Αφηρημένο

ανακάλυψη βιοδεικτών χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας (MS) έχει δει πρόσφατα μια σημαντική αύξηση των αιτήσεων, κυρίως από τη ραγδαία εξελισσόμενο πεδίο της μεταβολισμική. Ενόργανη και τα δεδομένα εξελίξεις χειρισμό επέτρεψαν για άστοχα μεταβολίτη αναλύει το οποίο ανακρίνει ταυτόχρονα πολλαπλές βιοχημικές οδούς για τη διαλεύκανση φαινοτύπους της νόσου και τη θεραπευτική τους μηχανισμούς. Παρόλο που οι περισσότερες προσεγγίσεις μεταβολομική MS-based συνδυασμό με υγρή χρωματογραφία, μερικές πρόσφατα δημοσιευμένες μελέτες χρησιμοποιήθηκαν υποβοηθούμενη από τη μήτρα εκρόφηση λέιζερ (MALDI), που επιτρέπουν την ταχεία και άμεση ανάλυση δειγμάτων με ελάχιστη προετοιμασία του δείγματος. Εμείς και άλλοι έχουν αναφέρει ότι η προσταγλανδίνη Ε

3 (PGE

3), που προέρχεται από το μεταβολισμό της COX-2 των ωμέγα-3 λιπαρών οξέων εικοσαπενταενοϊκό οξύ οξύ (ΕΡΑ), ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων πνευμόνων, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα. Ωστόσο, το πώς PGE

3 μεταβολισμός ρυθμίζεται σε καρκινικά κύτταρα, τα κύτταρα ιδιαιτέρως ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), δεν είναι πλήρως κατανοητός. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε επιτυχώς MALDI για να εντοπιστούν διαφορές στο μεταβολισμό των λιπιδίων μεταξύ δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLC), Α549 και Η596, η οποία θα μπορούσε να συμβάλει στην διαφορική απόκριση τους στη θεραπεία ΕΡΑ. Η ανάλυση με MALDI-MS έδειξε ότι το επίπεδο του ΕΡΑ ενσωματώνονται σε φωσφολιπίδια σε κύτταρα Η596 ήταν 4 φορές μεγαλύτερη από ό, τι τα κύτταρα Α549. Περιέργως, Η596 κύτταρα παρήγαγαν πολύ λιγότερο PGE

3 από τα κύτταρα Α549, ακόμη και αν η έκφραση της COX-2 ήταν παρόμοια στις δύο αυτές κυτταρικές σειρές. Αυτό φαίνεται να οφείλεται στη σχετικά χαμηλότερη έκφραση της κυτοσολικής φωσφολιπάσης Α

2 (cPLA

2) σε κύτταρα Η596 από εκείνη των κυττάρων Α549. Επιπλέον, η προσέγγιση MALDI-MS χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία σε εκχυλίσματα ιστού όγκου από ένα K-ras διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού καρκίνου του πνεύμονα να ενισχυθεί η κατανόηση μας για το μηχανισμό δράσης του ΕΡΑ στο

in vivo

μοντέλο. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν την χρησιμότητα του συνδυασμού ενός workflow μεταβολισμική με MALDI-MS για τον προσδιορισμό των βιολογικών δεικτών που μπορούν να ρυθμίζουν το μεταβολισμό των ωμέγα-3 λιπαρών οξέων και τελικά να επηρεάσει τη θεραπευτική δυνατότητές τους

Παράθεση:. Pirman DA, Efuet Ε, Ding XP, Παν Y, Tan L, Fischer SM, et al. (2013) Αλλαγές στο Cancer Cell Metabolism αποκάλυψε με άμεση ανάλυση του δείγματος με MALDI φασματομετρία μάζας. PLoS ONE 8 (4): e61379. doi: 10.1371 /journal.pone.0061379

Επιμέλεια: Julio Φρανσίσκο Turrens, Πανεπιστήμιο της Νότιας Αλαμπάμα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20, Νοεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 8 Μάρτη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 26η Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Pirman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας CA144053-01A1 επιχορήγησης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και πολλή προσπάθεια έχει αφιερωθεί στην γονιδιακό προφίλ με στόχο τον εντοπισμό ορισμένων συστατικών του γονιδίου του καρκίνου, πληροφορίες σχετικά με μεταβολισμική και lipidomics σε καρκινικά κύτταρα ή ιστούς είναι περιορισμένη. Ακόμα κι αν η μεταβολισμική και lipidomics θέτουν τεχνολογικές προκλήσεις όσον αφορά την ικανότητα οργάνων, επαναληψιμότητα, και το χειρισμό των δεδομένων, αυτά τα πεδία της μελέτης δείχνουν μεγάλη υπόσχεση για την παροχή μια ολοκληρωμένη επισκόπηση του μεταβολισμού ένα καρκινικό κύτταρο, οδηγώντας έτσι στη δημιουργία νέων και δυνητικά εξατομικευμένες θεραπείες.

οι πρόσφατες εξελίξεις στην υποβοηθούμενη από τη μήτρα εκρόφηση λέιζερ /ιονισμού (ΜΑΙΟΙ) φασματομετρίας μάζας (MS), [1] – [7] αύξησαν χρησιμότητα MALDI της σε ένα ευρύ φάσμα νέων εφαρμογών. Οι πρόοδοι στην εμπορικώς διαθέσιμα όργανα, συμπεριλαμβανομένης της MALDI συζευγμένο με παγίδα γραμμική ιόν όργανο Orbitrap ή τετραπολικά χρόνο-πτήσης (QTOF) φασματόμετρα μάζας επέτρεψαν για την επιτυχή παραγωγή φάσματα μάζας στα κατώτερα μάζα εύρη (& lt? 1.000 Daltons), επιτρέποντας έτσι την MALDI-MS προφίλ των μεταβολιτών, συμπεριλαμβανομένων λιπιδίων, συνήθως δεν κοινά με MALDI όργανα οφείλεται σε επιδράσεις υποστρώματος και τον κατακερματισμό πηγή [7] – [9]. Αυτές οι εξελίξεις στα κράτη μέλη και τα όργανα ιονισμού έχουν μετακινηθεί MALDI-MS σε πολλές νέες ερευνητικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένων lipidomics [7], [10] – [12], το πεπτίδιο [2], τα ναρκωτικά [13] – [16], και του μεταβολίτη [17 ] αναλύει απευθείας από βιολογικά δείγματα, συμπεριλαμβανομένων των ιστών.

