Αφηρημένο

Ιστορικό

Η παρεκκλίνουσα ρύθμιση των phosphatidylinositide 3-κινάσες (ΡΙ3-Κ) /Akt, AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) και στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (m-TOR ) μονοπατιών σηματοδότησης στον καρκίνο ώθησε σημαντικό ενδιαφέρον για την καταστολή αυτών των οδών για τη θεραπεία του καρκίνου. Caffeic οξύ (CA) έχει αναφερθεί ότι διαθέτει σημαντική αντιφλεγμονώδη δράση. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους τα παράγωγα CA συμπεριλαμβανομένων φαιναιθυλο καφεϊκό οξύ εστέρα (CAPE) και φαινυλπροπυλ εστέρα καφεϊκό οξύ (CapPE), ασκούν ανασταλτικές επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) έχουν ακόμη διευκρινιστεί.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

CAPE και CapPE αξιολογήθηκαν για την ικανότητά τους να ρυθμίζουν αυτά τα μονοπάτια σηματοδότησης και να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC τόσο

in vitro

και

in vivo

. αντικαρκινικές επιδράσεις αυτών των παραγώγων CA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού, ανάλυση κυτταρικού κύκλου, κηλίδωση Western δοκιμασία, δοκιμασία γονιδίου αναφοράς και ανοσοϊστοχημικές (IHC) δοκιμασίες χρώσης τόσο

in vitro

και

in vivo

. Αυτή η μελέτη αποδεικνύει ότι CAPE και CapPE εμφανίζουν μια εξαρτώμενη από τη δόση αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επιβίωση των κυττάρων CRC μέσω της επαγωγής του G

0 /G

1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και αύξηση των αποπτωτικών οδών. Κατανάλωση CAPE και CapPE ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των όγκων παχέος εντέρου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Οι μηχανισμοί δράσης περιλάμβανε διαμόρφωση της ΡΙ3-Κ /Akt, ΑΜΡΚ και m-TOR καταρράκτες σηματοδότησης και

in vitro

και

in vivo

. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα καταδεικνύουν νέους μηχανισμούς αντι-καρκίνου των παραγώγων CA κατά την ανάπτυξη των ανθρώπινων κυττάρων CRC.

Συμπεράσματα

παράγωγα CA είναι ισχυρό αντι-καρκινικών παραγόντων που αυξάνουν την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ και να προωθήσει την απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. Η δομή των παραγώγων CA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ορθολογική σχεδιασμό νέων αναστολέων που στοχεύουν ανθρώπινα κύτταρα CRC

Παράθεση:. Chiang E-PI, Tsai SY, Kuo YH, Pai ΜΗ, Chiu HL, Rodriguez RL, et al. (2014) Παράγωγα καφεϊκό οξύ αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου: Συμμετοχή της ΡΙ3-Κ /Akt και ΑΜΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης. PLoS ONE 9 (6): e99631. doi: 10.1371 /journal.pone.0099631

Επιμέλεια: Chih-Pin Chuu, Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 3, Ιούλη του 2013? Αποδεκτές: 16η του Μαΐου 2014? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Chiang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το υλικό βασίζεται σε έργο που υποστηρίζεται, εν μέρει, από το Υπουργείο Παιδείας, την Ταϊβάν, ROC στο πλαίσιο του σχεδίου ATU, επιχορήγηση Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, στο πλαίσιο των συμφωνιών NSC-100-2320-B-039-003, 100 – 2628-B005-002-MY4, 101-2320-B-039-054-my3, 101-2320- B-005-006-my3, 102 με 2911-I-005 -301, 101-2811-B-039-024, το Υπουργείο Υγείας επιχορήγησης στο πλαίσιο των συμφωνιών DOH 102-TD-B-111-004 και DOH-102- TD-C-111-005 και την Κίνα Medical University (CMU) επιχορήγηση στο πλαίσιο των συμφωνιών CMU101- Βραβείο -10, CMU100-ASIA-11, CMU101-ASIA-3, και CMU101-S-25. Οποιεσδήποτε απόψεις, τα ευρήματα, συμπεράσματα ή συστάσεις που εκφράζονται στην παρούσα έκδοση είναι του συγγραφέα (ες) και δεν απηχούν κατ ‘ανάγκη την άποψη του Υπουργείου Παιδείας, το Εθνικό Συμβούλιο Επιστήμης, Υπουργείο Υγείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Chung Hsing, Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Πανεπιστημίου της Ασίας, του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνιας Davis και η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες του καρκίνου και θνησιμότητας καρκίνου σε πολλές χώρες [1], [2]. Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, περίπου 50.000 θανάτους που αποδίδονται σε αυτόν τον καρκίνο κάθε χρόνο [1], [2]. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις του phosphatidylinositide 3-κινάση (ΡΙ3-Κ) /Akt και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) /εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενων κινάσης (ERK) μόρια που παρατηρείται συχνά σε διάφορους τύπους καρκίνου [3] , [4]. Για παράδειγμα, ογκογόνο ενεργοποίηση των μορίων ΡΙ3-Κ /Ακί ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αυξάνοντας το επίπεδο κυκλίνης D1 [5], [6]. Είναι γνωστό ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση των πρωτεϊνών κυκλίνης D1 και Cdk4 εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC [7]. Καταστολή της ΡΙ3-Κ /Akt και μονοπατιών σηματοδότησης /ERK ΜΑΡΚ οδηγεί στον αποκλεισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και καταδεικνύει τη σημασία αυτών των καταρρακτών σηματοδότησης στον έλεγχο τόσο της προόδου του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου [4], [8] . Ως εκ τούτου, η ΡΙ3-Κ /Akt και μονοπάτια ΜΑΡΚ /ΕΚΚ σηματοδότησης παίξει κυρίαρχο ρόλο στον καθορισμό της μοίρας της ανάπτυξης του όγκου. Κακοήθη καρκινικά κύτταρα αποσπώνται από τον πρωτογενή όγκο και μεταναστεύουν κατά μήκος διαρθρωτικά εμπόδια, συμπεριλαμβανομένων των μεμβρανών και τη γύρω στρωματικών εξωκυττάρια μήτρα (ECM) [9]. Όγκου εισβολή και η μετάσταση και οι δύο απαιτούν αύξηση στην έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) και την αποδόμηση του ECM [9], [10]. ΜΜΡ είναι εξαρτώμενη από ψευδάργυρο ενδοπεπτιδασών ικανού να αποδομεί ECM συστατικά [11]. Ένζυμα όπως ΜΜΡ-9 υποβαθμίσει ECM και να δημιουργήσει ένα μικροπεριβάλλον που διατηρεί την ανάπτυξη του όγκου [10], [11].

AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) είναι ένα μόριο καύσιμο ανίχνευσης που λειτουργεί ως ρυθμιστής της ισοζύγιο ενέργειας [12]. ΑΜΡΚ έχει δειχθεί ότι εκφράζεται πανταχού σε κύτταρα θηλαστικών και να εμπλέκονται στην ενεργειακή ομοιόσταση [13]. Μία αυξημένη μονοφωσφορική αδενοσίνη (ΑΜΡ) /τριφωσφορική αδενοσίνη αναλογία (ΑΤΡ), αντανακλώντας μία μείωση στην ενεργειακή κατάσταση του κυττάρου, οδηγεί στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης AMPK με φωσφορυλίωση [14]. Η αύξηση της ενεργοποίησης AMPK πιστεύεται ότι συσχετίζεται αντιστρόφως με τον κίνδυνο καρκίνου [15]. Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει περαιτέρω ότι η ενεργοποίηση της ΡΙ3-Κ /Akt και ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μόρια σηματοδότησης συνδέεται με μειωμένο επίπεδο της φωσφορυλιωμένης (ενεργοποιημένης) ΑΜΡΚ κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου [16], [17]. Πρόσθετες μελέτες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι αγωνιστές ΑΜΡΚ είναι αποτελεσματικοί στη θεραπεία του καρκίνου του [15], [18], ενώ άλλες μελέτες έδειξαν ότι η συνθάση lipogenic ένζυμο λιπαρού οξέος (FASN) ρυθμίζεται από την ενεργειακή πρόσληψη και παίζει κρίσιμο ρόλο στην καρκινογένεση [19] . Μία πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η έκφραση FASN συσχετίζεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του CRC [20]. Η φωσφορυλίωση (δηλ ενεργοποίησης) της Akt δείχθηκε ότι επάγει την έκφραση της FASN και να προκαλέσει επιθετική κακοήθεια των καρκινικών κυττάρων [21]. Αντίθετα, η θεραπεία με έναν αγωνιστή ΑΜΡΚ, που οδηγεί στην ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ, κατέστειλε την έκφραση του FASN και μπλοκάρει την ανάπτυξη ορθοκολικού όγκου [22] – [24]. Επιπλέον, επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν επίσης ότι ΑΜΡΚ (PRKAG2) πολυμορφισμό μονού νουκλεοτιδίου (SNP) σχετίζεται με τον κίνδυνο της ανθρώπινης CRC [25]. Έτσι, ΑΜΡΚ μεσολάβηση ενέργεια ομοιόσταση έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον σε αυτό το μονοπάτι, ως μέσο θεραπείας ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου.

Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι οι ενώσεις φαινολικό οξύ λειτουργούν ως ισχυρά αντιοξειδωτικά [26]. Μεταξύ αυτών, το καφεϊκό οξύ (CA) είναι ένας μη-βιταμίνη φαινολική ένωση που βρίσκεται σε μεγάλο βαθμό στα λαχανικά και τα φρούτα. Εκτός από την αντιοξειδωτική δράση της, CA ασκεί αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις σε διάφορα είδη κυττάρων [27], [28]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το καφεϊκό φαιναιθυλ οξέος (CAPE), ένα παράγωγο CA φυσικά απομονώνεται από πρόπολη μελισσών, ασκεί επίσης ευεργετικές επιδράσεις της μέσω αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις [29], [30]. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι CAPE αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και δρουν ως δυνητικό αντικαρκινικό παράγοντα [31], [32]. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία αναφορά των ανασταλτικών αποτελεσμάτων των παραγώγων CA επί της οδού των ΑΜΡΚ και /ή την έκφραση FASN κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της CRC. Επιπλέον, η έλλειψη σταθερά αποτελέσματα σε όλη πολυάριθμες μελέτες και την αποτυχία να προσδιοριστεί ο μηχανισμός δράσης των παραγώγων CA μπορεί να εξηγήσει τη δυσκολία που αποδεικνύουν το

