Αφηρημένο

Τα φλαβονοειδή και φλαβονοειδών παράγωγα, τα οποία έχουν σημαντικές βιολογικές και φαρμακολογικές έχουν δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένων κατά του όγκου και αντι-φλεγμονώδεις δραστηριότητες, έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στην ανθρώπινη υγειονομικής περίθαλψης. Για να σχεδιάσουμε ένα πιο αποτελεσματικό φλαβονοειδές παράγοντα κατά του όγκου, αλλάξαμε το φλαβονοειδές ραχοκοκαλιά με υποκαταστάσεις πιπεραζίνης και μεθοξυ ομάδες για να συνθέσει ένα νέο παράγωγο φλαβονοειδές, LZ-207. Η αντικαρκινική δράση του LZ-207 έναντι HCT116 του κόλου καρκινικών κυττάρων και της υποκείμενης μηχανισμός αυτής της επίδρασης διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Συγκεκριμένα, LZ-207 εμφάνισαν ανασταλτικά αποτελέσματα στην ανάπτυξη και την βιωσιμότητα σε αρκετές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα HCT116 τόσο in vitro όσο και in vivo. θεραπεία LZ-207 κατέστειλε επίσης την πυρηνική μετατόπιση του ΝΡ-κΒ και την φωσφορυλίωση ΙκΒ και ΙΚΚα /β σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο και στις δύο HCT116 κύτταρα και ανθρώπινης οξείας μονοκυτταρικής λευχαιμίας ΤΗΡ-1 κύτταρα. Επιπλέον, LZ-207 μείωσε επίσης την έκκριση της προ-φλεγμονώδους κυτοκίνης ιντερλευκίνης-6 (IL-6) σε επαγόμενη από LPS κύτταρα ΤΗΡ-1, και αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε στο μεταγραφικό επίπεδο. Επιπλέον, LZ-207 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCT116 που προκαλείται από LPS επαγόμενη κύτταρα ΤΗΡ-1 σε ένα σύστημα συγκαλλιέργειας. Τα ευρήματα αυτά διευκρινιστεί κάποια πιθανά μοριακών μηχανισμών για την πρόληψη της φλεγμονής με γνώμονα τον καρκίνο του παχέος εντέρου με τη χρήση του νεοσυντιθέμενες φλαβονοειδή LZ-207 και πρότεινε τη δυνατότητα περαιτέρω ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων που προέρχονται από φλαβονοειδή

Παράθεση:. Sun J, Li F, Zhao Υ, Zhao L, Qiao C, Li Ζ, et al. (2015) LZ-207, ένα νεοσυντιθέμενες Φλαβονοειδών, επάγει την απόπτωση και καταστέλλει τη φλεγμονή σχετίζονται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου Με την αναστολή του NF-κΒ μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 10 (5): e0127282. doi: 10.1371 /journal.pone.0127282

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Dominique Delmas, UMR INSERM U866, Γαλλία

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου, 2014? Αποδεκτές: 13 Απριλίου 2015? Δημοσιεύθηκε: May 29, 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το National Science & amp? Τεχνολογία Μεγάλου Έργου (No.2012ZX09304-001), το Πρόγραμμα Έργων του κράτους Βασικά Εργαστήριο Φυσικών Φαρμάκων, την Κίνα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου (Αρ JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303 και SKLNMZZJQ201302, G140042), το Πρόγραμμα για Changjiang μελετητές και Καινοτόμες Ερευνητική Ομάδα του Πανεπιστημίου (IRT1193), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 91029744)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κάθε χρόνο, περισσότεροι από 600.000 άνθρωποι πεθαίνουν από καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) και 1,25 εκατομμύρια άνθρωποι διαγιγνώσκονται με την ασθένεια αυτή. Η χειρουργική αφαίρεση του καρκίνου με τη λειτουργία είναι η παραδοσιακή θεραπεία για όλα τα στάδια της CRC? Ωστόσο, πολλοί ασθενείς έχουν ανεγχείρητο όγκους και να πάει για να αναπτύξουν μεταστάσεις [1]. Ως εκ τούτου, νέα θεραπευτικά μέσα για τη θεραπεία CRC απαιτούνται επειγόντως

Συσσωρευμένα στοιχεία έχουν καταδείξει ότι η φλεγμονή είναι ένα κρίσιμο συστατικό της εξέλιξης του όγκου [2].? θέσεις μόλυνσης, χρόνια ερεθισμός και φλεγμονή θα μπορούσε να είναι σε περιοχές υψηλού κινδύνου να εξελιχθούν σε καρκίνο. Η στενή σχέση μεταξύ φλεγμονώδεις νόσοι του εντέρου (IBDs) και καρκίνου του παχέος εντέρου έχει προταθεί από το 1925 και εξακολουθεί να είναι ένα ισχυρό περίπτωση για να αποδείξει τη σχέση μεταξύ φλεγμονής και του καρκίνου [3, 4]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι προ-φλεγμονώδεις παράγοντες που συντηρούν τις έμφυτες και προσαρμοστικές συστημάτων ανοσοποιητικού, περιλαμβανομένων των IL-6 [5] και ΤΝΡ-α [6], θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάπτυξη και την ανάπτυξη της νεοπλασίας του παχέος εντέρου. NF-κΒ, η οποία είναι ένας από τους πολλούς μεταγενέστερους στόχους του TNF ενεργοποίηση του υποδοχέα 1, είναι πιθανό να διαδραματίσει εξέχοντα ρόλο στην κολίτιδα που σχετίζεται με ογκογένεση, διότι ανώμαλη ενεργοποίηση του NF-κΒ ανιχνεύθηκε σε & gt? Το 50% των ορθοκολικού και όγκων κολίτιδα σχετιζόμενη και μελέτες ποντικού [7]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ένα συναρπαστικό ρόλο της φλεγμονής στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου.

