Αφηρημένο

καρκίνο του στομάχου είναι μια κακοήθης νόσος που προκύπτει από το γαστρικό επιθήλιο. Μια πιθανή βιοδεικτών για καρκίνο του στομάχου είναι η πρωτεΐνη αννεξίνης Α4 (ANXA4), ένα ενδοκυτταρικό Ca

αισθητήρα 2+. ANXA4 βρίσκεται κυρίως σε επιθηλιακά κύτταρα, και είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, ποδηλασία κυττάρων και αντιπηκτική αγωγή. Σε σχέση με τον καρκίνο, ANXA4-υπερέκφραση έχει παρατηρηθεί σε καρκίνους διαφόρων προελεύσεων, συμπεριλαμβανομένων γαστρικών όγκων που σχετίζονται με το

Helicobacter pylori

μόλυνση.

Η. pylori

προκαλεί ANXA4 έκφραση και ενδοκυτταρική [Ca

2 +]

i υψόμετρο, και είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για καρκινογένεση που οδηγεί σε καρκίνο του στομάχου. Παρά αυτή την συσχέτιση, ο ρόλος του ANXA4 στην εξέλιξη των γαστρικών όγκων παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε αν ANXA4 μπορεί να μεσολαβήσει το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων και κατά πόσον οι ANXA4 κατάντη σήματα που εμπλέκονται στην καρκινογένεση. Μετά την παρατήρηση του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων σε πραγματικό χρόνο, διαπιστώσαμε ότι ANXA4 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Το προφίλ γονιδιακής μεταγραφής των κυττάρων ANXA4 υπερεκφράζουν μετρήθηκε και αναλύθηκε με συστοιχίες ανθρώπινο εξώνιο. Από αυτό μεταγραφική δεδομένα γονιδίου, δείχνουμε ότι η υπερέκφραση του ANXA4 ρυθμίζει γονίδια που είναι γνωστό ότι σχετίζονται με τον καρκίνο, για παράδειγμα, την ενεργοποίηση της υαλουρονάνης με τη μεσολάβηση υποδοχέα κινητικότητα (RHAMM), ΑΚΤ, και κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση 1 (CDK1), καθώς και η καταστολή της p21. Η ρύθμιση αυτών των γονιδίων προκαλεί περαιτέρω πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Βρήκαμε επίσης Ca

2 + θα μπορούσε να ρυθμίσει τη μετάδοση των σημάτων προς τα κάτω από ANXA4. Προτείνουμε ότι ANXA4 ενεργοποιεί μια καταρράκτη σηματοδότησης, οδηγώντας σε αυξημένο πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων, την προώθηση τελικά καρκινογένεση. Τα αποτελέσματα αυτά μπορεί συνεπώς να παρέχει μια νέα αντίληψη για το γαστρικό θεραπεία του καρκίνου, ειδικότερα μέσω της τροποποίησης της δραστηριότητας ANXA4

Παράθεση:. Lin LL, Huang HC, Χουάν HF (2012) αποκαλύπτοντας το μοριακό μηχανισμό της γαστρικός καρκίνος Marker Αννεξίνη A4 στον Καρκίνο κυτταρικού πολλαπλασιασμού Χρησιμοποιώντας Exon πίνακες. PLoS ONE 7 (9): e44615. doi: 10.1371 /journal.pone.0044615

Συντάκτης: Eric Γ Chuang, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, Ταϊβάν

Ελήφθη: 6, Ιούν 2012? Αποδεκτές: 6, Αύγ του 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Ταϊβάν (NSC 99 έως 2.621-B-002-005-my3, NSC 99 έως 2.621-B-010-001-my3), το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν αιχμής Πρόγραμμα Καθοδήγησης Ερευνών (10R70602C3) και το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών Υγείας, Ταϊβάν (NHRIEX100-9819PI). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως και παρουσιάζει υψηλό επιπολασμό σε ασιατικούς πληθυσμούς. Παρά το γεγονός ότι η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του στομάχου μειώνεται, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών παραμένει σε χαμηλά επίπεδα [1]. Καθορισμός των πιο αποτελεσματικών γαστρικό θεραπείες του καρκίνου και την ανάπτυξη σε πρώιμα στάδια διαγνωστικά εργαλεία είναι σημαντικές στρατηγικές που επηρεάζουν τα κλινικά αποτελέσματα. Η ολοκληρωμένη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη γαστρική καρκινογένεση θα μπορούσε να παρέχει βοήθεια για την ανάπτυξη χρήσιμων θεραπευτικών στρατηγικών για την ασθένεια αυτή.

Helicobacter pylori

είναι ένα γαστρικό παθογόνο και είναι ο κυρίαρχος αιτιολογικός παράγοντας για την γαστρική καρκινογένεση . Περίπου το ήμισυ του παγκόσμιου πληθυσμού έχει μολυνθεί με το

H. pylori

, και περισσότερο από το 60% των ασθενών με καρκίνο του στομάχου έχουν ιστορικό

H. pylori

-positivity [2], [3], [4]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι

H. pylori

μπορεί να διεγείρει τόσο τον πολλαπλασιασμό των γαστρικών καρκινικών κυττάρων και του βλεννογόνου φλεγμονώδεις αποκρίσεις [5], [6]. Έτσι, προκειμένου να διερευνηθούν οι μοριακοί μηχανισμοί υποκείμενη γαστρική καρκινογένεση, είναι απαραίτητο να διερευνηθεί ο ρόλος και οι μηχανισμοί του

H. pylori

σε γαστρικό καρκινογένεση.

