κυττάρων

Αφηρημένο

Καρκίνος ενεργοποιήσετε τη βιοσύνθεση των κορεσμένων λιπαρών οξέων (SFA) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (MUFA), προκειμένου να διατηρηθεί η αυξανόμενη ζήτηση για τα φωσφολιπίδια με την κατάλληλη σύνθεση ακυλο κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγής των κυττάρων. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι ένα σταθερό knockdown του στεαροϋλ-ΟοΑ 1 (SCD1), ο κύριος Δ9-δεσατουράση η οποία μετατρέπει SFA σε MUFA, σε καρκινικά κύτταρα ελαττώνει το ρυθμό της λιπογένεσης, μειώνει τον πολλαπλασιασμό και in vitro διεισδυτικότητα, και εξασθενίζει δραματικά σχηματισμό όγκων και την ανάπτυξη. Εδώ αναφέρουμε ότι η φαρμακολογική αναστολή της SCD 1 με ένα νέο μικρό μόριο σε καρκινικά κύτταρα προώθησε την ενεργοποίηση της AMP-ενεργοποιημένη κινάση (ΑΜΡΚ) και την επακόλουθη μείωση της δραστηριότητας καρβοξυλάσης ακετυλΟοΑ, με ταυτόχρονη αναστολή της λιπογένεσης γλυκόζης με τη μεσολάβηση. Η φαρμακολογική αναστολή της ΑΜΡΚ μειώθηκε περαιτέρω πολλαπλασιασμό των κυττάρων SCD 1-εξαντλούνται, ενώ η ενεργοποίηση AMPK αποκατασταθεί πολλαπλασιασμό για να ελέγχουν τα επίπεδα. Η προσθήκη supraphysiological συγκεντρώσεις γλυκόζης ή πυροσταφυλικό, το τελικό προϊόν της γλυκόλυσης, δεν ανέστρεψε το χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού του SCD 1-αποκόπτεται καρκινικά κύτταρα. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα απαιτούν ενεργό SCD1 να ελέγχει το ρυθμό της λιπογένεσης γλυκόζης με τη μεσολάβηση, και ότι όταν η δράση της SCD 1 είναι εξασθενημένη κύτταρα ρυθμίζουν προς τα κάτω την σύνθεση SFA μέσω ΑΜΡΚ μεσολάβηση αδρανοποίηση του ακετυλο-CoA καρβοξυλάση, εμποδίζοντας έτσι τις βλαβερές συνέπειες της συσσώρευσης SFA.

Παράθεση: Scaglia Ν, Chisholm JW, Ιγάλ RA (2009) Αναστολή της StearoylCoA Αποκορεστάση-1 αδρανοποιεί ακετυλο-CoA καρβοξυλάση και εξασθενίζει Διάδοση στα καρκινικά κύτταρα: Ο ρόλος της ΑΜΡΚ. PLoS ONE 4 (8): e6812. doi: 10.1371 /journal.pone.0006812

Επιμέλεια: Marcelo Bonini, Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) /Εθνικό Ινστιτούτο Επιστημών Περιβαλλοντικής Υγείας (NIEHS), Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5η Μαΐου του 2009? Αποδεκτές: τέταρτης Αυγούστου 2009? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου, 2009

Copyright: © 2009 Scaglia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον Charles και Joanna Ίδρυμα Busch και SEBS /NJAES, Πανεπιστήμιο Rutgers. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μια ριζικά τροποποιημένο μεταβολισμό που προωθεί τη συνεχή πολλαπλασιασμό τους. Ως μέρος της μεταβολική μετατόπιση προς μακρομοριακές σύνθεση για να υποστηρίξει την αντιγραφή των κυττάρων, τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν τη βιοσύνθεση των κορεσμένων λιπαρών οξέων (SFA) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (MUFA) για να διατηρηθεί η αυξανόμενη ζήτηση για τα φωσφολιπίδια της κατάλληλης σύνθεσης ακύλιο για βιογένεση μεμβράνης. Έτσι, αρκετές κρίσιμες ένζυμα που εμπλέκονται στη σύνθεση de novo λιπαρών οξέων έχει αποδειχθεί ότι υπερεκφράζεται σε κακοήθη κύτταρα: ΑΤΡ-κιτρική λυάση, που απαιτείται για την παραγωγή της κυτοσολικής ακετυλΟοΑ [1], ακετυλΟοΑ καρβοξυλάσης (ACC), το ένζυμο που καταλύει την σύνθεση του malonylCoA, το πρώτο δεσμευτεί βήμα στη σύνθεση των λιπαρών οξέων [2], [3], και συνθάσης λιπαρού οξέος (FAS), το οποίο συνθέτει SFA [2]. Η σημασία της σύνθεσης λιπαρού οξέος για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση τονίζεται από το γεγονός ότι η αναστολή οποιουδήποτε από αυτά τα ένζυμα οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και αυξημένο κυτταρικό θάνατο [4] – [9]. Ωστόσο, παρά την υπερενεργοποίηση του δίδυμου των βιοσυνθετικών ενζύμων που καθιστά τελικά SFA, άφθονες ποσότητες MUFA τυπικά βρίσκονται σε καρκινικά κύτταρα [10] – [13], υποδηλώνοντας ότι η βιοσύνθεση του MUFA απαιτείται για να διασφαλιστεί ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων και επιβίωση.

