Αφηρημένο

Οι πολλαπλές δραστηριότητες που αποδίδεται στον παράγοντα νέκρωσης κυτοκίνη όγκων (TNF), στην υγεία και την ασθένεια. Ειδικότερα, ο TNF έχει δειχθεί ότι επηρεάζει την καρκινογένεση με πολλούς τρόπους. Αυτή η κυτοκίνη δρα μέσω της ενεργοποίησης δύο υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας, TNFR1, η οποία συνδέεται με τη φλεγμονή, και TNFR2, η οποία απεδείχθη να προκαλεί αντιφλεγμονώδη σηματοδότηση. Αξιολογήσαμε τις επιδράσεις του TNF και δύο υποδοχείς της σχετικά με την εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος με

in vivo

βιοφωταύγεια απεικόνισης σε ένα συνγονιδιακό ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού όγκου με κύτταρα Panc02. Ποντίκια με ανεπάρκεια για TNFR1 ήταν ανίκανοι να απορρίψουν αυθόρμητα Panc02 όγκων και, επιπλέον, εμφανίζεται ενισχυμένη εξέλιξης του όγκου. Αντίθετα, ένα κλάσμα του άγριου τύπου (37.5%), ΤΝΡ ανεπάρκεια (12,5%), και ποντίκια με ανεπάρκεια TNFR2 (22,2%) ήταν σε θέση να απορρίπτουν πλήρως τον όγκο εντός δύο εβδομάδων. Παγκρεατικών όγκων σε ανεπαρκή TNFR1 ποντίκια επέδειξαν αυξημένη αγγειακή πυκνότητα, ενισχυμένη διείσδυση των CD4

+ Τ κύτταρα και CD4

+ forkhead κουτί Ρ3 (FoxP3)

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Τ

reg), αλλά μείωσε τον αριθμό των CD8

+ Τ κύτταρα. Οι μεταβολές αυτές περαιτέρω συνοδεύεται από μεταγραφική ρύθμιση προς τα πάνω της IL-4. Ετσι, ο TNF και TNFR1 απαιτούνται καρκίνωμα παγκρεατικού πόρου να εξασφαλιστεί η βέλτιστη CD8

+ κυττάρων Τ με τη μεσολάβηση ανοσολογικής και όγκου απόρριψης. Η εξωγενής συστημική χορήγηση ανθρώπινου TNF, ωστόσο, η οποία αλληλεπιδρά μόνο με ΤΝΡΚ1 ποντικού, επιταχυνόμενη εξέλιξης του όγκου. Αυτό υποδηλώνει ότι TNFR1 έχει ουσιαστικά τη δυνατότητα στο μοντέλο Panc02 να προκαλέσει προ-και αντι-καρκινικές επιδράσεις, αλλά η χωροχρονική διαθεσιμότητα του TNF φαίνεται να καθορίσει τελικά το συνολικό αποτέλεσμα

Παράθεση:. Chopra Μ, Lang I, Salzmann S, Pachel C, Kraus S, Bäuerlein CA, et al. (2013) Tumor παράγοντα νέκρωσης όγκων Προκαλεί Προώθηση και καταπολέμησης των όγκων Επιδράσεις στην καρκίνο του παγκρέατος μέσω TNFR1. PLoS ONE 8 (9): e75737. doi: 10.1371 /journal.pone.0075737

Επιμέλεια: Dominik Hartl, Πανεπιστήμιο του Tübingen, Γερμανία

Ελήφθη: 24, Ιουλίου, 2013? Αποδεκτές: 21 του Αυγούστου 2013? Δημοσιεύθηκε: 30 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Chopra et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung der Universität Würzburg [χορηγεί B-149, B-233], η Deutsche José Carreras Leukämie-Stiftung eV (R /06/17), η Deutsche Forschungsgemeinschaft [επιχορηγήσεις SFBTR 52 Ζ2, Wa 1025 /18-1, KFO 216 ΤΡ8, και Ma 760 /19-1] και η Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2010_Kolleg.52) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDA) είναι μία από τις πιο καταστροφικές κακοήθειες με εξαιρετικά χαμηλά ποσοστά 5-ετή επιβίωση και πολύ περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές [1] – [3]. Διάφορα μονοπάτια σηματοδότησης διαταράσσονται στον καρκίνο του παγκρέατος και αυτό επηρεάζει όχι μόνο τα καρκινικά κύτταρα άμεσα, αλλά επίσης ισχύει και για τα στρωματικά κύτταρα εντός και γύρω από τον όγκο [4] – [6]. Ειδικά ΝΡ-κΒ σηματοδότηση συνήθως απορυθμισμένη σε PDA [7] – [9]. Ένα σημαντικό ενεργοποιητής του ΝΡ-κΒ είναι ο παράγοντας νέκρωσης κυτοκίνη όγκων (TNF), η οποία παράγεται κυρίως από ενεργοποιημένα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, ιδιαίτερα μακροφάγα και Τ κύτταρα, αλλά μπορεί επίσης να εκφράζεται από κύτταρα όγκου [10], [11].