αννεξίνες εκφράζονται παντού στους περισσότερους οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων των ζώων, των φυτών, των μυκήτων και πρώτιστα. Συνδέεται με μια ποικιλία από φυσιολογικές λειτουργίες [7]. Με βάση τη δομή του τομέα τους διατηρημένων πυρήνα, οι αννεξίνες θεωρούνται ενδοκυτταρικού Ca

2+ αισθητήρες και πρωτεΐνες σύνδεσης φωσφολιπιδίου. Έχουν παρατηρηθεί για την τόνωση της διακίνησης μεμβράνη και συσσωμάτωση κυστιδίων ως απάντηση στην αυξημένη ενδοκυτταρική [Ca

2 +]

i [8], [9]. Στους ανθρώπους, οι αννεξίνες έχουν παρατηρηθεί να έχουν μια σειρά κυτταρικών λειτουργιών που έχουν υπονοείται στην κυτταροσκελετική οργάνωση, εξωκυττάρωση, ενδοκυττάρωση, ρύθμιση διαύλων ιόντων, φλεγμονή, απόπτωση, ινωδόλυσης και πήξη [8]. Αννεξίνες θεωρούνται επίσης ότι εμπλέκονται σε καρκίνο, διαβήτη και φλεγμονή [10]. Πρόσφατα, όλο και περισσότερες μελέτες έχουν προκύψει που εμπλέκουν τη συμμετοχή των αννεξίνες στην καρκινογένεση, καθώς και την προώθηση του πολλαπλασιασμού [11], [12], εισβολή [13] και τη μετάσταση [14], [15]. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ όλων των μελών της οικογένειας αννεξίνες με καρκίνο δεν έχει χαρακτηριστεί.

αννεξίνης A4 (ANXA4) είναι ένα μέλος της οικογένειας αννεξίνες που σχετίζονται με το πεπτικό σύστημα. Είναι εμφανώς εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα [16]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ANXA4 θεωρείται ότι είναι ένας δυνητικός γαστρικό βιοδείκτης βασίζεται στην ταυτοποίηση του σε ιστούς ασθενών γαστρικού καρκίνου σε πρωτεομική μελέτες. Up-ρύθμιση του ANXA4 βρίσκεται συγκεκριμένα στο

H. pylori

μολυνθέντα ιστούς όγκων [17], [18]. Επιπλέον, πολλές μελέτες έχουν αναφέρει μια σχέση μεταξύ εκφράσεως ANXA4 και του καρκίνου. Η σχέση αυτή έχει αναφερθεί σε παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα [19], σαφείς καρκίνωμα ωοθήκης [20], [21], νεφρικό καρκίνωμα [22], ορθοκολικό καρκίνωμα [23] και του καρκίνου του προστάτη [24]. Σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, τα πάνω ρύθμιση του ANXA4 εμπλέκεται στην διάδοση των καρκινικών κυττάρων, την προώθηση της μετανάστευσης των κυττάρων [22]. Σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο, υψηλή έκφραση ANXA4 σχετίστηκε με χαμηλό ποσοστό επιβίωσης και αναφέρθηκε ως πιθανό βιοδείκτη για τη διάγνωση των όγκων [23]. Εφόσον κυτταρική λειτουργία, ANXA4 μπορεί να επάγει σηματοδότηση ασβέστιο, αντιπηκτική αγωγή και αντίσταση στην απόπτωση [25], [26]. Αυτά τα γεγονότα δείχνουν ότι ANXA4 έχει ογκογόνο λειτουργία ρυθμίζοντας ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων.

Στην παρούσα μελέτη, που προορίζεται για τη διαλεύκανση του μοριακού μηχανισμού με τον οποίο ANXA4 προκαλεί καρκινογένεση. Για να επιτευχθεί αυτό, θα παρακολουθείται ο ρυθμός αύξησης των γαστρικών καρκινικών κυττάρων με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης της ANXA4. Αξιολογήσαμε επίσης τη μεταγραφική προφίλ έκφρασης του ANXA4-κύτταρα που υπερεκφράζουν και να χρησιμοποιηθούν συστοιχίες εξόνιο για να αναλύσει την κατάντη σηματοδότησης του ANXA4. Από τις μελέτες αυτές, εντοπίσαμε 9 γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο από ANXA4 κατάντη σήματα χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων Ingenuity Pathway Ανάλυση (IPA). Επιπλέον, αποδείξαμε ότι ANXA4 ρυθμίζει την ενεργοποίηση του RHAMM, ΑΚΤ, CDK1 και την καταστολή της p21, και ως εκ τούτου πρότεινε μια ANXA4 ρυθμιζόμενων κυτταρικό μονοπάτι διάδοσης.