θηλαστικών αποκορεστάσες stearoylCoA (SCD) είναι μικροσωμικά ένζυμα που καταλύουν την Δ9-αποκορεσμό κορεσμένων acylCoAs να σχηματίσουν μονοακόρεστα παράγωγα [14]. Η έκφραση της SCD 1, το κύριο SCD ισομορφή, αυξάνεται σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους, χημικά επαγόμενη όγκων, όπως επίσης και σε κύτταρα ογκογονίδιο-μετασχηματισμένα [1], [13], [15] – [18]. Δείξαμε ότι SCD 1 διαμορφώνει όχι μόνο το περιεχόμενο των MUFA σε καρκινικά κύτταρα, αλλά επίσης και τη συνολική διαδικασία της λιπογένεσης [19]. Είναι αξιοσημείωτο ότι η εκτομή της έκφρασης SCD 1 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και in vitro διεισδυτικότητα, και εξασθενίζει δραματικά σχηματισμό όγκων και την ανάπτυξη [19], [20]. Βρήκαμε επίσης ότι η ενεργός SCD 1 μπορεί να απαιτείται για τα νεοπλασματικά κύτταρα να επιβιώσουν lipotoxic στρες αφού SCD1 knockdown αυξάνει τη βασική απόπτωσης και ευαισθητοποιεί τα κύτταρα στην κυτταροτοξική δράση της περίσσειας SFA [19]. SCD1 έχει επίσης ταυτοποιηθεί από μια βιβλιοθήκη siRNA ως ένα γονίδιο του οποίου η καταστολή εξασθενεί επιβίωση ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, υποστηρίζοντας περαιτέρω μια λειτουργική σύνδεση μεταξύ SCD1 και την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων [21]. Παρ ‘όλα αυτά, παρά την αυξανόμενη σώμα των πληροφοριών, οι περίπλοκες μηχανισμοί με τους οποίους SCD1 διαμορφώνει ταυτόχρονα μεταβολισμό των λιπιδίων και τα βιολογικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων δεν είναι γνωστές.

Η διαδικασία της λιπογένεσης σε κύτταρα θηλαστικών ρυθμίζεται από Akt και AMP- εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ), δύο σημαντικές πρωτεΐνες σηματοδότησης που ελέγχουν διάφορες κρίσιμες βιοσύνθεσης και καταβολισμού αντιδράσεις. Akt είναι ένα ισχυρό επαγωγέα της γλυκόζης με τη μεσολάβηση λιπογένεση σε καρκινικά κύτταρα, που ρυθμίζουν κυρίως τη δραστηριότητα και μεταγραφή των πολλαπλών ενζύμων της γλυκόλυσης και της σύνθεσης των λιπαρών οξέων [22], [23]. Ως μέρος ενός βρόχου ανάδρασης, η δραστικότητα της Akt ρυθμίζεται από τα επίπεδα του FAS και SCD 1. Παρατηρήθηκε ότι ο αποκλεισμός της δραστηριότητας FAS και εκτομή μείωσης έκφρασης SCD1 Akt φωσφορυλίωση και δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα [20], [24]. Σε αντίθεση, ΑΜΡΚ ενεργοποίηση με φωσφορυλίωση προωθεί την καθοδική ρύθμιση πολλών λιπογόνων οδών και ενεργοποιεί τις αντιδράσεις της ενέργειας που προμηθεύουν όπως η οξείδωση των λιπαρών οξέων [25]. Ένας σημαντικός στόχος των ενεργοποιημένων ΑΜΡΚ είναι ACC. Μετά φωσφορυλίωση από AMPK, ACC δραστικότητα μειώνεται με αποτέλεσμα την αναστολή της de novo σύνθεση των λιπαρών οξέων [26]. Η ταυτόχρονη μείωση των επιπέδων malonylCoA προάγει την β-οξείδωση των λιπαρών οξέων. SFA είναι επίσης ισχυροί αλλοστερικοί αναστολείς της ACC, παρέχοντας ένα αρνητικό βρόχου ανάδρασης για τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων [27] – [29]. Υποθέτουμε ότι αυξημένα SCD 1, με τη μετατροπή SFA προς MUFA, είναι σε θέση να διατηρήσει το μονοπάτι της σύνθεσης των λιπαρών οξέων και λιπογένεσης πλήρως ενεργοποιημένο. Αυτή η κατάσταση ευνοεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό, μειώνοντας δράσης SCD 1 θα πρέπει να επηρεάσει αυτές τις δύο βιολογικές διαδικασίες

Πρόσφατα, αρκετές σειρές εκλεκτικών αναστολέων μικρού μορίου νέα Δ9-δεσατουράσης έχουν δημοσιευθεί [30] – [32]. . Ένας από αυτούς τους αναστολείς SCD, CVT-11127 (Ν- (2- (6- (3,4-διχλωροβενζυλαμινο) -2- (4-μεθοξυφαινυλ) -3-οξοπυριδο [2,3-b] πυραζιν-4 (3Η) -υλ) αιθυλ) ακεταμίδιο), είναι ένας ισχυρός και ειδικός αναστολέας της μικροσωματικής αρουραίου και HepG2 κύτταρο Δ9-αποκορεσμού [30] και μπορεί να είναι ένας πιθανός πολύτιμο εργαλείο για την μελέτη της ρύθμισης του κυτταρικού μεταβολισμού και μονοπάτια σηματοδότησης με δραστηριότητα SCD1.

