά, πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων στα οποία κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις CPT ώστε να επιλεγεί η δόση CPT που προκαλεί σχεδόν πλήρη αναστολή της δραστηριότητας του ενζύμου μέσα σε σύντομο χρονικό διάστημα (δεν φαίνεται). Έχουμε επιλέξει μια δόση CPT 30 μΜ, η οποία αναστέλλει τη δράση Τορο Ι κατά 90-95% μέσα σε 1,5 h (Σχήμα 4Α, Β? Συγκρίνετε λωρίδα 4 έως λωρίδα 2). Τα κύτταρα μολύνθηκαν με ζωντανές

M. fermentans

επί 6 ώρες σε ΜΟΙ 10

3 CFU /κύτταρο, που ακολουθείται από 30 θεραπείες μΜ CPT για επιπλέον 1,5 ώρες. Μια σημαντική μειώνεται στο ανασταλτικό αποτέλεσμα CPT (από 95% αναστολή σε περίπου 60%) παρατηρήθηκε σε κύτταρα MCF7 που εκτίθενται στο συνδυασμό του

M. fermentans

λοίμωξης και θεραπεία CPT (Εικόνα 4Α, Β, συγκρίνετε λωρίδα 6 έως λωρίδα 4,

σ

& lt? 0.005). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κύτταρα U251 (Σχήμα S1 Α-Β). Η επεξεργασία των κυττάρων με CPT είναι γνωστό ότι μειώνει την ποσότητα της πρωτεΐνης δωρεάν Τορο Ι παρόν στο πυρηνόπλασμα λόγω της σταθεροποίησης του ενζύμου-ϋΝΑ διασπωμένη σύμπλοκα με CPT. Πράγματι, η θεραπεία των καρκινικών κυττάρων με CPT μείωσε το επίπεδο της ελεύθερης πρωτεΐνης Τορο Ι (Σχήμα 4C λωρίδα 3). Ο συνδυασμός της λοίμωξης Mycoplasma και θεραπεία CPT δεν επηρέασε το επίπεδο της πρωτεΐνης δωρεάν Τορο I όταν εξετάζεται σε σχέση με την ποσότητα του β-ακτίνης πρωτεΐνης (Εικόνα 4C).

κύτταρα MCF7 μολύνθηκαν με

M. fermentans

(

M.f

) για 6 ώρες ακολουθούμενη από CPT (30 μΜ) θεραπείες για επιπλέον 1,5 ώρες. Σύνολο πυρηνικής πρωτεΐνης (12,5 ng) προστέθηκε σε ένα ειδικό μίγμα αντίδρασης για Τορο Ι Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. (Α) αντιπροσωπευτική εικόνα n = 5, της δραστηριότητας Τορο Ι DNA-χαλάρωσης. (Β) ποσοτική ανάλυση της δραστηριότητας Τορο Ι. επίπεδο (Γ) Τορο Ι πρωτεΐνη εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Σύμβολα: R και S είναι η χαλαρή και υπερελικωμένο μορφή του DNA pUC19, αντίστοιχα, τοπογραφικά καμία πρωτεΐνη προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης

t-test

: *

ρ

& lt? 0,05, * *

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.005

Η

4. Πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) ανταγωνιστές εμπόδισε την προκαλούμενη από Mycoplasma Ανασταλτικό Αποτέλεσμα επί Τορο I Δραστηριότητα

Τα προαναφερθέντα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μείωση της δραστηριότητας Τορο Ι σε κύτταρα όγκου που ασκείται από

M. fermentans

μπορεί να οφείλεται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών ένζυμο. Τορο Ι υφίσταται διάφορες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, οι οποίες επηρεάζουν τη δράση της: Φωσφορυλίωση Τορο Ι με κινάση καζεΐνης II ή από PKC αυξάνει τη δράση της, ενώ Poly-ADP ριβοσυλίωση από ΡΑΚΡ-1 μειώνει τη δραστηριότητά του. Επιπλέον, ουβικιτινίωση Τορο Ι οδηγεί σε πρωτεόλυση του [44], [45]. Για τον προσδιορισμό της οδού με την οποία

M. fermentans

επηρεάζει τοποϊσομεράσης Ι, ερευνήσαμε πρώτα την επίδραση του πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) αναστολέας -3-αμινοβενζαμίδιο (3AB) στην δραστικότητα Τορο Ι, μόνες και ως προ-θεραπεία για

M. fermentans

λοίμωξη. κύτταρα MCF7 προ-επωάστηκαν με 3AB σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (1-3 mM) για 1.5 ώρες ακολουθούμενο από

M. fermentans

μόλυνσης (ΜΟΙ 10

3CFU /κύτταρο) και επώαση για επιπλέον 6 ώρες. Πυρηνική εκχύλισμα παρασκευάστηκε και αναλύθηκε για δραστικότητα Τορο Ι όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται στο Σχήμα 5Α-Β δείχνουν ότι η προθεραπεία με 3AB απέτρεψε την

M. fermentans

επαγόμενη μείωση της δραστηριότητας Τορο Ι. Θεραπεία των μη μολυσμένων κυττάρων με 3AB για τον υποδεικνυόμενο χρόνο δεν επηρεάζει την δραστικότητα Ι κυτταρική Τορο (Σχήμα 5Α, Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με τα κύτταρα U-251 (Σχήμα S2 Α-Β).