Αποτελέσματα

Η ενεργοποίηση της ANXA4 Προωθεί κυτταρικού πολλαπλασιασμού

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ANXA4 υπερεκφράζεται στο

H. pylori

μολυσμένο γαστρικό ιστό του όγκου [17]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω τη σχέση μεταξύ ANXA4 και την καρκινογένεση, έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει αν ANXA4 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με πλήρους μήκους

ANXA4

cDNA για αύξηση της έκφρασης ANXA4 ή ειδικά siRNA που προορίζονται να σιγήσει ANXA4 έκφρασης. Μετά την επιμόλυνση, θα παρακολουθείται ο ρυθμός ανάπτυξης της AGS γαστρικών καρκινικών κυττάρων με τη χρήση ενός συστήματος σε πραγματικό χρόνο ανάλυση των κυττάρων (RTCA). Οι αριθμοί των κυττάρων καταγράφηκαν ως τιμή του δείκτη κυττάρων (CI). Οι καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων AGS τροποποιήθηκαν μετά την επιμόλυνση. Η υπερέκφραση του ANXA4 αύξησε σημαντικά τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων σε κύτταρα AGS σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1Α), ενώ ANXA4 νοκ ντάουν μειώθηκε σημαντικά το ρυθμό ανάπτυξης (

P

& lt ? 0,001? Εικόνα 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ANXA4 έχει τη δυνατότητα να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Για τη μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, AGS κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 16-φρεατίων E-πλάκα. Μετά από επώαση για 24 ώρες, ο ρυθμός ανάπτυξης κυττάρου των κυττάρων (Α) που υπερεκφράζουν ANXA4, και κυττάρων (Β) που περιέχει

ANXA4

-ειδικές siRNA μετρήθηκαν. Παρατηρήθηκε ότι ANXA4 ρυθμίζεται το δείκτη κυττάρου σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. (Α και Β) Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν από μετρήσεις που λαμβάνονται στις 24 ώρες, η οποία ήταν όταν ξεκίνησε την επιμόλυνση. Ο χρόνος ανίχνευσης από τρία ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, η = 3.

P

τιμές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το δύο-δείγματος δοκιμής Kolmogorov-Smirnov.

Η

ANXA4 αυξάνει την έκφραση των πρωτεϊνών της μεμβράνης, RHAMM και LAMP2

επίσης εξετάσαμε τη διαφορά στην έκφραση γονιδίων μεταξύ των κυττάρων που υπερεκφράζουν ANXA4-και τα κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν ένα άδειο φορέα. Εξετάσαμε αυτό χρησιμοποιώντας εξόνιο ανάλυση της σειράς, η οποία προσφέρει μια πιο ακριβή εικόνα της έκφρασης του γονιδίου-επίπεδο χρησιμοποιώντας τέσσερις ανιχνευτές ανά εξόνιο, σε σύγκριση με τα συμβατικά 3 «συστοιχίες [27]. Στο Σχήμα S1, το

X

-άξονα του διαγράμματος διασποράς εμφανίζει η ένταση της έκφρασης καθετήρα μετράται σε ένα πείραμα και το

Υ-

άξονα εμφανίζει τις εντάσεις της έκφρασης καθετήρα μετράται στο άλλο πείραμα . Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ένα συσχετισμό μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο πειραμάτων και ως εκ τούτου δείχνουν μια συνοχή μεταξύ μικροσυστοιχίες διπλούν μας. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου υπολογίστηκαν από τις εντάσεις μετρούνται μέσω σετ καθετήρα. Συνολικά, η έκφραση των 1.052 γονίδια βρέθηκαν να είναι σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05). Μεταξύ των κυττάρων ANXA4-υπερεκφράζουν και κύτταρα ελέγχου

ANXA4 είναι μία μεμβράνη πλάσματος πρωτεΐνη δέσμευσης, έτσι ώστε να προτείνει ότι άλλες πρωτεΐνες της μεμβράνης του πλάσματος μπορεί να ρυθμίζεται από ANXA4 και να εργαστούμε μαζί για την μεταγωγή προς τα κάτω σηματοδότηση της. Για να εξερευνήσετε την μεταγωγή σηματοδότησης ρυθμίζεται από ANXA4, ερευνήσαμε τις πρωτεΐνες της μεμβράνης του πλάσματος από το εξόνιο ανάλυση της σειράς. Σαράντα επτά πρωτείνες μεμβράνης πλάσματος παρατηρήθηκαν να έχουν ένα ≥1.5 φορές αλλαγή σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ANXA4 (Πίνακας S1). Μεταξύ αυτών, η υαλουρονάνη μεσολάβηση υποδοχέα κινητικότητα (

HMMR

) έδειξε την μεγαλύτερη αύξηση στην έκφραση (2.4-φορές? Πίνακας S1). Επιπλέον, προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση κυτταρικής επιφάνειας πρωτεΐνης λυσοσωματικής μεμβράνης σχετιζόμενη 2 (

LAMP2

), ένας δείκτης λυσοσωμική, ρυθμίζεται προς τα πάνω από ANXA4 και εμπλέκεται σε εξωκυττάρωση (Εικόνα S2 και S1 αρχείου) . Εδώ, η μεταγραφική έκφραση του

LAMP2

έδειξαν επίσης μια αύξηση στην έκφραση (1,8 φορές? Πίνακας S1), όταν μετράται με ανάλυση συστοιχίας εξόνιο. Σε αυτή τη μελέτη, ANXA4 υπερεκφράστηκε ή σιγήσει (Σχήμα 2Α) και στη συνέχεια αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση να ελέγξει την έκφραση πρωτεΐνης του RHAMM και LAMP2. ANXA4 υπερέκφραση αύξησε την έκφραση του RHAMM (Σχέδιο 2Β) και LAMP2 (Σχήμα 2C) και, σύμφωνα με αυτό, η knockdown έκφρασης ANXA4 μειωμένα επίπεδα έκφρασης τους (Σχήμα 2Β και 2C).