σε τρέχουσες μελέτες μας, δείχνουν ότι η οξεία αναστολή της δράσης SCD 1 με CVT-11127, καθώς επίσης και η χρόνια έλλειψη SCD1 από σταθερές γονίδιο knockdown, παρεμποδίζει σημαντικά τη σύνθεση οξύ de novo οξέων από γλυκόζη σε ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα. Αναφέρουμε επίσης ότι η φαρμακολογική αναστολή της δράσης SCD μειωθεί δραστικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε καρκινικά κύτταρα, επιβεβαιώνοντας ότι η δραστηριότητα της SCD 1 είναι μια κρίσιμη απαίτηση για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι ο αποκλεισμός της SCD 1 ενεργοποιημένου ΑΜΡΚ και αδρανοποιημένο ACC με αποτέλεσμα μειωμένη λιπογένεση. Σε πειραματικές συνθήκες που επάγουν τη λιπογένεση, όπως διέγερση του ACC με κιτρικό και η αναστολή της ΑΜΡΚ, μια περαιτέρω μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό παρατηρήθηκε σε SCD 1 με ανεπάρκεια κυττάρων. Αντίθετα, η φαρμακολογική ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ αντιστραφεί πολλαπλασιασμού των κυττάρων για να ελέγχουν τα επίπεδα. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η αρνητική ρύθμιση της σύνθεσης των λιπαρών οξέων κατά τη δράση SCD 1 είναι χαμηλή μπορεί να είναι ένας προσαρμοστικός μηχανισμός διασφάλισης για την πρόληψη των επιβλαβών επιπτώσεων της υπερβολικής SFA, όταν η μετατροπή του σε μονοακόρεστα είναι μειωμένη. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία της SCD 1 στη ρύθμιση της νεοπλασματικής πολλαπλασιασμού και του μεταβολισμού.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Α549 ανθρώπινου πνεύμονα κύτταρα αδενοκαρκινώματος και WS-1 του ανθρώπου ινοβλάστες ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Η1299 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα και MCF-7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού είχαν γενναιόδωρα από τον Dr C. S. Yang και ο Δρ Wendie Cohick, Πανεπιστήμιο Rutgers, NJ, αντίστοιχα. τροποποίηση του Dulbecco του μέσου Eagle (ϋΜΕΜ) με L-γλουταμίνη, μίγμα βιταμίνης ΜΕΜ και διάλυμα ΜΕΜ μη απαραίτητο αμινοξύ ήταν από Mediatech Cellgro (Manassas, VA, USA). Ελάχιστο Βασικό Μέσο (ΜΕΜ) που περιέχει άλατα Earle και Ε-γλουταμίνη, γλυκόζη DMEM ελεύθερο, χωρίς ερυθρό φαινόλης ΜΕΜ, διάλυμα τρυψίνης-ΕϋΤΑ και αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine ™ 2000 αγοράσθηκαν από την Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό, κρυσταλλικό ιώδες, πρωτεάση και ο αναστολέας φωσφατάσης κοκτέιλ 2, λιπαρό οξύ αλβουμίνη ελεύθερη βόειου ορού, μονοκλωνικό αντι β-ακτίνης αντίσωμα, AICAR, συνένζυμο Α, ΑΤΡ, NADH και διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ήταν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, διαλύτες βαθμού HPLC, διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό χωρίς άλλα αναλώσιμα κυτταρικής καλλιέργειας ασβεστίου και μαγνησίου και ελήφθησαν από την Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, ΡΑ, USA). Αντι-φωσφο ACC (Ser79) αντισωμάτων φωσφο-AMPKα (Thr172) και ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology Inc (Danvers, ΜΑ, USA). HRP-συζευγμένο αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού IgG ήταν από την Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA, USA). D- [U-

14C] γλυκόζης, [1-

14C] στεατικό οξύ, και [1-

14C] οξικό νάτριο αγοράστηκαν από την American Radiolabeled Chemicals, Inc (St. Louis, ΜΟ, USA ). [Μεθυλ-

3Η] θυμιδίνης, [2-

3Η] δεοξυγλυκόζης και το πλήρες εύρος του ουράνιου τόξου δείκτης μοριακού βάρους ήταν από την GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ, USA). Γαλακτικό κιτ δοκιμασίας ήταν από Eton Biosystems Inc (San Diego, CA, USA). κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA Bradford και σούπερ σήμα West Pico υπόστρωμα χημιφωταύγειας ήταν από την Pierce (Rockford, IL, USA). Ενωση C ήταν από την Calbiochem (San Diego, CA, USA).

Κυτταροκαλλιέργεια

WS-1, Α549 και MCF-7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ και Η1299, Η460 και MDA-ΜΒ -231 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DMEM. Το μέσο συμπληρώθηκε με 10% FBS, πενικιλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (10 μg /ml), 1% μη απαραίτητα αμινοξέα και 1% διάλυμα ΜΕΜ βιταμίνης (καλλιεργητικό υπόστρωμα). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2, και 100% υγρασία.

μοντέλα κυττάρων αναστολής SCD1

Ένα σταθερό επιμολυσμένα κλωνικός πληθυσμός κυττάρων Α549 που φέρουν μία αλληλουχία αντινόημα του ανθρώπινου γονιδίου SCD1 (hSCDas) έχει περιγραφεί προηγουμένως [20]. Επιπλέον, η φαρμακολογική αναστολή της δράσης SCD αξιολογήθηκε με νέο αναστολέα χημική SCD, CVT-11127 (Ν- (2- (6- (3,4-διχλωροβενζυλαμινο) -2- (4-μεθοξυφαινυλ) -3-οξοπυριδο [2, 3-b] πυραζιν-4 (3Η) -υλ) αιθυλ) ακεταμίδιο), της οποίας η σύνθεση και η δομή περιγράφεται αλλού [30]. CVT-11127 χρησιμοποιήθηκε σε συγκεντρώσεις στις οποίες η αναστολή της SCD 1 ήταν μεγαλύτερη από 95%. Ο συνολικός χρόνος επώασης με τον αναστολέα SCD ήταν, τουλάχιστον, 24 ώρες, ώστε να επιτραπεί για ένα πληθυσμό κυττάρων διπλασιασμού.