in vivo

οφέλη της CA παράγωγο συμπληρωμάτων ενάντια CRC. Ερευνήσαμε, ως εκ τούτου, τα ανασταλτικά αποτελέσματα διαφόρων παραγώγων CA σε ανθρώπινα κύτταρα CRC τόσο

in vitro

και

in vivo

. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα παράγωγα CA όπως CAPE και φαινυλπροπυλ εστέρα καφεϊκό οξύ (CapPE) αναστέλλει σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. CAPE και CapPE που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της καταστολής των ΡΙ3 K-/Akt και mTOR μονοπάτια σηματοδότησης. Επιπλέον, τα παράγωγα CA μείωσε κυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ και κατέστειλε την έκφραση FASN. Ο μηχανισμός δράσης συνδέθηκε εν μέρει με αύξηση της οδού ΑΜΡΚ. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι τα παράγωγα CA δρουν ως παράγοντες προφύλαξης κατά της ανθρώπινης CRC, διαφοροποιώντας την οδούς σηματοδότησης ΡΙ3-Κ /Akt, mTOR και ΑΜΡΚ τόσο

in vitro

και

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κόλου HCT-116 και SW-480 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Walkersville, MD). Τα ακόλουθα μονοκλωνικά αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology, Inc .: Anti- Ν-cadherin (# 4061), ΡΤΕΝ (# 9559), αντι-φωσφορυλίωση ΡϋΚ1 (Ser241? # 3061), το σύνολο-ΡϋΚ1 (# 3062), αντι -phosphorylation Akt (S473? # 4060), το σύνολο-Akt (# 9272), αντι-φωσφορυλίωση GSK3α (S21? # 9327), σύνολο- GSK3α (4337), αντι-φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β (S9? # 9323), σύνολο- ΟδΚ3β (# 9315), αντι-φωσφορυλίωση FOXO3 (Τ32? # 9464), σύνολο- FOXO3 (# 12829), σύνολο- TSC1 (# 6935), σύνολο- TSC2 (# 3990), σύνολο- LKB1 (# 3047), σύνολο- 14-3-3 (# 8312), αντι-φωσφορυλίωση ERK 1/2 (T202 /Y204? # 9101), το σύνολο-ERK 1/2 (# 9102), αντι-φωσφορυλίωση AMPKα (T172? # 2535), σύνολο- AMPKα (# 5832), μ-TOR αντι-φωσφορυλίωσης (S2448? # 5536), το σύνολο-m-TOR (2983), αντι-FASN (# 3180), αντι-ΝΡ-κΒ (ρ65) (# 3033), αντι -Cdk4 (# 2906), αντι-ρ21

WAF /Cip1 (# 2947), αντι-κυκλίνης E (# 4132), αντι-κυκλίνης D1 (# 2978), αντι-c-myc (# 9402) και αντι -Lamin Α (# 2032) (Danvers, ΜΑ). Το αντίσωμα και η ένωση C αντι- β-ακτίνης (# A2066) (ειδικός αναστολέας του ΑΜΡΚ) αγοράστηκαν από την Sigma (St Louis, ΜΟ). Η δραστική Akt (Myr-Akt1, Addgene πλασμίδιο # 9008) και τον έλεγχο κενού φορέα (pcDNA3, Addgene πλασμίδιο # 10792) ελήφθησαν από Addgene. Το παράγοντα νέκρωσης όγκου α (ΤΝΡ-α) ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ήταν από R &? D System (Minneapolis, ΜΝ). Η πυρηνική πρωτεΐνη σετ αντιδραστηρίων Εκχύλισμα αγοράστηκε από την Pierce Biotechnology Inc. (Lackford, IL). Το κιτ δοκιμασίας ανίχνευσης φωταύγειας ΑΤΡ (κιτ ATPLite) αγοράστηκε από την Perkin Elmer Life Science (Boston, MA). Το ΝΡ-κΒ στοιχείο απόκρισης (NF-κΒ-RE) πλασμιδίου και Dual-Luciferase Reporter κιτ Δοκιμασίας αγοράστηκαν από την Promega (Madison, WI). PI (προπίδιο Ιώδιο) και αντι- πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων πυρηνικό αντιγόνο (PCNA) (# 610664) μονοκλωνικά αντισώματα αγοράστηκαν από την BD Biosciences Inc. (Franklin Lakes, NJ). παράγωγα CA, συμπεριλαμβανομένων CAPE και CapPE (Σχήμα 1) που παρέχονται από τον Δρ Γ H. Kuo (Κίνα Medical University). Αυτά τα παράγωγα CA διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε συγκέντρωση 200 mM στοκ διάλυμα και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C. Αμέσως πριν από το πείραμα, το διάλυμα αποθέματος προστέθηκε στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Τα παράγωγα CA απεικονίζεται στο Σχ. 1. (Α) CAPE και (Β) CapPE διαφέρουν στην επιμήκυνση της αλκυλικής πλευρικής αλυσίδας του εστέρα καφεϊκό οξύ.

Η

Κυτταροκαλλιέργεια

Εν συντομία, ανθρώπινα κύτταρα καλλιεργήθηκαν CRC σε 37 ° C υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 και αναπτύχθηκαν σε συρροή χρησιμοποιώντας βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS) συμπληρωμένο RPMI-1640. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται στα διάφορα πειράματα έχουν τον ίδιο αριθμό διόδου. RPMI-1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 2 mM L-γλουταμίνη και 1,5 g /L διττανθρακικό νάτριο.