(Α) AGS κύτταρα επιμολυσμένα με είτε ένα άδειο φορέα (pcDNA3.1), πλήρους μήκους

ANXA4

(pcDNA3.1 /

ANXA4

), ελέγχου siRNA (siControl), ή

ANXA4

siRNA (si

ANXA4

). (Β-Γ) ΚΗΑΜΜ και εκφράσεις LAMP2 μετρήθηκαν σε κύτταρα ANXA4-υπερεκφράζουν ή κύτταρα που περιέχουν

ANXA4

-ειδικών siRNA με ανοσοαποτύπωση ανάλυση. (Β) Η έκφραση των RHAMM ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (

P

& lt? 0,05) μετά υπερεκφράζουν ANXA4 και σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται (

P

& lt? 0,01) μετά την φίμωση της έκφρασης ANXA4. (Γ) Η έκφραση της LAMP2 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω μετά που υπερεκφράζουν ANXA4 και σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται (

P

& lt? 0,05) μετά την φίμωση της έκφρασης ANXA4. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, n = 3. *

P

& lt?. 0,05 έναντι θεραπείας τιμές ελέγχου

Η

ANXA4 υπερέκφραση Ρυθμίζει σχετίζονται με τον καρκίνο Γονιδιακής Έκφρασης

Χρησιμοποιήσαμε τη βάση δεδομένων Ingenuity Pathway ανάλυση (IPA) για να εκτελέσει μια ανάλυση της λειτουργίας των γονιδίων των δεδομένων συστοιχίας εξόνιο και διαπίστωσε ότι 25 από τα 42 γονίδια ήταν επιλέξιμες για την ανάλυση της λειτουργίας του δικτύου (≥2 φορές διαφορικής έκφρασης,

t

test,

P

& lt? 0,05) (Πίνακας 1). Τρία λειτουργικά δίκτυα ήταν σημαντικά σχετίζεται με γονίδια ANXA4-ρυθμίζονται. Η πιο έντονα σχετίζεται το δίκτυο ήταν

καρκίνου, του κυτταρικού κύκλου, και του αναπαραγωγικού συστήματος της νόσου (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 3Α), και η κορυφαία ασθενειών ή ανωμαλιών ήταν

καρκίνο

(

P

& lt? 0,05? Σχήμα 3Β). Υπήρχαν 9 γονίδια έχουν ταξινομηθεί ως γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ANXA4-συμπεριλαμβανομένων 7 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στα πειράματά μας. Αυτά τα γονίδια είναι παράγοντας έναρξης ευκαρυωτικό μετάφρασης 4Ε (

eIF4E

), ηλεκτρική αφυδρογονάση συγκρότημα, υπομονάδα C, ενσωματωμένη μεμβρανική πρωτεΐνη, 15 kDa (

SDHC

), κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση 1 (

CDK1

), διαγράφονται σε λεμφοκυτταρική λευχαιμία 2 (

dLEU2

), χρωματίνη τροποποίηση πρωτεΐνης 5 (

CHMP5

), διαχρονικό αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνη (

TIPIN

), PDZ- δεσμευτική κινάσης (

PBK

). Χοριακή somatomammotropin ορμόνη 1 (γαλακτογόνο πλακούντα) (

CSH1

) και ιντερφερόνη άλφα 2 (

IFNA2

) ήταν κάτω-ρυθμίζονται από ANXA4. Με βάση τα αποτελέσματα μας, προτείνουμε ότι ANXA4 έχει μια λειτουργία στην επαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Επιπλέον,

CDK1

και

PBK

(Σχήμα 3Β και Πίνακας 1) θεωρήθηκαν ότι εμπλέκεται στο μοντέλο πολλαπλασιασμού επάγει ANXA4. Δεδομένου ότι η ενεργοποίηση CDK1 συνδέεται με το κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε αναπτυσσόμενες γαστρικό λέμφωμα MALT [28]. Η αμοιβαία ενεργοποίηση των CDK1 και PBK έχει αναφερθεί προηγουμένως [29]. Σε αυτή τη μελέτη, η αυξητική ρύθμιση του

CDK1

και

PBK

παρατηρήθηκε σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ANXA4-ελέγχθηκε μέσω ποσοτικής πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-) ανάλυση (Σχήμα S3) .

Η

(Α) 25 από τα 42 υποψήφια γονίδια έδειξαν μια σημαντική διαφορά στην έκφραση (μια τριπλάσια αύξηση της ≥2 ή μια πτυχή μείωση των ≤0.5,

P

& lt? 0,05 ) και κατηγοριοποιούνται μεταξύ των τριών κορυφαία δίκτυα. (Β) Τα γονίδια που ταξινομήθηκαν σύμφωνα με τεκμηριωμένες /καθιερωμένους ρόλους τους σε διάφορες καταστάσεις ασθενειών και διαταραχών.

Η

ANXA4 Ρυθμίζει την ενεργοποίηση της ΑΚΤ, CDK1 και την καταστολή της p21

ενεργοποίηση CDK1 , το οποίο ρυθμίζεται από ρ21, αναστέλλει την G2 /M φάση σύλληψης, προωθώντας έτσι τη μίτωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [30]. Έχει επίσης αναφερθεί ότι εμποδίζει την ενεργοποίηση ΑΚΤ του ρ21, προκαλώντας συσσώρευση του στο κυτταρόπλασμα και, κατά συνέπεια, η προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [31]. Χρησιμοποιώντας ανάλυση ανοσοκηλίδος, παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση του ANXA4 αύξησε τη φωσφορυλίωση της σερίνης 473 σε ΑΚΤ και θρεονίνη 161 σε CDK1 και μείωσε την έκφραση της ρ21 (Εικόνα 4Α). Εκτός από αυτό, η knockdown έκφρασης ANXA4 μειώθηκε φωσφο-ΑΚΤ και φωσφο-CDK1 και αύξησε την έκφραση του p21 (Σχήμα 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η φωσφο-ΑΚΤ, φωσφο-CDK1 και p21 ρυθμίζονται από ANXA4 και κατάντη σήματα ANXA4