δράσης SCD και σύνθεση de novo λιπαρό οξύ

Δ9 δραστικότητα δεσατουράσης σε ολόκληρο κυττάρων προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, υποσυρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων επωάστηκαν με την καθορισμένη συγκέντρωση αναστολέα SCD ή φορέα DMSO στο μέσο ανάπτυξης για 24 ώρες. Έξι ώρες πριν τη συγκομιδή, τα κύτταρα σημάνθηκαν με [

14C] στεατικό οξύ (0.25 μΟί /60 mm τρυβλία τρυβλίο) σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 0.5% αλβουμίνη βόειου ορού. Το ολικό κυτταρικό λιπίδια εκχυλίζονται σύμφωνα με Bligh & amp? Dyer [33] και διεστεροποιείται με BF

3 σε μεθανόλη για 3 ώρες στους 64 ° C υπό ατμόσφαιρα αζώτου. Οι μεθυλεστέρες διαχωρίστηκαν με αργυρώσεως χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφεται από τους Wilson και Sargent [34], με τη χρήση μια φάση διαλύτη που αποτελείται από εξάνιο: αιθυλ αιθέρα (90:10, κατά όγκο). Τα ραδιοσημασμένα στεατικό και ελαϊκό οξύ ανιχνεύθηκαν με ένα σαρωτή Storm (Molecular Dynamics) και η οπτική πυκνότητα του ποσοτικά με Imagequant λογισμικό. Για τη σύνθεση de ηονο λιπαρών οξέων, τα κύτταρα επωάστηκαν για 6 έως 24 ώρες με [U-

14C] γλυκόζη ή για 24 ώρες με [

14C] οξικού νατρίου υπό την παρουσία ή απουσία του αναστολέα SCD. Τα κυτταρικά λιπίδια αφαιρέθηκαν όπως περιγράφεται και η ποσότητα της [

14C] ιχνηθέτη ενσωματωθεί λιπίδια ομαλοποιήθηκε στο περιεχόμενο κυτταρικής πρωτεΐνης των κυττάρων που αναπτύσσονται παράλληλα τρυβλία Petri. Κλάσματα του [

14C] κυττάρων λιπίδια γλυκόζης-σημασμένα εστεροποιημένα και τα επίπεδα ραδιοσημασμένης SFA και μονοακόρεστα προσδιορίστηκαν με TLC, όπως περιγράφεται παραπάνω.

Προσδιορισμός της γλυκόζης πρόσληψη

κύτταρα ταπήτιο Η1299 επωάστηκαν με 1 μΜ CVT-11127 ή το όχημα γλυκόζης ϋΜΕΜ με ανεπάρκεια για 24 ώρες. Κυττάρων μετά δέχθηκαν παλμό για 7 λεπτά με 0.5 μCi /τρυβλίο [

3Η] δεοξυγλυκόζης σε ϋΜΕΜ που περιείχε 0.5% BSA, 25 μΜ HEPES και 100 γλυκόζης μΜ. Επισημασμένα μέσο απομακρύνθηκε γρήγορα και η υπολειμματική επισήμανσης σχετικά με τις μονοστιβάδες απομακρύνθηκε με τρεις πλύσεις με παγωμένο PBS. Η συνολική ραδιενέργεια των κυτταρικών ομογενοποιημάτων μετρήθηκε σε έναν μετρητή σπινθηρισμού και [

3Η] DPM ομαλοποιήθηκαν στο περιεχόμενο κυτταρικής πρωτεΐνης.

συνολικής σύνθεσης κυψελοειδούς λιπαρών οξέων

Το συνολικό κυτταρικό λιπίδια από Α549 και Η460 καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 10 μΜ ή 1 μΜ CVT-11127, αντίστοιχα, ή όχημα για 24 ώρες εκχυλίσθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Δεκαεπτανοϊκού Οξέως (C17: 0), προστέθηκε ως εσωτερικό πρότυπο κατά την έναρξη της διαδικασίας εκχύλισης λιπιδίων. Μετεστεροποίηση και μεθυλίωση των λιπαρών οξέων από το σύνολο των λιπιδίων διεξήχθησαν όπως περιγράφεται από τους Lepage και Roy [35]. σύνθεση οξύ μεθυλεστέρες λιπαρών προσδιορίστηκε με χρωματογραφία αερίου χρησιμοποιώντας μια Varian 3800 GC (Varian Inc, Ραίο Alto, CA), εξοπλισμένο με μία στήλη DB-23 (J & amp? W Scientific Inc., Folsom, CA) και FID. οξύ ταυτοποίηση μεθυλεστέρα και απόκριση παράγοντες Λιπαρά προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπα μείγματα (NuChek Prep Ιηο, Elysian, ΜΝ). Χρωματογραφικές κορυφές ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση των χρόνων κατακράτησης τους με εκείνες των προτύπων καθαρό λιπαρών οξέων και το ποσοστό κατανομής υπολογίστηκε.

[

3Η] θυμιδίνης στο DNA των κυττάρων

Ο ρυθμός του DNA σύνθεση εκτιμήθηκε με προσδιορισμό των επιπέδων [

3Η] θυμιδίνης εντός του DNA μετά δόνηση των κυττάρων με το ραδιοσημασμένο ιχνηθέτη για 2 ώρες, που ακολουθείται από καταβύθιση του ολικού DNA και απαρίθμηση σπινθηρισμού, όπως περιγράφεται [36]. Ομάδες κύτταρα επωάστηκαν με γλυκόζη δωρεάν ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης για 22 ώρες πριν από την προσθήκη του [

3Η] θυμιδίνης. Σε άλλα πειράματα, η αυξανόμενη μέσο συμπληρωμένο με 10 mM πυροσταφυλικό νάτριο ή κιτρικό νάτριο για 22 ώρες. Για την αναστολή SCD, CVT-11127 προστέθηκαν στις ενδεικνυόμενες δόσεις τις καλλιεργητικά μέσα επί 22 ώρες πριν από την περίοδο σήμανσης. Σε όλες τις περιπτώσεις, ο συνολικός χρόνος επώασης με τους μεταβολίτες ή αναστολέα ήταν 24 ώρες.

