Αφηρημένο

Η μεταναστευτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων είναι ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά που αντανακλούν μεταστατικό δυναμικό. Ouabain, ένας ενδογενής καρδιακό γλυκοσίδιο που παράγεται από τα επινεφρίδια, έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι έχει αντι-νεοπλασματικές ενεργότητες? Ωστόσο, ο ρόλος του στη ρύθμιση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων παραμένει άγνωστη. Η παρούσα μελέτη έχει αποκαλύψει ότι η αγωγή με ουαμπαϊνη σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις είναι σε θέση να αναστέλλουν τις μεταναστευτικές δραστηριότητες του ανθρώπινου πνεύμονα Η292 κυττάρων του καρκίνου. Τα αρνητικά αποτελέσματα της ουαμπαϊνης βρέθηκαν να διαμεσολαβείται μέσω της καταστολής των ρυθμιστικών πρωτεϊνών μετανάστευσης, όπως κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), κινάση εξαρτώμενη από ΑΤΡ τυροσίνη (Akt), και την κυτταρική διαίρεση του κύκλου 42 (Cdc42). Βρήκαμε ότι οι παρατηρούμενες δράσεις ουαμπαϊνης διαμεσολαβούνται μέσω ενός μηχανισμού εξαρτώμενη αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), επειδή η προσθήκη του ROS καθαριστών (Ν-ακετυλοκυστεΐνη και γλουταθειόνης) θα μπορούσε να αντιστρέψει την επίδραση του ουαμπαϊνης στην κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, ουαμπαϊνη δείχθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σφαιροειδή και να μειώσει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Όμως, η ένωση δεν είχε σημαντική επίδραση επί anoikis των κυττάρων. Μαζί, αυτά τα ευρήματα ρίχνουν φως στην κατανόηση του καρκίνου κυτταρικής βιολογίας με τη διερεύνηση της μυθιστόρημα λειτουργία αυτού του ενδογενούς ανθρώπινου ουσία

Παράθεση:. Pongrakhananon V, Chunhacha P, Chanvorachote P (2013) Ouabain Καταστέλλει τη μεταναστευτική συμπεριφορά του πνεύμονα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (7): e68623. doi: 10.1371 /journal.pone.0068623

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4, Φεβρουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 30 Μάη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιουλίου 2013

Copyright: © 2013 Pongrakhananon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από το Ταμείο Ταϊλάνδη Έρευνας και Ratchadaphiseksomphot Κληροδότημα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η κατανόηση της μοριακής βάσης των καρκινικών κυττάρων ως απάντηση σε βιολογικά προέρχεται ουσιών θεωρείται ουσιαστική βοήθεια για την ανακάλυψη νέων μοριακών στόχων για φαρμακευτικές θεραπείες. Ουσιαστική απόδειξη έχει δείξει ότι ουαμπαϊνη, ένας αναστολέας της αντλίας νατρίου /καλίου, είναι παρούσα στο ανθρώπινο πλάσμα και τους ιστούς στην περιοχή από 0,002 έως 0,77 ηΜ [1] – [3]. Επιπλέον, ουαμπαϊνη βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις συμπεριλαμβανομένης της καρδιακής ανεπάρκειας [1], [4], η νεφρική ανεπάρκεια [5] και υπέρταση [3], [6]. Πρόσφατα, έχουμε παράσχει στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η ουαμπαϊνη ευαισθητοποιεί παράγοντα νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με συνδέτη που επάγει απόπτωση (TRAIL) μεσολάβηση των πνευμόνων των καρκινικών κυττάρων απόπτωση, και το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η ουαμπαϊνη μπορεί να επηρεάσει τον καρκίνο κυτταρική βιολογία [7].

Στον καρκίνο του πνεύμονα, μετάσταση έχει γίνει το πιο ενδιαφέρουσα περιοχή της έρευνας, επειδή το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας της νόσου αυτής συνδέεται με τη μετάσταση καρκίνου [8]. Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής εξάπλωσης, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να έχουν την ικανότητα να μεταναστεύουν από την αρχική τους θέσεις μέσα στο κοντινό κυκλοφορικό σύστημα. Αυξημένη δραστικότητα κινάσης της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), ένα βασικό μονοπάτι σηματοδότησης που ελέγχει την κινητικότητα των κυττάρων, ενισχύει την ογκογένεση και τη μετάσταση [9]. Τέτοιες μεταβολές βρέθηκαν επίσης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας απόκτησης των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων [10], [11]. FAK ελέγχει τη μεταγωγή σήματος από ιντεγκρίνη εμπλουτισμένο θέσεις εστιακή προσκόλληση της αλληλεπίδρασης κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας [12]. Όσον αφορά τη ρύθμιση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων, τη φωσφορυλίωση της FAK στα Tyr-397 και την πρόσληψη των Src κινάσες της οικογένειας είναι σημαντικές διαδικασίες που κινεί τη μετανάστευση [12] – [13]. Επιπλέον, η ενεργοποιημένη κατάσταση πολλών μεταναστευτικών ρυθμιστές όπως κινάση εξαρτώμενη από ΑΤΡ τυροσίνη (Akt) και κύκλο κυτταρικής διαίρεσης 42 (Cdc42) [14], [15] είναι κρίσιμες για την διαδικασία της κίνησης των κυττάρων. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση της Akt ενισχύει την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να μεταναστεύουν και εισβάλλουν [15], [16]. Akt που εντοπίζεται στο άκρο του κινείται κυττάρων αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες πρόσδεσης ακτίνης και επάγει την αναδιαμόρφωση της ακτίνης και το σχηματισμό των προεξοχών μεμβράνης, διευκολύνοντας την κυτταρική κινητικότητα [15]. Αυτή η έννοια επιβεβαιώθηκε από μια μελέτη που δείχνει ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της Akt χρησιμοποιώντας μια τεχνική αντιπληροφοριακό προκαλεί μια δραματική αναστολή των καρκινικών κυττάρων εισβολής