TNF είναι ένας τριμερές πρωτεΐνη τύπου II διαμεμβρανική από την οποία μια διαλυτή μορφή απελευθερώνεται από πρωτεολυτικής επεξεργασίας. Οι δύο μορφές του TNF αλληλεπιδρούν με δύο υποδοχείς, TNFR1 και TNFR2, αλλά διαφέρουν ως προς την ικανότητά τους να ενεργοποιούν αυτούς τους υποδοχείς. Οι δεσμευμένες σε μεμβράνη TNF ενεργοποιεί ισχυρά αμφότερους τους υποδοχείς ενώ διαλυτού TNF, παρά πρόσδεση σε TNFR2, ενεργοποιεί μόνο TNFR1 σωστά [12]. Ενώ TNFR1 είναι ένας τυπικός εκπρόσωπος του θανάτου υποομάδας που περιέχει την περιοχή της οικογένειας πρωτεϊνών υποδοχέα TNF, TNFR2 ανήκει στην TRAF-αλληλεπιδρούν υποομάδα. Ακόμα κι αν έχει μία περιοχή θανάτου, TNFR1 σε απόκριση σε TNF εκκινεί κυρίως προ-φλεγμονώδη μονοπάτια σηματοδότησης που οδηγούν στην ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής ΝΡ-κΒ και διαφόρων κινασών ΜΑΡ αλλά τυπικά όχι σε επαγωγή κυτταρικού θανάτου. Είναι προφανές από την ανάλυση των ΤΝΡΚ1 και TNFR2 ποντίκια knockout ότι πολλά ανοσορυθμιστικά διαδικασίες που ελέγχονται από τους δύο υποδοχείς TNF σε μια ανταγωνιστική, προσθετική ή ακόμα και συνεργική τρόπο, αλλά υπάρχουν επίσης στοιχεία για αυτόνομες λειτουργίες του καθενός από τα δύο υποδοχείς [11], [13]. Ειδικότερα, TNFR2 δείχθηκε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση της ανοσοκατασταλτικής ρυθμιστικών Τ κυττάρων (Τ

regs) [14] – [16].

καρκίνο του παγκρέατος TNF παίζει ένα συγκρότημα ακόμη μέχρι τώρα ελάχιστα κατανοητή ρόλο [17] – [23]. Εδώ, θα απευθύνεται πώς TNF και των υποδοχέων της, να επηρεάσει το ανοσοποιητικό έλεγχο των PDA σε ένα ορθοτοπικό συγγενικά μοντέλο ποντικού. Απώλεια του TNFR1 εντός του ξενιστή κατήργησε έλεγχο του όγκου και οδήγησε σε αυξημένη ανάπτυξη του όγκου. ανεπάρκεια TNFR1 προκάλεσε απορρύθμιση της διήθησης κυττάρων Τ και ενεργοποίηση. Προτείνουμε μια νέα αντι-ογκογόνο ρόλο της υποδοχής TNFR1 στο PDA, όπου TNF-TNFR-αλληλεπιδράσεις ρυθμίζουν την ομοιόσταση των δύο ρυθμιστικών και κυτταροτοξικά Τ κύτταρα να αποφασίσει αν PDA ελέγχεται και τελικά απορρίφθηκαν ή αυξάνεται σταδιακά.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους γερμανικούς κανονισμούς για τα πειράματα σε ζώα. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Regierung von Unterfranken ως αρμόδια αρχή (Αριθμός Άδειας 55.2-2531.01-76 /10). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό esketamine /ξυλαζίνη αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Ζώα

C57Bl /6 ανεπαρκή για TNF (B6.129S-TNF

tm1Gkl /J , σύντομη B6.TNF KO), TNFR1 (C57BL /6-Tnfrsf1a

tm1Imx /J, σύντομη B6.TNFR1 KO), TNFR2 (B6.129S7-Tnfrsf1b

tm1Imx /J, σύντομη B6.TNFR2 KO), TNFR1R2 (B6.129S-Tnfrsf1a

tm1ImxTnfrsf1b

tm1Imx /J, σύντομη B6.TNFR1R2 KO) αρχικά ελήφθησαν από Jackson Laboratories (Bar Harbor, μΕ, USA) και διασταυρώθηκαν με την αλμπίνο C57BL /6 υπόβαθρο (C57BL /6J-Tyr & lt? ποντίκια c-2J, Jackson Laboratories) για βελτιωμένη

in vivo

βιοφωταύγειας ευαισθησία απεικόνισης (μειωμένη απορρόφηση φωτός λόγω της έλλειψης μελανίνης στο δέρμα) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Γονότυπους των ποντικών ΚΟ ελέγχθηκαν συστηματικά με PCR. Θηλυκά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα μεταξύ 8 και 12 εβδομάδων. Όλα τα ποντίκια είχαν εκτραφεί εντός του καθορισμένου παθογόνου-free εγκατάσταση ζώων του Κέντρου Πειραματικής Μοριακής Ιατρικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου, Würzburg λήψη τρωκτικών και αυτόκαυστο πόσιμο νερό κατά βούληση.

Cell Culture

Για λεντοϊού μεταγωγή κυττάρων Panc02 [24], 293 Τ κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα πρότυπο πρωτόκολλο καθίζησης φωσφορικού ασβεστίου σε 10 πιάτα cm με 10 μg pMDL και 5 μg πλασμιδίων συσκευασίας RSV-REV, 6 μg VSV /G πλασμιδίου φακέλου και 20 μg του η eGFP και λουσιφεράση πυγολαμπίδας πλασμίδιο που κωδικοποιεί FUGLW. Δύο ημέρες αργότερα, το υπερκείμενο που περιέχει τα σωματίδια λεντοϊού αναρροφήθηκε, διηθείται μέσω φίλτρου 0.45 μπι, 8 μg πολυβρένιο /ml προστέθηκαν και το μίγμα χρησιμοποιήθηκε για τη μεταγωγή των κυττάρων του όγκου. Τα μεταδιηγερμένα κύτταρα ήταν ροής ταξινομημένο δύο φορές για eGFP-έκφραση, που ονομάζεται εφεξής Panc02-FUGLW. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 1% αντιβιοτικά (πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη), L-γλουταμίνη και 0.1% β-μερκαπτοαιθανόλη. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και περάστηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Κυττάρων μέσο καλλιέργειας και τα συμπληρώματα ελήφθησαν από την Invitrogen (Darmstadt, Γερμανία), όλα τα πλαστικά σκεύη ήταν από την Greiner BioOne (Frickenhausen, Germany). κύτταρα Panc02-FUGLW είναι συγγενικά να C57BL /6 ποντίκια.