Προσδιορισμός καμπυλών ανάπτυξης των κυττάρων

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων (14,000 κύτταρα ανά φρεάτιο). Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, οι μονοστιβάδες ξεπλύθηκαν με PBS και ομάδες κύτταρα επωάστηκαν με 0.5 ή 5.5 mM γλυκόζη στο μέσο ανάπτυξης. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε 48 ώρες μετά. Για ορισμένα πειράματα, τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες και 48 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ελαϊκό νάτριο μέχρι 100 μΜ. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφεται από Menna et al. [37], με τροποποιήσεις. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε απεσταγμένο νερό και ξεπλένεται τρεις φορές με νερό. Η βαφή στα χρωματισμένα κύτταρα διαλυτοποιήθηκε σε 10% μεθανόλη, 5% διάλυμα οξικού οξέος και ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία στα 580 nm. Η αξία ενός τυφλού καλά αφαιρέθηκε σε κάθε περίπτωση. Οι τιμές σε διαφορετικά χρονικά σημεία κανονικοποιήθηκαν με τα στοιχεία στις 24 ώρες μετά τη σπορά για να αποφευχθούν διαφορές που οφείλονται σε διαφορές ως προς την αποτελεσματικότητα προσκόλλησης κυττάρου ή κυτταρικό θάνατο.

Το γαλακτικό μέτρηση

Για να προσδιοριστεί η παραγωγή γαλακτικού , 9 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και αναπτύχθηκαν μέχρι μονοστοιβάδες φτάσει το 80% συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με PBS και αναπτύχθηκαν σε 10% FBS, φαινόλη χωρίς ΜΕΜ με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις αναστολέα SCD ή όχημα για 24 ώρες. Για ορισμένους προσδιορισμούς, τα κύτταρα υποβάλλονται σε αποκλεισμό της δράσης SCD επωάστηκαν με 10 mM κιτρικού νατρίου για 24 ώρες. Το περιεχόμενο του γαλακτικού στο ρυθμισμένο μέσο ποσοτικοποιήθηκε με μια δοκιμασία γαλακτικού (Eton Biosciences Inc), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ομαλοποιούνται στη συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης.

ανοσοαποτύπωσης

κύτταρα ταπήτιο έλαβαν θεραπεία όπως περιγράφεται, ξεπλένονται με παγωμένο PBS, αποξέστηκαν σε ψυχρό υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris-HCI ρΗ 7.5, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, συν αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης κοκτέιλ) και κατεργασία με υπερήχους. Πενήντα μικρογραμμάρια ολικού κυτταρικού πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Μετά τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού φωσφο-AMPKα (Thr172) και φωσφο-ACC (Ser79) όλη τη νύχτα ή αντι β-ακτίνης ποντικού μονοκλωνικό για 2 ώρες σε 1:1,000 αραιώσεις. Χρένου συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε 1:10,000 αραιώσεις. Πρωτεΐνες επί της μεμβράνης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης West Pico χημειοφωταύγειας και ποσοτικοποιούνται με ChemiDoc (BioRad) σύστημα ψηφιακής εικόνας χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό QuantityOne. Όλες οι αναλύσεις της πυκνότητας ζώνη πρωτεΐνης έγιναν στο γραμμικό τμήμα των καμπυλών κορεσμού και ομαλοποιούνται στη β-ακτίνης περιεχόμενο των ίδιων δειγμάτων.

Προσδιορισμός της κυτταρικής πρωτεΐνης

Συνολική περιεκτικότητα κυτταρικής πρωτεΐνης ήταν μετρήθηκε με την μέθοδο Bradford, χρησιμοποιώντας BSA σαν πρότυπο.

Στατιστική ανάλυση

τα αποτελέσματα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα με τουλάχιστον 3 δείγματα ανά πειραματική ομάδα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± S. D. Η στατιστική σημαντικότητα των δεδομένων προσδιορίσθηκε από t-test του Student.

Αποτελέσματα

Η φαρμακολογική αναστολή της δράσης της SCD μειώνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η χρόνια εξάντληση της SCD1 μειώνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε ογκογονίδιο-μετασχηματισμένα και τα καρκινικά κύτταρα [19], [20]. Για να αξιολογηθεί η πιθανή χρήση των αναστολέων που αναπτύχθηκαν πρόσφατα SCD ως νέα αντικαρκινικά μέσα, δοκιμάσαμε την πιθανή ανασταλτική επίδραση της αύξησης CVT-11127, ένα νέο αναστολέα μικρού μορίου της δραστηριότητας SCD, σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Αυτή η ένωση βρέθηκε να είναι ένα αποτελεσματικό και δεσατουράση εκλεκτικοί αναστολείς της δράσης SCD σε παρασκευάσματα μικροσωμικά ήπατος αρουραίου και ανθρώπινα κύτταρα HepG2 [30]. Οι συγγραφείς αυτοί ανέφεραν ότι CVT-11127 δεν αναστέλλει τη δραστηριότητα της μικροσωματικής αρουραίου Δ5 και Δ6 δεσατουρασών σε συγκεντρώσεις έως και 30 μΜ, υποδεικνύοντας ότι CVT-11127 είναι επιλεκτική για Δ9 δεσατουράσες. Έτσι, επωάζονται Α549, Η1299 και Η460 κύτταρα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του αναστολέα SCD για 24 ώρες και βρέθηκε μία προοδευτική μείωση του ρυθμού κυτταρικής αντιγραφής των καρκινικών κυττάρων σε σχέση με όχημα (DMSO) κατεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 1). κύτταρα Η1299 έδειξε -55% και 65% μείωση στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε παρουσία 1 μΜ και 5 μΜ CVT-11127, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Τα κύτταρα Α549 ήταν λιγότερο ευαίσθητη στην ανασταλτική δράση ανάπτυξης κυττάρου του CVT-11127, δεδομένου ότι αυτά τα κύτταρα μειωμένο συντελεστή αντιγραφής τους κατά 20% και 40% όταν έλαβαν θεραπεία με 5 μΜ και 10 μΜ CVT-11127, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων Η460 που έλαβαν θεραπεία με CVT-11127 ήταν 60% χαμηλότερο από ελέγχους που δέχτηκαν φορέα (σχήμα 1C), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα κύτταρα είναι τόσο ευαίσθητα στην antigrowth επίδραση του αναστολέα SCD ως Η1299 κύτταρα.

