Αφηρημένο

Η διαχείριση των ορμονών ανθεκτικών καρκίνου του προστάτη αποτελεί μια μεγάλη πρόκληση στη θεραπεία αυτού του όγκου, και τον προσδιορισμό των νέους ανταγωνιστές υποδοχέα ανδρογόνου είναι απαραίτητη για να καταστεί πιο αποτελεσματική θεραπεία. Αναλύσαμε τη δραστηριότητα των δύο νέων ανταγωνιστών των υποδοχέων των ανδρογόνων (

S

) -11 και (

R

) -9, στο

in vitro

και

in vivo

πειραματικά μοντέλα της ορμονικά ευαίσθητων ή ευνουχισμός ανθεκτικών καρκίνου του προστάτη (CRPC).

In vitro

πειράματα διεξήχθησαν σε LNCaP, LNCaP-AR, LNCaP-Rbic και vCap τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Η κυτταροτοξική δραστικότητα εκτιμήθηκε με SRB και πρόσληψης BrdU, AR μετενεργοποίηση με επίπεδα λουσιφεράσης δοκιμασίας ρεπόρτερ και PSA με δοκιμασίες Real Time RT-PCR και ELISA. δείκτες εξέλιξης που σχετίζονται με τον κύκλο των κυττάρων αξιολογήθηκαν από western blot.

In vivo

πειράματα διεξήχθησαν σε ποντίκια SCID ξενο-μεταμόσχευσις κυττάρων με διαφορετική ευαισθησία στην ορμονοθεραπεία. Σε LNCaP και LNCaP-AR κύτταρα ορμόνη-ευαίσθητη, ο τελευταίος που εκφράζουν επίπεδα υποδοχέα υψηλής ανδρογόνων, (

R

) -9 και (

S

) -11 εμφάνισαν μια υψηλότερη κυτταροτοξική δράση σε σύγκριση με εκείνη της ένωσης αναφοράς ((

R

) -bicalutamide), επίσης με την παρουσία του συνθετικού ανδρογόνου R1881. Επιπλέον, η κυτταροτοξική δράση που παράγεται από (

R

) -9 ήταν υψηλότερη από εκείνη της (

S

) -11 στα δύο LNCaP AR και vCap κύτταρα ορμόνη ανθεκτικά. Μια σημαντική μείωση στα επίπεδα PSA παρατηρήθηκε μετά από έκθεση και στα δύο μόρια. Επιπλέον, (

S

) -11 και (

R

) -9 ανέστειλε τη σύνθεση του DNA μέσω της αναστολής της επαγόμενης από ανδρογόνο αύξηση των επιπέδων πρωτεΐνης κυκλίνης D1.

In vivo

μελέτες σχετικά με την τοξικότητα προφίλ (

R

) -9 δεν αποκάλυψε την παρουσία των ανεπιθύμητων ενεργειών. Επιπλέον, (

R

) -9 ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε διάφορες

in vivo

μοντέλα, ιδίως LNCaP-Rbic ξενομοσχευμάτων, εκπρόσωπος της υποτροπιάζουσας νόσου. Μας

in vitro

αποτελέσματα υπογραμμίζουν την αντικαρκινική δράση των δύο νέα μόρια (

R

) -9 και (

S

) -11, που τους καθιστά μια δυνητικά ελκυστική επιλογή για η θεραπεία της CRPC

Παράθεση:. Tesei Α, Leonetti C, Di Donato Μ, Gabucci Ε, Porru Μ, Varchi G, et al. (2013) Επίδραση των μικρών μορίων Αναλογικός ανδρογόνων υποδοχέων (SARMs) σε μοντέλα του Ανθρώπου του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (5): e62657. doi: 10.1371 /journal.pone.0062657

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 12 Δεκέμβρη του 2012? Αποδεκτές: 25 του Μαρτίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2013

Copyright: © 2013 Tesei et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Gabriella Καστοριά και Marzia Di Donato λάβει κεφάλαια από την Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC-IG11520) και Ministero Italiano per la Ricerca Scientifica (ΠΡΙΝ 2010NFEB9L_002). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχει την ακόλουθη σύγκρουση να δηλώσει για την Άννα Tesei , Γκρέτα Varchi και Andrea Guerrini. Δρχ. Άννα Tesei, Γκρέτα Varchi και Andrea Guerrini είναι εφευρετών στην αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας (# WO /2010/092546) που βασίζεται σε ευρήματα που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη. Δεν υπάρχουν προς το παρόν προϊόντα σε εξέλιξη ή διατίθενται στην αγορά για να κηρύξει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος και η έκτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των ανδρών σε όλο τον κόσμο [1]. Στις ανεπτυγμένες χώρες, συμπεριλαμβανομένης της Ιταλίας, είναι η πιο κοινή κακοήθεια στους άνδρες και τη δεύτερη θέση μετά τον καρκίνο του πνεύμονα από την άποψη της θνησιμότητας του καρκίνου [2], [3]. Χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και /ή στέρηση ανδρογόνου είναι οι πιο αποτελεσματικές θεραπείες κλινικά στα πρώιμα στάδια της νόσου. Ειδικότερα, η ορμονική θεραπεία οδηγεί στη διαγραφή, η οποία τυπικά διαρκεί από 2 έως 3 έτη. Παρ ‘όλα αυτά, ο καρκίνος του προστάτη κάνει μετάσταση συχνά να οστών και σχεδόν πάντα εξελίσσεται σε μια ανδρογόνο ανεξάρτητο κράτος, με κακή πρόγνωση και διάμεση επιβίωση που κυμαίνεται από 10 έως 20 μηνών [4]. Μέχρι σήμερα, μεγάλο μέρος της έρευνας για τον καρκίνο του προστάτη έχει προσανατολίζεται προς ανδρογόνα, εστιάζοντας κυρίως στους τρόπους μείωσης των κυκλοφορούντων ανδρογόνων και της αναστολής της υποδοχέα ανδρογόνων (AR) λειτουργικότητα.