Φυσικό φλαβονοειδή είναι ευρέως διαδεδομένα στη διατροφή του ανθρώπου και τα φυτά, περιλαμβάνουν όλα τα εσπεριδοειδή, βατόμουρα, μαϊντανό, κρεμμύδια, μαύρο τσάι, πράσινο τσάι, κόκκινο το κρασί και οι μπανάνες [8]. Αυτές οι ενώσεις είναι ουσίες χαμηλού μοριακού βάρους που βασίζονται σε μια κοινή δομή τριών δαχτυλίδι με διαφορετικές αντικαταστάσεις [9]. Δεδομένου ότι το γαλλικό παράδοξο άφησε την εντύπωση ότι πολλά από χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης της Γαλλίας καρδιακής νόσου που σχετίζονται με τα υψηλά επίπεδα της χώρας κατανάλωση κόκκινου κρασιού, φλαβονοειδή από το κόκκινο κρασί έχουν γίνει το επίκεντρο της έρευνας για τον καρκίνο μελέτες [10]. Οι πιθανές ευεργετικές ιδιότητες των φλαβονοειδών περιλαμβάνουν αντιοξειδωτικό, αντιαθηροσκληρωτική, αντι-φλεγμονώδη, αντιθρομβογόνων, antiosteoporotic, και αντι-ιικά αποτελέσματα [10]. Πρόσφατα, τα αποτελέσματα κατά του όγκου των φλαβονοειδών έχουν επίσης αναγνωριστεί [11]. Πολλά φλαβονοειδή, όπως quercetin [12], η σιλυμαρίνη [13] και λουτεολίνη [14], ασκούν αντικαρκινική δράση έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα φλαβονοειδή είναι ενθαρρυντικά παράγοντες για την πρόληψη του καρκίνου και απαιτούν περαιτέρω μελέτη. Τα φλαβονοειδή είναι φαινυλ-υποκατεστημένο χρωμόνες (παράγωγα βενζοπυρανίου) που αποτελούνται από ένα βασικό σκελετό 15-άνθρακα (C6-C3-C6) (Εικ 1Α) με έναν χρωμαν (C6-C3) πυρήνας (ο δακτύλιος βενζο Α και ο ετεροκυκλικός δακτύλιος C) και με μια ομάδα φαινυλ (ο αρωματικός δακτύλιος Β) κανονικά υποκατεστημένο στη θέση 2 [15]. Τα τελευταία χρόνια, wogonin, το οποίο είναι ένα φλαβονοειδές, έχει λάβει αυξανόμενη προσοχή για αντικαρκινική δράση της στην ηπατώματος [16], καρκίνωμα του μαστού [17], γαστρικού καρκίνου [18], τραχηλικό καρκίνωμα [19], και λευχαιμία [20, 21] . Πολλά παράγωγα wogonin έχουν συντεθεί για να έχουν καλύτερη διαλυτότητα στο νερό και druggability, και κάποιες από αυτές συντίθενται παράγωγα έδειξαν πιθανές επιδράσεις κατά του όγκου. Για παράδειγμα, LYG-202, το οποίο είναι ένα παράγωγο wogonin, επάγει απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος HepG2 μέσω επαγωγής της ROS-μιτοχονδρίων μονοπάτι [22]. LYG-202 επίσης προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε ανθρώπινα κύτταρα ορθοκολικού καρκινώματος HCT116 μέσω της ρύθμισης της ρ53 και p21WAF1 /Cip1 [23]. Ένα άλλο παράγωγο wogonin, LW-214, έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού MCF-7 από κάτω ρύθμιση Τγχ-1 και με την ενεργοποίηση του μονοπατιού ΙΝΚ, τελικά επαγωγή μιτοχόνδρια απόπτωση που διαμεσολαβείται [24]. Σε αυτήν την εργασία, εστιάσαμε στην LZ-207, το οποίο είναι ένα πρόσφατα συντεθεί φλαβονοειδών με δομή παρόμοια με εκείνη του wogonin. Μια ομάδα μεθόξυ στην LZ-207 υποκαθίσταται στην 6′-θέση, και μία υποκατάσταση πιπεραζίνης παρουσιάζεται στο 7′-θέση (βλέπε Σχήμα 1Β). Αυτές οι υποκαταστάσεις βελτιώσει τη διαλυτότητα στο νερό (Πίνακας 1) και druggability του LZ-207 σε σύγκριση με άλλες φλαβονοειδών μέλη της οικογένειας. Ως εκ τούτου, μας ενδιαφέρει κατά την εξέταση των επιπτώσεων των όγκων του LZ-207 για καρκίνους κολίτιδα σχετιζόμενη και αποκαλύπτοντας τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των φλεγμονωδών κυττάρων και καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή την εργασία, μελετήσαμε τις ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις του LZ-207 σε κύτταρα HCT116 και τα ανασταλτικά αποτελέσματα του LZ-207 επί των φλεγμονωδών διεργασιών σε ΤΗΡ-1 μονοκύτταρα. Εξετάσαμε επίσης τα ανασταλτικά αποτελέσματα της LZ-207 επί της φλεγμονώδους απόκρισης που προκαλείται από την καλλιέργεια HCT116 κυττάρων με LPS επαγόμενη ανθρώπινα κύτταρα μονοκυττάρων ΤΗΡ-1.