κύτταρα MCF7 προ-επωάστηκαν με 3-αμινοβενζαμίδιο (3AB) επί 1 ώρα σε διάφορες συγκεντρώσεις που ακολουθείται από

M. fermentans

μόλυνσης (ΜΟΙ 10

3 CFU /κύτταρο) για 6 επιπλέον ώρες. Σύνολο πυρηνικής πρωτεΐνης (12,5 ng) προστέθηκε σε ένα ειδικό μίγμα αντίδρασης για Τορο Ι Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (Α) και τον ποσοτικό προσδιορισμό της δραστηριότητας Τορο Ι διεξήχθη (Β). Σύμβολα: R και S είναι η χαλαρή και υπερελικωμένο μορφή του DNA pUC19, αντίστοιχα, τοπογραφικά καμία πρωτεΐνη προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης

t-test

: *

ρ

& lt? 0,05, * *

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt?. 0.005

Η

5. ΜΕΚ αναστολέα εμπόδισε την Μείωση Mycoplasma που προκαλείται στο Τορο Ι Δραστηριότητα και ERK 1/2 φωσφορυλίωση

Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν ότι PARP-1 φωσφορυλιώνεται από ERK [28]. Η επίδραση των ζωντανών

M. fermentans

για MAPKs σε γενικές γραμμές δεν έχει μελετηθεί σε βάθος. Οι περισσότερες από τις μελέτες που αφορούν

M. fermentans

και ΜΑΡΚ πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση προϊόντων μυκόπλασμα ή θερμικά αδρανοποιημένο Mycoplasma (HIM). Ωστόσο, λίγες μελέτες έδειξαν ότι η μόλυνση των κυττάρων με διάφορες Mycoplasma μπορεί να οδηγήσει σε ERK-φωσφορυλίωση [11], [17], [30]. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την επίδραση της ΜΕΚ αναστολέα PD-98059 σχετικά με τη δραστηριότητα Τορο Ι, μόνη της ή πριν από τη μόλυνση με το

M. fermentans

. MCF7 και U-251 κύτταρα προ-επωάστηκαν με PD για 1,5 ώρες σε συγκέντρωση 25 μΜ ακολουθούμενη από

M. fermentans

μόλυνσης (ΜΟΙ 10

3CFU /κύτταρο) και επώαση για επιπλέον 6 ώρες. Πυρηνική εκχύλισμα παρασκευάστηκε και αναλύθηκε για δραστικότητα Τορο Ι και φωσφορυλίωση της ERK χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western με ειδικά αντι-ERK ρ 1/2 αντίσωμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η προσθήκη του αναστολέα ΜΕΚ στην αντίδραση Τορο Ι δεν επηρέασε δραστηριότητα Τορο Ι (Σχήμα 6Α, Β), και σε αντίθεση, επεξεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα (PD) απέτρεψε την

M. fermentans-

που προκαλείται από τη μείωση της δραστηριότητας Τορο Ι (Σχήμα 3Α, Β U-251 κύτταρα). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η ποσότητα του ρ-ERK1 /2 αυξήθηκε σε μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 6C για κύτταρα MCF7 και Σχήμα S3 C για U-251), ενώ προκατεργασία με PD απέτρεψε αυτή την αύξηση. Το επίπεδο του συνόλου των ΕΚΚ δεν επηρεάστηκε από τις διάφορες θεραπείες (Σχήμα 6C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μείωση της δραστηριότητας Τορο Ι σε

M. fermentans-

μολυσμένα κύτταρα διαμεσολαβείται από ΜΑΡΚ σηματοδότηση.

κύτταρα MCF7 προ-επωάστηκαν με αναστολείς ΜΕΚ (PD) για 1 ώρα σε μια συγκέντρωση 25 μΜ ακολουθούμενη από

M. fermentans

μόλυνσης (ΜΟΙ 10

3CFU /κύτταρο) για 6 επιπλέον ώρες. Σύνολο πυρηνικής πρωτεΐνης (12,5 ng) προστέθηκε σε ένα ειδικό μίγμα αντίδρασης για Τορο Ι Τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (Α) και δραστηριότητα Τορο Ι ποσοτικοποιήθηκε (Β). Η φωσφορυλιωμένη ERK πρωτεϊνικό επίπεδο 1/2 από MCF7-εκχύλισμα εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western (C). Σύμβολα: R και S είναι η χαλαρή και υπερελικωμένο μορφή του DNA pUC19, αντίστοιχα, τοπογραφικά καμία πρωτεΐνη προστίθεται στο μίγμα της αντίδρασης

t-test

: ***

ρ

& lt? 0.005 .

Η

6.

M. fermentans

Μόλυνση Αυξημένη Πολυ-ADP-ριβοσυλίωση του Τορο Ι Προέρχεται Από MCF7 κύτταρα

PARP-1 ρυθμίζει δραστηριότητα Τορο Ι από την ADP-ριβοσυλίωση της πρωτεΐνης του ενζύμου [46]. Να εξετάσει κατά πόσον μόλυνση με

M. fermentans

επαγόμενη Τορο I τροποποίηση από PARP, Τορο Ι πρωτεΐνη ανοσοκαταβυθίστηκε με αντισώματα αντι-Τορο Ι που προέρχεται από σκληροδερμία (SC) τον ορό του ασθενούς [47] και αναλύθηκε με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας αντι-Poly-ADP-ριβόζη μονοκλωνικό αντίσωμα (Σχήμα 7Α).