αντιανδρογόνα, ταξινομούνται ως στεροειδή ή μη στεροειδών ενώσεων , αναστέλλουν τη δράση των ανδρογόνων ανταγωνιστικά παρεμπόδισης της αλληλεπίδρασης μεταξύ της τεστοστερόνης και /ή διυδροτεστοστερόνη (DHT) και AR. Στεροειδή αντι-ανδρογόνα, μεταξύ των οποίων και οξική κυπροτερόνη είναι το πιο αντιπροσωπευτικό, έχουν πρόσφατα αποτελέσει το αντικείμενο πολλών συζητήσεων λόγω των παρενεργειών τους, παρόμοιες με εκείνες που προκαλούνται από θεραπεία με ευνουχισμό [5]. Υπάρχει επίσης ανησυχία για την προφανή ηπατοτοξικότητα τους από τη μακροχρόνια χρήση και θρομβοεμβολικών επιπλοκών που προκαλούνται από τους πιθανούς προγεστογονική δράση τους [6].

μη στεροειδές αντι-ανδρογόνα, όπως η βικαλουταμίδη (Casodex®), φλουταμίδη (Eulexin®) και νιλουταμίδη (Nilandron®) φαίνεται να είναι καλύτερα ανεκτή από στεροειδών αναλόγων τους και είναι προς το παρόν το μόνο διαθέσιμο μέσο για την αποφυγή ευνουχισμού στο ενδοκρινικό θεραπεία του καρκίνου του προστάτη [5]. Αυτές οι ενώσεις αναφέρονται συχνά ως «καθαρά αντιανδρογόνα» επειδή συνδέονται αποκλειστικά με το AR. Η βικαλουταμίδη είναι η καλύτερη ανεκτή από αυτά τα φάρμακα, [7] – [9], αλλά, όπως και τα άλλα δύο, δρα ως ένας αγωνιστής όταν συμβαίνουν AR μεταλλάξεις (W741C ε H874Y) και /ή σε περιπτώσεις AR υπερέκφρασης, όπως συμβαίνει σε ορμόνη ανθεκτικό καρκίνο προστάτη. Υπάρχει τώρα γενική συναίνεση σχετικά με το βασικό ρόλο της AR στην αιτιολογία και εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη (PC), ακόμα και όταν εξελίσσεται από ανδρογόνα-ευαίσθητο σε ευνουχισμό ανθεκτική νόσο (CRPC). Αυτό υποστηρίζεται από αποδεικτικά στοιχεία που AR έκφραση διατηρείται στα περισσότερα δείγματα καρκίνου του προστάτη, ανεξάρτητα από το στάδιο και βαθμό, και από το γεγονός ότι μόνο ένα μικρό ποσοστό των ασθενών CRCP βιώνουν απώλεια της έκφρασης AR, πιθανώς μέσω μεθυλίωσης AR υποκινητή [10]. Επιπλέον, μελέτες σε δείγματα όγκων από CRPC ασθενείς αποκάλυψαν διάφορους μηχανισμούς που χρησιμοποιούνται από τα καρκινικά κύτταρα να επανενεργοποιήσει σηματοδότηση AR,

π.χ.

ενίσχυση AR ή μετάλλαξη, αλλαγές στην έκφραση των ενζύμων που εμπλέκονται στην στεροειδογένεση, και intracrine παραγωγή ανδρογόνων [11 ] – [25]. Παρά το κλινικό όφελος και των δύο πρώτης και δεύτερης γραμμής ορμονικές θεραπείες, τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιανδρογόνα, συμπεριλαμβανομένων βικαλουταμίδη, έχουν χαμηλή συγγένεια AR [26]. Αυτά τα ευρήματα έχουν οδηγήσει στην έρευνα για νέα μόρια με υψηλότερη συγγένεια AR-προκειμένου να αυξηθεί η κλινική αποτελεσματικότητα.

Η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό προκλινική να διερευνηθεί η δραστικότητα και των μηχανισμών δράσης των νέων μικρών οργανικών μορίων μπορούν να λειτουργούν ως Οι ανταγωνιστές των υποδοχέων των ανδρογόνων στα κύτταρα LNCaP, τα οποία φέρουν μετάλλαξη στο κωδικόνιο 877 του πεδίου σύνδεσης συνδετήρα AR [27], και σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές αντιπροσωπευτικές του CRPC συνθήκες.

Υλικά και Μέθοδοι

φαρμάκων και χημικών

Καθαρό (

R

) -bicalutamide (το ενεργό εναντιομερές της μη στεροειδή αντι-ανδρογόνο, Casodex®) και ενώσεις (

S

) -11 και (

R

) -9 είχαν ευθέως συντίθενται με εξαιρετικά διαστερεοεπιλεκτική διαδικασίες (αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας αριθ. WO2010 /116342A2 και όχι. WO2010 /092546A1 [28]), με εκκίνηση από (D) -μηλικό οξύ, (D) και -phenylglicine (D) -φαινυλαλανίνη, αντίστοιχα. (

S

) -11 και (

R

) -9 διαλύθηκαν σε ακετόνη και αιθανόλη (10 mM), αντίστοιχα, ενώ το συνθετικό ανδρογόνο μεθυλοτριενολόνη R1881 (Chemos-GmbH, Regenstauf, Γερμανία ) διαλυτοποιήθηκε σε DMSO (35,2 mM) και αποθηκεύεται στους -20 ° C μέχρι τη χρήση. Casodex® αγοράστηκε από Sigma-Aldrich (Μιλάνο, Ιταλία).