(Α) Χημική δομή του σκελετού φλαβόνης 15-άνθρακα. (Β) Χημική δομή του LZ-207 (C

26Η

32N

2O

6, MW = 468,5421).

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

LZ-207 (καθαρότητα & gt? 99%), το οποίο ελήφθη από τον Dr. Zhiyu Li (Κίνα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου, Κίνα), διαλύθηκε σε DMSO σε 0,1 Μ ως διάλυμα αποθέματος και αποθηκεύεται στους -20 ° C. LZ-207 είχε πρόσφατα αραιωμένου με μέσο κυτταρικής καλλιέργειας σε διαφορετικές τελικές συγκεντρώσεις πριν από κάθε πείραμα. Η τελική συγκέντρωση DMSO δεν υπερέβη το 0,1% και δεν είχε επιδράσεις στην κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση.

Οι λιποπολυσακχαρίτες (LPSs), 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) και 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (ϋΑΡΙ) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Ένα αννεξίνη V-FITC κιτ ανίχνευσης απόπτωσης, μια δοκιμασία χημειοφωταύγειας μετατόπισης ηλεκτροκίνησης (EMSA) σετ, και ανθρώπινης IL-1β και IL-6 συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) σετ αγοράσθηκαν από Bender MEDSYSTEMS Co., Ltd. (Burlingame, CA, USA), Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας (Nanjing, Κίνα), και KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Κίνα), αντίστοιχα.

Το πρώτο αντίσωμα β-ακτίνης λήφθηκε από Boster Βιολογική Technology, Ltd . (Wuhan, Κίνα) και χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1: 20.000. Πρωτογενής Akt, Bax, κασπάσης-3, κασπάσης-8, κασπάσης-9, ΕΚΚ, ΙκΒα, ΝΡ-κΒ, JNK, ρ38, ρ-Akt, ρ-ERK, ρ-ΙΝΚ, αντισώματα ρ-ρ38 ελήφθησαν από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) και χρησιμοποιήθηκαν όλα σε αραίωση 1: 500. Πρωτογενής Bcl-2, ΙΚΚα /β, PARP, ρ-ΙΚΚα /β, ρ-ΙκΒα αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA) και χρησιμοποιήθηκαν όλα σε αραίωση 1: 1000. IRDye 800-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα ελήφθησαν από την Rockland, Inc. (Philadelphia, ΡΑ, USA) και χρησιμοποιήθηκαν σε μια 1:. Αραίωση 15.000

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο κόλου HCT116 καρκινώματος κύτταρα, τα ανθρώπινα ορθοκολικό καρκίνο και SW1116 ΗΤ29 κύτταρα, τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας HUVEC, φυσιολογικές ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα MRC5 κυττάρων και ανθρώπινης οξείας μονοκυτταρικής λευχαιμίας ΤΗΡ-1 κύτταρα ελήφθησαν από την κυτταρική τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Shanghai, Κίνα). HCT116, ΗΤ29, SW1116, HUVEC, MRC5 και ΤΗΡ-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε είτε μέσου McCoy 5Α ή ϋΜΕΜ μέσο (Gibco, Invitrogen Corporation, ΝΥ, USA). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco, Invitrogen Corporation, ΝΥ, USA), 100 U /ml βενζυλική πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε ρΗ 7.4, και τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μια CO

2 θερμοκοιτίδα (Θέρμο Forma, Thermo Fisher Scientific, Inc., ΜΑ, USA) με μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C [25, 26].

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Τα κύτταρα SW1116, ΗΤ29 κύτταρα, κύτταρα HCT116, τα κύτταρα HUVEC, MRC5 κύτταρα και κύτταρα ΤΗΡ-1 καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων με 100 μΙ του κατάλληλου μέσου σε μία βέλτιστη πυκνότητα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις LZ-207 και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 για 24, 48 και 72 ώρες. Ακολούθως, 20 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C με 5% CO

2 για άλλες 4 ώρες. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα απορρίφθηκαν, και 100 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες ανακινήθηκαν για 2 λεπτά για να εξασφαλιστεί η πλήρης διαλυτότητα των κρυστάλλων φορμαζάνης, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με βάση την μιτοχονδριακή μετατροπή του ΜΤΤ προς φορμαζάνη. Η απορρόφηση (Α) μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας μια καθολική Microplate Reader (EL800, BioTek Instruments Inc.). Η αναλογία αναστολής (%) και το ποσοστό επιβίωσης (%) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες εξισώσεις:

A

κατεργασμένης και Α

ελέγχου ήταν οι μέσες τιμές απορρόφησης των τριών παράλληλων πειραμάτων από την αγωγή και τον έλεγχο ομάδες, αντίστοιχα.

το IC

50, η οποία είναι η συγκέντρωση που προκάλεσε 50% αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων, υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την μέθοδο logit [24].