(Α

–

Β). Τα επίπεδα πρωτεΐνης του p21, φωσφο-ΑΚΤ ( Ser473) και φωσφο-CDK1 (Thr161) σε AGS κύτταρα, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση ανοσοκηλίδωσης. (Α) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με κενό φορέα ή πλήρους μήκους

ANXA4

. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με siControl ή si

ANXA4

. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0,01 έναντι θεραπείας τιμές ελέγχου

Η

Ca

2 + Παρεμβαίνει ANXA4 μεταγενέστεροι Μεταγωγή Σηματοδοσίας

στην καρκινογένεση, Ca

2+ συμμετέχει στην πρόκληση μεταγωγής σήματος για να μεσολαβήσει μια ευρεία ποικιλία των βιολογικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της εισβολής, του πολλαπλασιασμού, της αγγειογένεσης και της μετάστασης [32]. Έχει αναφερθεί ότι αννεξίνες μπορεί να μεσολαβήσει κάποιες φυσιολογικών μηχανισμών σε ένα Ca

2 + -εξαρτώμενη τρόπο [9]. Σε προηγούμενες μελέτες, ενδοκυτταρική [Ca

2 +]

i ανύψωση προκλήθηκε από

H. pylori

μόλυνση, η οποία, με τη σειρά του, up-ρυθμίζει την έκφραση ANXA4 [17], [33]. Για να διαπιστωθεί αν η αύξηση του ενδοκυτταρικού [Ca

2 +]

i διαμεσολαβεί τη μετάδοση των μεταγενέστερων σημάτων από ANXA4, AGS κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ιονομυκίνη. Ιονομυκίνη είναι Ca προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας σε AGS μοντέλο κύτταρο μας να επάγουν μια παρατεταμένη αύξηση του ενδοκυτταρικού

2+ ιονοφόρο και [Ca

2 +]

i [34]. Οι πρωτεΐνες εκφράσεις ANXA4, LAMP2, RHAMM, ρ21, φωσφο-ΑΚΤ και φωσφο-CDK1 μετρήθηκαν με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης (Σχήμα 5Α). Παρόμοια με τις παρατηρήσεις μας με ANXA4 υπερέκφραση, αυξημένη [Ca

2 +]

i επίπεδα σημαντικά up-ρυθμίζεται η έκφραση του RHAMM (

P

& lt? 0,01) και φωσφο-ΑΚΤ (Ser 473) (

P

& lt? 0,05) και σημαντικά κάτω ρυθμισμένα την έκφραση του p21 (

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 5Β). ενεργοποίηση CDK1 αυξήθηκε ελαφρά από [Ca

2 +]

i υψόμετρο. Ωστόσο, αυξημένα [Ca

2 +]

i επίπεδα δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του ANXA4 και LAMP2. Σε προηγούμενη μελέτη μας, ANXA4 και LAMP2 μπορούν να εντοπιστούν σε μεμβράνη του πλάσματος μετά από

H. pylori

μόλυνση με ενδοκυτταρικά [Ca

2 +]

i ανύψωσης (Σχήμα S4 και S1 αρχείου). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Ca

2+ αλλάζει μόνο ενδοκυτταρική θέση των ANXA4 και LAMP2, αλλά δεν ρυθμίζει την έκφρασή τους.

(Α) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ιονομυκίνη για την αύξηση της ενδοκυτταρικής

2+ επίπεδα Ca, και τα επίπεδα έκφρασης του ANXA4, LAMP2, RHAMM, φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), ρ21, και φωσφο-CDK1 (Thr161) έχουν έδειξε με ανοσοστύπωση. (Β) Το ιστόγραμμα δείχνει τα συναφή επίπεδα (Α). Οι σχετικές εκφράσεις του RHAMM (

P

& lt? 0.01), φωσφο-ΑΚΤ (Ser473) (

P

& lt? 0,05) και p21 (

P

& lt? 0,01) ήταν σημαντικά διαφορετικά. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα (μέση ± SD). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0,01 έναντι θεραπείας τιμές ελέγχου

Η

Συζήτηση

Στην έρευνα για τον καρκίνο, ο προσδιορισμός των βιοδεικτών και η επακόλουθη διευκρίνιση των μηχανιστικών σχέσεις τους με την ογκογένεση μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη χρήσιμων διαγνωστικών εργαλείων και να οδηγήσει σε βέλτιστη θεραπευτικές στρατηγικές. Πρόσφατα, όλο και περισσότερες μελέτες έχουν δείξει ότι οι υποψήφιες βιοδείκτη πρωτεΐνες στην οικογένεια αννεξίνες είναι δυνητικά ρόλο στην εξέλιξη διαφόρων καρκίνων? π.χ., ANXA1 σαφείς κύτταρο νεφρικό καρκίνο, ANXA2 για γαστρικό καρκίνο και ορθοκολικό καρκίνο, ANXA4 για καρκίνο του παχέος εντέρου, ANXA8 για τον καρκίνο του μαστού, ANXA10 για τον καρκίνο στο ήπαρ, ANXA11 για τον καρκίνο των ωοθηκών και του παχέος εντέρου [35]. ANXA4, ένα μέλος της οικογένειας αννεξίνες, έχει παρατηρηθεί ότι υπερεκφράζεται σε γαστρικό ιστούς όγκων και συνδέεται επίσης με τον καρκίνο του στομάχου σχετίζεται

H. pylori

μόλυνση [17]. Επιπλέον, ένα άλλο μέλος της οικογένειας αννεξίνες, ANXA2, έχει επίσης παρατηρηθεί ότι υπερεκφράζεται σε καρκίνο του στομάχου και σχετίζεται με κακή κλινική έκβαση, καθιστώντας το ένα δυνητικό προγνωστικός παράγοντας [36]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν την εμπλοκή των ANXA4 στην ογκογένεση? Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός στη διαδικασία παραμένει ασαφής. Προκειμένου να αξιολογηθεί περαιτέρω η κυτταρική λειτουργία της ANXA4 στην εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου, διερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ των δύο και στη συνέχεια απέδειξαν ότι ANXA4 μπορεί να ρυθμίζει γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο και να διαδώσει τη διαδρομή προς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

η παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι οι καρκινογένεση που σχετίζονται πρωτεΐνες όπως RHAMM, ΑΚΤ, ρ21, PBK, και CDK1 ρυθμίζεται από την υπερέκφραση του ANXA4. Μια σχηματική αναπαράσταση του ANXA4 επαγόμενης κατάντη σήματα που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό δείχνεται στο Σχήμα 6.

HMMR

(RHAMM) είναι ένα ογκογονίδιο που υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στομάχου και έχει εμπλακεί σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, όπως κύτταρο σηματοδότηση, πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και ογκογένεση [37], [38].

ANXA4 δεσμεύεται με την μεμβράνη του πλάσματος σε Ca

2 + -εξαρτώμενη τρόπο και επάγει κατάντη μεταγωγή σηματοδότησης. ANXA4 up-ρυθμίζει LAMP2, ένα δείκτη λυσοσωμική εμπλέκονται στην εξωκυπάρωση, και RHAMM. Προηγούμενες αναφορές έδειξαν ότι RHAMM ενεργοποιεί RAS και ΡΙ3Κ, το οποίο στη συνέχεια οδηγεί στην επαγωγή της ΑΚΤ. ANXA4 up-ρυθμίζει την ΑΚΤ και CDK1 ενεργοποίηση, την έκφραση του γονιδίου PBK και ρυθμίζει προς τα κάτω p21. Ca

2+ και up-ρυθμίζει ΚΗΑΜΜ και φωσφο-ΑΚΤ, και ρυθμίζει προς τα κάτω p21. Αυτό καταρράκτη σήμα θα μπορούσε τελικά να οδηγήσει σε κυτταρικό υπερπολλαπλασιασμό. Συμπαγείς γραμμές με βέλη και μπλε κύκλοι δείχνουν επιβεβαίωσε ρύθμιση? διακεκομμένες γραμμές με βέλη και μωβ κύκλοι δείχνουν αναφορές ή ανεπιβεβαίωτες αλληλεπιδράσεις.

Η

Έχει αναφερθεί ότι RHAMM προκαλεί την καταρράκτη σηματοδότησης RAS και ενεργοποιεί ΑΚΤ [39]. Η καταρράκτη σηματοδότησης RAS μετατρέπει κατάντη σήματα ενεργοποιώντας φωσφο-ΑΚΤ μέσω φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινασών. Αυτή η ενεργοποίηση του ΑΚΤ έχει επίσης αναφερθεί ως ένας δείκτης για γαστρικό εξέλιξης του καρκίνου [40]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι

H. pylori

λοίμωξη σχετίζεται με ANXA4 υπερέκφραση [17].

Η. pylori

μπορεί να παραδώσει το σχετικό κυτοτοξίνη γονίδιο Α (CagA) σε κύτταρα-ξενιστές, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ΑΚΤ, και προωθώντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [41]. Από την άποψη της επιβίωσης των κυττάρων, ΑΚΤ καταστέλλει απόπτωση με διέγερση ΝΡ-κΒ [42]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι ANXA4 αλληλεπιδρά με ρ105 (τον πρόδρομο ρ50 πρωτεΐνη NF-κΒ) και καταστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ για την επαγωγή αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα [25]. Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι ANXA4 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων και την ανάπτυξη των κυττάρων.

CDK1-κυκλίνης Β1 σύμπλοκα ρυθμίζουν την G2 του κυτταρικού κύκλου /Μ φάση και έχουν επίσης εμπλακεί στην προαγωγή ογκογένεσης [43]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η αυξημένη έκφραση του CDK1 συνδέεται με την πρόοδο από

H. pylori

-associated γαστρίτιδα σε βλεννογόνο που σχετίζεται με λέμφωμα λεμφικού ιστού [28]. Σε αυτή τη μελέτη, η ενεργοποίηση CDK1 ήταν πάνω ρυθμισμένα με ANXA4. Αυτά τα γεγονότα δείχνουν ότι ANXA4 θα μπορούσε να μεσολαβήσει στην κατάντη της οδού σήματος, οδηγώντας σε ογκογένεση σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου με μια

H. pylori

λοίμωξη.

Εκτός από τη συμμετοχή της στην εξέλιξη του καρκίνου, ANXA4 έχει επίσης συνδεθεί με τα κεκτημένα χημειοαντίσταση σε αντικαρκινικά φάρμακα [44], [45], [46]. Σε μια κυτταρική γραμμή ανθεκτική paclitaxel (Η460 /T800), ANXA4 έκφραση είναι αυξημένη και εντοπισμένη στον πυρήνα [44]. Σε σαφή καρκίνωμα των ωοθηκών και κυττάρων μεσοθηλίωμα, η έκφραση ANXA4 είναι αυξημένη και συνδέεται με την αντίσταση στη θεραπεία με καρβοπλατίνη, και θεωρείται ότι είναι ένας βιοδείκτης για ευπάθεια σε σισπλατίνη [45], [46]. Επιπλέον, ANXA4 είναι ένα ενδοκυτταρικό Ca

αισθητήρα 2+, Ca και

2 + διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στην νευροτοξικότητα και καρδιακή ανεπάρκεια [47], [48]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη ποσότητα ANXA4 δεν συνδέεται μόνο με τον καρκίνο, αλλά και τη νόσο του Αλτσχάιμερ, καρδιακή ανεπάρκεια και την κυτταρική βλάβη που προκαλείται από την αιθανόλη [49], [50], [51].

Ca

2+ σύστημα αγγελιοφόρου απαιτείται επίσης για την διαδικασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και μπορεί να ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο [52], [53]. Έχει αναφερθεί ότι το Ca

2+ να ενεργοποιήσετε μονοπατιού AKT για την προώθηση της κυτταρικής επιβίωσης [54]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση του RHAMM, φωσφο-ΑΚΤ και την καταστολή της p21 ήταν σημαντικά αυξημένα κατά [Ca

2 +]

i ανύψωσης (Σχήμα 5).

Η. pylori

μόλυνση σχετίζεται με ANXA4 υπερέκφραση και ενδοκυτταρική [Ca

2 +]

i ανύψωσης (Σχήμα S4 και S1 αρχείου) [17], [33]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

H. pylori

μόλυνση μπορεί να προκαλέσει κάποια κατάντη σηματοδότησης των ANXA4 διεγείροντας την ενδοκυτταρική [Ca

2 +]

i υψόμετρο. Παρ ‘όλα αυτά ο μηχανισμός λεπτομέρεια στη διαδικασία μπορεί να είναι πολύπλοκη και παραμένει ασαφής. Αυτές θα μπορούσαν να παρέχουν διαλεύκανση των γαστρικών διαδικασία ογκογένεσης υποκείμενες

H. pylori

διέγερση. Στο σύνολό τους, αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι Ca

2 + θα μπορούσε να βοηθήσει ANXA4 για τη μεταγωγή σηματοδότησης και να προωθήσει ογκογένεση σε γαστρικό ασθενείς με

H. pylori

λοίμωξη.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αποσιώπηση των ANXA4 μειώνει τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων, ενώ η υπερέκφραση του αυξάνει τον πολλαπλασιασμό. Επιπλέον, ANXA4 επάγει κατάντη σήματα που προάγουν την ανάπτυξη των κυττάρων. Υποθέτουμε ότι αυτές οι κατάντη σήματα και ενεργοποίηση της κυτταρικής διαίρεσης ξενιστή μπορεί να είναι παθογόνος γεγονότα στο

H. pylori

επαγόμενη καρκινογένεση. Στην τρέχουσα κλινική θεραπεία, ΑΚΤ, ρ21 και CDK1 έχουν χρησιμοποιηθεί ως στόχος αντικαρκινικό φάρμακο. αναστολέα ΑΚΤ, Perifosine, είναι ένα από του στόματος παράγων κατά του καρκίνου και έχει δραστικότητα αντι-πολλαπλασιασμού σε αρκετά μοντέλα όγκου [55], [56], [57]. Η πακλιταξέλη (ταξόλη) και η βινκριστίνη μπορούν να προκαλέσουν και να αυξήσει την έκφραση ρ21 να μειωθεί G2 /M σύλληψη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μπλοκ [58], [59], [60], [61]. Η φλαβοπιριδόλη είναι ένας αναστολέας αρκετών CDKs συμπεριλαμβανομένων CDK1 να επάγει απόπτωση και αντι-αγγειογένεσης [62]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η αύξηση του ANXA4 σε ασθενείς θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ένας στόχος φαρμάκου για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου. Χρησιμοποιώντας πολλαπλά φάρμακα σε συνδυασμό μπορεί να παρέχει περισσότερο αποτελεσματική θεραπεία για τον αποκλεισμό σημάτων στην οδό. Στο σύνολό τους, η μελέτη αυτή θα μπορούσε να προσφέρει νέες γνώσεις για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών για τον καρκίνο του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας

αδενοκαρκίνωμα του Ανθρώπου στομάχι AGS κύτταρα (CRL-1739, ATCC) αναπτύχθηκαν σε 90% RPMI 1640 (Biological Industries, Μπεθ-Haemek, Israel) που συμπληρώθηκε με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου μόσχου (Biological Industries, Μπεθ-Haemek, Israel) . Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ελεγχόμενη ατμόσφαιρα με υγρασία σε επωαστή που περιέχει 5% CO

2.

Πλασμίδια και Επιμολύνσεις

Ολόσωμη

ANXA4

WAS ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας το ζεύγος εναρκτήρα

ANXA4

-Ρ (5 ‘atataagcttgccaccatggccatggcaaccaaa 3’) και

ANXA4

-R (5 ‘gcgcgggaattcttaatcatctcctccaca 3’), και η ενίσχυση του προϊόντος εισήχθη εντός του HindIII /EcoRI θέσεις του pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA).