in vitro

[17] και

in vivo

[18] . Επιπλέον, η αλληλεπίδραση της FAK και ERK1 /2 έχει δειχθεί ότι ελέγχουν την κυτταρική κινητικότητα [19] – [20]. Πρόσφατα, η οικογένεια των μικρών Rho triphosphatases γουανοσίνης (GTPases), ιδιαίτερα Cdc42, έχει δειχθεί ότι παίζουν ένα ουσιαστικό ρόλο στην αναδιοργάνωση ακτίνης και το σχηματισμό filopodia. Το επίπεδο έκφρασης του Cdc42 βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του πνεύμονα [21] – [22], και επαγωγή Cdc42 δείχθηκε να ενισχύσει τη μετανάστευση του καρκίνου [23]

Μέχρι στιγμής, ο ρόλος. των ενδογενών επιπέδων ουαμπαϊνης στην ρύθμιση του καρκίνου κυτταρικής κινητικότητας υπήρξε σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, και μια τέτοια αντίληψη θα μπορούσε να οδηγήσει σε νέες αντικαρκινικές θεραπείες. Ως εκ τούτου, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει τις πιθανές επιπτώσεις αυτής της βιολογικής ουσίας για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο των κυττάρων του πνεύμονα. Για πρώτη φορά, δείχνουμε ότι ενδογενή επίπεδα ουαμπαϊνης καταστέλλουν κυττάρου όγκου κινητικότητα και συνδέονται με μειωμένη ενεργοποίηση του FAK και Akt και έκφραση του Cdc42. Η μελέτη μας δείχνει την νέα υπόθεση ότι αυτή η φυσιολογική ουσία έχει αρνητική ρυθμιστικό ρόλο στη διαδικασία της κυτταρικής μετάστασης του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κύτταρα και Αντιδραστήρια

Το μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυτταρικές σειρές Η292 και Η460 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου βοός (FBS), 2 mM L-γλουταμίνη και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα 5% CO

2 περιβάλλοντος στους 37 ° C. Ouabain, διχλωροφθορεσκεϊνης διοξεικό (DCFH

2-DA), πολυ 2-υδρόξυαιθυλίου (πολυ-ΗΕΜΑ), 3- (4,5-διμεθυλο-θειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) και phalloidin ισοθειοκυανική τετραμεθυλροδαμίνη Β ελήφθησαν από τη Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, ΜΟ). Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και Hoechst 33342 λήφθηκαν από Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Αντισώματα για παν-Akt, p473-Akt, FAK, p397-ΡΑΚ, Cdc42, caveolin-1 και β-ακτίνη, όπως επίσης και συζευγμένα με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, ΜΑ).

κυττάρων η βιωσιμότητα και η απόπτωση Δοκιμασίες

Κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Μετά τις υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές, τα κύτταρα επωάστηκαν με 500 μg /ml ΜΤΤ στους 37 ° C για 4 ώρες. Μια ανάγνωση ένταση του προϊόντος ΜΤΤ μετρήθηκε στα 550 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας, και το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων υπολογίζεται σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Η απόπτωση προσδιορίστηκε με Hoechst 33342 /χρώση ΡΙ και ανάλυση του περιεχομένου του DNA. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επωάστηκαν με 10 μg /ml Hoechst 33342 και 5 μg /ml ΡΙ για 30 min. Πυρήνες συμπύκνωσης και το DNA του κατακερματισμού των αποπτωτικών κυττάρων και νεκρωτικές κύτταρα ΡΙ-θετικής έγιναν ορατές και σκόραρε με μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX51 με DP70). Για την υποκατηγορία ανάλυση περιεχομένου G0 DNA, μετά την καθορισμένη θεραπεία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους 37 ° C για 3 ώρες. Μετά από πλύση με ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ένα διάλυμα που περιείχε ΡΙ 0,1% Triton-X, 1 μg /ml RNase και ιωδιούχο 1 mg /ml προπίδιο σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Το περιεχόμενο DNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ).

ROS Detection

ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας DCFH-DA ως φθορίζοντα ανιχνευτή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ DCFH

2-DA για 30 λεπτά στους 37 ° C, μετά την οποία πλένονται, επεξεργασία με θρυψίνη, επαναιωρήθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό, και αμέσως αναλύθηκε για ένταση φθορισμού με μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας.