Α549 (Α) και Η1299 (Β) επωάστηκαν με με διαφορετικές συγκεντρώσεις CVT-11127 (CVT) ή φορέα DMSO επί 24 ώρες, όπως περιγράφεται, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία ιώδες κρύσταλλο. Για μια παρόμοια ανάλυση, Η460 κύτταρα (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μm CVT-11127 για 24 ώρες. Για τον προσδιορισμό της σύνθεσης του DNA, Α549 (D) και τα κύτταρα Η460 (Ε) επωάστηκαν με 10 μΜ και 5 μΜ CVT-11127 ή όχημα για 24 ώρες και δονήθηκαν με [

3Η] θυμιδίνη (1 μΟί /πιάτο) για τη 2 ώρες στους 37 ° C. Σύνολο [

3Η] -επισημασμένο DNA καταβυθίστηκε, η ραδιενέργεια ποσοτικοποιήθηκε σε έναν απαριθμητή σπινθηρισμού και ομαλοποιήθηκε ως προς τη συγκέντρωση πρωτεΐνης. F, MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού, και WS-1 ινοβλάστες ανθρώπινου δέρματος επωάστηκαν με 10 μΜ CVT-11127 (CVT) ή φορέα DMSO επί 24 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη μέθοδο χρώσης με κρυσταλλικό ιώδες. Ε, Η460 κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες με 1 μΜ CVT σε παρουσία 1, 10, 50 και 100 μΜ ελαϊκό νάτριο συμπλοκοποιηθεί με BSA (1:02 BSA: αναλογία λιπαρών οξέων). Κυττάρων επωάζονται με φορέα DMSO θεωρήθηκαν η ομάδα ελέγχου. Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη μέθοδο χρώσης με κρυσταλλικό ιώδες. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α. τριπλών προσδιορισμών. *, P & lt?. 0.05 ή λιγότερο vs ελέγχου, με δοκιμή t του Student

Η

Η επώαση με τον αναστολέα SCD οδήγησε επίσης σε μια βαθιά μείωση (-60%) στην ενσωμάτωση της [

3Η ] θυμιδίνης στο νεοσυντιθέμενο DNA, ένα πρώιμο δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού ρυθμό, τόσο Α549 και καρκινικές κυτταρικές γραμμές Η1299 (Σχήμα 1 D και Ε). Για να επαληθευτεί ότι η antigrowth επίδραση του χημικού αναστολέα SCD δεν κυτταρικό τύπο, MCF-7 και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού, καθώς και σε φυσιολογικό ανθρώπινο WS-1 ινοβλάστες, επωάστηκαν με CVT-11127 για 24 ώρες και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους (Σχήμα 1 F). Διαπιστώθηκε ότι τα καρκινικά κύτταρα του μαστού ήταν ομοίως ευαίσθητα στην κυτταροστατικά δράση του μικρού αναστολέα μόριο SCD. Ωστόσο, ο πολλαπλασιασμός των WS-1 κανονικό ινοβλάστες δέρματος δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η antigrowth επίδραση του αποκλεισμού SCD μπορεί να εξαρτάται από το ρυθμό της αντιγραφής του κυττάρου. Επιπλέον, αυξανόμενες συγκεντρώσεις ελαϊκού σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, πλήρως ή μερικώς ανέστρεψε την παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε Η460 κύτταρα επωάστηκαν με το μικρό μόριο αναστολέα SCD (Σχήμα 1G). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με Η1299 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι είναι ουσιαστικά απαιτείται ελαϊκό οξύ για την πλήρως ενεργή αντιγραφή των καρκινικών κυττάρων.

Όπως ήταν αναμενόμενο, η ανασταλτική της ανάπτυξης δράση του CVT-11127 συσχετίστηκε θετικά με σημαντική αναστολή της δράσης SCD στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α-C, τη θεραπεία της Α549 και Η1299 κυττάρων για 24 ώρες με 10 μΜ και 5 μΜ CVT-11127, αντίστοιχα, μειωμένη δραστικότητα SCD περισσότερο από 95%, όπως προσδιορίστηκε από την παραγωγή του [

14C ] ελαϊκό οξύ από ραδιοεπισημασμένο πρόδρομο της, στεατικό οξύ. Αυτό επιβεβαιώνει ότι CVT-11127 είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικό στην καταστολή της πολύ υψηλή δραστικότητα SCD βρέθηκαν σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου.

Για τον προσδιορισμό της δραστικότητας Δ9-αποκορεσμού σε καρκινικά κύτταρα, Α549 (Α, Β) και Η1299 κύτταρα (A, C) υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με 10 μΜ και 5 μΜ CVT αντίστοιχα, ή φορέα DMSO. Έξι ώρες πριν από την συλλογή, τα κύτταρα σημάνθηκαν με [

14C] 18: 0 (0.25 μΟί /πιάτο). Μετά τη μετατροπή σε μεθυλεστέρες, λιπαρών οξέων διαχωρίστηκαν σε νιτρικού αργύρου-εμποτισμένο πλάκες TLC. Οι ραδιενεργές κηλίδες που αντιστοιχούν στο υπόστρωμα SCD και προϊόντος ([

14C] 18:01), έγιναν ορατές με Phosphor Imager (Α) και ποσοτικοποιείται με πυκνομετρική ανάλυση (Β και C). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α. τριπλών προσδιορισμών. *, P & lt?. 0.05, με την δοκιμασία t του Student