ορθοτοπική PDA Μοντέλο και Ιη Vivo Απεικόνιση βιοφωταύγεια

κύτταρα

Panc02-FUGLW τρυψινοποιήθηκαν, συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα ποντίκια δέκτες αναισθητοποιήθηκαν με i.p. ένεση 80 mg /kg σωματικού βάρους (bw) υδροχλωρική esketamine (Pfizer, Βερολίνο, Γερμανία) και 16 mg /kg σωματικού βάρους ξυλαζίνης (CP Pharma, Burgdorf, Γερμανία) και τοποθετείται σε θερμαντική πλάκα 37 ° C. κύτταρα Panc02-FUGLW εγχύθηκαν ορθοτοπικά όπως περιγράφεται αλλού [17], [25] με ελαφρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, η κοιλιακή κοιλότητα ανοίχθηκε από μια ελάχιστα επεμβατική εγκάρσια λαπαροτομία. εντοπίστηκε και εξωτερικεύεται η κεφαλή του παγκρέατος. 1 × 10

4 βιώσιμα κύτταρα Panc02-FUGLW αργά με ένεση σε 30 μl PBS στην κεφαλή του παγκρέατος χρησιμοποιώντας ένα 710 RN 100 μl σύριγγα Hamilton με έναν μετρητή 28, 10 mm, σημείο Style 4 βελόνα (Hamilton Σύριγγα, Bonaduz , Ελβετία). Το πάγκρεας τοποθετήθηκε πίσω στην κοιλιακή κοιλότητα και το περιτόναιο και το δέρμα έκλεισαν τρέχοντας μονού στρώματος από 6-0 ράμματα πολυγλακτίνη (Johnson & amp? Johnson, Norderstedt, Germany).

Για την αγωγή TNF, ποντίκια εγχύθηκαν ίρ με 5 μg ανθρώπινο TNF σε 200 μΙ PBS κάθε δεύτερη ημέρα αρχίζοντας από την ημέρα της ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Για

in vivo

βιοφωταύγεια απεικόνισης [26], οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν και συν-ένεση με 300 mg /kg σωματικού βάρους D-λουσιφερίνη (Biosynth, Staad, Ελβετία). Δέκα λεπτά αργότερα, τα σήματα βιοφωταύγειας των αναισθητοποιημένων ποντικών αξιολογήθηκαν με ένα σύστημα απεικόνισης IVIS Spectrum (δαγκάνα Life Sciences, Mainz, Germany). Εικόνες ελήφθησαν από την πλευρική όψη σε αυτόματη λειτουργία με μέγιστο χρόνο έκθεσης πέντε λεπτά ανά εικόνα. Εικόνες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Ζώντας Εικόνα 4.0 του λογισμικού (δαγκάνα Life Sciences).

Ex vivo

Imaging

Την ημέρα 23 ή 30 μετά από ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων, τα ποντίκια ενέθηκαν με D -luciferin και 10 λεπτά αργότερα ευθανασία. Τα εσωτερικά όργανα αφαιρέθηκαν και υποβλήθηκαν σε

ex vivo

βιοφωταύγεια απεικόνισης [26]. Δείγματα ιστών εγκλείστηκαν σε Tissue Tek OCT (Sakura Finetek, Staufen, Γερμανία) για περαιτέρω ιστολογική ανάλυση.

Απομόνωση ανοσοκύτταρα από παγκρεατικό ιστό και σπλήνες

Οι ιστοί κιμά με μια χειρουργική λεπίδα και πέψη για 45 λεπτά στους 37 ° C με 2 mg /ml κολλαγενάση Α και 0,1 mg /ml ϋΝάσης Ι (και τα δύο από τη Roche, Mannheim, Germany). κομμάτια ιστού πουρέ μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 70 μm και στροβιλίστηκαν. Το κυτταρικό σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό λύσης ερυθροκυττάρων (168 mM ΝΗ

4Cl, 10 mM KHCO

3, 0,1 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA)) και επωάστηκαν για 2 λεπτά. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 10 όγκους PBS και τα κύτταρα περιδινίστηκαν πάλι. Το προκύπτον σφαιρίδιο επανααιωρήθηκε σε PBS και τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για κυτταρομετρία ροής. Οι σπλήνες άμεσα διηθούνται διαμέσου ενός 70 μm κύτταρο σουρωτήρι σε ρυθμιστικό λύσης ερυθροκυττάρων και πλύθηκαν μία φορά με PBS.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

Cryo-ενσωματωμένα ιστοί κόπηκαν σε 3 μm πάχους τομές σε κρυοστάτη Leica CM1900 (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία) και τοποθετείται επάνω παγωμένος διαφάνειες. Τα πλακίδια ξηράνθηκαν στον αέρα και σταθεροποιήθηκαν με ακετόνη σε θερμοκρασία δωματίου για 7 λεπτά. Τα πλακίδια πλύθηκαν και αποκλείστηκαν με 2% FBS σε PBS για 15 λεπτά. Όταν χρησιμοποιήθηκαν συζευγμένο με βιοτίνη αντισώματα, επιπλέον μπλοκάρισμα χρησιμοποιώντας ένα μπλοκαρίσματος αβιδίνης /βιοτίνης κιτ (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) διεξήχθη. Τα πλακίδια στη συνέχεια επωάστηκαν με τα κατάλληλα αντισώματα επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μεταξύ αντίσωμα-επωάσεων, τα πλακίδια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές. Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με DAPI και τοποθετείται με μέσο στερέωσης (Vector Laboratories). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: CD11b-Alexa 647 (Μ1 /70), CD31-Βιοτίνη (MEC13.3), CD4-Alexa 647 (GK1.5), CD8-Βιοτίνη (53-6.7), Foxp3-καθαρισμένο (FJK-16) (eBioscience), γάιδαρο-αντι-αρουραίου-Cy3 (Dianova, Αμβούργο, Γερμανία), F4 /80-Alexa 488 (CI: Α3-1), GR-1-Βιοτίνη (RB6-8C5), στρεπταβιδίνη Alexa 546 (Invitrogen ). Εικόνες ελήφθησαν με ένα Zeiss Imager.Z1m μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss, Göttingen, Γερμανία) και αξιολογήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Zeiss AxioVision (Carl Zeiss). Κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος μετρήθηκαν και δίνεται ως κύτταρα /mm

2 ή ως pixels /150 000 μm

2, όπως εκτιμάται από το λογισμικό J εικόνας (ΝΙΗ, Bethesda, MD).