Η συμπλήρωση με παράγωγα CA

Ανθρώπινα κύτταρα CRC επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 5, 10, 20, 50, και 100 μΜ) των παραγώγων CA για 2 ώρες ή 24 ώρες. Για την αποτελεσματική απορρόφηση των παραγώγων CA από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου, οι ενώσεις αυτές ενσωματώνονται σε FBS για 30 λεπτά και αναμιγνύεται με το μέσο. Στις ομάδες ελέγχου, τα κύτταρα επωάστηκαν με ισοδύναμο όγκο διαλύτη DMSO. (Τελική συγκέντρωση: 0,05% ν /ν) ως ένα όχημα φορέας

Εκτίμηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

ΜΤΤ (3- [4,5-dimethhylthiaoly] – βρωμίδιο) δοκιμασία 2,5-διφαινυλοτετραζολίου διεξήχθη για την ανίχνευση της πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ανθρώπινα κύτταρα CRC σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων, το κάθε φρεάτιο που περιέχει 1 × 10

5 κύτταρα. Μετά από 24 ώρες, το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε τα παράγωγα CA σε μία από τις πέντε συγκεντρώσεις (δηλαδή, 0, 5, 10, 20, 50 και 100 μΜ) παρουσία ή απουσία της ένωσης C. Οι επιμολύνσεις μόνιμα ενεργών Akt ( MYR-Akt1, Addgene πλασμίδιο 9008) και άδειο φορέα (pcDNA3, Addgene πλασμίδιο 10792) διεξήχθησαν με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine LTX. Κάθε συγκέντρωση ελέγχθηκε εις τριπλούν. Στο τέλος του πειράματος, μία από τις πλάκες παραλήφθηκε και φρέσκο ​​ΜΤΤ (τελική συγκέντρωση 0.5 mg /mL σε PBS) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 2 ώρες επώαση, τα μέσα καλλιέργειας απομακρύνθηκαν, 200 μL του όξινου ισοπροπανόλης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και δονείται για να διαλυθεί το καταθέτη. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 570 nm με αναγνώστη μικροπλάκας.

Ποσοτική ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κόλου CRC καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα ανά φρεάτιο. Πριν από το πείραμα, τα κύτταρα συγχρονίστηκαν με καλλιέργεια αυτών σε 0.05% FBS συμπληρωμένο RPMI-1640 για όλη τη νύχτα μέχρι CAPE ή θεραπεία CapPE. Για τη μέτρηση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CAPE ή CapPE (0, 10, 50, 100 μΜ) για επιπλέον 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αγωγή με ένα διάλυμα θρυψίνης και αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA) και αναστέλλεται με το ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (1 χ 10

5 κύτταρα /mL). Ανθρώπινα κύτταρα CRC χρωματίστηκαν με ΡΙ και αναλύθηκαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, πέντε μικρολίτρα ΡΙ προστέθηκαν στα αιωρούμενα κύτταρα και επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και αναλύθηκαν με BD FACSCanto κυτταρομετρία ροής (BD Biosciences Inc., Franklin Lakes, NJ). Τα κύτταρα ΡΙ-χρώση αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό αξεσουάρ.

Ξενομοσχεύματος implanation των καρκινικών κυττάρων

Για να καθοριστεί το μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, υποσυμβάλλουσες καλλιέργειες του καρκίνου του παχέος εντέρου HCT-116 κύτταρα είχαν φρέσκο ​​μέσο 24 ώρες πριν συλλέχθηκαν με σύντομη κατεργασία με 0.25% θρυψίνη και 0.02% EDTA. Η επεξεργασία με θρυψίνη διακόπτεται με μέσο που περιέχει 10% FBS, και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές και επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 χωρίς ορό. Μόνο μονοκύτταροι αναστολές με τη βιωσιμότητα των & gt? 90% χρησιμοποιήθηκε για τις ενέσεις

Ζώα, Διατροφή και CA Παράγωγα συμπλήρωση

Ενήλικες (ηλικίας 3-4 εβδομάδων) BALB /C ΑηΝ. -Foxn1 γυμνά ποντίκια (19-22 g) ελήφθησαν από το Εθνικό Εργαστήριο του Κέντρου ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες από το Εθνικό Κέντρο Ζώων Εργαστηρίου, σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς και πρότυπα (πρωτόκολλο ζώων αρ. 102 – 142-N). Το πρωτόκολλο χρήση ζώων που αναφέρονται παραπάνω έχει ελεγχθεί και εγκριθεί από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών ζώων σε Κίνα Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Η μελέτη των ζώων διενεργήθηκε σύμφωνα με την εθνική κατευθυντήρια γραμμή και το εγκεκριμένο πρωτόκολλο των ζώων, προκειμένου να διατηρηθεί η καλή διαβίωση των ζώων και βελτίωση ταλαιπωρία στα πειραματόζωα. Κατά τη διάρκεια ολόκληρης της πειραματικής περιόδου, οι ποντικοί τράφηκαν με τυπική δίαιτα Lab 5010 αγοράστηκε από LabDiet Inc. (St. Louis, ΜΟ, USA). Το πρότυπο δίαιτα περιέχει ακατέργαστο λίπος (13.5% ολικές διαιτητικές ενέργειας), πρωτεΐνες (27,5%) και των υδατανθράκων (59%), και δεν είχαν ανιχνεύσιμα παράγωγα CA, όπως υποδεικνύεται από τον προμηθευτή. Ποντικοί που είχαν αναισθητοποιηθεί με εισπνοή ισοφλουορανίου τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση. Οι ποντικοί ήταν υποδορίως (s.c.) ένεση με ανθρώπινη καρκίνο του παχέος εντέρου HCT-116 κύτταρα (1 χ 10