μετανάστευση Δοκιμασία

η μετανάστευση προσδιορίζεται με την επούλωση των τραυμάτων και φρεατίων δοκιμασίες. Για τον προσδιορισμό επούλωσης πληγών, μία μονοστιβάδα κυττάρων καλλιεργήθηκε σε πλάκα 24-φρεατίων, και ένας χώρος τραύμα έγινε με ένα 1-mm-πλάτους άκρη. Μετά την έκπλυση με PBS, οι κυτταρικές μονοστοιβάδες επωάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες. Μικροφωτογραφίες ελήφθησαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Olympus DP70, Melville, ΝΥ), και οι χώροι του τραύματος μετρήθηκαν από 10 τυχαία πεδία του άποψη, χρησιμοποιώντας το λογισμικό του ελεγκτή της Olympus DP. Ποσοτική ανάλυση της κυτταρικής μετανάστευσης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα μέσο χώρο του τραύματος από αυτά τα τυχαία οπτικά πεδία, και το ποσοστό της αλλαγής στον χώρο του τραύματος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:% μεταβολή = (μέσος χώρος κατά το χρόνο 0 h) – (μέσος χώρος κατά το χρόνο 24 h) /(μέσος χώρος κατά το χρόνο 0 h) χ 100. η σχετική μετανάστευση των κυττάρων υπολογίστηκε διαιρώντας το ποσοστό μεταβολής στο χώρο του τραύματος των επεξεργασμένων κυττάρων με εκείνη των κυττάρων ελέγχου σε κάθε πείραμα. Για τη δοκιμασία transwell, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο πάνω στο ανώτερο θάλαμο ενός transwell (8 μm μέγεθος πόρου) σε ένα 24-φρεατίων σε μέσο ελεύθερο ορού και επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης. μέσο RPMI που περιείχε 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Μετά την επώαση, τα μη μεταναστεύσαντα κύτταρα στον άνω θάλαμο απομακρύνθηκαν με βαμβάκι-μάκτρο σκούπισμα, και τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης βάφτηκαν με 10 μg /ml Hoechst 33342 για 10 λεπτά και έγινε ορατό και σημείωσε υπό μια μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX51 με DP70).

εισβολή δοκιμασία

μία δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα 24 φρεατίων transwell μονάδα με πολυανθρακικό (PVDF) φίλτρα (8 μm μέγεθος πόρου). Η μεμβράνη επικαλύφθηκε με 0,5% Matrigel επί της άνω επιφάνειας του θαλάμου όλη τη νύκτα στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο εντός του άνω θαλάμου της μονάδας transwell σε μέσο χωρίς ορό. Μέσο που περιέχει 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο της μονάδας. Μετά την επώαση με ειδικούς παράγοντες δοκιμής για 24 ώρες στους 37 ° C, το μέσο στον ανώτερο θάλαμο αναρροφήθηκαν, και τα κύτταρα στην άνω πλευρά της μεμβράνης απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα που εισέβαλαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης βάφτηκαν με 10 μg /ml Hoechst 33342 για 10 λεπτά, οπτικοποιήθηκε και βαθμολογήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

Κυτταρική μορφολογία και filopodia Χαρακτηρισμός

μορφολογία κυττάρων διερευνήθηκε με δοκιμασία φαλλοϊδίνης-ροδαμίνη και χρώση σουλφοροδαμίνης Β. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 10

4 κύτταρα /φρεάτιο πάνω σε πλάκα 96 φρεατίων όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά στους 37

° C

, διαπερατά με 0,1% Τπίοη-Χ100 σε PBS για 4 λεπτά, και αποκλείστηκαν με 0,2% BSA για 30 min. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν είτε με 1:100 φαλλοϊδίνης-ροδαμίνης σε PBS ή 0,4% σουλφοροδαμίνης Β σε 1% οξικό οξύ για 15 λεπτά, ξεπλύθηκε 3 φορές με PBS, και τοποθετείται με 50% γλυκερόλη. μορφολογία των κυττάρων στη συνέχεια αξιολογούνται από φθορισμού απεικόνισης (Όλυμπος IX51 με DP70). Filopodia προεξοχή εκπροσωπήθηκε ως ο μέσος αριθμός των filopodia /κύτταρο σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα σε κάθε πεδίο.

In vitro 3D Ογκογένεση Δοκιμασία

In vitro 3D ογκογένεση διεξήχθη σε επικαλυμμένα με Matrigel 96- φρεατίων. Μία πλάκα επενδύεται με 0.5% Matrigel και αφήνεται για στερεοποίηση νύκτα στους 37

° C.

Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 4% matrigel και ουαμπαϊνης (0-30 ρΜ) και απλώθηκαν σε μια πυκνότητα των 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε μία πλάκα επικαλυμμένα με Matrigel. Μέσο που περιέχει ουαμπαϊνης (0-30 ρΜ) αντικαταστάθηκε κάθε 3 ημέρες. Μετά από 10 ημέρες, τα κύτταρα κατέστησαν ορατά και Ο αναλυτής εικόνας κάτω από μικροσκόπιο.