κυτταρομετρίας ροής

τα κύτταρα αποκλείστηκαν με φυσιολογικό ορό αρουραίου (1:20 σε PBS) και χρωματίστηκαν με κατάλληλα αντισώματα στους 4 ° C για 30 λεπτά. Μετά χρώση αντιγόνο επιφανείας, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο. Για ενδοκυτταρική χρώση, τα κύτταρα βάφονται με ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΩΝ /DEAD επιδιορθώνεται κιτ βιολετί νεκρών κυττάρων λεκέ (Invitrogen) και περαιτέρω επεξεργασία χρησιμοποιώντας το ποντίκι χρώση ρυθμιστικών Τ κυττάρων σετ # 2 (eBioscience, Φρανκφούρτη, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από Biolegend (Uithoorn, The Netherlands), εάν δεν δηλώνεται διαφορετικά: α4β7-ΡΕ (DATK32), CCR4-APC (2G12), CCR5-ΡΕ (C34-3448), CCR7-APC (4Β12), CD102-Βιοτίνη ( 3C4 (MIC2 /4)), CD103-Pacific Blue (2Ε7), CD106-Alexa 488 (429), CD107a-FITC (1D4B), CD107b-Alexa 647 (M3184), CD11a-ΡΕ (Μ17 /4) (BD) , CD11b-Alexa 647 (Μ1 /70), CD11b-PE /Cy7 (Μ1 /70), CD11c-Alexa 647 (Ν418), CD25-PE (PC61.5) (eBioscience), CD24-PE (LG.7F9) (eBioscience), CD29-ΡΕ (HMβ1-1), CD4-FITC (RM4-5) (eBioscience), CD4-APC (RM4-5), CD44-ΡΕ (IM7), CD45.1-ΡΕ (Α20), CD45.2-APC (104), CD49d-Alexa 647 (RI-2), CD49f-Alexa 488 (GoH3), CD54-PE (YN1 /1.7.4), CD62E-ΡΕ (10E9.6) (BD), CD62L-APC /Cy7 (MEL-14), CD69-Pacific Blue (H1.2F3), CD8-PE /Cy7 (53-6.7), CXCR3-APC (CXCR3-173), CXCR4-Alexa 488 (2B11) (eBioscience ), Ε-σελεκτίνης πρωτεΐνη σύντηξης IgG (R & amp? D Systems, Wiesbaden, Γερμανία), F4 /80-Alexa 488 (C1: Α3-1), Foxp3-APC (FJK-16) (eBioscience), Ly6G-ΡΕ (1A8 ) (BD), πρωτεΐνης σύντηξης Ρ-σελεκτίνης IgG (BD), TNFR1-APC (55R-286), TNFR2-ΡΕ (TR75-89), κατσίκα-αντι-ανθρώπινη IgG-ΡΕ (Jackson), στρεπταβιδίνη-Alexa 546 ( Invitrogen). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ένα BD FACS Canto II (BD) και τα δεδομένα του δείγματος καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό BD FACSDiva και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA).

Απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή και qRT -PCR

RNA απομονώθηκε από δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας QIAshredder και RNeasy μίνι στήλες κιτ σπιν (Qiagen, Hilden, Germany). 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας το QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Έκφραση για γονίδια ενδιαφέροντος (αλληλουχίες εκκινητών μπορούν να βρεθούν στον πίνακα 1) αναλύθηκε σε ένα θερμοκυκλοποιητή iCycler (Bio-Rad, Munich, Germany) με τη χρήση iTaq καθολική SYBR Green Supermix (Bio-Rad) και β-ακτίνης ως γονίδιο αναφοράς. επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν με τη χρήση του ΔΔC

μέθοδο Τ.

Η

In vitro

TNF θεραπεία και την αξιολόγηση των μεταστατικών Δυνατοτήτων

1 × 10

5 Panc02 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και αφέθηκε για μια νύχτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1,67 ηΜ ανθρώπινης TNF ή 1,67 ηΜ ποντικού TNF για 48 ώρες, συλλέχθηκαν με ήπια απόξεση του μονοστιβάδα έξω από την πλαστική επιφάνεια, πλένονται δύο φορές με PBS και αξιολογήθηκαν για την έκφραση των μορίων προσκόλλησης και υποδοχέων χημειοκίνης με κυτταρομετρία ροής.

για να δοκιμαστεί η ικανότητα των κυττάρων Panc02 να αποδίδουν διαφορετικά συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας, η δοκιμασία CytoSelect 48 φρεατίων κυτταρικής προσκόλλησης (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να δοκιμαστεί η ικανότητα των κυττάρων να εισβάλουν Panc02 την βασική μεμβράνη, η εισβολή Δοκιμασία CytoSelect 24 Καλά Κυττάρων (Cell Biolabs) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Τα ανεπεξέργαστα και TNF-επεξεργασμένα κύτταρα Panc02 περαιτέρω αξιολογούνται για η δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 με ζυμογραφία ζελατίνης. Για την απομόνωση της πρωτεΐνης, το μυοκάρδιο ιστό ενός με έμφραγμα καρδιάς ποντικού καθώς και σφαιρίδια κυττάρων Panc02-FUGLW ομογενοποιήθηκαν με ρυθμιστικό RIPA και PMSF (Cell Signaling, Φρανκφούρτη, Γερμανία). Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% που περιείχε 2,5 mg /ml ζελατίνη σε σταθερή τάση 120 V για 2 ώρες στους 4 ° C. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες αποκατεστημένων με επώαση των πηκτωμάτων σε 2,5% Triton Χ-100 για 90 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πήγματα στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ενεργοποίησης (50 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5, 5 mM CaCl2, 0.2 Μ NaCl, και 0,02% Brij-35) επί 12 ώρες στους 37 ° C. Τέλος, τα πηκτώματα χρωματίστηκαν για 1 ώρα με διάλυμα μπλε χρώση 0,5% Coomassie και, στη συνέχεια, αποχρωματίζεται σε 40% ν /ν μεθανόλη, 10% ν /ν οξικό οξύ για να αποκαλύψει ζώνες εκκαθάρισης που δείχνουν πρωτεολυτική δράση. Η ένταση μπάντα ποσοτικά με τη χρήση ImageJ (version 1.44p)