δοκιμασία χρώσης ϋΑΡΙ

πυρήνες κυττάρων απεικονίστηκαν με χρώση ϋΑΡΙ, που εκπέμπει μπλε φθορισμού κατά τη σύνδεση με το ΑΤ περιοχές του DNA, για την ανίχνευση οποιασδήποτε μορφολογικά στοιχεία της απόπτωσης. Μετά LZ-207 αγωγή για 24 ώρες, τα κύτταρα HCT116 σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 0,3% Triton Χ-100 για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού πλύθηκαν δύο φορές με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με DAPI (1 μg /ml) για 10 λεπτά και στη συνέχεια παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Olympus, Japan) με κορυφή μήκος κύματος διέγερσης 340 nm [27].

αννεξίνης V /PI διπλή χρώση ανιχνεύσεως

η απόπτωση με τη μεσολάβηση θάνατος κυττάρων όγκου εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μια μέθοδο διπλής χρώσης με επισημασμένο με FITC Annexin V /PI Apoptosis Detection Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. HCT116 κυττάρων σε μέσο McCoy 5Α που περιέχει 10% FBS, καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε μια άνετη πυκνότητα για 24 ώρες. Μετά LZ-207 κατεργασία (5, 10, ή 20 μΜ) για άλλες 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS, και μετά επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης. Στη συνέχεια, 5 μΐ αννεξίνης V και 5 μΙ ΡΙ προστέθηκαν διαδοχικά σε κάθε σωλήνα, αναμίχθηκαν απαλά και διατηρήθηκαν σε πάγο για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Η απόκτηση δεδομένων και ανάλυση εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας μια ροή Becton Dickinson FACS Calibur κυτταρόμετρο με FlowJo 7 λογισμικό με διέγερση /εκπομπή στα 488/530 nm. Το αριστερό κάτω τμήμα των fluorocytograms (An-, ΡΙ-) αντιπροσωπεύει φυσιολογικά κύτταρα, το δικαίωμα κάτω τμήμα των fluorocytograms (Ένα +, ΡΙ-) αντιπροσωπεύει αρχές και τα μέσα-αποπτωτικά κύτταρα, και το δεξιό άνω τμήμα των fluorocytograms (Ένα +, ΡΙ +) αντιπροσωπεύει τέλη αποπτωτικών κυττάρων [28, 29].

δυναμικό (ΔΨm) αξιολόγηση

Το μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό () αλλαγές ΔΨm μιτοχονδριακή διαμεμβρανική θα μπορούσε να υποδεικνύεται από τον JC-1, μια φθορίζουσα χρωστική ουσία από keygen JC-1 απόπτωση Detection Kit (Κίνα). Μετά LZ-207 (5, 10, ή 20 μΜ) αγωγή για 24 ώρες, τα κύτταρα HCT116 συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, επαναιωρήθηκαν σε JC-1 ρυθμιστικό εργασίας. Μετά από επώαση στους 37 ° C με 5% CO

2 για 30 λεπτά, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα επώασης και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και το λογισμικό FlowJo 7 με τις ρυθμίσεις του FL1 (FITC, πράσινο) και FL2 (ΡΙ, κόκκινο ) [30].

Παρασκευή των μιτοχονδρίων και κυτοσολικά κλάσματα

Το μιτοχονδριακό και κυτοσολικά κλάσματα από κύτταρα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης keygen μιτοχόνδρια (Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά LZ-207 (5, 10, ή 20 μΜ) αγωγή για 24 ώρες, τα κύτταρα HCT116 συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, επαναιωρήθηκαν σε κρύο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, και ομογενοποιήθηκαν σε πάγο νερού με ένα σφιχτό γουδοχέρι. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε μέσο ρυθμιστικού διαλύματος και φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στους 4 ° C (1200 g). Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και φυγοκεντρήθηκε και πάλι για 10 λεπτά στους 4 ° C (7000 g) για να ληφθούν οι μιτοχόνδρια (pellet) και κυτοσόλιο (υπερκείμενο) κλάσματα. Μιτοχόνδρια και κυτοσόλιο κλάσματα των κυττάρων HCT116 αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C [31].

ανοσοφθορισμού

κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες σε πλάκες 6 φρεατίων για 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με LZ -207 (5, 10, ή 20 μΜ), με ή χωρίς LPS (10 μg /ml) για άλλες 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS για 5 λεπτά η κάθε μία, σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά, ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS για 5 λεπτά η κάθε μία, διαπερατά με 0,3% Triton Χ-100 για 20 λεπτά, αποκλείστηκαν με 5 % BSA για 60 λεπτά και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα ΝΡ-κΒ (αραιωμένο 1: 200) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από ξέπλυμα τρεις φορές με PBS που περιέχει 0,01% Tween 80 για 5 λεπτά η κάθε μία, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-επισημασμένο αντίσωμα δευτερογενούς γίδινου αντι-ποντικού IgG (1: 100) σε 37 ° C για 1 ώρα στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS για 5 λεπτά το καθένα και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ. Οι εικόνες συλλήφθηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο της Olympus FV1000 [32].