Anoikis Δοκιμασία

Για την αξιολόγηση anoikis, Ιστοκαλλιέργεια πλάκες έξι φρεατίων επικαλύφθηκαν με 6 mg /ml πολυ (2 υδροξυαιθυλ-μεθακρυλικό (πολυ-ΗΕΜΑ) (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) σε 95% αιθανόλη και επωάζεται στους 37 ° C για την ξήρανση. Η292 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πολυ-ΗΕΜΑ-επικαλυμμένες πλάκες σε μέσο RPMI που περιείχε υποδεικνύεται θεραπείες για 0-24 ώρες. Μετά την επώαση με 10 μg /ml Hoechst 33342 για 30 λεπτά, συμπύκνωση πυρήνες και DNA κατακερματισμό των κυττάρων anoikis έγιναν ορατά και βαθμολογήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (Olympus IX51 με DP70).

Anchorage-ανεξάρτητο η ανάπτυξη δοκιμασία

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη προσδιορίστηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας σε μαλακό άγαρ. εν συντομία, κύτταρα από 6 φρεατίων καλλιέργειες μονοστοιβάδας πλάκα παρασκευάστηκαν σε ένα ενιαίο-κυτταρικό εναιώρημα. τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε RPMI που περιέχει 10% FBS και 0,33% χαμηλής τήξης αγαρόζη θερμοκρασία, και 2 χ 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλίο 35 mm σε ένα στρώμα στερεοποιείται ΚΡΜΙ /10% FBS /0.6% αγαρόζης. Τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν κάθε τρεις ημέρες με την προσθήκη 200 μΙ RPMI /10% FBS. Αποικίες χρωματίζονται χρησιμοποιώντας 10 μg /ml Hoechst 33342 για 30 λεπτά, οπτικοποιείται και Ο αναλυτής εικόνας κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX51 με DP70).

μονόφυλλο κυτταρικής προσκόλλησης Δοκιμασία

HUV-ΕΚ- C διεγέρθηκαν με 10 ng /ml IL-1β για 0-4 ώρες. Μετά ενδεικνυόμενη θεραπεία, Η292 κύτταρα (2.5 × 10

4 κύτταρα /ml) προστέθηκαν σε ένα ημι-συρρέουσα μονοστιβάδα καλλιέργειας HUV-EC-C, επωάστηκαν για 20 λεπτά στους 37 ° C με περιστροφή σε 120 rpm, και πλένεται εκτενώς για τον αποκλεισμό της μη ειδικής σύνδεσης κυττάρου. Ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων μετρήθηκε άμεσα κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

Western Blotting

Μετά ειδικές επεξεργασίες, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 20 mM Tris-HCl (ρΗ 7,5), 1 % Triton Χ-100, 150 mM χλωριούχο νάτριο, 10% γλυκερόλη, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 50 mM φθοριούχο νάτριο, 100 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και ένα εμπορικό κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Molecular Biochemicals) επί 30 λεπτά επί πάγου. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και η περιεκτικότητα πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε δείγμα (60 μg) μετουσιώθηκαν με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης Laemmli και ακολούθως φορτώθηκε σε ένα πήκτωμα 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου. Μετά το διαχωρισμό, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης 0,45-μm (Bio-Rad). Οι μεταφέρονται μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBST (25 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 125 mM NaCl, 0.05% Tween 20) και επωάστηκαν με τα κατάλληλα πρωτεύοντα αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες πλύθηκαν δύο φορές με TBST για 10 λεπτά και επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη ισότυπου-ειδικά δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με ενίσχυση με ένα υπόστρωμα χημειοφωταύγειας. (SuperSignal West Pico? Pierce) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό αναλυτής /PC πυκνομετρία (Bio-Rad)

Στατιστική Ανάλυση

Μέση στοιχεία από ανεξάρτητες πειράματα κανονικοποιήθηκαν με τα αποτελέσματα από τα κύτταρα στην ομάδα ελέγχου. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τέσσερις φορές. Μία στατιστική ανάλυση μεταξύ δύο ομάδων επιβεβαιώθηκε με δοκιμή Student, και να συγκρίνουν σε πολλές ομάδες, πραγματοποιήθηκε μια ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με ένα τεστ post-hoc. Μια Ρ-τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

μεταναστευτικών Χαρακτηριστικό της μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Η292 κύτταρα

Για να δοκιμαστεί η επίδραση του ουαμπαϊνης για πνεύμονα μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, χαρακτηρίσαμε πρώτα το προφίλ μετανάστευσης των κυττάρων Η292 χρησιμοποιώντας μετανάστευση πληγή και Transwell δοκιμασίες. Σχ. 1Α και Β δείχνουν ότι τα κύτταρα Η292 μετανάστευσαν σε όλον τον χώρο του τραύματος σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, και τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με εκείνα που λαμβάνονται από τη δοκιμασία μετανάστευσης transwell

Α:. Συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων Η292 τραυματίστηκαν χρησιμοποιώντας 1-mm σε όλη την άκρη και επιτρέπεται να μεταναστεύσουν για 0-24 ώρες. Ο χώρος του τραύματος έγινε ορατή κάτω από ένα μικροσκόπιο, και τα σχετικά επίπεδα μετανάστευσης σε σύγκριση με αυτές υπολογίζεται η χρονική στιγμή 0 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD (η = 4). *

P

& lt? 0,05 αξία έναντι στο χρονικό σημείο 0 h. Β: η μετανάστευση κυττάρων Η292 εξετάστηκε με μια δοκιμασία φρεατίων για 0-24 ώρες. Τα μεταναστευτικά κύτταρα στην βασεοπλευρική πλευρά της μεμβράνης βάφτηκαν με Hoechst 33342 για 30 λεπτά και έγινε ορατό κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς ως μέσος αριθμός κυττάρων σε κάθε πεδίο και αποτελούν τα μέσα ± SD (η = 4). *

P

& lt? 0,05 αξία έναντι σε 0 h χρονικό σημείο. C: κύτταρα Η292 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης (0-5,000 ρΜ) για 24 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων προσδιορίστηκε με μια 3- (4,5-dimethly-θειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ). Η βιωσιμότητα των μη επεξεργασμένων κυττάρων παρουσιάστηκε ως 100%. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD (η = 4). *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. D: Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Hoechst 33342 χρώσης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD (η = 4). *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Ε:. Κυτταρική απόπτωση προσδιορίστηκε με ανάλυση του περιεχομένου του DNA χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής

Η

Στη συνέχεια, ένα πείραμα κυτταροτοξικότητα εκτελέστηκε για να εξεταστεί κατά πόσο βιολογική συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων Η292. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εν απουσία ή παρουσία ουαμπαϊνης (10-5000 ρΜ), και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό ΜΤΤ στις 24 ώρες. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης σε ενδογενή επίπεδα (2-770 ρΜ) προκάλεσε ούτε τοξικές ούτε πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα (Εικ. 1 C). Ενώ οι συγκεντρώσεις της ουσίας αυτής έως 1000 ηΜ επάγεται καμία απόπτωση, 5000 ηΜ ουαμπαϊνη μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα (Εικ. 1 C) και με τη μεσολάβηση του κυτταρικού θανάτου που ανιχνεύεται από έναν Hoechst 33342 πυρηνική χρώση δοκιμασία (Σχ. 1D). Επιπλέον, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0-500 ρΜ ουαμπαϊνη για 24 ώρες, και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κυτταρομετρία ροής για την υπο G

0 προσδιορισμός κλάσμα. Σύκο. 1Ε δείχνουν ότι η θεραπεία των κυττάρων με 10-500 ρΜ ουαμπαϊνη δεν προκάλεσε σημαντική μεταβολή των υπο G

0 κλάσμα σε σύγκριση με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης βρίσκεται στο ανθρώπινο πλάσμα και στους ιστούς δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων Η292.

Ouabain Αναστέλλει Lung Cancer Cell Μετανάστευση και την εισβολή

Η ενδογενής συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης εξετάστηκαν περαιτέρω για τις πιθανές επιπτώσεις τους για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0-30 ρΜ ουαμπαϊνη και χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες μετανάστευσης για 24 ώρες. Μια δοκιμασία μετανάστευσης πληγή έδειξε ότι ουαμπαϊνη κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση Η292 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 2Α). Στη συγκέντρωση των 20 ρΜ, ουαμπαϊνη προκάλεσε μια κατά προσέγγιση 50% μείωση της μεταναστευτικής δραστηριότητας των κυττάρων. Επιπλέον, η δοκιμασία μετανάστευσης transwell παρέχονται υποστηρικτικά στοιχεία δείχνουν ότι η ουαμπαϊνη ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων (Σχ. 2Β). Αν και οι μηχανισμοί που ορίζονται και τη ρύθμιση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων και εισβολή δεν είναι πλήρως γνωστές, μελέτες έχουν προτείνει ότι υπάρχουν συνδέονται μονοπατιών σηματοδότησης [24]. Η επίδραση της ουαμπαϊνης στην επεμβατική δυναμικό των καρκινικών κυττάρων εξετάστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας μία εξωκυτταρική δοκιμασίας Transwell μήτρας με λεπτό υμένιο. Τα κύτταρα προστέθηκαν στο transwell και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης για 24 ώρες. Σύκο. 2C δείχνει ότι ουαμπαϊνη αγωγή μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων που εισέβαλαν Η292 σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου με περίπου 50% μείωση βρέθηκε σε απόκριση σε 20 ρΜ ουαμπαϊνης

Α:. Συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων Η292 τραυματίστηκαν με χρήση 1 -mm σε επίπεδο άκρο και επωάστηκαν με ουαμπαϊνη (0-30 ρΜ) για 24 ώρες. Ο χώρος του τραύματος αναλύθηκε και παριστάνεται ως το επίπεδο μετανάστευσης σε σχέση με την αλλαγή των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Β: μεταναστευτικών κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 για 30 min, ορατά κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού και αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος αριθμός των κυττάρων σε κάθε πεδίο. C: Κυττάρων εισβολή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα transwell επικαλυμμένο με matrigel όπως περιγράφεται υπό

Υλικά και Μέθοδοι

. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα που εισέβαλαν κατά μήκος της μεμβράνης οπτικοποιήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού και αντιπροσωπεύονται ως μέσος όρος αριθμός των κυττάρων σε κάθε πεδίο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD (η = 4). *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου

Η

Ouabain Μειώνει τΊΙοροάίβ Σχηματισμός σε Η292 κύτταρα

Plasma προεξοχές μεμβράνη που ονομάζεται αύξηση filopodia κατά την κίνηση των κυττάρων, και ο σχηματισμός των filopodia εμπλέκεται στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση [25]. Έχοντας δείξει ότι ουαμπαϊνη ανέστειλε τη μετανάστευση και εισβολή των κυττάρων, ερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση της ουσίας αυτής από την παρουσία filopodia σε κύτταρα Η292. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία ουαμπαϊνης (30 ρΜ) για 24 ώρες, και filopodia προεξοχή συνελήφθη υπό φθορισμού και αντίθεσης φάσης τρόπων ενός μικροσκοπίου χρησιμοποιώντας δοκιμασίες phalloidin και σουλφοροδαμίνη Β, αντίστοιχα. Σύκο. 3Α δείχνει ότι τα κύτταρα Η292 στο κινούμενο κατάσταση εμφάνισαν ένα σημαντικό αριθμό προεξοχών filopodia που μειώθηκε δραματικά σε ανταπόκριση προς ουαμπαϊνη θεραπείες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μείωση των filopodia στα κύτταρα μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, παίζουν ρόλο στην αρνητική ρυθμιστικό ρόλο της ουαμπαϊνης. Επαρκή αποδεικτικά στοιχεία έχει δείξει ότι τΊΙοροάίβ σχηματισμό των καρκινικών κυττάρων περιλαμβάνει την πρωτεΐνη Cdc42 [26] – [28]. Επειδή το επίπεδο έκφρασης της Cdc42 δείχθηκε ότι συνδέεται στενά με το σχηματισμό filopodia, ερευνήσαμε περαιτέρω το μηχανισμό της ουαμπαϊνης στη ρύθμιση filopodia σε αυτά τα κύτταρα με τον προσδιορισμό της κυτταρικής έκφρασης του Cdc42. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το επίπεδο έκφρασης της Cdc42 μειώθηκε δραματικά σε απόκριση σε αγωγές ουαμπαϊνης (Σχ. 3Β). Ενώ ένα επαρκές επίπεδο αυτής της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, 30 μ.μ. ουαμπαϊνη σχεδόν κατάργησε την έκφραση Cdc42. Αυτή η πληροφορία υποδεικνύει ότι ουαμπαϊνη μπορεί να μειώσει τη μεταναστευτική δραστηριότητα αυτών των κυττάρων μέσω Cdc42 εξασθένηση

Α:. Κύτταρα Η292 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 30 ρΜ ουαμπαϊνη (ΟΒ) ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία ως κύτταρα ελέγχου για 24 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν είτε με σουλφοροδαμίνη Β ή phalloidin και οπτικοποιούνται υπό ένα μικροσκόπιο φθορισμού σε 40 ×. Οι προεξοχές filopodia υποδεικνύεται από τα βέλη και αντιπροσωπεύονται ως μέσος αριθμός filopodia ανά κύτταρο σε κάθε πεδίο σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD (η = 4). *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Β: Μετά την ενδεικνυόμενη αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για τον κύκλο κυτταρικής διαίρεσης 42 (Cdc42) έκφραση με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με β-ακτίνης για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση. Τα σήματα ανοσοστυπώματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία, και μέση δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν στα αποτελέσματα. Οι ράβδοι είναι τα μέσα ± SD (η = 4). *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου

Η

Ouabain Μειώνει την ενεργοποίηση της FAK, Akt, και ERK μέσω ROS-εξαρτώμενο μηχανισμό

Για να φωτιστούν οι μηχανισμοί αναστολής κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων από ουαμπαϊνη, η παρούσα μελέτη προσδιόρισε την έκφραση και ενεργοποιημένα επίπεδα πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μη-τοξικές συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης ή αφεθεί χωρίς θεραπεία, και Akt, ενεργοποιημένα Akt (φωσφορυλιωμένο Akt σε Ser473) [29], ΡΑΚ, ενεργοποιημένα FAK (φωσφορυλιωμένη FAK κατά Tyr-397) [24] και τα επίπεδα Cav-1 προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Σύκο. 4 δείχνει ότι η θεραπεία των κυττάρων με ουαμπαϊνη (0-30 ρΜ) ουσιαστικά κάτω-ρυθμίζεται η έκφραση του ενεργοποιημένου Akt και ενεργοποιημένων ΡΑΚ διατηρώντας παράλληλα μη ενεργοποιημένα αντίστοιχά τους. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ουαμπαϊνη παρενέβαινε με το ενεργοποιημένο επίπεδο των πρωτεϊνών και ενδεχομένως ρυθμιζόμενη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή με αναστολή Akt και FAK κατάντη οδούς. Πρόσφατα, εμείς και άλλοι έχουν δείξει τη σημαντική ρόλο της Cav-1 επί του καρκίνου του πνεύμονα και των μεταναστευτικών επεμβατικές δραστηριότητες. Δοκιμάσαμε περαιτέρω εάν ουαμπαϊνη μειώνει την κυτταρική κινητικότητα μέσω μειωμένα επίπεδα Cav-1. Απροσδόκητα, το επίπεδο της Cav-1 σε απόκριση προς ουαμπαϊνη θεραπεία δεν μεταβλήθηκε (Εικ. 4)