Στατιστικά

Όλα τα γραφήματα εμφανίζονται τα συνδυασμένα δεδομένα από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.? ο αριθμός των ζώων που αναγράφεται στις επεξηγήσεις εικόνων. Όλα τα δεδομένα δείχνονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Σχήματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, USA) και το Adobe Photoshop 7 (San Jose, CA, USA). Όλες οι ομάδες συγκρίθηκαν με του άγριου τύπου ή χωρίς θεραπεία ομάδα ελέγχου, αντίστοιχα με t-test δύο ουρών unpaired σπουδαστή χρησιμοποιώντας GraphPad INSTAT 3 λογισμικό. Τα δεδομένα επίτευξη στατιστικής σημαντικότητας αναφέρεται ως: * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0,01

Αποτελέσματα

Απώλεια της υποδοχής TNFR1 καταργεί Αυθόρμητη Απόρριψη ορθοτοπική Panc02 όγκοι

. για να παρακολουθεί την ανάπτυξη του όγκου με μη επεμβατικό σε ένα συνγονιδιακό μοντέλο ποντικού PDA, δημιουργήσαμε κύτταρα Panc02 εκφράζουν eGFP και λουσιφεράση πυγολαμπίδας (Panc02-FUGLW) και ενίεται 1 × 10

4 από αυτά τα κύτταρα όγκου ορθοτοπικά σε αλμπίνο άγριου τύπου C57BL /6 ποντικούς και albino C57BL /6 ποντίκια με ανεπάρκεια για TNF, TNFR1, TNFR2 ή δύο TNFR έχουν. Σε όλες τις γονότυπους αξιολογηθούν Panc02-FUGLW όγκοι αναπτύχθηκαν αρχικά για τις πρώτες 7 ημέρες μετά τον εμβολιασμό του όγκου (Σχήμα 1Α και Β). 3/8 Β6 ποντικούς άγριου τύπου, 1/8 ποντίκια B6.TNF ΚΟ, και 2/9 ποντίκια B6.TNFR2 ΚΟ απορρίφθηκε αυθόρμητα το όγκου εντός 14 ημερών. Σε αντίθεση 13/13 ποντίκια με έλλειψη για TNFR1 ή ΤΝΡΚ1 και TNFR2 δεν μπορούσε να απορρίψει τον όγκο.

In vivo

BLI (Εικόνα 1Α και Β) και

ex vivo

BLI ένα μήνα μετά τον εμβολιασμό του όγκου (Σχήμα 1 C και D) αποκάλυψε επίσης σημαντικά υψηλότερο φορτίο όγκου σε ποντίκια με ανεπάρκεια για TNFR1 (ή TNFR1 και TNFR2) σε σχέση με ποντικούς άγριου τύπου. Έτσι, TNFR1 εμφανίστηκε ως ένας σημαντικός παράγοντας για τον έλεγχο και την απόρριψη των όγκων Panc02.

Ποντικού αδενοκαρκινώματος παγκρεατικού πόρου κύτταρα (Panc02) μετήχθησαν να εκφράζουν σταθερά eGFP και λουσιφεράση πυγολαμπίδας και 10

4 καρκινικά κύτταρα εγχύθηκαν ορθοτοπικά σε αλμπίνο C57BL /6 ποντίκια. Η ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς άγριου τύπου (B6.WT) και τα ποντίκια που ήταν ανεπαρκή για TNF ή τους υποδοχείς του προσδιορίστηκε με

in vivo

BLI. Α: Η ανάπτυξη του όγκου εμφανίζονται ως συνολική ακτινοβολία (B6.WT n = 8, B6.TNF KO η = 8, B6.TNFR1 KO n = 6, B6.TNFR2 KO n = 9, B6.TNFR1R2 KO n = 7). Β: Παραδειγματικά εικόνες της χρονικής πορείας απεικόνισης ενός ποντικού που απέρριψαν αυθόρμητα τον όγκο (αριστερά) και ένα ποντίκι που δεν μπορούσε να ελέγξει την εξέλιξη του όγκου (δεξιά). C:

Ex vivo

απεικόνισης, ένα μήνα μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων. Τα εσωτερικά όργανα απεικονίστηκαν για την παρουσία καρκινικών κυττάρων. Παραδειγματικά εικόνες ενός ποντικού που απέρριψαν αυθόρμητα τον όγκο (Ι), ένα ποντίκι με χαμηλή φορτίο του όγκου (II), και ένα ποντίκι με υψηλό φορτίο όγκου (III). D: παγκρέατος μέγεθος του όγκου, ένα μήνα μετά τον εμβολιασμό Panc02 εμφανίζεται ως συνολική ακτινοβολία (B6.WT n = 8, B6.TNF KO n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6, B6.TNFR2 KO n = 9, B6.TNFR1R2 KO n = 5). * P ≤ 0,05, ** p≤0.01. Συνδυασμένα δεδομένα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Panc02 όγκοι Εμφάνιση Altered Τ κυττάρων Διείσδυση στην B6.TNFR1 KO ποντίκια

Στη συνέχεια, αναλύσαμε το ανοσοποιητικό διείσδυση των κυττάρων σε όγκους Panc02-FUGLW αναπτύσσονται είτε σε C57BL /6 άγριου τύπου ή C57BL /6 ποντικοί με ανεπάρκεια για TNF, TNFR1 ή TNFR2 (Σχήμα 2 και Πίνακας 2) για την αντιμετώπιση κατά πόσον η απώλεια ελέγχου του όγκου θα μπορούσε να σχετίζεται με αλλαγές στο ανοσοποιητικό κυτταρικό διήθημα του όγκου. Απώλεια TNFR1 συσχετίστηκε με μείωση του αριθμού των διεισδύοντας CD8