6 /0.1 ml μέσου) στο δεξί πλευρό του κάθε BALB /C Ann-Foxn1 γυμνό ποντίκι. Ένα καλά εντοπισμένη κύστης θεωρήθηκε να είναι ένα σημάδι μιας ικανοποιητικές τεχνικές ένεσης.

Μετά τον εμβολιασμό, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε τρεις υποομάδες (n = 6 ανά ομάδα). παράγωγα CA δόθηκαν στα πειραματόζωα με καθετηριασμό μία φορά την ημέρα σε έναν συνολικό όγκο 0,15 mL. Η CAPE και ομάδες CapPE κάθε λάβει μια ημερήσια δόση από το στόμα παράγωγα CA διαλύθηκε σε αραβοσιτέλαιο (4% β /β) στους 50 nmol /kg BW μία φορά την ημέρα. Η ομάδα ελέγχου έλαβε όγκου αραβοσιτέλαιο (4% β /β) μία φορά ανά ημέρα μόνο. Φυσιολογικά ποντίκια χωρίς εμβολιασμό από όγκο χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Ο όγκος του όγκου υπολογίσθηκε από τον ακόλουθο τύπο: 0.524 L1 (L2)

2, όπου L1and L2 αντιπροσωπεύουν το μακρύ και κοντό άξονα του όγκου, αντίστοιχα. BW προσδιορίστηκε μία φορά την εβδομάδα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην πρόσληψη τροφής ή το σωματικό βάρος βρέθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Στο τέλος της πειραματικής περιόδου, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με

2 εισπνοή CO? ιστοί όγκου στη συνέχεια αποκόπτονται, ζυγίζονται και καταψύχονται αμέσως. Αυτοί οι ιστοί του όγκου τμήθηκαν και χρώστηκαν με hematoxilin- ηωσίνη Mayer (H & amp? Ε) για εξέταση με οπτικό μικροσκόπιο. Τα υπόλοιπα ιστούς του ήπατος, του πνεύμονα, σπλήνα, πάγκρεας και το έντερο ήταν επίσης αποκόπηκαν, ζυγίστηκαν και καταψύχθηκαν για περαιτέρω πειράματα. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από την καρδιά σε έναν σωλήνα vacutainer 1-ml παρουσία ή απουσία ηπαρίνης και φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 1000 g για να ληφθεί πλάσματος ή ορού, αντίστοιχα.

Ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική χρώση των καρκινικών ιστών

Κατεψυγμένα ιστούς όγκων κόπηκαν σε τομές 5 μm και αμέσως σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Οι τομές χρωματίστηκαν με του Meyer αιματοξυλίνης-Ηωσίνη (Η &? Ε) για μικροσκοπία φωτός. Οι αρνητικοί έλεγχοι δεν εμφάνισαν καμία χρώση. Τρία καυτά σημεία εξετάστηκαν με τυφλό τρόπο ανά τμήμα του όγκου (πεδίο υψηλής ισχύος 200 ×) από έξι διαφορετικούς όγκους σε κάθε ομάδα. Για την ανοσοϊστοχημική χρώση, κατεψυγμένες τομές ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα του υπεροξειδίου. Η μη ειδική δέσμευση στις πρωτεΐνες αποκλείστηκε με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας (NGS) για 1 ώρα που ακολουθείται από επώαση με είτε αντι-FASN ή αντι-ΡΟΝΑ πρωτογενή αντισώματα (1:300). Τομές ιστού πλύθηκαν με 0,1 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και επωάζονται με biotinyated ανοσοσφαιρίνη G (1:300 δευτερεύον αντίσωμα) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τομές ιστού βάφτηκαν με σύμπλοκο αβιδίνης-βιοτίνης (ABC), διαμινοβενζιδίνη (DAB) και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν με αιματοξυλίνη. Απεικόνιση διεξήχθη σε 200 × μεγεθύνσεις. Εικόνες των τμημάτων του όγκου αποκτήθηκαν σε Όλυμπο BX-51 μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας ένα Olympus DP-71 ψηφιακό σύστημα φωτογραφικής μηχανής και απεικόνισης (Όλυμπος, Tokyo, Japan).