Παρασκευή προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου και εκχυλίσματα κυτταρολύματος και πυρήνων

Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε περίπου 80-90% συρροή και κατεργάζεται με LZ-207 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις με ή χωρίς LPS (10 μg /ml) για 24 ώρες. Το σύνολο κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. εκχυλίσματα πυρήνων και κυτταρολυμάτων πρωτεΐνη παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Nuclear /κυτοσόλιο κλασματοποίηση σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή τροποποιημένο παρακάτω. Μετά από πλύσιμο δύο φορές με PBS, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωλήνες με PBS με απόξεση με ξέστρο κυττάρων και φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στους 4 ° C (600 g). Στη συνέχεια, αφαιρέθηκε το υπερκείμενο, επαναιωρήθηκαν απαλά το κυτταρικό ίζημα με κυτοσολικό ρυθμιστικό εκχύλισης και επωάστηκε το εναιώρημα αυτό σε πάγο για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 15 λεπτά φυγοκέντρηση στους 4 ° C (14.000 g). Το υπερκείμενο (κυτοπλασμικό κλάσμα) μεταφέρθηκε προσεκτικά σε ένα καθαρό, προ-ψύξη του σωλήνα και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μεταγενέστερη χρήση. Στη συνέχεια, ο ίδιος όγκος ρυθμιστικού εκχύλισης κυτοσολικής προστέθηκε στο σφαιρίδιο και πάλι, και τα ίδια στάδια επαναλήφθηκαν όπως προηγουμένως, εκτός του ότι το υπερκείμενο απορρίφθηκε τελευταία. Το πυρηνικό δισκίο εναιωρείται εκ νέου σε ρυθμιστικό διάλυμα πυρηνικής εκχύλισης, διατηρήθηκε επί πάγου για 30 λεπτά, και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για 15 λεπτά στους 4 ° C (12.000 g). Το υπερκείμενο (εκχύλισμα πυρηνική πρωτεΐνη) μεταφέρθηκε προσεκτικά σε ένα καθαρό, προ-ψύξη του σωλήνα και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C [33].

EMSA

πυρηνικές πρωτεΐνες HCT116 κυττάρων εκχυλίστηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως. EMSA εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετατόπισης γέλης μη-ραδιενεργά (βιοτίνη επισημασμένο) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές συντέθηκαν, ανόπτηση, και η επισήμανση με χρήση βιοτίνης 3′-άκρο κιτ επισήμανσης DNA (Pierce). Ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, παρασκευασμένα σύμπλοκα ΟΝΑ-πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε μη μετουσιωτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 6% σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα 0.5 χ Τρις-βορικού-ΕϋΤΑ σε 380 mA για 1 ώρα και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νάιλον. Τέλος, η μετατόπιση γέλη του επισημασμένου με βιοτίνη DNA οπτικοποιήθηκε με χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υπέρυθρης Bio-Rad και χημειοφωταύγειας EMSA kit [34].

Western ανάλυση κηλίδος

Το σύνολο κυτταρολύματα και κυτοσολίου και πυρηνικά εκχυλίσματα από επεξεργασμένα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία BCA με Varioskan πολύτροπη μικροπλάκας φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, ΜΑ, USA) στα 562 nm. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης δείγματα παρασκευάστηκαν, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη (NC) μεμβράνες. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 1% BSA σε PBS στους 37 ° C για 1 ώρα και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με IRDye 800-συζευγμένο δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα στους 37 ° C. Η ανίχνευση έγινε με το Infrared System Οδύσσεια απεικόνισης (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA). Όλες οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-β-ακτίνης να εξακριβωθεί ίση φόρτωση πρωτεϊνών [35].

κυτοκίνης ποσοτικός προσδιορισμός με ELISA

Ανθρώπινο IL-6 και IL-1β κιτ ELISA χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση των εκκρινόμενων IL-6 και IL-1β κυτοκινών στα υπερκείμενα των κατεργασμένων κυττάρων ΤΗΡ-1. Τα κύτταρα ΤΗΡ-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με LZ-207 (5, 10, ή 20 μΜ), με ή χωρίς LPS (10 μg /ml). Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα επίπεδα κυτοκίνης που εκφράζονται σε pg /ml. Οι κυτοκίνες δεν ανιχνεύθηκαν στο φρέσκο ​​μέσο που χρησιμοποιείται για καλλιέργεια αυτά τα κύτταρα [36].

εκχύλιση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR) δοκιμασία

Ολικό RNA από επεξεργασμένα κύτταρα ΤΗΡ-1 εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας μια μέθοδο φαινόλης /χλωροφορμίου με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ίσες ποσότητες mRNA, και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) εκτελέστηκε ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κιτ Takara (Takara, Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan). cDNA επίσης συλλέγονται για πραγματικού χρόνου ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (qRT-PCR), η οποία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός Chromo4instrument (Bio-Rad, Berkeley, CA, USA) με SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA). Η σχετική ποσότητα του mRNA στόχου προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο της συγκριτικής κύκλος κατωφλίου (Ct) με κανονικοποίηση τιμές στόχου mRNA Ct σε αυτές τις τιμές για β-ακτίνη (△ Ct) [37]. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής:

IL-6-sense: 5′-TGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG-3 ‘?

IL-6-αντινόημα: 5′-TACATTTGCCGAAGAGCC-3′?

IL-1β-νόημα: 5′-AGGCTGCTCTGGGATTC-3 ‘?

IL-1β-αντίθετης φοράς: 5′-GCCACAACAACTGACGC-3′?

β-ακτίνης νόημα: 5′-CTGTCCCTGTATGCCTC Τ-3 ‘?