Α:. Κύτταρα Η292 υποβλήθηκαν σε αγωγή με ουαμπαϊνη (0-30 ρΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), φωσφο-ΡΑΚ (ρ-ΡΑΚ, Tyr397), ΑΤΡ-εξαρτώμενη κινάση τυροσίνης (Akt), φωσφο-Akt (ρ-ΑΚΤ, Ser473) και caveolin-1 ( Cav-1) έκφρασης με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με β-ακτίνης για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση. Β: Τα σήματα ανοσοστυπώματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία, και μέση δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν στα αποτελέσματα. Οι ράβδοι είναι τα μέσα ± SD (η = 4). *

P

& lt?. 0,05 vs. μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου

Η

Έχουμε δείξει ότι η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων είναι στενά συνδεδεμένες με την οξειδωτική κατάσταση των κυττάρων. Προηγούμενα δεδομένα έδειξαν ότι η μεταναστευτική δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων ήταν σημαντικά εξασθενημένος σε απόκριση σε αντιοξειδωτικές θεραπείες [30]. Για να διευκρινιστεί η πιθανή ρυθμιστική επίδραση της ουαμπαϊνης σε αυτό το πλαίσιο, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντιοξειδωτικά με την παρουσία ή απουσία ουαμπαϊνης και μεταναστευτικής συμπεριφοράς τους και κυτταρικά επίπεδα ROS αξιολογήθηκαν. Σχ. 5Α και 5Β δείχνουν ότι η θεραπεία με τις γνωστές κυτταρικές διαπερατό γλουταθειόνη (GSH) και Ν-ακετυλοκυστεϊνη (NAC) αντιοξειδωτικά αυξήθηκε σημαντικά μετανάστευση των κυττάρων ουαμπαϊνης-αγωγή, επιβεβαιώνοντας το ρόλο του ROS στην μεταναστευτική δραστηριότητα των κυττάρων που καταστέλλεται από ουαμπαϊνη . Επιπλέον, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS προσδιορίστηκαν σε κύτταρα που επωάστηκαν με ουαμπαϊνη, GSH, και NAC. ROS ανιχνεύεται από ένα ειδικό οξειδωτικό ανιχνευτή έδειξαν ότι η κυτταρική ROS αυξήθηκε σε απόκριση σε αγωγές ουαμπαϊνης (10-30 ρΜ), σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο, ενώ ούτε NAC ούτε GSH μόνος είχε επίδραση σε κάθε κυτταρική κινητικότητα ή ενδογενή επίπεδα ROS. Είναι σημαντικό ότι, η προσθήκη GSH και NAC στα κύτταρα ουαμπαϊνης-αγωγή κατέστειλε σημαντικά την παραγωγή ROS πυροδοτείται από ουαμπαϊνη (Εικ. 1 C). Επιπλέον, παρέχεται μια σύνδεση μεταξύ της κυτταρικής ROS και την κατάσταση ενεργοποίησης της Akt και FAK. Τα κύτταρα προ-αγωγή είτε με GSH ή NAC, παρουσία ή απουσία ουαμπαϊνης και τα επίπεδα της Akt, ενεργοποιημένα Akt, FAK και ενεργοποιημένα ΡΑΚ προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η χορήγηση των αντιοξειδωτικών ανέστρεψε την προς τα κάτω ρύθμιση επίδραση της ουαμπαϊνης σε ενεργοποιημένο Akt και ενεργοποιημένα ΡΑΚ, ενώ οι μη-φωσφορυλιωμένες μορφές των δύο πρωτεϊνών δεν επηρεάστηκαν (Εικ. 6). Τα ευρήματα αυτά δεν παρέχουν μόνο ενδείξεις προ-οξειδωτικό αποτέλεσμα των ουαμπαϊνη, αλλά δείχνουν επίσης ο πιθανός μηχανισμός της ουαμπαϊνης στην αναστολή της μετανάστευσης κυττάρων μέσω μιας ROS-εξαρτώμενο μηχανισμό

Α:. Συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων Η292 τραυματίστηκαν με τη χρήση ενός 1-mm σε επίπεδο άκρο και επωάστηκαν με αντιοξειδωτικά, 1 mM κύτταρο διαπερατό γλουταθειόνη (GSH) ή 5 mM Ν-ακετυλο κυστεϊνη (NAC) παρουσία ή απουσία ουαμπαϊνης (0-30 ρΜ) για 24 ώρες. Ο χώρος του τραύματος αναλύθηκε και παριστάνεται ως το επίπεδο μετανάστευσης σε σχέση με την αλλαγή των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Β: Η μετανάστευση των κυττάρων συλλήφθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο. C: Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία είτε με 1 mM GSH ή 5 mM NAC για 30 λεπτά παρουσία ή απουσία 30 ρΜ ουαμπαΐνη ή ουαμπαϊνη (0-30 ρΜ) και μόνο για 0-3 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με διχλωροφθορεσκεϊνης διοξεικό (DCFH

2-DA) για 30 λεπτά, και η ένταση φθορισμού αναλύθηκε με μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Η μέση ένταση ομαλοποιήθηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου και εκπροσωπήθηκαν ως σχετικά επίπεδα ROS. Τα σημεία δεδομένων είναι μέσοι ± SD (η = 4). *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου.

#

P

& lt? 0,05 έναντι 30 μ.μ. κύτταρα ουαμπαϊνη επεξεργασμένα

Η

Α: κύτταρα Η292 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία είτε με 1 mM GSH ή 5 mM NAC για 30 λεπτά. με την παρουσία ή απουσία ουαμπαϊνης (30 ρΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), φωσφο-ΡΑΚ (ρ-ΡΑΚ, Tyr-397), ΑΤΡ-εξαρτώμενη κινάση τυροσίνης (Akt) και φωσφο-Akt (ρ-ΑΚΤ, Ser-473) έκφραση με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με β-ακτίνης για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση. Β: Τα σήματα ανοσοστυπώματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία, και μέση δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν στα αποτελέσματα. Οι ράβδοι είναι τα μέσα ± SD (η = 4). *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου

#

P

& lt?. 0,05 έναντι 30 μ.μ. κύτταρα ουαμπαϊνη επεξεργασμένα

Η

Ouabain μειώνει τη μετανάστευση και την εισβολή των NSCLC Η460 κύτταρα

για να ελέγξετε αν ουαμπαϊνη ήταν ικανή να αναστείλει τη μετανάστευση σε άλλα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, που αντιμετωπίζεται το ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα καρκίνο κυτταρική σειρά Η460 με ουαμπαϊνης (0-30 ρΜ) και υποβλήθηκαν τα κύτταρα σε μία δοκιμασία μετανάστευσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα αποτελέσματα ΜΤΤ με χρήση των κυττάρων Η460 έδειξε ότι η θεραπεία με ουαμπαϊνη στους 0-30 ρΜ προκαλείται καμία σημαντική επίδραση επί της βιωσιμότητας των κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τα κύτταρα Η292, κατεργασία των κυττάρων Η460 με ουαμπαϊνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις σημαντικά εξασθενημένο κυτταρική μετανάστευση με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 7Α). Επιπλέον, η έκφραση των πρωτεϊνών και ενεργοποιημένων αντίστοιχά τους προσδιορίστηκαν. Western blotting αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με ουαμπαϊνη ομοίως αλλάζει με ενεργοποιημένη Akt, ενεργοποιημένα FAK και ERK ενεργοποιείται, ενώ τα μη ενεργοποιημένα πρωτεΐνες και Cav-1 επίπεδα δεν επηρεάστηκαν από τη θεραπεία (Εικ. 7Β).

Α : Συρρέουσες μονοστιβάδες κυττάρων Η460 τραυματίστηκαν με χρήση 1-mm σε επίπεδο άκρο και επωάστηκαν με ουαμπαϊνη (0-30 ρΜ) για 24 ώρες. Ο χώρος του τραύματος αναλύθηκε και παριστάνεται ως το επίπεδο μετανάστευσης σε σχέση με την αλλαγή των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD (η = 4). *

P

& lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Β Υπό τις ίδιες συνθήκες επεξεργασίας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), φωσφο-ΡΑΚ (ρ-ΡΑΚ, Tyr-397), ΑΤΡ-εξαρτώμενη κινάση τυροσίνης (Akt), φωσφο-Akt (ρ- ΑΚΤ, Ser-473) και caveolin-1 (Cav-1) έκφρασης με κηλίδωση Western. Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν και πάλι με β-ακτίνης για να επιβεβαιωθεί ίση φόρτωση. Τα σήματα ανοσοστυπώματος ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία, και μέση δεδομένα από ανεξάρτητα πειράματα κανονικοποιήθηκαν στα αποτελέσματα. Οι ράβδοι είναι τα μέσα ± SD (η = 4). *

P

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου

Η

Ouabain καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων σε 3D όγκου σφαιροειδές Κατάσταση και Αναστέλλει την αποκόλληση των κυττάρων

Έχοντας δείξει το ρόλο της ουαμπαϊνη στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, μπορούμε επόμενο διερευνήθηκε το δυναμικό ρύθμιση της μετάστασης του καρκίνου με ουαμπαϊνη.