+ Τ κυττάρων και αύξηση του αριθμού των διεισδύοντας CD4

+ Foxp3

+ T

regs. ανεπάρκεια TNFR1 επιπλέον αύξησε σημαντικά την αγγειακή πυκνότητα, όπως εκτιμάται από CD31-έκφραση, αλλά δεν μετέβαλε σημαντικά τη διείσδυση με έμφυτη κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος της μυελοειδούς σειράς (CD11b

+, F4 /80

+, Gr1

+ κύτταρα). Οι αλλαγμένες Τ μοτίβα κυτταρική διήθηση του Panc02-FUGLW όγκους από B6.TNFR1 KO ένα μήνα μετά τον εμβολιασμό μας ώθησε να αξιολογήσει τον φαινότυπο Τ κυττάρων στο πρώιμο στάδιο της επέκτασης του όγκου. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε την έκφραση των δεικτών ενεργοποίησης σε CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα 7 και 15 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου (Σχήμα 3). δεικτών ενεργοποίησης Τ κυττάρου μόνο διακριτικά διέφεραν. Ωστόσο, παρατηρήσαμε μια τάση για υψηλότερη ενεργοποίηση με το χρόνο των CD8

+ Τ κυττάρων (έκφραση του CD25 και CD69) και χαμηλότερη ενεργοποίηση των CD4

+ Τ κυττάρων (έκφραση CD27, CD54 και CD69). Η ανάπτυξη του όγκου στενά με μυελοειδή φλεγμονή. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε αυξημένα ποσοστά CD11b

+ και Ly6G

+ κύτταρα στο πάγκρεας πάροδο του χρόνου ανεξάρτητα από το γενετικό υπόβαθρο των ποντικών που φέρουν όγκο. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε συστημικό επίπεδο, η απώλεια της ΤΝΡΚ1 είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένη CD11b

+ και Ly6G αριθμούς

+ κυττάρων στις σπλήνες των ποντικών που φέρουν όγκο. Αυξημένη ανάπτυξη του όγκου εντός παγκρέατα από ΤΝΡΚ1 ΚΟ επιβεβαιώθηκε με σημαντικά αυξημένους αριθμούς των κυττάρων eGFP

+ Panc02-FUGLW σε αυτά τα ποντίκια δύο εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό του όγκου (Σχήμα 3).

Panc02-όγκοι εκφυτευτεί ένα μήνα μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, διαδοχικές ιστολογικές τομές βάφτηκαν για υποδεικνύεται ανοσοποιητικού κυτταρικών πληθυσμών και των αιμοφόρων αγγείων (CD31). Παγκρεατικών όγκων είχε ως αποτέλεσμα μια εισροή του ανοσοποιητικού κυτταρικών πληθυσμών του έμφυτου και προσαρμοστικού ανοσοποιητικού συστήματος που δεν παρατηρήθηκαν σε υγιή παγκρεατικό ιστό κάτω από συνθήκες σταθερής κατάστασης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ανεπάρκεια των TNFR1 οδήγησε σε μειωμένη κυτταροτοξικών CD8

+ διείσδυση Τ κυττάρων αλλά αυξήθηκε Τ

διείσδυση reg κυττάρων. Παραδειγματικά μικροφωτογραφίες φαίνονται. Ράβδος κλίμακας δείχνει 100 μm.

Η

Παγκρέατα και σπλήνες από αφελή και ποντίκια που φέρουν όγκους μία και δύο εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων αφαιρέθηκαν και παρασκευάστηκε ως εναιωρήματα μονών κυττάρων. Τ κύτταρα αναλύθηκαν για την έκφραση των επιφανειακών υποδοχέων ενεργοποίησης που σχετίζεται με κυτταρομετρία ροής. Επιπλέον, το ποσοστό των Τ

regs, μυελοειδή κύτταρα και κύτταρα όγκου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής (w /o όγκου: B6.WT n = 8, B6.TNFR1 KO n = 6? D + 7: B6.WT n = 7, B6.TNFR1 KO n = 6? d + 15: B6.WT n = 7, B6.TNFR1 KO n = 7). * P ≤ 0,05, ** p≤0.01. Συνδυασμένα δεδομένα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για την περαιτέρω εκτίμηση των μηχανιστική διαφορές του ελέγχου του όγκου μεταξύ άγριου τύπου και ποντίκια TNFR1 ΚΟ, εκτιμήσαμε την έκφραση των ανοσοκατασταλτικών γονιδίων και διάφορες κυτοκίνες σε Panc02-FUGLW όγκοι (Σχήμα 4). Εδώ, παρατηρήσαμε σε ένα μετεγγραφικό επίπεδο σημαντικά αυξημένη έκφραση του γαλεκτίνης-9 και IL-4, ενώ η έκφραση του iNOS ήταν σημαντικά μειωμένη.

Panc02-όγκοι εκφυτευτεί ένα μήνα μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων και το συνολικό RNA απομονώθηκε από τον ιστό του όγκου. RNA μεταγράφηκε αντίστροφα και ενισχύθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως σχετική έκφραση στους όγκους που προέρχονται από ποντικούς B6.TNFR1 ΚΟ σε σύγκριση με τους όγκους που προέρχονται από άγριου τύπου (WT) ποντίκια (B6.WT n = 3, B6.TNFR1 KO n = 4). * P ≤ 0,05.