β-ακτίνης-αντίθετης φοράς: 5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′

Συν-καλλιέργεια των κυττάρων HCT116 με κύτταρα ΤΗΡ-1

κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 4 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε περίπου 80% συρροή. κύτταρα ΤΗΡ-1 συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (600 g για 10 λεπτά, πλύθηκαν, και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 2 × 10

5 κύτταρα /ml) και προστίθεται στα κύτταρα HCT116. Στη συνέχεια, το σύστημα συν-καλλιέργειας αφεθεί χωρίς θεραπεία, ενεργοποιημένα με LPS, ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με LZ-207 μαζί με LPS. Μετά από 24 ώρες, το σύστημα συν-καλλιέργειας σταμάτησε, και τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας απομακρύνθηκαν. Τα κύτταρα HCT116 πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS (ρΗ = 7.4), και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ΜΤΤ όπως περιγράφεται παραπάνω [38, 39].

επιδράσεις κατά του όγκου επί HCT116 γυμνούς ποντικούς ξενομοσχευμάτων

το πείραμα των ζώων έγινε με βάση την τυπική διαδικασία που θεσπίστηκε από το κράτος Food and Drug Administration (SFDA) στην Κίνα. Αθυμικοί BALB /c γυμνά ποντίκια, θηλυκό, 35-42 ημερών με βάρος που κυμαίνεται από 18 έως 22 g ελήφθησαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο του Materia Medica, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Οι χωρίς ειδικό παθογόνο γυμνά ποντίκια τέθηκαν σε ελεγχόμενο περιβάλλον (23 ± 2 ° C, 55 ± 5% υγρασία, 12 ώρες φωτός + 12h σκοτάδι /ημέρα) και τρέφονται με πρότυπη εργαστηριακή τροφή και νερό. 1 × 10

6 κύτταρα HCT116 εγχύθηκαν εντός του δεξιού μασχάλη κάθε γυμνών ποντικών για τη δημιουργία του ζωικού μοντέλου. Μετά από 12 ημέρες, δαγκάνες μικρόμετρο χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του μεγέθους του όγκου. Επελέγησαν Γυμνά ποντίκια με παρόμοιο όγκο του όγκου και τυχαία χωρίζονται σε 5 ομάδες: 0.9% ομάδα ελέγχου με φυσιολογικό ορό (12 γυμνά ποντίκια), 5-FU 30 mg /kg ομάδα θετικού (6 γυμνούς ποντικούς), LZ-207 20 mg /kg ομάδα ( 6 γυμνούς ποντικούς), LZ-207 /kg ομάδα 10 mg (6 γυμνούς ποντικούς) και LZ-207 /ομάδα kg 10 mg (6 γυμνούς ποντικούς). Η γυμνά ποντίκια έλαβαν ενδοφλέβια ένεση κάθε τρεις ημέρες. Ο όγκος του όγκου και το σωματικό βάρος μετρήθηκαν επίσης κάθε τρεις ημέρες. Μετά τη θεραπεία 21 ημέρες, όλοι οι γυμνοί ποντικοί θανατώθηκαν, συλλέχθηκε περιφερικό αίμα? όγκοι αφαιρέθηκαν και σταθμίζονται? καρδιά, το συκώτι, η σπλήνα, οι πνεύμονες και τα νεφρά διαχωρίστηκαν. Ο όγκος του όγκου (TV) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: Τηλεόραση (mm

3) = D /2 × δ

2, όπου D και D είναι η μεγαλύτερη και η μικρότερη διάμετρο του όγκου, αντίστοιχα [27].

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) από πειράματα εις τριπλούν πραγματοποιήθηκαν κατά παράλληλο τρόπο, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Όλες οι συγκρίσεις των δεδομένων έγιναν με τη χρήση του Student

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ και θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε *

P

& lt? 0.05 και **

P

& lt? 0.01.

Αποτελέσματα

LZ-207 αναστέλλει κύτταρο όγκου βιωσιμότητα

προσδιορισμοί ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η επίδραση των διαφόρων συγκεντρώσεων του LZ-207 στην κυτταρική βιωσιμότητα των καρκινικών κυτταρικών σειρών (SW1116, ΗΤ29 και κύτταρα HCT116), καλοήθεις κυτταρικές γραμμές (HUVEC και MRC5 κύτταρα) και κύτταρα ΤΗΡ-1. Μετά από θεραπεία 48 ώρες, LZ-207 ανέστειλε αποτελεσματικά την βιωσιμότητα του SW1116, ΗΤ29 και κύτταρα HCT116 (Σχήμα 2Α), με IC

50 τιμές των 25,1 ± 0,86, 39,5 ± 1,13, και 13,2 ± 1,49 μΜ, αντίστοιχα ( Σχήμα 2Β). Όπως φαίνεται στο Σχ 2C, κύτταρα HCT116 εμφάνισαν χρόνου και εξαρτώμενη από τη δόση της ευαισθησίας προς LZ-207. Τα IC

50 τιμές για 24, 48 και 72 ώρες LZ-207 θεραπείες σε κύτταρα HCT116 ήταν 19,81 ± 0,75, 14,58 ± 0,42 και 9,32 ± 0,50 μΜ, αντίστοιχα (Εικόνα 2D). Ως εκ τούτου, η HCT116 κυτταρική γραμμή επελέγη για όλα τα μετέπειτα πειράματα χρησιμοποιώντας 5, 10 και 20 μΜ LZ-207 θεραπείες για 24 ώρες. Τρεις δόσεις LZ-207 έδειξε επίσης καμία εμφανή επίδραση στο ρυθμό επιβίωσης των καλοήθων κυττάρων και ΤΗΡ-1 κύτταρα, τα οποία θα χρησιμοποιηθούν στο σύστημα συν-καλλιέργειας παρακάτω.