μορφώματα

cDNA που κωδικοποιεί την άγριου τύπου Har ήταν σε pSG5 [29]. Το κατασκεύασμα 3416, που περιέχει τέσσερα αντίγραφα του άγριου τύπου SLP-HRE2 (59-TGGTCAgccAGTTCT-39), κλωνοποιήθηκε στη θέση NheI στο pTKTATA-Luc [30].

Γραμμές Κυττάρων και Culture

Τα καρκινικά προερχόμενο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη LNCaP και vCap ελήφθησαν από την American Tissue Culture Collection (Rockville, MD, USA). Η κυτταρική σειρά LNCaP-AR, που προέρχεται από LNCaP και κατασκευαστεί για να εκφράζουν σταθερά υψηλά επίπεδα AR, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Charles L. Sawyers (Ιατρικό Ινστιτούτο Howard Hughes Ερευνητής στο Memorial Sloan Kettering Cancer Center στη Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Το (

R)

-bicalutamide ανθεκτικά υποκλώνος των κυττάρων LNCaP (LNCaP-Rbic) απομονώθηκε στο εργαστήριο μας με την καλλιέργεια LNCaP γονική κυτταρική γραμμή για 50 εβδομάδες με 20 μΜ (

R

) – βικαλουταμίδη.

κύτταρα VCAP διατηρήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Mascia Brunelli SpA, Μιλάνο, Ιταλία). LNCaP και LNCaP-AR κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 1% γλουταμίνη (Mascia Brunelli S.p.A., Μιλάνο, Ιταλία). LNCaP κύτταρα-Rbic διατηρήθηκαν με τον ίδιο τρόπο που έχει συμπληρωθεί με (

R

) -bicalutamide. Εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά, τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για την εκθετική φάση ανάπτυξης σε όλα τα πειράματα. Cos 7 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε DME συμπληρωμένο με ερυθρό φαινόλης, 5% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), ινσουλίνη (6 ng /ml), L-γλουταμίνη (2 mM), πενικιλλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 U /ml) και υδροκορτιζόνη (3,75 ng /ml). Τα κύτταρα καθίστανται αδρανείς με τη χρήση άνευ ερυθρού φαινόλης DMEM και δεξτράνη ξυλάνθρακα επεξεργασμένο ορό μοσχαριού. Όλες αυτές οι διαδικασίες έχουν περιγραφεί προηγουμένως [31] – [33].

Η επιμόλυνση, Πυρηνικής μετατόπιση και Δοκιμασία Μετενεργοποίησης

Για ανάλυση AR μετατόπισης (Εικ. S5), κύτταρα Cos-7 στους 70 % συρροή επιμολύνθηκαν με 1 μα καθαρισμένου πλασμιδίου χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Superfect (Qiagen, Hilden, Germany). Τα κύτταρα στη συνέχεια καθίστανται αδρανείς και αριστερά μη διεγερμένα ή διεγερμένα με 10 ηΜ R1881 για 60 λεπτά υπό την απουσία ή παρουσία των ενώσεων της μελέτης. Για τη δοκιμασία μετενεργοποίησης (Εικ. S4), κύτταρα Cos-7 απλώθηκαν σε 70% συρροή σε άνευ ερυθρού φαινόλης DME που περιέχει 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Superfect με 0,8 μg του 3416-ΡΤΚ ΤΑΤΑ-Luc, μόνο του ή με 0.2 μg του pSG5-Har-πλασμίδιο εκφράσεως. Μετά από 18 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα διεγέρθηκαν με 10 ηΜ R1881 (διαλυμένο σε 0,001% αιθανόλη, τελική συγκέντρωση) για 24 ώρες απουσία ή παρουσία των υποδεικνυόμενων ενώσεων. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με το όχημα. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega). Τα αποτελέσματα διορθώθηκαν χρησιμοποιώντας δραστικότητα CH110-εκφρασμένο-γαλακτοσιδάσης.

AR Ligand Binding εκτοπισμός Μελέτες σε LNCaP κύτταρα

κύτταρα LNCaP διατηρήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [32] και καθίστανται αδρανείς με τη χρήση άνευ ερυθρού φαινόλης μεσαίες και δεξτράνη απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό [32]. Τα κύτταρα σε 70% συρροή επωάστηκαν με την προσθήκη 10 ηΜ [3Η] R1881 (98 Ci /mmole? Perkin Elmer) στο μέσο εν τη απουσία ή παρουσία της υποδεικνυόμενης περίσσειας ραδιο-αδρανείς ενώσεις. Μετά από επώαση 4 ωρών στους 37 ° C, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS και συλλέχθηκαν με ήπια απόξεση στο ψυχρό δωμάτιο χρησιμοποιώντας 600 μΙ παγωμένου PBS που περιέχει 0.05% ΕϋΤΑ (β /ο). μετρήθηκε ο αριθμός των κυττάρων σε ένα δείγμα 100 μΐ. Ένα κλάσμα (200 μΙ) του κυτταρικού εναιωρήματος υποβλήθηκε εις διπλούν για την εκχύλιση των ενδοκυτταρικών ραδιενέργεια με την χρησιμοποίηση 500 μΙ παγωμένης αιθανόλης (100%) για 1 ώρα [33]. Μετά από 24 ώρες στους 37 ° C, μετρήθηκε η ραδιενέργεια σε έναν μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Η μη ειδική δέσμευση της [3H] R1881 προσδιορίστηκε σε ξεχωριστά φρεάτια με την προσθήκη της ενδεικνυόμενης περίσσειας μη επισημασμένου R1881 στο μέσο επώασης.