Η

εξωγενή TNF δεν προκαλεί μετάσταση Παρά την ενίσχυση της ανάπτυξης των όγκων και επηρεάζοντας Τ

reg Ομοιόσταση

TNF έδειξε να ενισχύσει τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων σε διάφορες em

in vivo

μοντέλα ποντικού [27] – [29] περιλαμβάνει ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομεταμόσχευσης του PDA με παγκρεατεκτομή επαγόμενη μετάσταση [17]. Για να ελεγχθεί αν TNF επηρεάζει επίσης την ανάπτυξη του όγκου Panc02-FUGLW και μετάσταση, υποβάλλαμε σε αγωγή ποντικούς που φέρουν όγκο με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TNF, το οποίο δεσμεύεται μόνο σε μυϊκή TNFR1, κάθε δεύτερη ημέρα για τρεις εβδομάδες μετά από ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Αυτό αύξησε σημαντικά τη συνολική ανάπτυξη του όγκου εντός παγκρέατα και εκτέμνονται αυθόρμητη απόρριψη όγκου όπως αξιολογήθηκε με το

in vivo

και

ex vivo

BLI (Σχήμα 5Α και Β), αλλά δεν προκάλεσε μετάσταση στο ήπαρ, το νεφρά, ή του μεσεντερίου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αναλύσαμε επίσης την διείσδυση των CD8

+ και CD4

+ Τ κύτταρα, και Τ

regs σε όγκους των μη επεξεργασμένων και TNF-αγωγή ζώων και μάλιστα παρατήρησε ότι η ανθρώπινη θεραπεία TNF αυξάνει σημαντικά Τ

αριθμούς reg εντός των όγκων (Πίνακας 3). Από τη στιγμή που και άλλοι έχουν βρεθεί στο παρελθόν ότι TNFR2 αντί TNFR1 σε Τ

regs καλείται να οδηγήσει την επέκτασή τους [14] – [16], αυτό οδηγεί σε μια έμμεση μηχανισμός με τον οποίο τη διοίκηση του ανθρώπινου TNF προκαλεί Τ

reg επέκταση στο μοντέλο PDA μας.

10

4 κύτταρα όγκου εγχύθηκαν εντός του σπλήνα ποντικών αλμπίνο B6.WT. Οι ποντικοί είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία κάθε δεύτερη ημέρα με 5 μg ανασυνδυασμένου ανθρώπινου TNF. Η ανάπτυξη του όγκου προσδιορίστηκε με

in vivo

BLI. Α: Η ανάπτυξη του όγκου εμφανίζονται ως συνολική ακτινοβολία (χωρίς θεραπεία n = 11, TNF n = 10). Β:

Ex vivo

απεικόνισης 23 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων. Τα εσωτερικά όργανα απεικονίστηκαν για την παρουσία καρκινικών κυττάρων. Παγκρέατος μέγεθος του όγκου εμφανίζεται ως σύνολο ακτινοβόληση (χωρίς θεραπεία n = 11, TNF n = 10). ** P≤0.01. Συνδυασμένα δεδομένα από δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Panc02 κύτταρα δείχνουν μικρή In Vitro Δυνατότητες για μετάσταση

Λόγω του περιορισμένου μεταστατική δραστηριότητα των κυττάρων Panc02

in vivo

, αναλύσαμε τα μεταστατικά ικανότητες αυτών των κυττάρων

in vitro

ιδιαίτερα επίσης από TNF διέγερση. Panc02 κύτταρα προσκολλημένα στο πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας ινωδονεκτίνη, λαμινίνη Ι, και το ινωδογόνο, αλλά ούτε να κολλαγόνου Ι ούτε IV. Ούτε τα ανθρώπινα ούτε ποντικού TNF τροποποιημένα προσκόλληση κυττάρων Panc02 σε εξωκυτταρικά συστατικά μήτρας (Σχήμα 6Α) παρά την ισχυρή ενεργοποίηση της κλασσικής οδού του ΝΡ-κΒ (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Στη συνέχεια, αναλύσαμε τα κύτταρα Panc02 για έκφραση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην προσκόλληση και μετανάστευση κυττάρων (Σχήμα 6Β). Βρήκαμε τα καρκινικά κύτταρα PDA για να εκφράσουν CD29 (ιντεγκρίνη β1), CD49f (ιντεγκρίνη α6), και CD107a και b, η έκφραση του οποίου δεν διαμορφώνονται από TNF. CD106 (VCAM-1) έκφρασης, ωστόσο, προκλήθηκε από TNF. Εκτιμήσαμε επίσης την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων Panc02 χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

δοκιμασία εισβολής και μέτρησης ζελατινολυτικής δραστηριότητες (Σχήμα 6C). TNF δεν προκάλεσε σημαντικά την εισβολή και ότι με έμφραγμα μυοκαρδίου ποντίκια έδειξε MMP-9 και -2 δραστηριότητες, τα κύτταρα Panc02 δεν το έκανε, ανεξάρτητα του TNF διέγερσης. Εν ολίγοις, τα αποτελέσματα της

in vitro

ανάλυση των παραγόντων μετάστασης που σχετίζονται επιβεβαιωθεί η περιορισμένη μεταστατική δραστηριότητα που παρατηρήθηκε με κύτταρα Pan02

in vivo

.

Panc02 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1.67: Πρόσφυση σε διαφορετικές πρωτεΐνες εξωκυττάριας μήτρας (n = 4). Β: Προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής της έκφρασης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην προσκόλληση και μετανάστευση (n = 3). C: Επεμβατική ικανότητες των κυττάρων Panc02. Αριστερό πλαίσιο:

In vitro

εισβολή της βασικής μεμβράνης (n = 3). Δεξιό πλαίσιο: Ζελατίνη ζυμογραφία κυτταρικών δειγμάτων όγκου. Εμφραγμένη καρδιά ποντικού λύμα χρησιμοποιήθηκε σαν ένας θετικός έλεγχος (η = 4).