Η

Ως αποτέλεσμα της μείωσης της δράσης SCD 1 με τον αναστολέα μικρό μόριο, την κατανομή των SFA και μονοακόρεστα συνολικά κυτταρικά λιπίδια των κυττάρων Α549 ήταν σημαντικά μεταβληθεί (Σχήμα 3Α και Β). Οι αναλογίες MUFA να SFA στις δύο Ν-7 και Ν-9 λιπαρό οξύ της σειράς μειώθηκε κατά 25% και 35%, αντίστοιχα, σε κύτταρα σε αγωγή για 24 ώρες με CVT-11127 σε σχέση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα. Επιπλέον, οι αναλογίες MUFA /SFA σε κύτταρα Η460 βρέθηκαν μειώθηκε κατά 47% (n-7MUFA /SFA) και 60% (n-9MUFA /SFA) σε κύτταρα που υποβάλλονται σε παρόμοια θεραπεία με CVT-11127 σε σχέση με DMSO επεξεργασμένο κύτταρα (Σχήμα 3C και D). Διαταραχές στο περιεχόμενο MUFA κύτταρο με επωάσεις με τον αναστολέα μικρού μορίου παρατηρήθηκαν ήδη 1 ώρα μετά τη θεραπεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν σαφώς ότι η συνολική σύνθεση αλυσίδα λιπαρού ακυλίου των λιπιδίων σε καρκινικά κύτταρα είναι υπό τον έλεγχο της δραστηριότητας της SCD 1, ακόμη και όταν αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο με FBS, το οποίο περιέχει σημαντικές ποσότητες MUFA.

Α549 κύτταρα (Α, Β) και Η460 κύτταρα (C, D) επωάστηκαν με 10 μΜ και 1 μΜ CVT-11127 (CVT), αντίστοιχα, ή DMSO για 24 ώρες. Τα κυτταρικά λιπίδια αφαιρέθηκαν και τα λιπαρά οξέα μετατράπηκαν σε μορφή μεθυλεστέρας τους με μετεστεροποίηση, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. σύνθεση οξύ μεθυλεστέρες λιπαρών αξιολογήθηκε με αέριο χρωματογραφία και τοις εκατό κατανομή των λιπαρών οξέων υπολογίστηκε. Οι τιμές εκφράζουν την αναλογία 18: 1η-9/18: 0 (A, C) και 16:01-Ν7 + 18: 1η-7/16: 0 (Β, D), και αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α. 4-5 δείγματα. *, P & lt?. 0.01 ή λιγότερο, από την δοκιμασία t του Student

Η

Η αναστολή της SCD 1 μειώνει την de novo σύνθεση των λιπιδίων από

γλυκόζη κύτταρα

Ο καρκίνος έχει τροποποιηθεί ένα σύνολο σηματοδότησης και μεταβολικές οδούς για να ενισχυθεί η χρήση της γλυκόζης ως κύριο υπόστρωμα για την μακρομοριακές βιοσύνθεση και για τις αντιδράσεις παραγωγής ενέργειας [38]. Προηγουμένως, δείξαμε ότι η χρόνια εξάντληση της SCD 1 καταστέλλει το συνολικό ποσοστό της λιπογένεσης [19], [20]. Προκειμένου να αναλύσουμε τους μηχανισμούς μεταβολική ρύθμιση από SCD1, διερευνήσαμε την επίδραση της οξείας αναστολής της δράσης SCD με το νέο μικρό μόριο CVT-11127 στις lipogenic οδούς. Για την τεκμηρίωση του αποτελέσματος της οξείας αδρανοποίησης SCD σε λιπίδιο βιοσύνθεση της γλυκόζης με τη μεσολάβηση, Α549 και Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολέα SCD ή όχημα για 6 ώρες και 24 ώρες αντίστοιχα, και το σχηματισμό του συνολικού κυτταρικού λιπιδίων από [

14C] γλυκόζης ήταν αποφασισμένος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α και Β, η ενσωμάτωση ραδιοσημασμένης γλυκόζης σε ολικό κυτταρικό λιπίδια ήταν σημαντικά μειωμένη (30%) σε SCD αναστολέα επεξεργασμένα Η1299 και τα κύτταρα Α549 σε σχέση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα. Όπως παρατηρήθηκε στο παρελθόν [20], η ενσωμάτωση ραδιοσημασμένης γλυκόζης σε ολικών λιπιδίων μειώθηκε κατά περίπου 20% στα κύτταρα σταθερή SCD 1-νοκ ντάουν Α549 (hSCDas) (Σχήμα 4C), επιβεβαιώνοντας ότι η παρουσία ενός πλήρως ενεργό SCD 1 είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ταχείας γλυκόζη μεσολάβηση λιπογένεση σε καρκινικά κύτταρα. Η μεταβολή στο σχηματισμό της [

14C] λιπίδια γλυκόζη-επισημασμένο δεν προκλήθηκε από μια ανεπάρκεια της πρόσληψης της γλυκόζης επειδή παρατηρήσαμε καμία αλλαγή στο ρυθμό [

3Η] πρόσληψη δεοξυγλυκόζης σε κύτταρα κατεργασμένα με CVT ή όχημα ( Εικόνα 4D). Ενσωμάτωση ραδιοσημασμένης γλυκόζης στα λιπαρά οξέα των λιπιδίων καρκινικού κυττάρου μειώθηκε με κατεργασία με CVT (Σχήμα 4Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μη φυσιολογική διαμόρφωση των λιπιδίων στα κύτταρα που υποβάλλονται σε αναστολή της SCD 1 μπορεί να προκληθεί από μια ελαττωματική de novo λιπαρού οξέος βιοσύνθεση. Όπως ήταν αναμενόμενο, η παραγωγή γλυκόζης-επισημασμένου μονοακόρεστα σχεδόν κατασταλεί πλήρως σε Η1299 κυττάρων με ένα μπλοκ σε δραστηριότητα SCD (Σχήμα 4Ε, άνω πάνελ). Επιπλέον, η βιοχημική μεταβολή λιπογένεση σε κύτταρα με χημικό μπλοκάρισμα της SCD φαίνεται να βρίσκεται κατάντη του σχηματισμού ακετυλΟοΑ δεδομένου ότι ένα μειωμένο σχηματισμό του [

14C] λιπίδια οξικό σημασμένο παρατηρήθηκε σε Η1299 κύτταρα CVT-αγωγή σε σχέση με όχημα κατεργασμένα δείγματα αναφοράς (Σχήμα 4F).

Α549 κύτταρα (Α) και Η1299 κύτταρα (Β) επωάστηκαν με 10 μΜ και 1 μΜ CVT-11127 (CVT), αντίστοιχα, ή DMSO για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια δονήθηκαν με 1 μΟΐ D- [U-

14C] γλυκόζη για μέχρι 24 ώρες. C, Α549 κύτταρα με μια σταθερή knockdown στην έκφραση SCD1 (hSCDas) και ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε παρόμοια επώαση με [

14C] γλυκόζης. Τα κυτταρικά λιπίδια αφαιρέθηκαν και ενσωμάτωση της [

14C] γλυκόζης σε ολικά λιπίδια ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση σπινθηρισμού και ομαλοποιήθηκε ως προς τη συγκέντρωση πρωτεΐνης. D, βασική πρόσληψη γλυκόζης αποτιμήθηκε σε Η1299 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 1 μΜ CVT ή το όχημα για 24 ώρες από την εκτίμηση της πρόσληψης του [

3Η] δεοξυγλυκόζης. Ε, κύτταρα Η1299 επωάστηκαν με [

14C] γλυκόζης παρουσία ή απουσία 1 μΜ CVT για 6 ώρες και τα επίπεδα της ολικής [

14C] λιπαρά οξέα, καθώς και ραδιοεπισημασμένο SFA και MUFA (άνω πάνελ), προσδιορίστηκαν με αργυρώσεως TLC όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. F, ο ρυθμός σύνθεσης των λιπιδίων σε Η1299 κύτταρα εκτιμήθηκε με επώαση με 1 μΜ CVT ή όχημα και 0,5 μCi /τρυβλίο του [

14C] οξικό για 24 ώρες. Τα λιπίδια εκχυλίστηκαν και η ραδιενέργεια των ολικών λιπιδίων προσδιορίστηκε με απαρίθμηση σπινθηρισμού. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± Τ.Α. τριπλών προσδιορισμών. *, P & lt?. 0,05 ή λιγότερο, από την δοκιμασία t του Student

Η

Η διέγερση της γλυκόλυσης /λιπογένεσης δεν αντιστραφεί η μείωση του πολλαπλασιασμού των SCD1 ανεπάρκεια κύτταρα

Όπως περιγράφεται παραπάνω, οξείες φαρμακολογική αποκλεισμός της δράσης SCD και σταθερή γονιδίου νοκ ντάουν της SCD 1 μεταβάλλουν σημαντικά τα ποσοστά της γλυκόζης με τη μεσολάβηση λιπογένεση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Υποθέσαμε ότι μία διαταραχή στην αερόβια γλυκόλυση θα μπορούσε να είναι η πρωταρχική αιτία της εξασθενημένη πολλαπλασιασμό και την επιβίωση του SCD 1 ελλειμματικών κυττάρων ([19], [20] και Σχήμα 1). Στη συνέχεια προσδιορίζεται το ποσοστό της γλυκόλυσης σε Α549 και Η1299 κυττάρων με την αξιολόγηση των επιπέδων γαλακτικού στο ρυθμισμένο μέσο, ​​ένας δείκτης της αερόβιας γλυκόλυσης ρυθμό σε καρκινικά κύτταρα [39], και βρήκε μια αύξηση της τάξης του 30-60% σε κύτταρα που υποβάλλονται σε φαρμακολογική αναστολή του SCD σύγκριση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα (Σχήμα 5Α). Για να επιβεβαιωθεί ότι η μεταβολή της ροής του γλυκολυτικού μεταβολιτών δεν ήταν υπεύθυνος για την ανεπαρκή αντιγραφή των κυττάρων SCD 1-αποκόπτεται, επωάσαμε τα κύτταρα σε μέσο που περιέχει πολύ χαμηλή (0,5 mM), η κανονική (5,5 mM) ή υψηλές (25 mM) επίπεδα γλυκόζης και προσδιορίζεται το ποσοστό της σύνθεσης του DNA και την κυτταρική ανάπτυξη. Όπως φαίνεται για άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές, κύτταρα Α549 εμφανίζεται αυστηρή εξάρτηση γλυκόζη για πολλαπλασιασμό (Σχήμα 5Β). Όταν αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜ ουσιαστικά χωρίς γλυκόζη (που περιέχει περίπου 0,5 mM γλυκόζης από το 10% FBS-συμπλήρωση) για 24 ώρες, με την ενσωμάτωση του ραδιοσημασμένου θυμιδίνης στο DNA του SCD 1-ανεπαρκή (hSCDas) και έλεγχος των κυττάρων μειώθηκε κατά 70%, όταν σε σύγκριση με κύτταρα που αναπτύσσονται κάτω από πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας (5.5 mM γλυκόζη). Ωστόσο, ο ρυθμός μειώθηκε σημαντικά από τη σύνθεση του DNA που παρατηρήθηκε στα κύτταρα SCD 1-αποκόπτεται παρέμενε ανεξάρτητα από το επίπεδο της γλυκόζης στο μέσο καλλιέργειας.