In vitro χημειοευαισθησία Δοκιμασία

Σουλφοροδαμίνη Β (SRB) δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Skehan et al. [34]. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, μετρήθηκαν και επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων με επίπεδο πυθμένα (100 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος /φρέαρ). Τα πειράματα διεξήχθησαν σε octuplicate και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Η οπτική πυκνότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε μήκος κύματος 490 nm με έναν αναγνώστη χρωματομετρική πλάκας. Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης δημιουργήθηκαν από το λογισμικό Excel και 50% ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) τιμές προσδιορίστηκαν γραφικά από τα οικόπεδα.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Το ολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy MINIKIT (Qiagen). Ένα μικρογραμμάριο RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας iScript (BioRad, Hercules, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του MyiQ ενιαίο χρώμα Real-Time PCR σύστημα ανίχνευσης (BioRad) και SYBR Green Ι βαφή χημεία. Η σταθερά εκφράζεται ενδογενούς γονιδίου β2-μικροσφαιρίνης ενισχύθηκε ως έλεγχος για την ποιότητα και την ποσότητα του RNA εισόδου. Εκκινητές για GAPDH ενίσχυση mRNA, προς τα εμπρός 5′-CGCTACTCTCTCTTTCTGGC-3 ‘, αντίστροφη 5′-AGACACATAGCAATTCAGAAT-3′? HPRT προς τα εμπρός 5’-AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG -3 ‘, 5′-αντίστροφη GTCTGGCTTATATCCAACATTCG -3′? PSA μπροστά 5’-GCAGCATTGAACCAGAGGAG -3 ‘, 5′-αντίστροφη CCATGACGTGATACCTTGA -3’) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Beacon Λογισμικό Designer (Έκδοση 7.2, BioRad). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν αντιδράσεις σε ένα τελικό όγκο 25 ml που περιέχει 50 ng εκμαγείου οϋΝΑ, SYBR Green Mix, και 200 ​​ηΜ του προς τα εμπρός και αντίστροφους εκκινητές. Τα δείγματα διατηρήθηκαν στους 95 ° C για 10 λεπτά και 30 δευτερόλεπτα, που ακολουθείται από 40 κύκλους ενίσχυσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, και στη συνέχεια στους 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα για την GAPDH, HPRT και PSA. εξειδίκευση του προϊόντος ελέγχθηκε με σημείο τήξεως ανάλυση. αποτελεσματικότητα ενίσχυσης, η οποία ποτέ δεν μεταβάλλεται & gt? 5% στα διάφορα πειράματα, χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σχετική έκφραση του mRNA που λαμβάνεται χρησιμοποιώντας Expression Gene Macro Software (Version 1.1) (BioRad). Η ποσότητα του mRNA ομαλοποιήθηκε στα ενδογενή γονίδια αναφοράς GAPDH και HPRT, και εκφράζεται ως η-πλάσια επίπεδα σε σχέση με μη επεξεργασμένα δείγματα.

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και του συντελεστή διακύμανσης ( CV), υπολογίζεται από τις τρεις τιμές Ct, ήταν πάντα & lt? 1,5%. Αναπαραγωγιμότητα της έκφρασης σε σχέση mRNA υπολογίστηκε από τα αποτελέσματα των δύο πειραμάτων στα οποία η διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε διαφορετικά προϊόντα ανάδρομης μεταγραφής που προέρχονται από το ίδιο δείγμα mRNA. CV ήταν πάντα & lt?. 10%

προσδιορισμό των επιπέδων PSA

Κιτ Α PSA ELISA παρέχονται από Abnova (Ταϊβάν Corporation, Ταϊβάν) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του PSA μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά στα 450 nm σε μέσο καλλιέργειας.

Ενσωμάτωσης BrdU

Μετά την

in vivo

επισήμανση με 100 μΜ BrdU (Sigma), αδρανή κύτταρα σε καλυπτρίδες σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά. ενσωμάτωσης BrdU αναλύθηκε με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας αντι-BrdU αντίσωμα αραιωμένο (1:50 σε PBS) μονοκλωνικό ποντικού (κλώνος BU-1, από την GE Healthcare), όπως έχει ήδη αναφερθεί [35]. αντισώματος ποντικού ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας αραιωμένο (1:200 σε PBS) Texas red-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (Jackson Laboratories).

Ανάλυση Ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα σε καλυπτρίδες στερεώθηκαν και διαπερατά [36 ]. Άγριου-τύπου Har εκτοπικά εκφραζόμενη σε κύτταρα COS-7 οπτικοποιήθηκε [37] χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό κουνελιού αντι-C19 αντίσωμα (Santa Cruz). Το πρωτογενές αντίσωμα ανιχνεύθηκε με τη χρήση αραιωμένου (1:100 σε PBS) Texas red-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (Jackson Laboratories). Καλυπτρίδες τελικά χρωματίστηκαν με Hoechst 33258, αναστρέφεται και τοποθετείται σε Mowiol (Calbiochem). Τα πεδία αναλύθηκαν με DMBL Leica (Leica Microsystems S.r.l., Μιλάνο, Ιταλία) μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιώντας αντικειμενική πετρελαίου HCXPL Apo 63 ×. Οι εικόνες ελήφθησαν με χρήση DC480 κάμερα (Leica) και απέκτησε χρησιμοποιώντας FW4000 (Leica), το λογισμικό, όπως περιγράφεται [36], [37].