(Α) Η ανασταλτική επίδραση ενός 48 h θεραπεία με LZ-207 για SW1116, ΗΤ29 και κύτταρα HCT116. (Β) IC

50 αξίες μιας θεραπείας 48 ώρες με LZ-207 στην SW1116, ΗΤ29 και κύτταρα HCT116. (Γ) Κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις LZ-207 για 24, 48 και 72 ώρες. (D) IC

50 τιμές των 24, 48 και 72 ώρες LZ-207 θεραπείες σε κύτταρα HCT116. (Ε) Το ποσοστό επιβίωσης μιας θεραπείας 48 ώρες με LZ-207 επί HUVEC και MRC5 κύτταρα. (F) Το ποσοστό επιβίωσης μιας θεραπείας 48 ώρες με LZ-207 σε κύτταρα ΤΗΡ-1. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (η = 3).

Η

LZ-207 επάγει απόπτωση σε κύτταρα HCT116

Η μορφολογία των κυττάρων HCT116 μεταβλήθηκε σημαντικά μετά από 24 ώρες θεραπεία με LZ-207. Για να εξεταστεί κατά πόσον LZ-207 απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα HCT116, χρώση DAPI χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση πυρηνικών αλλαγών. μικροσκοπία φθορισμού έδειξε ότι τα κύτταρα μάρτυρες ομοιόμορφα χρωματίζονται με μπλε φθορισμό, επιδεικνύοντας την τυπική ομοιογενής κατανομή της χρωματίνης στο πυρηνίσκο. Αντιθέτως, κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με LZ-207 εκπέμπεται ένα λαμπρότερο φθορισμό, η οποία είναι ενδεικτική της πρώιμη απόπτωση λόγω της συμπύκνωσης της χρωματίνης και nucleolus πύκνωση (Σχήμα 3Α).

κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5, 10 ή 20 μΜ LZ-207 για 24 ώρες. (Α) μορφολογικές αλλαγές του πυρηνίσκου παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού (400 Χ). Τα κύτταρα εξετάστηκαν για την παρουσία αποπτωτικών σωμάτων και της πυρηνικής πύκνωση. (Β) αννεξίνη V /PI διπλή δοκιμασία χρώση των κυττάρων HCT116. Η

Υ-άξονα

δείχνει το PI-επισημασμένο πληθυσμού, και το

X

-άξονα δείχνει τα σημασμένο με FITC Αννεξίνη V-θετικά κύτταρα. (Γ) Τα αποπτωτικά ποσοστά των κυττάρων HCT116 που επάγεται από LZ-207. (D) κηλίδωση Western ανάλυση της PARP, Bax, Bcl-2, procaspase-3, procaspase-9, και procaspase-8 σε κύτταρα HCT116 που έλαβαν θεραπεία με LZ-207. ανάλυση (E-G) πυκνομετρική αντιπροσωπεύει τη σχετική μεταβολή φορές σε έκφραση πρωτεΐνης. (H-I) Η αλλαγή του ΔΨm ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας χρώση JC-1 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής σε LZ-207 αγωγή HCT116 κύτταρα. ανάλυση (J-K) Western blot του κυτοχρώματος c στα μιτοχόνδρια και κυτοσόλιο σε LZ-207 αγωγή HCT116 κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (η = 3). *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01, σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Η

LZ-207-επαγόμενη απόπτωση στα κύτταρα HCT116 περαιτέρω επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες χρώσης /ΡΙ Annexin V. Μετά την αγωγή με 5, 10, ή 20 μΜ LZ-207 για 24 ώρες, οι πρώιμες αποπτωτικά ποσοστά στον έλεγχο και τα επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 ήταν 4.35, 10.21, 14.76, και 22.14%, αντίστοιχα, και τα τέλη της αποπτωτικά ποσοστά ήταν 3,76, 9,75, 21.78, και 26.79%, αντίστοιχα (Σχ 3Β και 3C). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η θεραπεία LZ-207 επάγει τόσο νωρίς και αργά απόπτωσης σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο.

κηλίδες Western έδειξαν ότι το επίπεδο πρωτεΐνης διασπασμένης ΡΑΚΡ αυξήθηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις LZ-207, ενώ το επίπεδο της πρωτεΐνης άθικτων PARP μειώθηκε, επιβεβαιώνοντας την ικανότητα του LZ-207 για να επάγει απόπτωση ως μέρος του όγκου αποτέλεσμα του σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3D και 3Ε). Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση Bcl-2 μειώθηκαν μετά κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με LZ-207 για 24 ώρες, ενώ η αυξημένη έκφραση Bax, που οδηγεί σε σημαντική αύξηση του λόγου Ββχ /Bcl-2 (Σχ 3F). Διαπιστώσαμε επίσης ότι procaspase-3 και procaspase-9 έκφραση μειώθηκε σημαντικά μετά την αγωγή LZ-207, υποδεικνύοντας ότι αυτή η μιτοχονδριακή μονοπάτι μπορεί να εμπλέκεται σε LZ-207-επαγόμενη απόπτωση (Σχήμα 3G). Κατά τη διάρκεια της μιτοχονδρίων-μεσολαβούμενη απόπτωση, αποπόλωση του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού (ΔΨ) που συνοδεύεται από την απελευθέρωση κυτοχρώματος c από μιτοχονδριακή στο κυτοσόλιο, το οποίο ενεργοποιεί ένα κασπάση-εξαρτώμενη απόπτωση. Υπήρχε μια προφανής αύξηση του πράσινου φθορισμού της JC-1 μονομερή στην LZ-207 αντιμετωπίζονται HCT116 κύτταρα, υποδεικνύοντας αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό (ΔΨm) (Εικ 3η και 3θ). Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση του Cyt-c μειώθηκε στα μιτοχόνδρια, ενώ αυξήθηκε στο κυτταρόπλασμα σε LZ-207 αντιμετωπίζονται HCT116 κύτταρα (Σχήμα 3J και 3K). Εν τω μεταξύ, η ελαφρά υποβάθμιση των procaspase-8 πρότειναν ότι μια εξωγενή οδό της απόπτωσης μπορεί επίσης να συσχετίζονται με LZ-207-επαγόμενη απόπτωση (Σχήμα 3G).