Η

Συζήτηση

Εδώ αποδείξαμε ότι TNFR1 είναι ένας σημαντικός υποδοχέας για τον έλεγχο των ανοσολογικών PDA. Απώλεια αυτού του υποδοχέα στο πλαίσιο των αποτελεσμάτων υποδοχής σε διαταραχές του ανοσοποιητικού κυτταρική διήθηση μέσα στον όγκο και αφαιρεί μηχανισμούς ανοσοεπιτήρηση. Παρ ‘όλα αυτά, η εξωγενής ενεργοποίηση TNFR1 με ανασυνδυασμένο TNF σε ζώα που φέρουν όγκο είχε σαν αποτέλεσμα ενισχυμένη της προόδου των όγκων, μιλώντας για ένα δίκοπο ρόλος του TNF-TNFR1-αλληλεπιδράσεις σε έλεγχο του όγκου PDA.

Μια πρόσφατη μελέτη αναλύθηκαν Τ αντιγόνο επαγόμενη πολυσταδιακής καρκινογένεσης σε παγκρεατικά νησίδια και διαπιστώθηκε ότι ενώ σε ποντίκια άγριου τύπου που διηθούν CD4

+ Τ κυττάρων που προκαλείται από το λήθαργο όγκου, απώλεια της TNFR1 σε αυτά τα κύτταρα αυτά μεταβαίνει σε μια φαινότυπο προαγωγής όγκων με διέγερση αγγειογένεσης [18]. Οι παρατηρήσεις αυτές είναι σύμφωνες με τα αποτελέσματα μας, δηλαδή η απώλεια της ΤΝΡΚ1 αυξημένη αγγειακή πυκνοτήτων εντός των όγκων. Ενώ TNFR1-ανεπάρκειας δεν τροποποίησε σταθερά τον φαινότυπο ενεργοποίησης ογκο-διηθητικά κύτταρα Τ, βρήκαμε περισσότερο CD4

+ Τ κυττάρων που διηθούν τους όγκους σε TNFR1-ανεπαρκή σε σχέση με ποντικούς άγριου τύπου. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μείωση του αριθμού των διεισδύοντας CD8

+ Τ κυττάρων και αύξηση του αριθμού των Τ

regs. Chee και οι συνεργάτες του διαπίστωσαν την απώλεια της TNFR1 σε ποντίκια NOD για να τους προστατεύσει από διαβήτη επηρεάζοντας την παλιννόστηση των συμβατικών Τ κυττάρων σε παγκρεατικά νησίδια, ενώ αύξηση του αριθμού των Τ

κύτταρα reg [30]. Στο μοντέλο μας, η ανεπάρκεια TNFR1 είχε ως αποτέλεσμα μεταβολές στην έκφραση του IL-4, γαλεκτίνη-9, και iNOS. Σύμφωνα με αυτό, η IL-4 έχει περιγραφεί ως ένας ισχυρός Τ

H2 κυτταροκινών [31] που προτάθηκε για την προώθηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων PDA και ως εκ τούτου να διαδραματίσουν ενεργό ρόλο στην εξέλιξη του όγκου αυτής της κακοήθειας [32], [33 ]. Γκαλεκτίνη-9 καταστέλλει Τ

H1 λειτουργίες του ανοσοποιητικού συστήματος [34] και επάγει την Τ

regs [35]. Ο ρόλος αυτής της πρωτεΐνης σε PDA δεν είναι καλά εδραιωμένη, παρ ‘όλα αυτά, η αυξημένη έκφραση αμφοτέρων των IL-4 και γαλεκτίνης-9 θα μπορούσε να υπαινίσσονται προς ένα μηχανισμός που εξηγεί αύξησαν τα CD4

+ Τ κυττάρων και Τ

διείσδυση reg σε όγκους Panc02 καλλιεργούνται σε TNFR1-ανεπαρκή ποντίκια. iNOS περιγράφηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε παγκρεατικά όγκους [36], [37].

Ο ρόλος του TNF σε παγκρεατικά εξέλιξης του όγκου είναι αμφιλεγόμενη. Ενώ μερικές μελέτες έδειξαν αντι-ογκογόνων ιδιοτήτων του TNF [19], [21], άλλοι έχουν δείξει τα αντίθετα αποτελέσματα [17], [20]. Έχουμε αποδείξει εδώ μια προ-ογκογόνο λειτουργία συστημικώς δραστικών TNF ως θεραπεία των ποντικών που φέρουν όγκο με αυτό κυτοκίνη αύξησε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Αυτό πηγαίνει μαζί με αυξημένους αριθμούς Τ

regs εντός των όγκων. Δείξαμε πρόσφατα ένα παρόμοιο μηχανισμό στην πνευμονική μοντέλο μετάστασης B16F10 [16], όπου εξωγενή θεραπεία ενισχυμένη ανάπτυξη όγκων TNF σε ένα Τ

reg-εξαρτώμενο τρόπο.

TNF είναι γνωστό ότι παίζει ένα ρόλο στην προαγωγή του καρκίνου μετάσταση [16] – [17], [27] – [29]. Παρά το γεγονός αυτό, δεν παρατηρήσαμε αυξημένη μετάσταση του πρωτογενούς όγκου Panc02 στο ήπαρ μετά από εξωγενή επεξεργασία TNF. Ενώ PDA μεθίσταται εύκολα σε άλλα μοντέλα [17], [38] και σε ασθενείς ανθρώπους [39], [40], ο όγκος Panc02 δεν φαίνεται να έχει τις δυνατότητες να κάνουν μετάσταση αυθόρμητα. Τα καρκινικά κύτταρα έδειξαν πολύ μικρή ζελατινολυτική ικανότητα και

in vitro

ούτε τους επεμβατικές ούτε κόλλα δυνατότητές τους ήταν διαμορφωμένο από τον TNF διέγερση.

Εν κατακλείδι, προτείνουμε ένα ρόλο TNFR1 στο ανοσολογικής όγκου των PDA . Ενώ τα δεδομένα μας μιλήσει για ένα ανοσοποιητικό μεσολάβηση αντι-ογκογόνο δράση του TNF μέσω TNFR1, όπως προειδοποιητικές αποτέλεσμα παρατηρήσαμε επίσης ότι η εξωγενής θεραπεία των ποντικών που φέρουν όγκο με TNF επαυξημένη ανάπτυξη του όγκου αντί να ελεγχθεί.