Τα προϊόντα λύσεως και Western Blot ανάλυση

προϊόντα λύσης κυττάρων (σε 2 mg /ml συγκέντρωση πρωτεΐνης) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Η κυκλίνη D1, ρ27 και CDK4 ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα αντισώματα [38]. AR ανιχνεύθηκε, με τη χρήση των αντισωμάτων αντι-AR πολυκλωνικό κουνελιού (C-19? Santa Cruz), όπως αναφέρθηκε [36] ανοσοποιητικού αντιδραστικές πρωτεΐνες αποκαλύφθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ECL (από την GE Healthcare)

In vivo

Πειράματα

Πέντε έως έξι εβδομάδων αρσενικούς SCID CB-17 ποντίκια /IcrHanHsd-Prkdcscid αγοράστηκαν από Harlan Laboratories (Correzzana, Ιταλία). nude (ηυ /ηυ) ποντίκια ηλικίας CD-1 αρσενικό έξι έως 8 εβδομάδων αγοράστηκαν από την Charles River Laboratories (Calco, Italy). Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν στην εγκατάσταση των Ζώων (Safu) του Regina Elena Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου στη Ρώμη, Ιταλία. Κατά τη στιγμή κατά την οποία έγιναν τα πειράματα, δεν υπήρχε ενεργός επιτροπή δεοντολογίας για την Έρευνα των ζώων στο Regina Elena Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Ωστόσο, η διευκόλυνση των ζώων στο Ινστιτούτο είχε λάβει πλήρη άδεια να εκτελέσει σε in vivo πειράματα από το ιταλικό Υπουργείο Υγείας, το οποίο ενέκρινε επίσης την παρούσα μελέτη. Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα και τη φροντίδα τους διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος, το οποίο είναι σε συμμόρφωση με την εθνική (DL Νο 116, GU, Συμπλ 40, Φεβ 213 18, 1992?. Circolare Νο 8, GU, Ιούλιος 1994) και διεθνείς νόμους (ΕΟΚ οδηγία του Συμβουλίου 86/609, ΕΕ L 358. 1, 12 Δεκεμβρίου του 1987? Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων, Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας, 1996). Τα ζώα θυσιάστηκαν για ηθικούς λόγους με εξάρθρωση του αυχένα, όταν οι όγκοι έφθασαν κατά μέσο όρο 3,0 g σε βάρος ή όταν έγιναν ετοιμοθάνατα κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης.

Για (

R

) -9 τοξικολογικά πειράματα , υγιή ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή από του στόματος με καθετηριασμό ημερησίως με 10, 25, 50 και 100 mg /kg (

R

) -bicalutamide ή (

R

) -9 για 28 συνεχόμενες ημέρες. Για πειράματα αντικαρκινική δραστικότητα, τα ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως στο πλευρό με vCap, LNCaP και LNCaP-RBic καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε 10

6 κύτταρα /ποντικό σε 100 μΐ διαλύματος που αποτελείται από 50% Matrigel και 50% μέσο χωρίς ορό. Μετά από περίπου 1 μήνα (όταν μια μάζα όγκου 5-150 mg ήταν εμφανής) ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν, διαιρούμενο σε ομάδες και ξεκίνησε θεραπεία. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία από το στόμα με ημερήσια καθετήρα για.

4 συνεχόμενες εβδομάδες με (

R

) -bicalutamide, (

R

) -9 ή Casodex® στα 10 mg /Kg . Οι ενώσεις διαλύθηκαν σε 80% PEG-400 και 20% Tween-80. Οι ποντικοί ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα για την ίδια περίοδο θεραπείας. Πέντε ποντικοί για κάθε ομάδα εκτιμήθηκαν. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε τρεις φορές την εβδομάδα σε δύο διαστάσεις με πάχος και ο όγκος βάρους υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: a × b

2/2, όπου α και b είναι η μεγάλη και μικρή διάμετρος του όγκου, αντίστοιχα.

η αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της θεραπείας εκτιμήθηκε από τα ακόλουθα τελικά σημεία:% TWI, το ποσοστό αναστολής βάρος του όγκου? (Β) καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου, αξιολογούμενη ως Τ-Ο, όπου Τ και C είναι οι διάμεσοι χρόνοι για θεραπεία και τον έλεγχο των όγκων, αντίστοιχα, για την επίτευξη ισοδύναμου μεγέθους (

δηλ

1000 mg.)? γ) τη σταθεροποίηση, παλινδρόμησης ή πλήρης ανταπόκριση αποδεικνύεται από ψηλαφητό.

Ηθική Δήλωση

Όλες οι διαδικασίες που αφορούν τα ζώα και τη φροντίδα τους διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ιδρύματος, το οποίο είναι σε συμμόρφωση με την εθνική (DL Όχι . 116, GU, Συμπλ 40, Φεβ 213 18, 1992?. Circolare Νο 8, GU, Ιούλιος 1994) και διεθνείς νόμους (ΕΟΚ οδηγία του Συμβουλίου 86/609, ΕΕ L 358. 1, 12 του Δεκεμβρίου 1987? οδηγός για η φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων, Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Συμβούλιο Έρευνας, 1996).

Στατιστική ανάλυση

Για την ανάλυση της δοκιμασίας πρωτεΐνης PSA, οι διαφορές μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκε μετά τις διάφορες θεραπείες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-test του Student για αταίριαστο παρατηρήσεις

Ένα

P

αξία & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική. Για την ανάλυση των ποσοτικών πειραμάτων PCR πραγματικού χρόνου, μονόδρομη ANOVA με ανάρτηση τεστ Dunnett διεξήχθη χρησιμοποιώντας GraphPad Prism version 4.00 για Windows (GraphPad Software, San Diego California USA). Δεδομένα που προκύπτουν από την ενσωμάτωση BrdU, ΕΙΝΑΙ-Luc προσδιορισμούς γονιδίου αναφοράς και πυρηνική μετατόπιση αναλύθηκαν από ζεύγη

t-test

. Ένα

P

αξία & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Για

in vivo

πειράματα, t-test του Student (μη ζευγαρωμένα, two-tailed) χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση μέσων τιμών (Software Primer Βιοστατιστικής, McGraw-Hill, New York, ΝΥ, USA). Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η Ένωση Δομή

Η δουλειά μας επικεντρώνεται στον εντοπισμό πιθανών ενώσεων μολύβδου από ένα νέα τάξη εκλεκτικών τροποποιητών του υποδοχέα ανδρογόνων (SARMs), συντίθεται με μια καινοτόμο και εξαιρετικά διαστερεοεπιλεκτική μεθοδολογία, για περαιτέρω προκλινική και κλινική ανάπτυξη. Οι ανταγωνιστικές και αγωνιστικές δραστηριότητες των περίπου 30 διαφορετικά μη στεροειδή, συνθετικά AR συνδετήρες μέσω μιας μελέτης σχέση δομής-δραστικότητας έχουν ήδη περιγραφεί [28]. Ειδικότερα, αξιολογήσαμε το

in vitro

αντικαρκινική δράση των δύο νέων μορίων προπαναμίδιο βικαλουταμίδη-όπως, (

S

) -11 και (

R

) -9, ( Σχ. 1Α). χημικές δομές τους διαφέρει από εκείνη βικαλουταμίδης με την παρουσία ενός ατόμου αζώτου αντί της υδροξυλομάδας στο κεντρικό άτομο άνθρακα, και στον υποκαταστάτη στην χηλική στερεοκέντρο,

π.χ.

. μια βενζυλ και φαινύλ ομάδα, αντίστοιχα. Επιπλέον, (

S

) -11 χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενός τμήματος υδαντοϊνης, η οποία επηρεάζει περαιτέρω στερεοχημική παρεμπόδιση της.

(Α) Χημική δομή και το μοριακό βάρος (MW) της (

R

) -bicalutamide, (

S

) -11 και (

R

) -9. (Β) συνδέτη AR δεσμευτική ανάλυση μετατόπισης σε κύτταρα LNCaP. κύτταρα LNCaP Αδρανή επωάστηκαν με 10 ηΜ [3Η] R1881 απουσία ή παρουσία της ενδεικνυόμενης περίσσειας (από 0,5 μm έως 4 μΜ) των ενώσεων ραδιόφωνο αδρανή. Η ενδοκυτταρική ραδιενέργεια προσδιορίστηκε. Ένθετο στο πάνελ Β δείχνει τις θέσεις δέσμευσης AR προσδιορίστηκε σε 10

3 κύτταρα επωάστηκαν με 10 ηΜ [3Η] R1881 (R1881 *) απουσία ή παρουσία της υποδεικνυόμενης περίσσειας μη επισημασμένου (

R

) -9, (

S

) -11 ή (

R

) -bicalutamide (

R

) -bic. Τα δεδομένα από τρία διαφορετικά πειράματα συγκεντρώθηκαν και απομένουσας συνδέσεως υπολογίστηκε και εκφράστηκε ως% της συνολικής θέσεων σύνδεσης AR.

n

= ο αριθμός των πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα των αποτελεσμάτων αξιολογήθηκε επίσης με η αντιστοιχισμένη

t

δοκιμών και οι τιμές ρ & lt? 0.005 θεωρήθηκαν σημαντικές. Αριθ σημασία αποδόθηκε στην διαφορά στο απομένουσας συνδέσεως μεταξύ των κυττάρων που επωάστηκαν με 10 ηΜ [3Η] R1881 παρουσία (

S

) -11 ή (

R

) -9 και εκείνοι που επωάστηκαν με 10 ηΜ [3Η] R1881 παρουσία (

R

) -bicalutamide ((

R

) -bic). LNCaP κύτταρα επωάστηκαν επίσης με 10 ηΜ [3Η] R1881 απουσία ή παρουσία 100-πλάσιας περίσσειας (1 μΜ) μη επισημασμένης R1881 ή Casodex®. Υπολειμματική δέσμευσης ήταν 13% και 14% για τις μη επισημασμένη R1881 ή Casodex®, αντίστοιχα.

Η

Βιβλιοδεσία Κυβισμός Σπουδών

Είμαστε αξιολόγησε για πρώτη φορά την ικανότητα του (

S

) -11 και (

R

) -9 να εκτοπίσει ειδικά τη δράση δεσμεύσεως προσδέματος του AR σε ολικά κύτταρα LNCaP. Για το σκοπό αυτό, αδρανή κύτταρα επωάστηκαν με 10 ηΜ [3Η] R1881 απουσία ή παρουσία της υποδεικνυόμενης περίσσειας ραδιο-αδρανείς ενώσεις. Τα κύτταρα καθίστανται αδρανείς με κατεργασία του ορού με δεξτράνη-άνθρακα για να απομακρυνθεί το ελεύθερο στεροειδή και στη συνέχεια συλλέχθηκε με ήπια απόξεση για να διατηρηθεί η σύνδεση του AR μεμβράνη προκειμένου να το θεωρήσουμε ως μέρος των συνδετικών αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα από διάφορες ανεξάρτητες πειράματα αναλύθηκαν, αποκαλύπτοντας ότι και οι δύο (

S

) -11 και (

R

) -9 ενώσεων μετατοπίζεται το [3Η] R1881 σύνδεση κατά περίπου 45% και 80%, όταν χρησιμοποιείται στα 0.5 μΜ και 1 μΜ, αντίστοιχα (Εικ. 1Β και ένθετο). Σχεδόν σύνολο [3Η] R1881 μετατόπιση ανιχνεύθηκε όταν κάθε ένωση χρησιμοποιήθηκε σε 2 μΜ ή 4 μΜ (Εικ. 1 Β και ένθετο). Παρόμοια δεδομένα παρατηρήθηκαν με τη χρήση μη επισημασμένο R1881 ή Casodex® (Εικ. 1Β λεζάντα) ή όταν η ανάλυση μετατόπισης σύνδεσης διεξήχθη σε κύτταρα Cos εκτοπικά εκφράζουν Har (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η αντι-ανδρογόνα (

R

) -bicalutamide ουσιαστικά συμπεριφέρθηκε (

S

) -11 και (

R

) -9, αν και ήταν ελαφρώς πιο αποτελεσματική από ό, τι (

S

) -11 και (

R

) -9 σε μετατόπιση της δέσμευσης, όταν χρησιμοποιούνται σε χαμηλές συγκεντρώσεις (0,5 ή 1 μΜ) συνδέτη AR. Από στατιστική άποψη (Εικ. 1Β μύθο), οι διαφορές αυτές φαίνονται αμελητέα. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η (

S

) -11 και (

R

) -9 ενώσεις δεσμεύουν AR.

κυτταροτοξική δράση ίη vitro

Καταγράφηκε η

in vitro

κυτταροτοξική δραστικότητα (

R

) -9 και (

S

) -11 σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών σειρών προστάτη σε διαφορετικά στάδια της ορμόνης ανταπόκριση και εκπρόσωπος των διαφόρων παθολογικών χαρακτηριστικών του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη (Εικ. 2).

Η κυτταροτοξική δράση της (

R

) -bicalutamide, (

S

) -11and (

R

) -9 στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές LNCaP, LNCaP-Rbic, LNCaP AR και vCap μετά από μια έκθεση 144 ωρών, μετρήθηκε με δοκιμασία SRB (μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων). Οι συγκεντρώσεις (μΜ) της (

R

) -bicalutamide, (

S

) -11 και (

R

) -9 προκαλεί 50% μείωση στην επιβίωση των κυττάρων (IC

50) εμφανίζονται στα δεξιά των καμπυλών.

η

τα κύτταρα εκτέθηκαν σε βαθμωτές συγκεντρώσεις του φαρμάκου που κυμαίνονται από 0,02 μΜ έως 20 μΜ για 144 ώρες. (

R

) -bicalutamide δεν έδειξε καμπύλες δόσης-επίδρασης στην ανθεκτική κυτταρική σειρά LNCaP-Rbic ή σε κύτταρα vcap φιλοξενούν υψηλά επίπεδα άγριου τύπου AR. Παρά το γεγονός ότι ένας ασθενής τάση δόσης-επίδρασης παρατηρήθηκε στις κυτταρικές σειρές εκφράζουν φυσικά AR (LNCaP) ή κύτταρα τροποποιημένα ώστε να υπερεκφράζουν τον υποδοχέα (LNCaP-AR), IC

50 (2 μΜ) παρατηρήθηκε μόνο στην κυτταρική σειρά LNCaP (Σχ . 2).

(

S

) -11 εμφάνισε μέτρια δραστικότητα σε όλα, αλλά την υψηλότερη συγκέντρωση (20 μΜ) στην οποία παρατηρήθηκε μια μέτρια κυτταροτοξική επίδραση στα κύτταρα VCAP (Σχ. 2 ). Στις άλλες κυτταρικές σειρές μια ισχυρή κυτταροκτόνο αποτέλεσμα ανιχνεύθηκε με IC

50 τιμές που κυμαίνονται από 11,2 μΜ έως 13 μΜ. (

R

) -9 παρήγαγε ένα αποτέλεσμα παρόμοιο με αυτό του (

S

) -11 σε μόνο LNCaP-Rbic αλλά προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη και ισχυρή κυτταροτοξική επίδραση στις άλλες κυτταρικές γραμμές, φυσικά ή τεχνητά εκφράζοντας AR, φτάνοντας πάντα IC

50 τιμές, ακόμη και σε κύτταρα vcap (6 μΜ).

Επίδραση στις ορμονικές ερέθισμα

Ερευνήσαμε επίσης την παρέμβαση των αντιανδρογόνα για το επίδραση του R1881 σε αφελή LNCaP και παράγωγο γραμμές LNCaP-AR, το τελευταίο κατασκευάζεται για να εκφράσουν υψηλότερα επίπεδα άγριου τύπου AR ((Εικ. 3Α). η παρατεταμένη έκθεση σε R1881 10 ηΜ αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό των γραμμών καρκίνου του προστάτη κατά περίπου 1,5- 2.5-φορές. Η ταυτόχρονη έκθεση των κυττάρων σε R1881 και (

R

) -bicalutamide, (

S

) -11 ή (

R

) -9 για 72 ώρες κατέστειλε την ανάπτυξη ερέθισμα δίνεται από το συνθετικό ανδρογόνο. ειδικότερα, (

R

) -9 αποδείχθηκε ότι είναι η πιο αποτελεσματική στην αναστολή της πολλαπλασιαστικής ορμονική διέγερση, αρχίζοντας από μια συγκέντρωση 5-μΜ. Επιπλέον, όπως ήταν αναμενόμενο, μια σημαντική αύξηση (

P

& lt? 0,01) στα επίπεδα PSA παρατηρήθηκε στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων LNCaP (43%) και LNCaP-AR (62%) μετά από μία έκθεση 48 ωρών σε 10 nm του συνθετικό ανδρογόνο R1881 (Σχ. S1). Αντίθετα, όλες οι ενώσεις αντιανδρογόνο χρησιμοποιούνται σε συγκεντρώσεις 20 μΜ έκκρισης αναστέλλει PSA στο μέσο καλλιέργειας και των δύο κυτταρικών σειρών. Συγκεκριμένα, οι δύο (

R

) -9 και (

S

) -11 προκάλεσε μια μείωση στα επίπεδα PSA σημαντικά υψηλότερα (

P

& lt? 0,01) από αυτή που παράγεται από (

R

) -bicalutamide (

P

& lt? 0,01).

(Α) Αξιολόγηση με τη δοκιμασία SRB του αντικαρκινική δραστικότητα της βαθμωτές συγκεντρώσεις (

R

) -bicalutamide, (

S

) -11 ή (

R

) -9 σε ορμόνη ανταποκρινόμενο LNCaP και AR-υπερεκφράζουν LNCaP-AR κύτταρα, με την παρουσία ή όχι του συνθετικού ανδρογόνου, R1881 (10 ηΜ). Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β), (Γ) Αξιολόγηση των επιπέδων mRNA του γονιδίου PSA μετά από μία έκθεση 24 ωρών σε διαφορετική συγκέντρωση (

S

) -11 (C) ή (

R

) –

9

(D) με την παρουσία ή απουσία R1881 (σημεία είναι μέσος όρος των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων, *

P

& gt? 0,05).

η

επίσης, διερευνάται η έγκαιρη διαμόρφωση του AR μεταγραφική δραστηριότητα που ασκείται από τα δύο νέα μόρια κατά καιρούς και συγκεντρώσεις έκθεσης δεν είναι ικανό να προκαλεί μαζική θανάτωση των κυττάρων.

Μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα PSA mRNA παρατηρήθηκε (

P

& lt ? 0,01) σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές μετά από έκθεση 24 ωρών σε 10 ηΜ R1881 (Σχήμα 3 π.Χ.).. Μια έκθεση 24 ωρών έως (

S

) -11, μόνο του ή σε συνδυασμό με R1881, προκάλεσε μια μέτρια μείωση των επιπέδων PSA mRNA σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Αντιστρόφως, ένα άνοιγμα 24 ώρες έως (

R

) -9 μόνη προκάλεσε μια σημαντική μείωση της έκφρασης PSA mRNA σε LNCaP και LNCaP-AR ξεκινώντας από χαμηλότερη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε (0.5 μΜ). Όταν μια έκθεση 24 ωρών από R1881 προηγηθεί εκείνη του (

R

) -9, μια σημαντική μείωση στην έκφραση του mRNA PSA σε σχέση με εκείνη που παρουσιάζεται από τα κύτταρα που εκτίθενται σε R1881 μόνος παρατηρήθηκε ξεκινώντας από 0,5 μΜ σε LNCaP και από 5 μΜ σε LNCaP-AR, αντίστοιχα (

P

& lt? 0.005). Τα δεδομένα που λαμβάνονται δείχνουν ότι (

R

) -9 σε χαμηλές συγκεντρώσεις είναι πιο αποτελεσματική από (

S

) -11 στην αναστολή της μεταγραφική δραστικότητα AR.

επίδραση επί Ενσωμάτωσης BrdU

αξιολόγησε την επίδραση και των δύο ενώσεων επί της σύνθεσης DNA ανδρογόνων που προκαλείται από κύτταρα LNCaP σε τρία διαφορετικά πειράματα. (

R

) -9 (Σχ. 4Α) και (

S

) -11 (Εικ. 4Β) ανέστειλε σημαντικά την ενσωμάτωση BrdU διεγείρεται από 10 θεραπεία nM R1881 κυττάρων LNCaP έκανε ηρεμίας χρήση φαινόλης κόκκινο-μέσο ελεύθερο και δεξτράνη ξυλάνθρακα επεξεργασμένο ορό. Το ανασταλτικό αποτέλεσμα ήταν παρόμοια ή ακόμη και ισχυρότερο από αυτό που λαμβάνεται χρησιμοποιώντας το ίδιο εύρος συγκεντρώσεων (10-20 μΜ) του Casodex (Εικ. 4 Α και Β) ή (

R

) -bicalutamide (Πίνακας 1). (

R

) -9 και (

S

) -11 και πάλι αναστέλλεται σημαντικά ενσωμάτωσης BrdU που διεγείρεται από 10 ηΜ κατεργασία R1881 του LNCaP-AR κύτταρα γίνονται αδρανή όπως περιγράφεται παραπάνω για LNCaP (Σχ. S2).

Α και Β, ηρεμίας LNCaP κύτταρα σε καλυπτρίδες αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (έλεγχος) ή θεραπεία για 18 ώρες με το συνθετικό ανδρογόνο R1881 (10 ηΜ) απουσία ή παρουσία των υποδεικνυόμενων ανταγωνιστές (που χρησιμοποιείται στα 10 ή 20 μΜ). Μετά

in vivo

πάλλεται με 100 μΜ BrdU, BrdU ενσωμάτωση αναλύθηκε με ανοσοφθορισμό και εκφράστηκαν ως% των συνολικών πυρήνων. Σε Α και Β, οι αριθμοί στην κορυφή κάθε ράβδου αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (

= 3

), με τυπική απόκλιση (SD) & lt? 1. Η στατιστική σημαντικότητα των αποτελεσμάτων σε Α και Β αξιολογήθηκε με την αντιστοιχισμένη

t

δοκιμής.

P

τιμές ήταν & lt? 0.005 για τα κύτταρα διεγείρονται με 10 nM R1881. Σύκο.