ANXA4

-ειδικές siRNA και αρνητικού ελέγχου Stealth siRNA (Stealth RNAi ™) αγοράστηκαν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε έξι φρεατίων πλάκες ή επί επικαλυμμένων καλυπτρίδες για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν παροδικά με pcDNA 3.1 (+) /

ANXA4

(8 μg για έξι φρεατίων? 0.4 μg /mL για 96 φρεατίων E-πλάκα) ή

ANXA4

siRNA (100 pmol για έξι φρεατίων? 10 pmol για 96 φρεατίων E-πλάκα) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αποτελεσματικότητα της φορέα έκφρασης και siRNA διαμόλυνση αναλύθηκε με ανοσοκηλίδα. Μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες, η διαφορική έκφραση πρωτεϊνών και γονιδίων ανιχνεύθηκε

Αντισώματα

Τα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ως ακολούθως:. CDK1 Ρ34 (sc-51578) από Σάντα Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)? LAMP2 (ab25631) και RHAMM (ab67003) από Abcam (Cambridge, UK)? και α-τουμπουλίνης (T5168) από την Sigma (Dorset, UK). Το κουνέλι πολύκλωνα αντισώματα είχαν ως εξής: ANXA4 (SC-28827), ρ21 (sc-397), και pCDK1 Ρ34 (Thr 161? Sc-101654) από την Santa Cruz Biotechnology? και ΑΚΤ (9272) και ρΑΚΤ (Ser473? 9271S). από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA)

ανοσοαποτύπωσης

κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα AGS που επιμολύνθηκαν παροδικά με το φορείς έκφρασης pcDNA 3.1 (+) /

ANXA4

(8 μα) ή

ANXA4

siRNA (100 pmol). Για να καθοριστούν οι διαφορές στην έκφραση της πρωτεΐνης υπό συνθήκες υψηλής ενδοκυτταρικού [Ca

2 +]

i, ιονομυκίνη (5 μΜ) προστέθηκε στα κύτταρα για 1 ώρα. Για τη μελέτη των επιδράσεων της αναστολής της φωσφορυλίωσης Akt, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής για 1,5 ώρες μετά από την επιμόλυνση 48 ώρες και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ του αναστολέα ΑΚΤ VIII (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) για 1 ώρα. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πάνω σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Μετά από αποκλεισμό σε 5% άπαχο γάλα και τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (TBS) που περιείχε 0,1% Tween 20 (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) για 1 ώρα σε RT με ήπια ανακίνηση, εφαρμόστηκαν οι ακόλουθες πρωτογενή αντισώματα: αντι-ANXA4 ( 1:1000), αντι-ρ21 (1:500), αντι-ΑΚΤ (1:500), αντι-ρΑΚΤ (Ser473? 1:500), αντι-CDK1 (1:1000), αντι-pCDK1 (Thr 161? 1:500), και αντι-ΚΗΑΜΜ αντισώματος (1:400). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένα αντισώματα δευτερογενούς γίδινου αντι-ποντικού IgG (Sigma) ή κατσίκας αντι-κουνελιού συζευγμένο IgG (Rockland, Gilbertsville, ΡΑ), αντίστοιχα. α-τουμπουλίνης αντίσωμα (1:4000) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα ανοσοστυπώματα εμφανίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (Millipore) και οπτικοποιήθηκαν σε ταινίες ακτίνων Χ. Η ένταση των ζωνών που παρατηρήθηκε ομαλοποιήθηκε με την ένταση της ζώνης α-τουμπουλίνης. Πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Kodak 1-D έκδοση του λογισμικού ανάλυσης εικόνας 3.6 (Eastman Kodak, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο).

Το εξόνιο Array υβριδισμός και ανάλυση

Για τη μελέτη των κατάντη γονίδια της ANXA4, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1 (+) /

ANXA4

και κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με ένα άδειο φορέα χρησιμοποιώντας μια σειρά εξόνης. Ολικό κυτταρικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRIzol® (Invitrogen), και η καθαρότητα του RNA επιβεβαιώθηκε με φασματοφωτομετρία (αναλογία Α260 /Α280) όπως επίσης με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). RNA επεξεργασία και υβριδισμό διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τις συστοιχίες Affymetrix Human εξόνιο 1.0 ST (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε σειρά έχει 28.869 καλά σχολιασμένο γονίδια με 764.885 διαφορετικούς ανιχνευτές. Η συστοιχία περιέχει περίπου 26 ανιχνευτές για κάθε γονίδιο. πληροφορίες Affymetrix καθετήρα θέτει εμφανίζονται στην NetAffx ιστοσελίδα (https://www.affymetrix.com) [63]. ανάλυσης μικροσυστοιχιών (n = 2 ανά ομάδα) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Partek Γονιδιωματική Σουίτα έκδοση 6.5 (Partek Inc., St Louis, MO, USA). Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα (αρχεία CEL) ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο ισχυρή πολυπλινθιακό μέσου όρου (RMA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμές. Ανάλυση της λειτουργίας και βιολογικός μηχανισμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έκδοση την εφευρετικότητα Διαδρομή ανάλυση (ΜΠΒ), το λογισμικό 7.5? ένα σκορ 3 ή παραπάνω θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0,01) για να σχολιάσετε τις πληροφορίες. Έχουμε υποβάλει τα δεδομένα πίνακα στη βάση δεδομένων GEO, καθώς και ο αριθμός εγγραφής της σειράς είναι GSE33620.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR)

Τα στοιχεία πίνακα εξόνιο που λαμβάνονται με τη χρήση του λογισμικού Partek και η βάση δεδομένων του ΜΠΒ επιβεβαιώθηκε από qRT-PCR.