MALDI-MS έχει πρόσφατα χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την ανάλυση βιολογικών δειγμάτων απ ‘ευθείας σε συνδυασμό με το χειρισμό των στατιστικών στοιχείων. Αυτές οι προσεγγίσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διαφοροποίηση τύπους ιστών ή ταυτοποιεί διαφορικά ρυθμίζονται οδούς μεταβολισμού. Για παράδειγμα, οι ενδο-χειρουργικές ανιχνευτές που αναπτύσσεται από Balgo,

κ.ά.

., Στην οποία ο ιστός του δείγματος κατά τη διάρκεια της χειρουργικής εκτομής, αναλύθηκε με MS, μπορεί στη συνέχεια να κατηγοριοποιηθούν με στατιστικό λογισμικό [18]. Αυτή η προσέγγιση επέτρεψε την ταχεία, αμερόληπτη διάκριση των νοσούντων και τους υγιείς ιστούς και θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί για να αντικαταστήσει την παραδοσιακή ταξινόμηση ιστολογική κατά τη διάρκεια χειρουργική εκτομή του όγκου. Πρόσφατα, MALDI-MS έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για την ταξινόμηση των τάξεων όγκου, καθώς επίσης προέλευση του όγκου, αν και δεν intrasurgically [5], [19] – [21]. Αυτά τα πρόσφατα δημοσιευμένες μελέτες υπογραμμίζουν την εκτεταμένη χρήση MALDI-MS για άμεση ανάλυση των ιστών για τον χαρακτηρισμό ιστών, με βάση τα προφίλ μεταβολίτη, λιπιδίων, πεπτιδίων και πρωτεϊνών τους.

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε MALDI συνδεδεμένη με ένα φασματόμετρο μάζας QTOF για την ταχεία ανάκριση δύο NSCLC κυτταρικών σειρών για να αποκαλύψει διαφορές στον κυτταρικό μεταβολισμό του εικοσαπενταενοϊκού οξέος ιχθυελαίου που προέρχεται, πολυ-ακόρεστων λιπαρών οξέων (PUFA) (EPA). Έχουμε προσαρμοστεί επίσης την τεχνική για να αναλύσουν άμεσα και χαρακτηρίζουν τον μεταβολισμό των λιπιδίων ιστού ΕΡΑ από ΕΡΑ-αγωγή K-ras όγκους διαγονιδιακών πνεύμονα ποντικού τόσο από υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS /MS) και MALDI-MS για την επαλήθευση ο

in vitro

MALDI δεδομένα χρησιμοποιώντας μια συμπληρωματική προσέγγιση.

Πολλές προκλινικές μελέτες έχουν υποστηρίξει την ιδέα ότι οι ιχθυελαίου που προέρχονται από ωμέγα-3 λιπαρά οξέα EPA και το δοκοσαεξανοϊκό οξύ (DHA) έχουν την ικανότητα να την πρόληψη της διάδοσης των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή σε διάφορους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC [22]. Εμείς και άλλοι ερευνητές έχουν αναφέρει ότι η αποτελεσματικότητα του ΕΡΑ μπορεί να διαμεσολαβείται μέσω της κυκλοοξυγενάσης του (COX) μεταβολίτης της προσταγλανδίνης Ε

3 (PGE

3) σε ανθρώπινο πνεύμονα, του παχέος εντέρου, και παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [23] – [25 ]. Σε αντίθεση με DHA, EPA μπορεί επίσης να ενεργεί ως υπόστρωμα της COX, ιδίως COX-2, οδηγώντας σε αύξηση της PGE

3, σε αντίθεση με το αραχιδονικό οξύ (ΑΑ) που προκαλεί την προ-φλεγμονώδη μεταβολίτη προσταγλανδίνη Ε

2 (PGE

2) (Εικ. 1) [22]. Υψηλά επίπεδα της δράσης της COX-2, και ως εκ τούτου PGE

2, είναι γνωστό ότι σχετίζονται με αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μεταστατικό δυναμικό σε όγκους [26] – [28]. EPA έχει προηγουμένως δειχθεί ότι είναι αποτελεσματική στη μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Α549 αυξάνοντας την παραγωγή της PGE

3 και έτσι, η αύξηση της PGE

3 PGE

2 αναλογία /[22]. Ωστόσο, πώς άλλοι παράγοντες που σχετίζονται με τη σύνθεση των προσταγλανδινών επηρεάσουν την αντικαρκινική δράση των ΕΡΑ στα κύτταρα NSCLC δεν έχει αξιολογηθεί πλήρως.

Η

Εδώ, με τη χρήση MALDI-MS σε δύο κυτταρικές σειρές NSCLC που εκφράζουν παρόμοια επίπεδα του COX-2, έχουμε εντοπίσει επιτυχώς τις διαφορές στον κυτταρικό μεταβολισμό του ΕΡΑ. Με την τεχνική αυτή, ήμασταν σε θέση να άμεσα και γρήγορα (χρόνος ανάλυση & lt? 30 δευτερόλεπτα) ανακρίνει τον διαφορικό μεταβολισμό, ιδιαίτερα μεταβολισμό των λιπιδίων, σε κάθε κυτταρική σειρά με αναπαραγώγιμο τρόπο. Διαφορετικές ΕΡΑ που προέρχεται από το μεταβολισμό των λιπιδίων παρατηρήθηκε επίσης σε ιστούς όγκου πνεύμονα που προέρχονται από τα

K-ras

μεταλλαγμένο ποντίκι. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επιτυχή πρωτεΐνη προφίλ του ανθρώπινου πνεύμονα υποτύπων καρκίνου χρησιμοποιώντας MALDI-MS [29], αλλά εδώ δείξαμε τις δυνατότητες της MALDI για όχι μόνο διάκριση υποτύπων καρκίνου με διακριτά προφίλ των λιπιδίων τους, αλλά και για την παρακολούθηση βιολογική αποτελεσματικότητα της θεραπείας μέσω της ταυτοποίησης κατάλληλων βιοδεικτών. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που να αναλύει άμεσα τα καρκινικά κύτταρα με MALDI-MS, αποκαλύπτοντας διαφορές στον κυτταρικό μεταβολισμό, το οποίο θα μπορούσε να είναι κρίσιμη για την EPA-προκάλεσε αντικαρκινική δραστηριότητα στα κύτταρα NSCLC.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

το ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) Α549 και Η596 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C. Α549 και Η596 κύτταρα συνήθως καλλιεργούνται σε DMEM /F12 media (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 5% και 10% θερμο-απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), αντίστοιχα, και πενικιλλίνη -Streptomycin 100 × Solution και 2 mM L-γλουταμίνη από την ΟΙΒΟΟ (Invitrogen).

ανοσοαποτύπωσης

Για στύπωμα Western, κύτταρα σε 70% συρροή πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) , σε επεξεργασία με θρυψίνη και τα σφαιρίδια κυττάρου συλλέχθηκαν. Το σφαιρίδιο πλύθηκε δύο φορές με ψυχρό PBS και το προκύπτον σφαιρίδιο επανααιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Invitrogen), σε υπερήχους αμέσως ή αποθηκεύονται στους -80 ° C. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε πάγο για 3 λεπτά (Misonix Sonicator 3000, Farmingdale, ΝΥ, USA), και φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C. Τα επίπεδα πρωτεΐνης μετρήθηκαν ποσοτικά μέσω του προσδιορισμού πρωτεΐνης BioRad DC (BioRad, Inc., Hercules, CA). Ίσες επίπεδα της πρωτεΐνης (50 μg) αναλύθηκαν σε 7% (cPLA

2) και 10% πήγματα (COX-2) SDS PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου, σύμφωνα με τυποποιημένες μεθόδους. Μετά από επώαση 2-ώρες σε 5% άπαχο ξηρό γάλα ρυθμιστικό παρασκευάζεται σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween 20 (TBST) και το κλείδωμα, μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με cPLA

2 πρωτογενές αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ή την COX-2 (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ, USA) σε αραίωση 1:1000 για 2 ώρες, πλύθηκαν σε TBST, επωάστηκαν σε δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα, που ακολουθείται από 3 χ 10 λεπτά πλένουμε το καθένα σε TBST. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές μέσω χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας το κιτ ECL + ανίχνευση και υπερ-φιλμ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Ίση φόρτωση των δειγμάτων απεικονίζεται με κηλίδωση Western για την παρουσία β-ακτίνης.

cPLA

2 δραστικότητα δοκιμασία

Η δραστηριότητα των cPLA

2 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα cPLA

2 κιτ δοκιμασίας (Cayman Chemical Company). Εν συντομία, Α549 και Η596 (5 × 10

6) κύτταρα σπάρθηκαν σε 100 mM πιάτα και αφέθηκαν να αναπτυχθούν όλη τη νύχτα να φθάσει ~ 70% συρροή. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM Hepes, ρΗ 7,4? 1 mM EDTA), ξύνεται με ένα κύτταρο ανυψωτικό (Corning Incorporated, Coming, ΝΥ, USA) και μεταφέρθηκε σε ένα σωλήνα eppendorf σε πάγο. Μετά κατεργασία με υπερήχους για 3 λεπτά, τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 14.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και η συγκέντρωση των πρωτεϊνών προσδιορίστηκε με την δοκιμασία πρωτεΐνης BioRad Dc. Για την δοκιμασία δραστικότητας, χρησιμοποιήθηκε το ισοδύναμο όγκο 1 μα πρωτεΐνης. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 414 nm σε αναγνώστη πλακός Spectra Max M5 (Molecular Devices Corp., Sunnyville, CA, USA). Η cPLA

2 δραστηριότητα εκφράστηκε σε μmol /min /ml, όπως καθορίζεται από τον τύπο που προβλέπεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

K-ras

διαγονιδιακό ποντίκι

Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το ιδρυματική φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου. Για να εκτιμηθεί η μεταβολισμό των λιπιδίων του ΕΡΑ σε ιστούς πνεύμονα ποντικού, πέντε-εβδομάδων

K-rasLA

C57BL6 /129 /SV F1 μεταλλαγμένα ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν ως μια αυθόρμητη μοντέλο όγκου πνεύμονα και διατρέφονται με δίαιτα που περιέχει σογιέλαιο ή EPA (1% και 2%) για 9 εβδομάδες. Στο τέλος της ένατης εβδομάδας, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, οι ιστοί των πνευμόνων απομακρύνθηκαν, flash-καταψυχθεί σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω ανάλυση με MALDI-MS.

Ανάλυση με MALDI- MS

κύτταρα (1 χ 10

6) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΕΡΑ (25, 50, ή 100 μΜ), σε μέσα άνευ ορού που περιέχει 1% BSA για 24 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, ανέπαφα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 rpm για 2 λεπτά στους 4 ° C, πλύθηκαν σε PBS, και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 20 μί PBS. Τα κύτταρα είτε αποθηκεύεται στους -80 ° C ή αμέσως σε επεξεργασία για ανάλυση MALDI-MS.

Για ανάλυση MALDI-MS των κυττάρων, τα κυτταρικά ιζήματα αποψύχθηκαν και 1 μL του εναιωρήματος κηλιδώθηκε επάνω σε μια πολυλυσίνη-επικαλυμμένο γυάλινη πλάκα (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ, USA) χρησιμοποιείται ως MALDI στόχου. Για τις αναλύσεις MALDI-MS των δειγμάτων ιστού, 10-30 mg ιστού ομογενοποιήθηκε σε 500 μL PBS χρησιμοποιώντας ένα ομογενοποιητή ιστών Precellys (Bertin Technologies, Paris, France). Ένα υποπολλαπλάσιο κλάσμα από 1 μι του ομογενοποιημένου κηλιδώθηκε πάνω σε ένα γυάλινο πλακίδιο επικαλυμμένες με πολυλυσίνη. Τα κυτταρικά εναιωρήματα και ομογενοποιημένου ιστού ξηραίνονται σε ξηραντήρα κενού σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Διυδροξυβενζοϊκό οξύ (DHB) (20 mg /ml) σε χλωροφόρμιο /αιθανόλη (9:01?

ν /ν

) εφαρμόστηκε στα δείγματα με επικάλυψη με ψεκασμό μέσω ενός νεφελοποιητή Meinhard (Meinhard, Χρυσή, CO, ΗΠΑ). Το μείγμα χλωροφορμίου /αιθανόλης επιτρέπεται σχηματισμός ταχεία κρύσταλλο πάνω στα κύτταρα ενώ εμποδίζει τη συγκέντρωση του διαλύτη μήτρας. Τα φάσματα μάζας που συλλέγεται σε ένα φασματόμετρο μάζας Waters Synapt G1 QTOF (Milford, ΜΑ, USA). Για την ταυτοποίηση των λιπιδίων, τα δεδομένα ακριβή μάζα και MALDI-MS /MS συλλέχθηκαν σε ένα φασματόμετρο μάζας Thermo Scientific MALDI LTQ Orbitrap (San Jose, CA, USA).

LC-MS /MS

οι προσταγλανδίνες Ε

2 και Ε

3 (PGE

2 και PGE

3), εξήχθησαν σύμφωνα με την προηγουμένως δημοσιευμένη μέθοδο από Yang

et al

. [30], [31]. Εν συντομία, ένα δείγμα του ρυθμιστικού διαλύματος 0.5 κ.εκ. PBS προστέθηκε στα κατεψυγμένα σφαιρίδια ιστών ή κυττάρων, που ακολουθείται από ομογενοποίηση σε σωλήνες 1,5 ml με κεραμικές χάντρες χρησιμοποιώντας το ομογενοποιητή ιστών Precellys (Bertin Technologies) και 400 μι κλάσματα χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση προσταγλανδίνης. Όλες οι διαδικασίες εξόρυξης πραγματοποιήθηκαν κάτω από ελάχιστο φως. Τα δείγματα στη συνέχεια ανασυστάθηκαν σε 100 μL μεθανόλης /0,1% οξικό οξύ (50:50,

ν /ν

) πριν από την ανάλυση με LC-MS /MS [31].

Το εξωκυτταρικό επίπεδα της PGE

2 και PGE

3 σε Α549 και Η596 κύτταρα εκχυλίζονται σύμφωνα με Yang

κ.ά.

[22]. PGE

2 και PGE

3 ποσοτικοποιήθηκαν με LC-MS /MS χρησιμοποιώντας ένα Agilent 6460 τριπλό τετραπολικό (QQQ) φασματογράφο μάζας (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) εφοδιασμένο με έναν Agilent ΗΡ 1200 δυαδικό HPLC αντλία εισόδου (Agilent). PGE

2 και PGE

3 διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα 2 x 100 mm Kinetex 3 μ C18 αναλυτική στήλη (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Η κινητή φάση συνίστατο από 0.1% μυρμηκικό οξύ και ακετονιτρίλιο με 0.1% μυρμηκικό οξύ. Η θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 40 ° C, και τα δείγματα κρατήθηκαν στους 4 ° C κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. Μεμονωμένα αναλυτών ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ιονισμό ηλεκτροψεκασμού και πολλαπλές παρακολούθηση της αντίδρασης, και η ακόλουθη

m /z

μεταπτώσεις παρακολουθήθηκαν σε αρνητικό τρόπο ιονισμού με:

m /z 351

→ 271 για PGE

2,

m /z

349 → 269 για PGE

3, και

m /z

355 → 275 για PGE

2-δ

4. Τα επίπεδα της PGE

2 και PGE

3 ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αυθεντικά πρότυπες καμπύλες και ομαλοποιήθηκε ως προς είτε τον αριθμό των κυττάρων (ενδοκυτταρική ή εξωκυτταρική) ή την ποσότητα της πρωτεΐνης προσδιορίζεται με μία δοκιμασία Bradford (Bio-Rad).

η στατιστική ανάλυση

Κάθε βιολογικό αντίγραφο εντοπίστηκε δύο φορές και αναλύονται δύο φορές με MALDI-MS και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Εξάγονται τα φάσματα από κάθε ομάδα φορτώθηκε σε απευθείας σύνδεση λογισμικό Metaboanalyst (Metaboanalysis 2.0, Διαθέσιμα:. https://www.metaboanalyst.ca/Προσεγγισμένες Μάιος 2012) [32], [33]. Αυτό το online λογισμικό προσφέρει μια σειρά από στατιστικά εργαλεία για να μειωθεί η πολύπλοκη φάσματα και να εντοπίσει σημαντικά αλλάζοντας

m /z

τιμές. Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA), μερική ανάλυση ελαχίστων τετραγώνων διακρίσεις, t-τεστ και ανάλυση διασποράς χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των δεδομένων που προκύπτουν MS τόσο για τον εντοπισμό αλλαγή κορυφές και να καθορίσει κατά πόσον οι τύποι κυττάρων ή ιστών θα μπορούσε να διακριθεί από το άλλο . Σημαντικά διαφορετικά χαρακτηριστικά στη συνέχεια συγκρίθηκαν με αυτά τόσο από την Ανθρώπινη μεταβολιτών Τράπεζας (HMDB? Διαθέσιμα: https://www.hmdb.ca Προσεγγισμένες Μάιος 2012). Και το METLIN (Διαθέσιμο: https://metlin.scripps.edu/. προσπελαστεί Μάιο 2012) βάσης δεδομένων για τον χαρακτηρισμό της ένωσης.

Αποτελέσματα

μεταβολισμό ΕΡΑ διαφορικά ρυθμίζεται σε NSCLC Α549 και κύτταρα Η596

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του ΕΡΑ σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC διαμεσολαβούνται μέσω της έκφρασης τους από COX-2 και το σχηματισμό του αντι-πολλαπλασιαστική μεταβολίτη, PGE

3 [22]. Ωστόσο, όταν αντιμετωπίζονται δύο NSCLC Α549 και Η596 κυττάρων με την EPA, ΕΡΑ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549 (IC

50 & lt? 6,25 μΜ) πιο αποτελεσματικά από ό, τι τα κύτταρα Η596 (IC

50 & gt? 50 μΜ) ( Το Σχ. 2Α), ακόμη και αν αυτές οι δύο κυτταρικές γραμμές έδειξαν παρόμοια έκφραση COX-2 (Σχ. 2Β). Για να οριοθετηθούν οι μηχανισμοί που θα μεσολαβούν οι διαφορικές επιδράσεις σημείωσε με θεραπεία ΕΡΑ, αξιολογήσαμε τα διαφορετικά φάσματος μάζας προφίλ αυτών των κυτταρικών σειρών με τη χρήση MALDI-MS που ακολουθείται από ανάλυση PCA (Εικ. 3). Αρχικά αυτή η ανάλυση χρησιμοποιείται απλώς για να προσδιορισθεί αν το συλλεγόμενο MS φάσματα θα μπορούσαν πράγματι να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση μεταξύ κυτταρικό τύπο και υποβάλλεται σε αγωγή έναντι μη επεξεργασμένα δείγματα. Σημαντικά αλλαγή κορυφές που προσδιορίζονται από p-τιμές & lt? 0,05 ερευνήθηκαν και ταυτοποίηση προσπάθησε συμπεριλαμβανομένων των λιπιδίων PC συζητηθεί περαιτέρω. Η MALDI-MS φάσματα των ανεπεξέργαστων Α549 και Η596 κύτταρα έδειξαν πολύ παρόμοιες μεταβολικές /lipidomic υπογραφές (Εικ. S1 Α και S1B) εκτός από μερικές μικρές διαφοροποιήσεις στην ένταση του σήματος και, συνεπώς, δεν διαφοροποιούνται από ανάλυση PCA, ΕΡΑ-αντιμετωπίζονται Α549 και Η596 κύτταρα διέφεραν ουσιαστικά στη μεταβολική τους /lipidomic προφίλ (Σχ. 4). Μετά την επεξεργασία EPA, το μοτίβο μεταβολίτης στις δύο κυτταρικές σειρές διαφοροποιούνται εύκολα με την παρατήρηση νέες και επάνω ρυθμισμένη κορυφές, γεγονός που υποδηλώνει ότι κυτταρικό μεταβολισμό του ΕΡΑ σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές είναι διαφορικά ρυθμίζεται (Εικ. S1c και S1D).

(Α). Το αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του ΕΡΑ στο ανθρώπινο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Α549 και κύτταρα Η596 (Β). Η έκθεση των κυττάρων Α549 σε EPA για 72 ώρες παρήγαγε μια δέκα φορές ισχυρότερη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα Α549 από ότι σε Η596 κύτταρα.

Η

Τα κύτταρα χωρίς θεραπεία (Α) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μΜ EPA ( ΣΙ). Τα ανεπεξέργαστα Α549 και Η596 κύτταρα είχαν παρόμοια φάσματα μάζας (Α). Ωστόσο, η θεραπεία μετα-ΕΡΑ οδήγησε σε μια σαφώς διαφοροποιημένη μοτίβο μεταβολική μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικών σειρών (Β). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο βιολογικών επαναλήψεων με επαναλαμβανόμενες αναλύσεις. Ένας μέσος όρος 25 φάσματα μάζας συνελέγησαν και ο μέσος όρος από κάθε κηλίδα κύτταρο. Ο χρόνος για κάθε ανάλυση ήταν λιγότερο από ένα λεπτό. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται από τρία αναπαραχθεί πειράματα.

Η

Μια σημαντική αύξηση παρατηρείται για

m /z 802,5

, το οποίο αντιστοιχεί σε ένα PC (36:5) λιπαρό οξύ. MS /MS επιβεβαίωσε ότι PC (16:00 /20:05) ήταν συστατικό της παρατηρούμενης

m /z

αξία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Spectra φαίνεται στο (C) και (D), που αντιστοιχεί στα κύτταρα Α549 γραμμή χωρίς θεραπεία και ΕΡΑ αντιμετωπίζεται? αντίστοιχα, δείχνουν επίσης μια αύξηση σε ποσοστό

m /z 802,5

μετά τη θεραπεία με ΕΡΑ. Ωστόσο, η αύξηση αυτή είναι σημαντικά μικρότερη από την αύξηση που παρατηρήθηκε για την κυτταρική γραμμή Η596.

Η

Υψηλότερο επίπεδο ενσωμάτωσης ΕΡΑ σε φωσφατιδυλοχολίνη (PC) με Η596 από ό, τι στα κύτταρα Α549

Περαιτέρω επιθεώρηση του συλλεγόμενου φασμάτων προσφέρει διορατικότητα διαφορικά ρυθμίζεται μεταβολισμό ΕΡΑ σε αυτά τα δύο συγκεκριμένα κυτταρικές σειρές, που φαίνεται στο Σχ. 4. Οι κορυφές που εμφανίζονται σε αυτό το σχήμα αντιπροσωπεύουν λιπίδιο είδη με δύο ποικίλα μήκη ακυλο-αλυσίδας και βαθμό ακορεστότητας. Για παράδειγμα,

m /z

804,5 αντιπροσωπεύει την sodiated υπολογιστή που περιέχει δύο ακυλο-αλυσίδες συνολικά 36 άτομα άνθρακα με 4 διπλούς δεσμούς (36:4). Από προηγουμένως δημοσιευμένα αποτελέσματα, μια λογική υπόθεση μπορεί να γίνει ότι μία ακυλο-αλυσίδα περιέχει 16 άνθρακες με μηδέν διπλούς δεσμούς και ότι η άλλη αλυσίδα περιέχει 20 άνθρακες και τέσσερις διπλούς δεσμούς (μια ρίζα ΑΑ) [7]. Συνηθέστερα, η ακόρεστη χαρακτηριστική ομάδα καταλαμβάνει την θέση SN2 στη ραχοκοκαλιά φωσφογλυκερόλης? Ωστόσο, όπως αποικοδόμηση λιπιδίων και αναγέννησης είναι συνεχώς σε ροή, οι δομές αλλάζουν συνεχώς, καθιστώντας απόλυτη λιπίδιο δομικούς προσδιορισμούς δύσκολο σε κάθε δεδομένη στιγμή. Σύκο. 4Β δείχνει επίσης μια πενταπλάσια αύξηση σε

m /z 802,5

, [M + Na]

+ του PC σε κύτταρα Η596 μετά από θεραπεία με ΕΡΑ σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με όχημα μόνο. Περαιτέρω ανάλυση MALDI-MS /MS προσδιορίζονται τη μάζα αυτή για να πράγματι να αποτελείται από έναν υπολογιστή πιθανότατα προέρχεται από την EPA, όπως το PC (36:5) (Εικ. S2). Η παρατηρούμενη αύξηση των PC (36:5) αποδίδεται στην ενσωμάτωση των λιπαρών οξέων EPA στο PC, ενδεχομένως, στη θέση SN2. Σε σύγκριση, το παρόμοιο μεταβολίτης από τα κύτταρα Α549 (Σχ. 4C και 4D) δείχνει μόνο μία οριακή αύξηση του

m /z 802,5

. Ως εκ τούτου, αυτές οι διαφορές στον κυτταρικό μεταβολισμό μπορεί ειδικώς να συσχετιστούν με Η596 κύτταρα κατά την αγωγή ΕΡΑ. Σύγκριση των μη επεξεργασμένων φασμάτων κύτταρο του PC (36:4) εντάσεις στις δύο κυτταρικές σειρές σαν αποτέλεσμα παρόμοιες τιμές, υποδεικνύοντας αυτές οι δύο κυτταρικές γραμμές έχουν παρόμοια ικανότητα να σχηματίζουν τέτοια είδη PC. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι Α549 και Η596 κύτταρα διαφέρουν ελάχιστα στη βιοσύνθεση των PC, αλλά θα μπορούσαν να έχουν διαφορετικές ικανότητες για τη ρύθμιση της χρησιμοποίησης των ΕΡΑ από το PC.

Για να δημιουργήσετε συγκρίσιμες εκτιμήσεις μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές και να λογοδοτήσουν για κάθε MALDI παραλλαγές της έντασης του σήματος, κάθε λιπαρό οξύ PC (

m /z 802

και 804) ομαλοποιήθηκε με την ένταση του σήματος της ομάδας κεφαλής PC (

m /z

184), η οποία κυρίως μορφές μέσω κατακερματισμό πηγή. Αν υποθέσουμε ότι η συνολική περιεκτικότητα σε PC μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών είναι παρόμοια, αυτό ιόν χρησιμεύει ως ένας κατάλληλος ομαλοποίηση ιόν, καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να αντιπροσωπεύσει το σύνολο των ειδών PC. Η προσέγγιση αυτή περιορίζεται σε είδος υπολογιστή με 16:00 ακυλο-αλυσίδα στη θέση SN1 και την υποκατάσταση PUFA στην θέση SN2 για την απλότητα της σύγκρισης. Παρόμοιοι υπολογισμοί μπορούν να γίνουν με την αύξηση του μήκους SN1 ακυλ αλύσου. Από τους υπολογισμούς, μια σημαντική αύξηση των PC (36:5) και PC (36:4) παρατηρείται σε κύτταρα Η596 μετά από θεραπεία με ΕΡΑ (Πίνακας 1). Η αύξηση των PC (36:5) μπορεί να αποδοθεί στο σχηματισμό των ειδών PC με ένα τμήμα EPA προστίθεται στη θέση SN2 των ομάδων PC. Η αύξηση του PC (36:4) είναι ενδεικτική της στροφής μακριά από ΑΑ είσοδο του COX-2 πορεία προς εκείνη της ΕΡΑ. Μια αύξηση στα δύο είδη PC παρατηρείται επίσης στο Α549 κυτταρική γραμμή? Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα δεν είναι τόσο μεγάλη όσο αυτή που παρατηρήθηκε στην κυτταρική σειρά Η596.

Η

Η596 παράγεται χαμηλότερα επίπεδα της PGE

3 από ό, τι Α549 κύτταρα

Από την MALDI- MS δεδομένα υποδηλώνουν ότι το ΕΡΑ παρατηρήθηκε κυρίως σε ένα φωσφολιπίδιο μορφή σε Η596 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα Α549 και τα δύο από αυτά τα κύτταρα έχουν παρόμοιες φωσφολιπίδιο βιοσυνθετικών δυνατοτήτων, τρέχουσα υπόθεση μας είναι ότι μπορεί να υπάρχουν διαφορές είτε στην έκφραση ή τη δραστηριότητα της φωσφολιπάσης Α

2 (cPLA

2), ένα ένζυμο που απελευθερώνει λιπαρά οξέα από τη θέση SN2 της ραχοκοκαλιάς γλυκερίνης. Αυτή η τροποποίηση μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικές ικανότητες των Η596 και Α549 κύτταρα να σχηματίσουν PGE

3 ανάλογα με τη διαθεσιμότητα του υποστρώματος, περιορίζοντας έτσι τις αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις του ΕΡΑ στα κύτταρα Η596.

πρώτα συνέκρινε την ενδοκυτταρική και εξωκυτταρικά επίπεδα της PGE

3 σε Η596 και Α549 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ΕΡΑ (50 μΜ). Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, η ενδοκυτταρική επίπεδο της PGE

3 ήταν σχεδόν δύο έως τέσσερις φορές υψηλότερες, στα χρονικά σημεία μέχρι 20 ώρες σε Α549 κύτταρα από ό, τι στα κύτταρα Η596, ενώ μια μεγαλύτερη ποσότητα εξωκυτταρικής PGE

3 ήταν παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 από ό, τι στα κύτταρα Η596 μετά από 4 ώρες της θεραπείας. Για να ελέγξετε περαιτέρω την υπόθεση μας, καθορίζεται το επίπεδο της πρωτεΐνης του cPLA

2, καθώς και τη δραστηριότητά της σε αυτά τα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6. Η έκφραση της πρωτεΐνης του cPLA

2 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα Α549 από εκείνη του Η596 κύτταρα (Σχ. 6Α). Ομοίως, η δραστικότητα των cPLA

2 ήταν 4 φορές υψηλότερη σε κύτταρα Α549 από εκείνη του Η596 κύτταρα (Σχ. 6Β). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η απελευθέρωση του ΕΡΑ σε Η596 κύτταρα από ΕΡΑ-ενσωματώνεται PC ήταν πολύ μικρότερη από ό, τι σε κύτταρα Α549 λόγω περιορισμένης έκφρασης και τη δραστηριότητα των cPLA

2 σε Η596 κύτταρα, υποστηρίζοντας την υπόθεση ότι ο μεταβολισμός EPA είναι διαφορικά ρυθμίζεται , όπως προτείνεται από την ανάλυση MALDI-MS.

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με EPA για διαφορετικούς χρόνους όπως υποδεικνύεται και ακέραια κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με LC-MS /MS. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα της PGE

3 σε κύτταρα Α549 ήταν τουλάχιστον διπλάσια υψηλότερες από εκείνες σε κύτταρα Η596. (Β) μέσα καλλιέργειας κυττάρων συλλέχθηκαν σε διαφορετικούς χρόνους όπως υποδεικνύεται και υποβλήθηκε σε εκχύλιση στερεάς φάσης. Εξωκυτταρικά επίπεδα της PGE

3 στη συνέχεια αναλύθηκαν με LC-MS /MS. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ξεχωριστών πειραμάτων

Η

(Α) Protein έκφραση του cPLA2 σε Α549 και Η596 κυττάρων προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western.? (Β) Δραστηριότητα του cPLA2 σε Α549 και Η596 κυττάρων μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τόσο επίπεδο πρωτεΐνης και δραστικότητα cPLA2 ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε κύτταρα Η596 σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων Α549.

Η

EPA αλλοιωμένος μεταβολισμός λιπιδίων σε K-ras ιστούς όγκων πνεύμονα ποντικού

Για να καθοριστεί εάν MALDI-MS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρατήρηση αλλαγές στον μεταβολισμό ιστού

in vivo

, μετά διαιτητική πρόσληψη ΕΡΑ, τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν επίσης σε εκχυλίσματα πνευμονικού ιστού από γενετική K-ras μεταλλαγμένα ποντίκια. Τα φάσματα μάζας συλλέγονται απευθείας από πνευμονικό ιστό που κυμαίνονται από

m /z

800-840 φαίνονται στο Σχ. 7. Από την ανάλυση απευθείας ιστού με MALDI, η επίδραση κάθε δίαιτας μπορεί να παρατηρηθεί από τα προφίλ των λιπιδίων του όγκου. Μετά τη διατροφή EPA (Εικ. 7Α), τα αντίστοιχα είδη PC με την EPA (

m /z

802 και 830) ακυλο-ομάδα απορυθμίζεται σε σύγκριση με εκείνη της ομάδας διατροφή σόγια. Περιέργως, η αναλογία της PGE

3 πάνω PGE

2 ήταν σημαντικά αυξημένη από 0,011 ± 0,004 ιστών από σόγια τρέφονται ποντίκια για να 0,063 ± 0,03 (1% EPA) και 0,42 ± 0,11 (2% ΕΡΑ) των πνευμόνων ιστών που προέρχονται από ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε ΕΡΑ (σχ. 7Β). Η παρατήρηση ενσωμάτωσης ΕΡΑ στα είδη PC συσχετίζεται καλά με την αναλογία της PGE

3 /PGE

2 ανιχνεύθηκε από τα ίδια δείγματα ιστών με LC-MS /MS, υποδεικνύοντας ότι EPA οδήγησε σε μετατόπιση του όγκου στο μεταβολισμό από παράγει την πολλαπλασιαστική μεταβολίτη PGE

2 σε αντι-πολλαπλασιαστική μεταβολίτη PGE

3 μέσω της οδού της COX-2.

Α). MALDI φάσματα μάζας που συλλέγονται απευθείας από λύματα ιστό του όγκου του K-ras μεταλλαγμένα όγκους του πνεύμονα, είτε ακατέργαστα ή κατεργασμένα με EPA. Οι παρατηρούμενες μεταβολές στην λιπιδίων καταβολισμό από AA σε EPA εγκλωβιστούμε, δείχνουν σημαντικές αλλαγές στο μεταβολισμό του όγκου. ΣΙ). Αναλογία PGE

3 /PGE

2 εξάγεται από ιστό όγκου που προέρχονται από το διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού K-ras. PGE

2 και PGE

3 ήταν ποσοτικά με LC-MS /MS. Τα στοιχεία αυτά αντιπροσωπεύουν το μεταβολισμό μετατόπιση του όγκου από την παραγωγή ΑΑ προέρχεται PGE

2 έως PGE

3 από την EPA προκαλέσουν έτσι μια αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση.

Η

Συζήτηση

Η αρχική στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί αν η διαφορική απόκριση των κυτταρικών σειρών NSCLC στη θεραπεία ΕΡΑ θα μπορούσε να μετρηθεί με άμεση ανάλυση με MALDI-MS. Αν και τα στατιστικά εργαλεία που χρησιμοποιούνται, δεν θα μπορούσε να διακρίνουν άμεσα μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές πριν από τη θεραπεία, θα μπορούσαμε να διαφοροποιηθούν με επιτυχία τις κυτταρικές σειρές που βασίζονται στη μάζα προφίλ φάσματα τους μετά από θεραπεία ΕΡΑ. Αυτά τα δεδομένα έχουν οδηγήσει σε αυξημένη κατανόηση του βιολογικού μηχανισμός που ευθύνεται για σχετικά χαμηλότερη ευαισθησία των κυττάρων Η596 »στη θεραπεία EPA από εκείνη των κυττάρων Α549, ακόμη και αν η έκφραση της πρωτεΐνης COX-2 ήταν παρόμοια και στις δύο κυτταρικές σειρές. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη έκθεση να αναλύσει άμεσα τα καρκινικά κύτταρα με MALDI-MS, αποκαλύπτοντας διαφορές στον κυτταρικό μεταβολισμό, η οποία θα μπορούσε να είναι ένας δείκτης για την EPA-προκάλεσε αντικαρκινικά δραστηριότητες σε κύτταρα NSCLC. Αυτή η απλή προσέγγιση MALDI-MS επέτρεψε την ανάκριση των λιπιδίων μονοπάτια που λειτουργούν σε κυτταρικές σειρές NSCLC σηματοδότησης.

Ενώ η χρήση MALDI-MS χωρίς αναλυτική διαχωρισμός έχει πολλά μειονεκτήματα, συμπεριλαμβανομένης της καταστολής ιόντων, MALDI ιόντων μήτρας-παρεμβολής, και η αδυναμία να διαχωρίσει ισοβαρή ενδογενή ειδών, η τεχνική εξακολουθεί να έχει μεγάλες δυνατότητες στην ικανότητά της για άμεσες μετρήσεις από βιολογικά δείγματα. Αυτό έχει αποδεικνύεται και από την πρόσφατη αύξηση στις αιτήσεις MALDI απεικόνισης MS [34]. Περαιτέρω εξελίξεις στην άμεση βιολογική ανάλυση με τεχνικές MS, όπως τεχνικές ιονισμού χωρίς μήτρα ή τεχνικές ατμοσφαιρική εκρόφησης, θα επιτρέψει ένα μεγαλύτερο εύρος των μεταβολομική και lipidomic κάλυψη.

Αυτές οι τεχνικές μπορεί να είναι ιδιαίτερα χρήσιμο όταν συνδυάζει την κλασική ποσοτική στοχευμένες μεταβολομική προσεγγίσεις. Όπως αναφέρθηκε εδώ, με τη χρήση MALDI-MS για να διερευνήσει τις διαφορές στο μεταβολισμό των λιπιδίων μετά κατεργασία κυττάρων με EPA έχει οδηγήσει σε μια πιθανή χαρακτηρισμός του φαινοτύπου του NSCLC Α549 και Η596 κύτταρα. Επιπλέον, η παρόμοια μεταβολική μετατόπιση σε Η596 και Α549 κύτταρα παρατηρήθηκε επίσης στα κύτταρα που υποβάλλονται σε θεραπεία με αραχιδονικό οξύ, δηλαδή, η μέγιστη ένταση του PC (36:4), ΑΑ-ενσωματώνεται PC, ήταν υψηλότερη σε κύτταρα Η596 παρά σε κύτταρα Α549 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι οι μεταβολικές απόκλιση μοτίβα που παράγονται στα κύτταρα που δεν είχαν το υπόστρωμα που εξαρτάται, μάλλον πιο πιθανό εξαρτιόταν από το φαινότυπο αυτών των δύο κυτταρικών σειρών. Τα αποτελέσματα MALDI-MS τεκμηριώθηκαν από περαιτέρω ανάκριση του μονοπατιού της COX-2 και EPA μεταβολίτη της PGE

3 χρησιμοποιώντας ποσοτική LC-MS /MS. Δεδομένου ότι τα λιπαρά οξέα, όπως ΕΡΑ ή ΑΑ, πρέπει να απελευθερώνεται από τα φωσφολιπίδια της μεμβράνης με cPLA

2, ούτως ώστε αυτά να χρησιμοποιηθούν από COX ή λιποξυγενάσες, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι cPLA

2 ρυθμίζονται διαφορικά σε αυτές τις δύο NSCLC κύτταρα. Πράγματι, παρατηρήσαμε τόσο χαμηλότερη έκφραση και τη δραστηριότητα των cPLA

2 σε Η596 από εκείνη των κυττάρων Α549. Είμαστε σήμερα αξιολογεί κατά πόσον cPLA

2 είναι κρίσιμης σημασίας για την ΕΡΑ προκάλεσε αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα μέσω της COX-2 μεταβολίτη της PGE

3 σε κύτταρα NSCLC.

Τα στατιστικά εργαλεία που χρησιμοποιούνται μας οδήγησε σε διακρίσεις μεταξύ των αυτές οι κυτταρικές σειρές και μας βοήθησε να προσδιορίσει τη διαφορά σε μεταβολίτες μεταξύ των ομάδων θεραπείας. PCA και διάκριση ανάλυση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) χρησιμοποιήθηκαν ως προκαταρκτικό εργαλείο για τον εντοπισμό απλώς τις διαφορές στην φάσματα μάζας των κυττάρων ή των ιστών με ή χωρίς επεξεργασία του ΕΡΑ. Ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει ορισμένα χαρακτηριστικά που αντιστοιχούν σε αυτές τις διαφορές, αλλά απευθείας φασματομετρίας μάζας ερμηνεία τελικά χρησιμοποιηθεί.