Προετοιμασία της πρωτεΐνης εξόρυξης

Ανθρώπινο CRC HCT-116 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS μέσο καλλιέργειας παρουσία του Πράσινου ή CapPE για 2 ώρες ή 24 ώρες. Προϊόντα λύσης κυττάρου (κυτταροπλασματικό και πυρηνικές πρωτεΐνες) από καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας την Nuclear Kit αντιδραστηρίου Protein Extract που περιείχε αναστολείς αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα 12.000 χ g για την απομάκρυνση των κυτταρικών υπολειμμάτων, τα υπερκείμενα διατηρούνται ως κυτταροπλασματικό εκχύλισμα. Cross μόλυνση μεταξύ των πυρηνικών και κυτταρόπλασμα κλάσματα δεν ανιχνεύθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ανίχνευση Plasma ΜΜΡ-9 με Enzyme-Linked Δοκιμασία ανοσοαπορρόφησης (ELISA)

Το επίπεδο ΜΜΡ-9 πλάσμα ήταν μετρήθηκε με ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (R &? D Systems Inc.). Εν συντομία, ένα 100 μL αραιωμένο δείγμα πλάσματος (1:08 αραίωση) από κάθε ομάδα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αναλύθηκαν. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας ELISA, η πλάκα αναγνώστηκε σε μήκος κύματος 450/570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Tecan Inc., Μάνερντορφ, Ελβετία).

Ανάλυση των κυτταρικών επιπέδων ΑΤΡ

Ανθρώπινο CRC κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε πλάκες 96 φρεατίων, το κάθε φρεάτιο περιέχει 1 × 10

4 κύτταρα παρουσία του CAPE ή CapPE. Μετρήσεις της κυτταρικής ΑΤΡ αναλύθηκαν ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας άμεσα ρυθμιστικό κυτταρικής λύσεως. Σύνολο κυτταρικής λύσης (100 μL) αναμείχθηκαν με διάλυμα υποστρώματος και δονείται για τη διάλυση των καταθέσεων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε με ένα Synergy HT Multi-Λειτουργία Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT).

Ανάλυση Western Blotting

κυτταρικές πρωτεΐνες

(70 μg) κλασματοποιήθηκαν σε 10% SDS- PAGE, μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, στυπώθηκαν με αντι-φωσφορυλίωση μονοκλωνικό αντίσωμα Akt, και εκτελείται με χημειοφωταύγεια δοκιμασία που βασίζεται. φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης του ΡϋΚ1, φωσφορυλίωση ΟδΚ3α, η φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β, φωσφορυλίωση FOXO3, φωσφορυλίωση της ΑΜΡΚ, η φωσφορυλίωση της m-TOR, PTEN, Ν-cadherin, ΡϋΚ1, Akt, ΟδΚ3α, ΟδΚ3β, FOXO3, TSC1, TSC2, mTOR, LKB1 , 14-3-3, ΑΜΡΚ, FASN, NF-κΒ (ρ-65), κυκλίνη D1, CDK4, PCNA, ρ21

Cip1 /WAF1, κυκλίνη Ε και c-myc στα προϊόντα λύσης κυττάρων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το ίδιο διαδικασία που περιγράφεται παραπάνω. Οι κηλίδες απογυμνώνεται και ξαναϊχνηθετούνται με αντισώματα Α είτε β-ακτίνη ή λαμίνη ως έλεγχος φόρτωσης.

Reporter προσδιορισμό γονιδίου

Η επιμόλυνση του στοιχείου απόκρισης ΝΡ-κΒ (NF-κΒ-RE) πλασμίδιο διεξήχθη σε ανθρώπινα CRC HCT-116 και SW-480 κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ανθρώπινη CRC HCT-116 και SW-480 κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων σε 2 κ.εκ. μέσου και επωάζονται όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με είτε CAPE ή CapPE σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24 ώρες πριν από την ανάλυση των δραστηριοτήτων του γονιδίου αναφοράς. Η δοκιμασία γονιδίου αναφοράς διεξήχθη με χρήση κιτ Διπλής Λουσιφεράσης Reporter Assay. Λουσιφεράσης εντάσεις μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Synergy HT Multi-Λειτουργία Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT).

Η στατιστική ανάλυση

Μια ποσοτική μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν υπήρχε κάποια σημαντική διαφορά στην η κυτταρική βιωσιμότητα, καθώς και η έκφραση της πρωτεΐνης μεταξύ των πειραματικών συνόλων και σύνολα έλεγχο του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Εν συντομία, οι στατιστικές αναλύσεις των διαφορών στη βιωσιμότητα κυττάρου μεταξύ των τριπλότυπων συνόλων των πειραματικών συνθηκών διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λογισμικό SYSTAT. Επιβεβαίωση διαφορά στη βιωσιμότητα κυττάρου ως σημαντική απαιτεί απόρριψη της μηδενικής υπόθεσης των καμία διαφορά μεταξύ των μέσων δεικτών που λαμβάνονται από τις επαναληπτικές σειρές πειραματικών και ελέγχου ομάδες στο

P

= 0,05 επίπεδο, χρησιμοποιώντας την απλή ΑΝΟνΑ μοντέλο. Η post hoc δοκιμασία Bonferroni χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των διαφορετικών ομάδων.

Αποτελέσματα

παράγωγα

CA ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων CRC

in vitro

Η

διερευνήθηκαν Τα ανασταλτικά αποτελέσματα των παραγώγων CA στον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων CRC (ΗΟΤ-116 και SW-480 κύτταρα)

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2-3, παράγωγα CA (στις συγκεντρώσεις των 5, 10, 20, 50 και 100 μΜ) ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων CRC HCT-116 και SW-480 κύτταρα. Στις συγκεντρώσεις των 5, 10, 20, 50 και 100 μΜ, CAPE και CapPE κάθε κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων CRC HCT-116, αντίστοιχα. (Ανασταλτικά αποτελέσματα των CAPE: 4, 31, 47, 54, και 58%? CapPE: 5, 45, 56, 59 και 64%) (Σχήμα 2Α). Οι IC50s για CAPE και CapPE σε ανθρώπινα κύτταρα CRC HCT-116 είναι 44,2 μΜ και 32,7 μΜ, αντίστοιχα. Στις συγκεντρώσεις των 5, 10, 20, 50 και 100 μΜ, CAPE και CapPE κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων CRC SW-480, αντίστοιχα. (Ανασταλτικά αποτελέσματα των CAPE: 0.5, 8.9, 14, 19 και 32%? CapPE: 6, 15, 22, 26 και 47%) (Σχήμα 3Α). Οι IC50s για CAPE και CapPE σε ανθρώπινα κύτταρα CRC SW-480 είναι 132,3 μΜ και 130,7 μΜ, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι CAPE και CapPE είναι το καθένα ικανά να αναστέλλουν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων CRC με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. CapPE φαίνεται να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων CRC HCT-116 κύτταρα πιο αποτελεσματικά από CAPE. Για το λόγο αυτό, επελέγησαν CAPE και CapPE για περαιτέρω μελέτη των πιθανών επιπτώσεων αντικαρκινικές τους σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. Ο ρόλος των μορίων στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ανθρώπινα κύτταρα CRC σε επεξεργασία με τα παράγωγα CA σηματοδότησης διερευνήθηκε. Σε αυτά τα κύτταρα, Akt ήταν είτε υπερ-εκφράζονται από επιμόλυνση με ένα συστατικώς δραστικό Myr-Akt1 πλασμίδιο, ή δραστηριότητα ΑΜΡΚ αναστάλθηκε από την ένωση C. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, και οι δύο υπερ-έκφραση του Akt και καταστολή της δραστηριότητας ΑΜΡΚ διασωθέντων κυτταρικό πολλαπλασιασμό αναστέλλεται από CAPE ή CapPE θεραπείες σε ανθρώπινο CRC HCT-116 κύτταρα. Τα αποτελέσματα της Akt υπερέκφραση ή μειωμένη δραστικότητα ΑΜΡΚ για τη διάσωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν λιγότερο σημαντική, ωστόσο, σε SW-480 κύτταρα κατεργασμένα με CA-παράγωγο (Σχήμα 3Α). Τα επίπεδα έκφρασης της ρ-Ακί και t-Ακί πρωτεϊνών με την υπερέκφραση μιας συστατικώς δραστική μορφή της Akt σε ανθρώπινα CRC HCT-116 και SW-480 κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 2Β και Σχήμα 3Β, αντιστοίχως. Τα επίπεδα έκφρασης του ρ-ΑΜΡΚ και πρωτεΐνες t-ΑΜΡΚ με την κατεργασία της ένωσης C σε ανθρώπινο CRC HCT-116 και SW-480 κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 2C και στο Σχήμα 3C, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα παράγωγα CA δρουν ως παράγοντες προφύλαξης κατά της ανθρώπινης CRC μέσω διαφοροποίησης των οδών σηματοδότησης ΡΙ3-Κ /Akt και ΑΜΡΚ

(Α) Ανθρώπινη CRC HCT-116 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με CAPE και CapPE (σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20, 50 και 100 μΜ) παρουσία ή απουσία της ένωσης Ο (10 μΜ) για 24 ώρες. Οι επιμολύνσεις μόνιμα ενεργών Akt (Myr-Akt1) και άδειο φορέα (pcDNA3) διεξήχθησαν πριν από την επεξεργασία των παραγώγων CA. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος ± SD (τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα διαφορετικά σύμβολα (??? για CAPE και ▵ για CapPE) αντιπροσωπεύουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την CA παράγωγο ομάδα -untreated ελέγχου σε κάθε ομάδα, αντίστοιχα, στην P & lt? 0,05. Τα διαφορετικά σύμβολα (# για CAPE_Akt, § για CAPE_compound C, ▴ για CAPPE_Akt, και ▪ για CAPPE_compound C) αντιπροσωπεύουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με το καθένα να αντιστοιχεί CA παράγωγου αγωγή ομάδα ελέγχου σε κάθε δοσολογία υποομάδα, αντίστοιχα, σε Ρ & lt? 0.05. (Β-C) Κυτταροπλασματικά πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν για ανάλυση Western αποτύπωση χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα έναντι αντι-φωσφορυλίωσης Akt (S473), το συνολικό-Akt, αντι-φωσφορυλίωση AMPKα (T172) και το συνολικό-AMPKα.

Η

(Α) Ανθρώπινη CRC SW-480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 με CAPE και CapPE (σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20, 50 και 100 μΜ) παρουσία ή απουσία της ένωσης Ο (10 μΜ) για 24 h. Οι επιμολύνσεις μόνιμα ενεργών Akt (Myr-Akt1) και άδειο φορέα (pcDNA3) διεξήχθησαν πριν από την επεξεργασία των παραγώγων CA. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα είναι ο μέσος όρος ± SD (τυπική απόκλιση) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα διαφορετικά σύμβολα (??? για CAPE και ▵ για CapPE) αντιπροσωπεύουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την CA παράγωγο ομάδα -untreated ελέγχου σε κάθε ομάδα, αντίστοιχα, στην P & lt? 0,05. Τα διαφορετικά σύμβολα (# για CAPE_Akt, § για CAPE_compound C, ▴ για CAPPE_Akt, και ▪ για CAPPE_compound C) αντιπροσωπεύουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με το καθένα να αντιστοιχεί CA παράγωγου αγωγή ομάδα ελέγχου σε κάθε δοσολογία υποομάδα, αντίστοιχα, σε Ρ & lt? 0.05. (Β-C) Κυτταροπλασματικά πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν για ανάλυση Western αποτύπωση χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα έναντι αντι-φωσφορυλίωσης Akt (S473), το συνολικό-Akt, αντι-φωσφορυλίωση AMPKα (T172) και το συνολικό-AMPKα.

Η

CAPE και CapPE κάθε προκαλούμενη G

0 /G

1 κύτταρο σύλληψη κύκλου σε κύτταρα CRC

για να προσδιορίσετε αν CA παράγωγο με τη μεσολάβηση της καταστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού οφείλεται σε ανακοπή σε ένα ορισμένο στάδιο της κυτταρικού κύκλου, τα αποτελέσματα της CAPE και CapPE μελετήθηκαν περαιτέρω σε HCT-116 και SW-480 κύτταρα. Κύτταρα κατεργασμένα με κάπα ή CapPE υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μετά το DNA τους χρωματίστηκε με ΡΙ. Τα ιστογράμματα των δεδομένων κυτταρομετρίας ροής που φαίνεται στο Σχήμα 4Α. CAPE και CapPE επάγεται σημαντικά διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά την G

0 /G

1 φάσης σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Ρ & lt? 0,05). Σε συγκέντρωση 50 μΜ, CAPE και CapPE αυξήθηκε σημαντικά διακοπή του κυτταρικού κύκλου των HCT-116 κυττάρων κατά τη διάρκεια της G

0 /G

1 φάση έως 56% και 61%, αντίστοιχα, ενώ στην ομάδα ελέγχου το ποσοστό των κυττάρων στη G

0 /G

1 φάση ήταν μόνο 34% (Σχήμα 4Β). Σε συγκέντρωση 50 μΜ, CAPE και CapPE αυξήθηκε σημαντικά διακοπή του κυτταρικού κύκλου του SW-480 κύτταρα κατά τη διάρκεια της G

0 /G

1 φάση με έως και 44% και 57%, αντίστοιχα, ενώ στην ομάδα ελέγχου το ποσοστό των κυττάρων στη G

0 /G

1 φάση ήταν μόνο 37% (Σχήμα 4C). Αυτές οι αυξήσεις των G

0 /G

1 σύλληψης ήταν ως επί το πλείστον σε βάρος των S και G

2 /M κυτταρικών πληθυσμών φάση. CapPE φαίνεται να επάγει G

0 /G

1 κύτταρο σύλληψης κύκλου πιο αποτελεσματικά από ό, τι CAPE σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. Έτσι, είναι εύλογο ότι CAPE και CapPE ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων CRC μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο G

0 /G

1 φάση.

Ανθρώπινα κύτταρα CRC συγχρονίστηκαν σε RPMI- 1640 με 0,05% FBS σε δίσκους καλλιέργειας ιστών επί μία νύκτα. Για τη μέτρηση της κατανομής του κυτταρικού κύκλου, κυτταρική καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία CAPE και CapPE (0, 10, 50 και 100 μΜ) καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS RPMI-1640 για άλλες 24 ώρες. (Α) Η μέτρηση του κυτταρικού πληθυσμού σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Τα στοιχεία υποδεικνύουν ότι η (Β) HCT-116 κυττάρων (C) ποσοστό του πληθυσμού SW-480 κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις των κυττάρων κάτω από τη θεραπεία CAPE ή CapPE σε ανθρώπινα κύτταρα CRC. Ανθρώπινα CRC (D) HCT-116 κύτταρα (Ε) SW-480 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με είτε CAPE ή CapPE (σε συγκεντρώσεις 0, 5, 10, 20, 50 και 100 μΜ) σε 10% FBS RPMI-1640 για 24 ώρες . Πυρηνικές πρωτεΐνες παρασκευάστηκαν για ανάλυση Western αποτύπωση χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα έναντι κυκλίνης D1, CDK4, PCNA, και αντισώματα λαμίνη Α, όπως περιγράφεται υπό Υλικά και Μέθοδοι. Τα επίπεδα ανίχνευσης αντιπροσωπεύουν τα ποσά της κυκλίνης D1, CDK4 και PCNA στους πυρήνες των ανθρώπινων κυττάρων CRC. Τα αποτελέσματα (μέση τιμή ± SD) αντιπροσωπεύουν το πτυχώσεις αλλαγή της ομάδας ελέγχου και είναι αντιπροσωπευτικά τριών διαφορετικών πειραμάτων. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες σημειώνεται με ένα βέλος. Οι μέσες ολοκληρωμένες πυκνότητες αυτών των πρωτεϊνών ρυθμίζεται με τη λαμίνη εσωτερικού ελέγχου Μια πρωτεΐνη που φαίνεται στο κάτω σειρά.