Ανασταλτική δράση του LZ-207 επί επαγόμενη από LPS ΝΡ-κΒ ρ65 ενεργοποίηση σε κύτταρα HCT116

Η οικογένεια ΝΡ-κΒ των παραγόντων μεταγραφής ρυθμίζει την έκφραση πολλαπλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων που σχετίζεται με φλεγμονή. Έτσι, η κακή ρύθμιση του NF-κΒ σηματοδότηση είναι ένας δείκτης της ανάπτυξης του καρκίνου. Χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ανοσοφθορισμού συνεστιακή (Σχήμα 4Α), παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία LZ-207 ανέστειλε ΝΡ-κΒ ρ65 πυρηνική μετατόπιση σε κύτταρα HCT116. Εμείς ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα του ΝΡ-κΒ ρ65 στον πυρηνικό κλάσμα του LZ-207 επεξεργασμένα HCT116 κύτταρα μέσω ανάλυσης στυπώματος Western, η έκφραση του πυρηνικού NF-κΒ αυξάνεται με 10 μg /ml αγωγή LPS σε κύτταρα HCT116, όπως φαίνεται στο Σχ 4Β και 4C? Ωστόσο, αυτή η επαγόμενη από LPS ΝΡ-κΒ πυρηνική μετατόπιση κατεστάλη με επεξεργασία LZ-207. Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες EMSA, αποδείξαμε επίσης ότι LZ-207 κατέστειλε προκαλούμενη από LPS δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 4D).

κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς LZ- 207 παρουσία LPS για 1 ώρα. Μετά την απομόνωση των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων, (Α) Τα επίπεδα του ΝΡ-κΒ ρ65 προσδιορίσθηκαν με ανοσοφθορισμό, και (Β-Ο) ΝΡ-κΒ ρ65 μετατόπιση μετρήθηκε μέσω κηλίδωση Western. (D) LZ-207 κατέστειλε προκαλούμενη από LPS δραστικότητα δέσμευσης του ΝΡ-κΒ DNA σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο, όπως ανιχνεύεται μέσω προσδιορισμού EMSA. (Ε-Η) στύπωση Western ανάλυση της φωσφορυλίωσης του ΙκΒ και ΙΚΚ σε κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με ή χωρίς LZ-207 παρουσία LPS για 1 ώρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD (η = 3). *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01, σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Η

Επειδή ΝΡ-κΒ αποτελέσματα ενεργοποίησης από την ταχεία φωσφορυλίωση, ουβικιτινίωση, και, τελικά, πρωτεολυτική αποικοδόμηση του ΙκΒ, εξετάσαμε την επίδραση της LZ-207 επί της έκφρασης φωσφορυλιωμένη ΙκΒα σε επαγόμενη από LPS HCT116 κύτταρα μέσω στυπώματος Western. LZ-207 ανέστειλε σημαντικά την φωσφορυλίωση ΙκΒα σύγκριση με τον έλεγχο, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση πρωτεΐνης ΙκΒα (Σχ 4Ε και 4ΣΤ). Επειδή αποικοδόμηση της ΙκΒ εξαρτάται πρωτίστως από την ενεργοποίηση ΙΚΚ συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της LZ-207 στην ενεργοποίηση ΙΚΚ και διαπίστωσε ότι LZ-207 κατέστειλε σημαντικά επαγόμενη από LPS ΙΚΚα /β φωσφορυλίωση σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 4G και 4Η).

LZ-207 αναστέλλει οδών ανοδικά του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε HCT116 κύτταρα

Cells ανιχνεύουν αλλαγές στο περιβάλλον τους μέσω της ενεργοποίησης του οδών μεταγωγής σήματος που άμεσα βιοχημικά προγράμματα να μεσολαβήσει πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Το ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) οικογένεια και Akt μονοπάτια σηματοδότησης μπορεί να ρυθμίσει αυτές τις θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες μέσω της επαγωγής του ΙΚΚ-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ. Εξετάσαμε την έκφραση των παραγόντων ανάντη της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ, συμπεριλαμβανομένων των ρ38 ΜΑΡΚ, ERK1 /2, JNK και Akt, μετά LZ-207 αγωγή σε επαγόμενη από LPS κύτταρα HCT116. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α και 5Β, LZ-207 ανέστειλε την επαγόμενη από LPS φωσφορυλίωση της p38 ΜΑΡΚ, ERK1 /2, JNK και Akt, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του p38 ΜΑΡΚ, ERK1 /2, JNK, και Akt δεν είχαν αλλάξει.

κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ή χωρίς LZ-207 παρουσία LPS για 1 ώρα. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt?