Αφηρημένο

Η εμφάνιση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKD) ως πιθανό θεραπευτικό στόχο για πολλές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου έχει ενεργοποιηθεί η Αναζητούμε ισχυρός, εκλεκτικός, και κύτταρο-διαπερατό αναστολείς μικρού μορίου. Σε αυτή τη μελέτη, περιγράφουμε την ταυτοποίηση,

in vitro

χαρακτηρισμό, ανάλυση δομής-δράσης, και η βιολογική αξιολόγηση ενός ανασταλτικού ικρίωμα νέα PKD παραδειγματικά με 1-ναφθυλ ΡΡ1 (1-NA-ΡΡ1). 1-NA-ΡΡ1 και ΙΚΚ-16 ταυτοποιήθηκαν ως παν-PKD αναστολείς σε μια μικρής κλίμακας δοκιμή βιβλιοθήκη αναστολέας στοχευμένες κινάσης. Και οι δύο χτυπήματα διαλογής αναστέλλεται PKD ισομορφών σε περίπου 100 nm και ήταν ΑΤΡ-ανταγωνιστικοί αναστολείς. Ανάλυση αρκετών κινασών που σχετίζονται έδειξε ότι 1-NA-ΡΡ1 ήταν άκρως επιλεκτική για PKD σε σύγκριση με το ΙΚΚ-16. Ανάλυση SAR έδειξε ότι 1-NA-ΡΡ1 ήταν πολύ πιο ισχυρός και έδειξε διαφορετικά αποτελέσματα υποκαταστάτη στον πυρήνα πυραζολοπυριμιδινικό. 1-NA-ΡΡ1 ήταν κυττάρου-ενεργό, και ισχυρά μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη μέσω επαγωγής G2 /M σύλληψης. Επίσης ισχυρά μπλοκάρει τη μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, αποδεικνύοντας ελπιδοφόρα αντικαρκινική δραστηριότητα σε πολλαπλά μέτωπα. Η υπερέκφραση του PKD1 ή PKD3 αντιστραφεί σχεδόν πλήρως την αναστολή της ανάπτυξης και την αναστολή της εισβολής των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από 1-NA-ΡΡ1, υποδεικνύοντας ότι η αντι-πολλαπλασιαστική και αντι-επεμβατική δραστηριότητές της διαμεσολαβείται μέσω της αναστολής της PKD. Είναι ενδιαφέρον ότι, μια αύξηση 12-φορές σε ευαισθησία σε 1-NA-ΡΡ1 θα μπορούσε να επιτευχθεί δια κατασκευής μίας μεταλλάξεως φύλακα στη δραστική θέση του ΡΚϋ1, υποδηλώνοντας ότι το 1-NA-ΡΡ1 θα μπορούσε να συνδεθεί με τον αναλογικό ευαίσθητη ΡΚϋ1

M659G για την ανατομία PKD ειδικές λειτουργίες και πορείες σε διάφορα βιολογικά συστήματα σηματοδότησης

Παράθεση:. Tandon Μ, Johnson J, Li Ζ, Xu S, Wipf P, Wang QJ (2013) Αναστολείς Νέα πυραζολοπυριμιδινικό της πρωτεϊνικής κινάσης Α ως ισχυρή αντικαρκινική παράγοντες για καρκινικά κύτταρα του προστάτη. PLoS ONE 8 (9): e75601. doi: 10.1371 /journal.pone.0075601

Επιμέλεια: Makoto Kanzaki, Πανεπιστήμιο Tohoku, Ιαπωνία

Ελήφθη: 30η του Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 18 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Tandon et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το National Institutes of Health (R01CA129127-01, R01CA142580-01, και Ρ50-GM067082). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η coauthor Qiming Jane Wang είναι ένα PLoS ONE Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Μετά την ανακάλυψη του Gleevec, ήταν ευρέως καταδειχθεί ότι οι εξαιρετικά ισχυροί και ειδικοί μικρό μόριο αναστολείς κινασών εμφανίζουν αξιοσημείωτη κλινική αποτελεσματικότητα και μειωμένη τοξικότητα [1]. Οι πρωτεϊνικές κινάσες αποτελούν βασικούς ρυθμιστές οδών μεταγωγής σήματος και ως εκ τούτου ελκυστική θεραπευτικοί στόχοι για πολλές ασθένειες. Η οικογένεια κινάσης σερίνης /θρεονίνης πρωτεΐνης D (PKD) σχηματίζει μια ξεχωριστή ομάδα από ασβέστιο /καλμοδουλίνη πρωτεΐνες κινάσες (CaMK) [2], [3]. Οι τρεις γνωστές ισομορφές του PKD (ΡΚϋ1, PKD2 και PKD3) παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές βασικές κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τη μετανάστευση, τη ρύθμιση του γονιδίου, της διακίνησης πρωτεϊνών, και ανοσολογική απόκριση [4], [5]. Ειδικότερα, ΡΚϋ1 έχει εμπλακεί σε πολλές πτυχές της ανάπτυξης όγκου, όπως ανάπτυξη όγκου, μετάσταση, και την αγγειογένεση [4]. Η παρεκκλίνουσα δραστηριότητα PKD και έκφραση έχουν αναφερθεί σε διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων και ιστούς όγκων από το πάγκρεας [5], το δέρμα [6], [7] και του προστάτη [8], [9]. PKD διαμεσολαβεί σημαντικές οδούς σηματοδότησης που είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του VEGF και /ERK μονοπατιών σηματοδότησης ΜΕΚ [4], υποστηρίζοντας έναν ενεργό ρόλο του PKD σε σχετίζονται με όγκους βιολογικές διεργασίες σε διάφορους τύπους καρκίνου του [5], [7], [ ,,,0],9] – [12].

PKD είναι ένα βασικό συστατικό της σηματοδότησης του διακυλογλυκερόλη (DAG) δίκτυο σηματοδότησης. Είναι ο πρωταρχικός στόχος της DAG και καθοδικός τελεστής της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC). Υπάρχουν αρκετές συντηρημένα δομικά μοτίβα σε PKD, όπως έναν τομέα που δεσμεύει C1 DAG και ρυθμίζει PKD εντοπισμού, και μια περιοχή ΡΗ που ασκεί μια autoinhibitory λειτουργία στο πεδίο κινάσης. Σε άθικτα κύτταρα, PKD συνδέεται άμεσα φωσφορυλιώνεται από DAG αποκρίνονται PKCs στις δύο συντηρημένα κατάλοιπα σερίνης στον βρόχο ενεργοποίησης της καταλυτικής περιοχής, γεγονός που οδηγεί σε ενεργοποίηση της. PKD παρουσιάζει συχνά παρατεταμένη δραστηριότητα μετά την ενεργοποίηση η οποία διατηρείται κυρίως μέσω αυτοφωσφορυλίωσης [5].

Κατά τα τελευταία αρκετά χρόνια, σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στην ανάπτυξη ισχυρών και ειδικών αναστολέων μικρού μορίου PKD. CID755673 και αναλόγων [13], [14], 2,6-ναφθυριδίνη και διπυριδυλ αναστολείς και τα ανάλογά τους [15] – [17], 3,5-diarylazoles [18], CRT0066101 [19], και CRT5 [20] κατέδειξε στοχευμένη αναστολή της PKD

in vitro

και σε άθικτα κύτταρα. Ιδιαιτέρως, CRT0066101 βρέθηκε να δεσμεύει ισχυρώς την ανάπτυξη των παγκρεατικών ξενομοσχευμάτων όγκου

in vivo

σε ποντικούς [19]. Παρά τις σημαντικές αυτές εξελίξεις, δεν PKD-υποτύπου ειδικός αναστολέας είναι διαθέσιμο, και αναστολείς PKD δεν έχουν ακόμη προχωρήσει στην κλινική. Εν μέρει, η απουσία κλινικών υποψηφίων μπορεί να αποδοθεί στην περιορισμένη εκλεκτικότητα,

in vivo

σταθερότητα και γενικά θέματα τοξικότητα με το τρέχον σύνολο των γνωστών αναστολέων. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική ανάγκη να συνεχιστεί η αναζήτηση για τα νέα ανασταλτική χημειοτύπων PKD που αποδεικνύουν ελκυστική επιλεκτικότητα στόχου, βελτιωμένες φαρμακοκινητικές προφίλ, και μεγαλύτερη

in vivo

αποτελεσματικότητα.

Έχουμε εντοπίσει στο παρελθόν τόσο ΑΤΡ-ανταγωνιστική και -noncompetitive αναστολείς PKD που είναι διακριτές σε δομή με άλλους αναστολείς αναφερθεί [13], [14], [21] – [23]. Αυτές οι επιτυχίες εντοπίστηκαν σε μια εκστρατεία HTS χρησιμοποιώντας μεγάλα, αμερόληπτη μικρών μορίων. Στη συνέχεια, τα φάρμακα στρατηγικές χημεία χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση της δραστηριότητας, την επιλεκτικότητα, και φυσικοχημικές ιδιότητες του μολύβδου δομή, CID755673, με αποτέλεσμα μια σειρά αναλόγων που εμφάνισε αυξημένη αναστολή στόχου

in vitro

και σε κύτταρα, και βελτιωμένη μεταβολική προφίλ [13], [14], [21] – [24]. Στο παρόν, περιγράφουμε την ταυτοποίηση και την αξιολόγηση ενός νέου ανασταλτική χημειότυπος PKD βασίζεται σε 1-ναφθυλ ΡΡ1 (1-NA-ΡΡ1), ένα πυραζολοπυριμιδινικό που είχε σχεδιαστεί αρχικά για το αναλογικό ευαίσθητη μεταλλαγμένο κινάσης της src [25]. Αυτός ο αναστολέας ταυτοποιήθηκε σε μια μικρή, στοχευμένη βιβλιοθήκη ποικίλων αναστολείς κινάσης. 1-NA-ΡΡ1 επέδειξαν εξαιρετική εκλεκτικότητα προς PKD με μικρή ή καθόλου ανασταλτική δραστικότητα για δύο συνδεδεμένες κινάσες, CaMK ή PKC. Είναι ισχυρά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Μια επακόλουθη ανάλυση SAR αποκάλυψε σημαντικές διαρθρωτικές καθοριστικούς παράγοντες για αυτή την ένωση μολύβδου και τις θέσεις 1-NA-ΡΡ1 ως νέα και διακριτή αναστολέας PKD χημειότυπος με τη δυνατότητα να αποδώσει την ανάπτυξη υποψήφιοι για

in vitro

και

in vivo

εφαρμογές.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των νέων ανασταλτικών ικριωμάτων PKD από μια στοχευμένη βιβλιοθήκη αναστολέας της κινάσης

επιλέχθηκαν Ογδόντα χημικά ποικίλες αναστολείς κινάσης από Tocris Βιοεπιστημών συλλογής μικρό μόριο. Η

ανασταλτική δραστικότητα in vitro

ΡΚϋ1 αυτών των ενώσεων αξιολογήθηκε με βάση την ικανότητά τους να αναστέλλουν την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΡΚϋ1 σε συγκέντρωση 1 μΜ σε μια ραδιομετρική δοκιμασία κινάσης PKD. Η επί τοις εκατό αναστολή ΡΚϋ1 υπολογίστηκε ως η ποσοστιαία αναστολή της συνολικής δραστηριότητας ΡΚϋ1 κινάσης εν απουσία αναστολέων (DMSO). Δεκαέξι ενώσεις ταυτοποιήθηκαν ως πρωταρχικό χτυπήματα (≥50% αναστολή της συνολικής δραστηριότητας PKD1 κινάση) στην δοκιμασία ραδιομετρική ΡΚϋ1 (Πίνακας 1). Μεταξύ αυτών των επισκέψεων, 1-NA-ΡΡ1, ένα μεταλλαγμένο αναστολέα src κινάση, και ΙΚΚ-16, ενός αναστολέα της κινάσης ΙκΒ, καταστέλλεται 77% και 67% της δραστηριότητας ΡΚϋ1 σε συγκέντρωση 1 μΜ, αντίστοιχα, και επιλέχθηκαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό με βάση την τους δραστικότητα και διακριτά δομικά χαρακτηριστικά.

Η

1-NA-ΡΡ1 και ΙΚΚ-16 είναι νέα αναστολείς της παν-PKD

Το

in vitro

IC

50 1-NA-ΡΡ1 και ΙΚΚ-16 προσδιορίστηκε σε μία καμπύλη συγκέντρωσης 10-σημείων χρησιμοποιώντας ένα ραδιομετρική δοκιμασία κινάσης PKD [13]. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΡΚϋ1, 2, ή 3 πρωτεΐνες επωάστηκαν σε ένα μίγμα που περιέχει ένα υπόστρωμα πεπτίδιο που προέρχεται από ένα υπόστρωμα PKD, HDAC-5, και 10 διαφορετικές συγκεντρώσεις των δύο ενώσεων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, 1-NA-ΡΡ1 και ΙΚΚ 16 ανέστειλαν τις τρεις ισομορφές της PKD με σχεδόν ίση δραστικότητα. 1-NA-ΡΡ1 ανέστειλε ΡΚϋ1, 2 και 3 με ένα IC

50 154,6 ± 21,8 ηΜ (η = 3), 133,4 +/- 3,6 ηΜ (η = 3), 109,4 +/- 6,8 ηΜ (η = 3), αντίστοιχα, ενώ ΙΚΚ-16 αναστέλλεται παρομοίως το PKD ισομορφών με IC

50 153.9 +/- 7,7 ηΜ (n = 2) για ΡΚϋ1, 115,0 +/- 7,1 ηΜ (n = 2) για PKD2 και 99,7 +/- 3,0 ηΜ (n = 2) για PKD3. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι και οι δύο 1-NA-ΡΡ1 και ΙΚΚ 16 είναι ισχυροί αναστολείς παν-PKD.

Αναστολή του ανασυνδυασμένου ανθρώπινου ΡΚϋ1, 2 και 3 προσδιορίστηκε με την παρουσία 10 διαφορετικών συγκεντρώσεων της 1-NA-ΡΡ1 (Α) και ΙΚΚ-16 (Β) από έναν

in vitro

δοκιμασία PKD κινάσης ραδιομετρική. Τα IC

50 τιμές υπολογίστηκαν ως η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα με τριπλούς προσδιορισμούς σε κάθε συγκέντρωση του φαρμάκου σε κάθε πείραμα. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου και ένα αντιπροσωπευτικό γράφημα φαίνεται.

Η

1-NA-ΡΡ1 είναι μία ΑΤΡ-ανταγωνιστικός αναστολέας με υψηλή εκλεκτικότητα για PKD πάνω στενά συνδεόμενες κινασών

για να αποκτήσουν μια καλύτερη κατανόηση του τρόπου δράσης για 1-NA-ΡΡ1 και ΙΚΚ-16, εξετάσαμε τις επιδράσεις των αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ΑΤΡ στην αναστολή PKD1. Lineweaver-Burk γραφικές παραστάσεις παρήχθησαν με γραφική παράσταση του αντίστροφου της ταχύτητες αντίδρασης (1 /ν) κατά την αμοιβαία των συγκεντρώσεων ΑΤΡ (1 /[ATP]) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της ένωσης. Τα σημεία προσαρμόσθηκαν με γραμμική παλινδρόμηση. Όπως φαίνεται το Σχ. 2Α-Β, όλες οι γραμμές συγκλίνει επί του Υ-άξονα, υποδεικνύοντας ότι και οι δύο 1-NA-ΡΡ1 και ΙΚΚ-16 ήταν ΑΤΡ-ανταγωνιστικοί αναστολείς.

δραστικότητα κινάσης ΡΚϋ1 μετρήθηκε ως συνάρτηση αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ΑΤΡ με την παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων 1-NA-ΡΡ1 (Α) και ΙΚΚ-16 (Β). Οι Lineweaver-Burke διαγράμματα των δεδομένων που εμφανίζονται. Τα δεδομένα που παρουσιάστηκαν ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται η ειδικότητα του 1-NA-ΡΡ1 και ΙΚΚ-16 για PKD εξετάζοντας τη δραστηριότητά τους για πολλά λειτουργικά ή δομικά σχετίζεται κινασών, συμπεριλαμβανομένων ΡΚΟα , ΡΚΟδ και CAMKIIα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ανασταλτικές δράσεις για ισομορφές PKC ανιχνεύθηκαν σε 0,1, 1 και 10 μΜ συγκεντρώσεις 1-NA-ΡΡ1, σε αντίθεση με το ΙΚΚ-16 η οποία έδειξε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή τόσο για ΡΚΟα και ΡΚΟδ και & gt? 50% αναστολή στα 10 μΜ συγκέντρωση (Σχ. 3Α-Β). Η ισχυρός αναστολέας PKC GF109203X δοκιμάστηκε ως θετικός έλεγχος και είναι ισχυρά και εξάρτηση από τη συγκέντρωση ανέστειλε ΡΚΟα και ΡΚΟδ. PKD ανήκει σε μια υποομάδα της οικογένειας CaMK και κινασών σε αμφότερες τις οικογένειες μοιράζονται ομολογία υψηλή αλληλουχίας. Αυτό μας ώθησε να αξιολογηθεί η αναστολή της CAMKIIα από αυτές τις ενώσεις. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 3C, 1-NA-ΡΡ1 έδειξε μικρή δραστηριότητα στο CAMKIIα έως και 10 μΜ, ενώ ΙΚΚ-16 προκάλεσε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή του ενζύμου και κατήργησε σχεδόν εντελώς τις δραστηριότητές του στα 10 μΜ. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι 1-NA-ΡΡ1 είναι ένας πολύ εξειδικευμένος αναστολέας για PKD σε σχέση με άλλες που συνδέονται στενά με κινάσες, συμπεριλαμβανομένων PKCs και CAMKs, ενώ ΙΚΚ-16 είναι πιθανόν ένα promiscuous αναστολέας κινάσης.

Αναστολή της ΡΚΟα (Α) ή ΡΚΟδ (Β) προσδιορίστηκε στα 10 ηΜ, 100 ηΜ, 1 μΜ και 10 μΜ. Ως μάρτυρες, ο αναστολέας PKC GF109203X αναστέλλεται ισχυρά δραστηριότητα ΡΚΟα και ΡΚΟδ. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα. C. Αναστολή της CAMKIIα μετρήθηκε με τη δοκιμασία κινάσης CaMK ραδιομετρική. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές και ένα αντιπροσωπευτικό γράφημα φαίνεται. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το ζευγαρωμένο t-test. ns, δεν είναι στατιστικά σημαντική? *,

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt? 0.001

Η

Περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την ιδιαιτερότητα της 1-NA-ΡΡ1 μπορεί να αποκτηθεί από την αξιολόγηση των kinome δεδομένων σάρωσης σε 1-ναφθυλομεθύλιο ΡΡ1 (. 1-NM-ΡΡ1), όπου το 1-NM-ΡΡ1, μαζί με 178 γνωστά αναστολείς κινάσης, είχε προφίλ έναντι μιας ομάδας 300 ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεϊνικών κινασών σε μία μόνη συγκέντρωση [26]. Like 1-NA-ΡΡ1, 1-NM-ΡΡ1 είναι επίσης μια C3-παραγωγοποιημένη αναλογικό ΡΡ1 που διαφέρει από το 1-NA-ΡΡ1 από μία μόνο ομάδα μεθυλίου που συνδέει πυραζόλιο και ναφθύλιο δακτυλίους. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η 1-NM-ΡΡ1 ανέστειλε ΡΚϋ1 με IC

50 138,7 ± 33,2 ηΜ (η = 3) (Σχ. 3D), η οποία ήταν ισοδύναμη με εκείνη του 1-NA-ΡΡ1 (154.6 ηΜ). ανασταλτικές τις δραστηριότητές τους για μεγαλύτερο μέρος του άγριου τύπου και μεταλλαγμένων κινασών Src οικογένεια είναι επίσης συγκρίσιμες [27], υποδεικνύοντας ότι οι δύο αναστολείς είναι παρόμοια όχι μόνο ως προς τη δομή, αλλά και στην βιολογική δραστικότητα. Τα δεδομένα εξειδίκευση για 1-NM-ΡΡ1 εκχυλίστηκαν σε αποκοπής & lt? 50% υπολειμματική δραστικότητα κινάσης χρησιμοποιώντας το Kinase Inhibitor Πόρων (KIR) online εργαλείο (https://kir.fccc.edu/) όπως περιγράφεται (Πίνακας S1) [26]. Τα στοιχεία επιβεβαίωσαν την αναστολή της PKD ισομορφής από την ένωση αυτή. Παρά το γεγονός ότι εντοπίστηκαν επιπλέον στόχους της 1-NM-ΡΡ1, αυτός ο αναστολέας εμφάνισε μια σχετική υψηλή βαθμολογία Gini 0,67 (ένα σκορ εκλεκτικότητα για κινάσες και αναστολείς κινάσης), υποδηλώνοντας μεγαλύτερη εκλεκτικότητα. Εν τω μεταξύ, δεν ισόμορφα PKC ήταν σημαντικά αναστέλλονται από αυτού του αναστολέα (& gt? 90% υπολειμματική δραστικότητα κινάσης για όλες τις ισομορφές PKC). Με βάση αυτό και τα παραπάνω αποτελέσματα, επιλέγουμε να επικεντρωθεί αποκλειστικά στην 1-NA-ΡΡ1 στις μεταγενέστερες μελέτες μας.

Σύνθεση και SAR ανάλυση των αναλόγων 1-NA-ΡΡ1

Ο στόχος της συνθετικές μελέτες μας ήταν να τροποποιήσει τις υποκαταστάτες επί του 1-NA-ΡΡ1 πυραζολο [3,4-

d

] πυρήνα πυριμιδίνης δομή και καθορίζουν την βιολογική απόκριση σε αυτές τις τροποποιήσεις, καθώς και σε δυνητικά προσδιορίσει πιο PKD υποτύπου επιλεκτική αναλόγων. Θεωρήσαμε 4 τύπους παραλλαγών, όπως φαίνεται στο Σχ. 4, και ετοίμασε ένα σύνολο 18 παραγώγων, συμπεριλαμβανομένης της αναδομημένης γονέα, 1-NA-ΡΡ1.

Α. μοντέλο 4-Zone για αναλογική σύνθεση 1-NA-ΡΡ1. Β Σύνθεση του 1

Η

πυραζολο [3,4

δ

] πυριμιδίνες 1.

Η

Μόνο δύο παραλλαγές διερευνήθηκαν στη ζώνη 1, em

t

βουτύλιο και μεθύλιο (Πίνακας 2). Σε συγκέντρωση 1 μΜ, 1-NA-ΡΡ1 αναστέλλεται δραστηριότητας PKD1 κατά 80%, ενώ αναλογικά R

1 = μεθύλιο της 1στ μόνο οδήγησε σε μείωση 32% της δραστηριότητας. Όλα τα άλλα ανάλογα με έναν υποκαταστάτη μεθυλίου στη ζώνη 1 και διάφορες υποκαταστάσεις στις ζώνες 2-4 ήταν ακόμη χειρότερα και απέδειξαν & lt? Ανασταλτικές δραστηριότητες 10% σε 1 μΜ συγκεντρώσεις. Η απαίτηση για ογκώδεις ομάδες στο R

1 της πυραζολοπυριμιδίνης έχει προηγουμένως αναγνωριστεί και φαίνεται να είναι ένα γενικό χαρακτηριστικό για την αναστολή της κινάσης με την παρούσα ικρίωμα [11]. Ωστόσο, ακόμη και όταν η διατήρηση της

t-βουτυλ

ομάδα στη ζώνη 1, παραλλαγές, όπως η εισαγωγή μίας ομάδας μεθυλίου στη ζώνη 3 (1α), και αντικαταστάσεις του υποκατάστατη ναφθυλ με άλλους δακτυλίους αρυλίου (1b-e ) αποκόπτεται τη δραστηριότητα PKD1. Κατά συνέπεια, η περιορισμένη μας SAR τονίζεται 1-NA-ΡΡ1 ως η πλέον ισχυρή πτητικού συστατικού με πολύ περιορισμένη ανοχή για δομικές τροποποιήσεις των υποκαταστατών στον πυρήνα πυραζολοπυριμιδίνης. Ακόμη και ηλεκτρονιόφιλες παράγωγα με μια ομάδα χλωρίου στη ζώνη 4 και το δυναμικό για μη αναστρέψιμη ένζυμο αλκυλίωση (1ι, 1ια, 1m, 1ρ, 1r) δεν δείχνουν αύξηση στην ισχύ. Μια παρόμοια απότομη μείωση στην ανασταλτική δράση κινάσης τυροσίνης v-Src παραγώγων πυραζολοπυριμιδίνης έχει παρατηρηθεί προηγουμένως και είναι πιθανό σχετίζεται με ένα συγκεκριμένο μοτίβο σύνδεσης υδρογόνου στις ζώνες 2 και 3 στο θύλακα σύνδεσης ΑΤΡ που δεν πρέπει να διαταράσσεται [25]. Κατά συνέπεια, συνέχισε την έρευνά μας του προφίλ αναστολέα πυραζολοπυριμιδινών στο PKD με τον πιο ισχυρό παράγοντα, 1-NA-ΡΡ1.

Η

1-NA-ΡΡ1 είναι κύτταρο-ενεργός και προκαλεί αναστολή στόχου του προστάτη καρκινικά κύτταρα

στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε αν 1-NA-ΡΡ1 ήταν κύτταρο διαπερατό και ικανό αναστολής στόχου σε ακέραια κύτταρα. Η επίδραση της 1-NA-ΡΡ1 στις 12-μυριστικό 13-οξικό άλας (ΡΜΑ) προκληθείσα ενδογενής ενεργοποίηση PKD1 σε LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη εξετάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9], [23], [28]. PMA ενεργοποιεί PKD μέσω PKC εξαρτώμενη trans-φωσφορυλίωση του Ser744 /748 (S

744/748) στον βρόχο ενεργοποίησης που ακολουθείται από αυτοφωσφορυλίωση του ΡΚϋ1 επί Ser916 (S

916) στο Ο-άκρο [29], [30]. δραστηριότητα PKD1 συσχετίζεται καλά με το επίπεδο της φωσφο-S

916 (p-S

916) [30]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται ρ-S

916 να παρακολουθούν τη δραστηριότητα PKD και ρ-S

744/748 του ΡΚϋ1 για να προσδιοριστεί εάν η ένωση παρενέβαινε με trans-φωσφορυλίωση PKC επαγόμενη από πιθανώς αναστέλλοντας PKC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, η θεραπεία των κυττάρων LNCaP με 10 ηΜ ΡΜΑ για 20 λεπτά και τα δύο επαγόμενη ρ-S

916-ΡΚϋ1 και ρ-S

744 σήματα /748-PKD1. Η προεπεξεργασία με αυξανόμενη συγκέντρωση 1-NA-ΡΡ1 εξάρτηση από τη συγκέντρωση ανέστειλε αυτοφωσφορυλίωσης σε ρ-Ser

916-ΡΚϋ1 με IC

50 22,5 ± 1,5 μΜ (η = 2). Σε αντίθεση, PKC-εξαρτώμενη trans-φωσφορυλίωση σε Ser

744/748 ήταν ανεπηρέαστη από 1-NA-ΡΡ1. Έτσι, 1-NA-ΡΡ1 καταργηθεί ειδικά δραστηριότητα PKD1 χωρίς να εμποδίζει PKC μεσολάβηση trans-φωσφορυλίωση.

Α. LNCaP κύτταρα προκατεργάστηκαν με διαφορετικές δόσεις αναστολέων για 45 λεπτά, που ακολουθείται από ΡΜΑ διέγερση στα 10 ηΜ επί 20 λεπτά. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση για ρ-S

916-ΡΚϋ1 και ρ-S

744/748-PKD1. Τουμπουλίνης αποτυπώθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες φαίνονται. B. Προσδιορισμός του IC

50. Στυπώματα Western ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση πυκνομετρίας. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς και IC

50 τιμές προέκυψαν οι καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης με χρήση GraphPad. Μία από τις τρεις καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης φάνηκε.

Η

1-NA-ΡΡ1 ισχυρά πολλαπλασιασμό μπλοκ του προστάτη καρκινικών κυττάρων από επαγωγή G2 /M σύλληψη

PKD έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στόχευση για τον καρκίνο. Εδώ, εξετάστηκαν οι επιδράσεις της στοχευμένης αναστολής της PKD από 1-NA-ΡΡ1 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, την επιβίωση και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με κατεργασία των κυττάρων σε 30 μΜ συγκέντρωση του παράγοντα, και στη συνέχεια ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε για έξι διαδοχικές ημέρες με την παρουσία και απουσία αναστολέα. Η ανάπτυξη και κυτταροτοξικά αποτελέσματα του 1-NA-ΡΡ1 αξιολογήθηκαν με τον αριθμό των κυττάρων μετρήσεις και ανάλυση ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, 1-NA-ΡΡ1 στο 30 μΜ προκάλεσε δραστική αύξηση σύλληψη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη PC3 αρχίζοντας την ημέρα 2 και συνεχίστηκε μέχρι το τέλος του πειράματος (ημέρα 6). 1-NA-ΡΡ1 επίσης εξάρτηση από τη συγκέντρωση κυτταρικό θάνατο που επάγεται με IC

50 23,3 ± 5,7 μΜ (η = 3) (Σχ. 6Β). Για την παροχή διορατικότητα στην επίδραση του 1-NA-ΡΡ1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εξετάσαμε την συνέπεια της αγωγής 1-NA-ΡΡ1 στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη μετά την κατεργασία των κυττάρων PC3 με 30 μΜ 1-NA-ΡΡ1 για 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, 1-NA-ΡΡ1 αύξησε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G2 /M του κυτταρικού κύκλου, που αντιστοιχεί σε μία μετατόπιση από 5,8% των κυττάρων σε G2 /M στον έλεγχο σε 28,6% σε 1-NA-ΡΡ1 επεξεργασμένο κύτταρα και υπονοώντας έτσι ότι η αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από 1-NA-ΡΡ1 οφείλεται στην ικανότητά του να επάγει G2 /M σύλληψης.

Α.1-NA-ΡΡ1 μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC3. PC3 κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Ένα πλήθος των κυττάρων κατά την ημέρα 1 έγινε, και στη συνέχεια είτε προστέθηκε ένα όχημα (DMSO) ή 1-NA-ΡΡ1 στα 10 μΜ. Τα κύτταρα μετρήθηκαν καθημερινά για συνολικά 5 ημέρες. Φρέσκα μέσα και αναστολέας προστέθηκαν κάθε 2 ημέρες. Τα μέσα τριπλών προσδιορισμών χαράχθηκαν πάροδο του χρόνου. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές και τα αποτελέσματα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται. Β 1-NA-ΡΡ1 που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα PC3. PC3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (3000 κύτταρα /φρεάτιο) και στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσα που περιέχουν 0,3 έως 100 μΜ αναστολείς για 72 ώρες. διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 570 nm για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. Το IC

50 προσδιορίστηκε ως η μέση τιμή δύο ανεξάρτητων πειραμάτων για κάθε ένωση. C. 1-NA-ΡΡ1 προκαλείται G2 /M φάση διακοπή του κυτταρικού κύκλου. PC3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με φορέα (DMSO), ή 10 μΜ 1-NA-ΡΡ1 για 48 ώρες. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από σήμανση με ιωδιούχο προπίδιο σταθερών κυττάρων. Η στατιστική σημαντικότητα καθορίστηκε με μη ζευγαρωμένο t-test και ενδείκνυται. **

σ

& lt? 0,01? ***

σ

& lt?. 0.001

Η

1-NA-ΡΡ1-indued αναστολή της ανάπτυξης επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση στοχευμένη αναστολή της PKD

Για να εξασφαλιστεί η επιτυχία μιας στοχευμένης θεραπείας, είναι σημαντικό να αποδειχθεί η εξειδίκευση στόχου σε βιολογικό επίπεδο. προηγούμενα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα βιολογικά αποτελέσματα που επάγονται από αναστολείς PKD phenocopied αυτές που προκαλούνται από knockdown ισομορφές PKD, υποδεικνύοντας ότι οι επιδράσεις των αναστολέων ήταν προκαλούνται μέσω στοχοθετημένων αναστολής της PKD [9], [23]. Σε αυτή τη μελέτη, πήραμε μια πιο άμεση προσέγγιση για να καθοριστεί εάν μια στοχευμένη αναστολή της PKD αντιπροσωπεύει τις βιολογικές δράσεις της 1-NA-ΡΡ1. Ειδικότερα, εστιάζοντας στην αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της 1-NA-ΡΡ1, επιδιώξαμε να καθορίσει εάν η υπερέκφραση του PKD1 και PKD3 χρησιμοποιώντας αδενοϊούς θα μπορούσε να σώσει τις αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 1-NA-ΡΡ1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α-Β, κύτταρα PC3 μολύνθηκαν με μηδενική αδενοϊό (ADV-null) και αδενοϊό που μεταφέρουν PKD1 και γονίδια PKD3 (Adv-PKD1 και Adv-PKD3) στους 50 και 100 MOI. Τα μολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κατεργασία 1-NA-ΡΡ1 στα 10 και 30 μΜ. Μόλυνση με Adv-ΡΚϋ1 και Adv-PKD3 ανέστρεψε τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της 1-NA-ΡΡ1. Τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του PKD1 ή PKD3, τόσο μεγαλύτερη είναι τα αποτελέσματα διάσωσης, και σε 100 ΜΟΙ μια σχεδόν πλήρη αντιστροφή της 1-NA-ΡΡ1 επαγόμενη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε για Adv-PKD1. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της 1-NA-ΡΡ1 έγιναν με τη μεσολάβηση της αναστολής της PKD. Προτείνει, επίσης, ότι οι λειτουργίες των ισομορφών PKD είναι πιθανό περιττές δεδομένου ότι τόσο PKD1 και PKD3 μπορεί να σώσει τα αποτελέσματα της 1-NA-ΡΡ1.

Η υπερέκφραση του PKD1 και PKD3 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη έσωσαν τις αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 1-NA-ΡΡ1. PC3 (0,5 εκ) κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο 60 mm και μολύνθηκαν την επόμενη μέρα με 50 και 100 ΜΟΙ αδενοϊοί που φέρουν PKD1 (Adv-ΡΚϋ1) (Α) και (Adv-PKD3) PKD3 (Β). Κενό αδενοϊό (ADV-null) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Μετά από 24 ώρες, 3000 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με και χωρίς 10 και 30 μΜ 1-NA-ΡΡ1 για 72 ώρες. διάλυμα ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 570 nm για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα των κυττάρων. Η υπερέκφραση του PKD1 και PKD3 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western κηλίδωση (εικόνες κάτω από τα γραφήματα). Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ DMSO και θεραπεία αναστολέα για κάθε αδενοϊό, καθώς και μεταξύ ελέγχου και PKD αδενοϊούς σε κάθε συγκέντρωση αναστολέα προσδιορίστηκαν με μη ζευγαρωμένο t-test σε GraphPad Prism V. ns, όχι στατιστικά σημαντική? *, P & lt? 0,05? **, P & lt? 0,01? ***, Ρ & lt? 0.001

Η

1-NA-ΡΡ1 αναστέλλει αποτελεσματικά τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και εισβολή

PKD έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής κινητικότητας , προσκόλληση και εισβολή [4]. Σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα της 1-NA-ΡΡ1 για τη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου και την εισβολή αξιολογήθηκαν από δύο ανεξάρτητους προσδιορισμούς, μια δοκιμασία επούλωσης πληγών (μετανάστευση κυττάρων) και μία δοκιμασία εισβολή Matrigel (κυτταρική εισβολή). Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 8Α, 1-NA-ΡΡ1 στα 30 μΜ μπλοκάρει ισχυρά μετανάστευση PC3 κυττάρων. Είκοσι δύο ώρες μετά τον τραυματισμό, 88,6% της πληγωμένης περιοχής στην 1-NA-ΡΡ1 επεξεργασμένο μονοστιβάδα παρέμειναν ανοικτά ενώ εκείνη του ελέγχου είχαν εντελώς κλειστή. Παρομοίως, 1-NA-ΡΡ1 επίσης μπλοκάρει σημαντικά την εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Η επεξεργασία των κυττάρων με 30 μΜ 1-NA-ΡΡ1 για 20 ώρες είχε ως αποτέλεσμα & gt? 60% αναστολή του κυτταρικού εισβολής σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 8Β).. Στο σύνολό τους, 1-NA-ΡΡ1 είναι ένας ισχυρός αναστολέας της μετανάστευσης των κυττάρων καρκίνου του προστάτη και εισβολή.

Α.1-NA- ΡΡ1 μπλοκαριστεί η μετανάστευση του καρκίνου του προστάτη κυττάρων. PC3 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή σε πλάκες 6 φρεατίων. Μονόφυλλο τραυματίστηκε και απεικονίζεται αμέσως (0 h). Τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει ένα όχημα (DMSO) ή 30 μΜ 1-NA-ΡΡ1 για 22 ώρες και το κλείσιμο του τραύματος μετρήθηκε. Ποσοστό επούλωση τραύματος υπολογίστηκε ως το ποσοστό του επουλωθεί περιοχή τραύματος σε σύγκριση με την αρχική πληγή. Β 1-NA-ΡΡ1 ανέστειλε καρκίνου του προστάτη εισβολή των κυττάρων. κύτταρα DU145 επωάστηκαν με 30 μΜ 1-NA-ΡΡ1 στα ένθετα Matrigel. Μετά από 20 ώρες, μη επεμβατική κύτταρα απομακρύνθηκαν και επεμβατικές κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη, βάφτηκαν σε διάλυμα αιματοξυλίνης 0,4%, και φωτογραφήθηκαν. Ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν στην μήτρα Matrigel προσδιορίστηκε με μετρήσεις κυττάρων σε 6 τομείς σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω του ενθέτου ελέγχου. Ποσοστό εισβολή υπολογίστηκε ως το ποσοστό των κυττάρων που εισέβαλαν μέσω Matrigel ένθετα έναντι του συνόλου των κυττάρων που μετανάστευσαν μέσω των ενθέτων ελέγχου. C. υπερεκφράζεται ΡΚϋ1 και PKD3 αντιστραφεί τα ανασταλτικά αποτελέσματα της 1-NA-ΡΡ1 επί των κυττάρων του όγκου εισβολή. κύτταρα DU145 μολύνθηκαν με null, PKD1, και αδενοϊοί PKD3 (Adv-null, Adv-ΡΚϋ1, και Adv-PKD3) σε 100 ΜΟΙ. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα απλώνονται εκ νέου σε έλεγχο και Matrigel ένθετα, και μία ανίχνευση εισβολής Matrigel διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω. Η υπερέκφραση του PKD1 και PKD3 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western κηλίδωση (εικόνες κάτω από τα γραφήματα). Όλα τα παραπάνω πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται.

Η

Για να προσδιοριστεί εάν PKD διαμεσολαβεί τις επιδράσεις της 1-NA-ΡΡ1 για τη μετανάστευση και την εισβολή, τα πειράματα διάσωσης διεξήχθησαν να εξετάσει αν υπερεκφράζεται PKD1 και PKD3 θα μπορούσαν να μετριάσουν τις ανασταλτικές επιδράσεις της 1-NA-ΡΡ1. PC3 κύτταρα που έχουν μολυνθεί με μηδενική αδενοϊό (ADV-null) και αδενοϊό που μεταφέρουν PKD1 και γονίδια PKD3 (Adv-PKD1 και Adv-PKD3). Η επεμβατική ιδιοκτησία των μολυσμένων κυττάρων μετρήθηκε με προσδιορισμό εισβολή Matrigel. Όπως φαίνεται στο Σχ. 8C, η υπερέκφραση του ΡΚϋ1 ή PKD3 αναστραφεί πλήρως την αναστολή της 1-NA-ΡΡ1 στην κυτταρική εισβολή, παρά την έλλειψη των ανασταλτικών αποτελεσμάτων επί κυττάρων εισβολή όταν εκφράζεται μόνη της. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η στοχευμένη αναστολή της PKD μεσολαβεί τα αντι-επεμβατική αποτελέσματα της 1-NA-ΡΡ1. Αντιθέτως, δεδομένου ότι η υπερέκφραση του ΡΚϋ1 και PKD3 μπλοκάρει τη μετανάστευση των κυττάρων PC3, δεν ήμασταν σε θέση να μετρήσουν σημαντικές μεταβολές στην κυτταρική μετανάστευση παρουσία ή απουσία 1-NA-ΡΡ1 με χρήση πληγή δοκιμασία επούλωσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εναλλακτικά, εξετάσαμε την μετανάστευση κυττάρων DU145 χρησιμοποιώντας τους θαλάμους μετανάστευσης. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η υπερέκφραση του PKD1 ή PKD3 ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου και δεν επηρέασε την ανασταλτική επίδραση του 1-NA-ΡΡ1 στην κυτταρική μετανάστευση (Εικ. S1).

Ένα φύλακα μετάλλαξη του ΡΚϋ1 είναι 12 φορές πιο ευαίσθητη στην αναστολή της 1-NA-ΡΡ1 σε άθικτα κύτταρα

1-NA-ΡΡ1 είναι μία από τις C3-τροποποιημένα ανάλογα της Src-οικογένειας ΡΡ1 αναστολέα κινάσης. Αυτό αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως ένα πολύ εκλεκτικός αναστολέας κινάσης με μονοψήφιο nanomolar IC

’50 για αναλογικό-ευαίσθητα (as) κινάσες που έχουν κατασκευαστεί για να μεταφέρει ένα μόνο υποκατάσταση αμινοξέος στο υπόλειμμα gatekeeper στην ενεργό θέση κινάσης [25] , [27]. Ωστόσο, micromolar 1-NA-ΡΡ1 δεν αναστέλλει ή μόνο ασθενώς μπλοκ κινάσες άγριου τύπου, η οποία επιτρέπει τον αναστολέα /κινάσης ως ζεύγος για να χρησιμοποιηθεί στην ανατομία των ειδικών λειτουργιών και μηχανισμών κινασών σηματοδότησης. Αυτή η χημική γενετική προσέγγιση έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε μια ποικιλία πρωτεϊνικών κινασών [27], [31] – [36]. Έτσι, πιθανολογείται ότι η ισχύς και η επιλεκτικότητα του 1-NA-ΡΡ1 για PKD θα μπορούσε να ενισχυθεί περαιτέρω με την εισαγωγή μεταλλάξεων φύλακα αμινοξέων. Ευθυγράμμιση της δραστικής αλληλουχία θέσεως των ισομορφών PKD οδήγησε στην ταυτοποίηση του φύλακα αμινοξύ, η μεθειονίνη 659 (M659), σε ΡΚϋ1 (Εικ. 9Α). Εμείς στη συνέχεια δημιουργούνται δύο χώρου που δημιουργούν ανάλογο ευαίσθητες μεταλλάξεις PKD1 της σημαίας-tagged PKD1 (Flag-PKD1), δηλαδή σημαία-PKD1

M659G και Flag-PKD1

M659A. Μετά την υπερέκφραση σε ανέπαφα κύτταρα (Σχ. 9Β), η ανασταλτική δράση των 1-NA-ΡΡ1 αξιολογήθηκε με προ-κατεργασία με τον αναστολέα που ακολουθείται από ΡΜΑ διέγερση, και επακόλουθη ανοσοκηλίδωση για το PS

916-ΡΚϋ1 όπως πριν (Σχ. 5). ΡΚϋ1 και τουμπουλίνης κηλιδώθηκαν ως έλεγχοι. Όπως φαίνεται στο Σχ. 9C, Flag-ΡΚϋ1

M659G έδειξαν σημαντικά αυξημένη ευαισθησία σε 1-NA-ΡΡ1 σε σύγκριση με τον έλεγχο άγριου τύπου. Με βάση την ανάλυση πυκνότητας, το IC

50 για άγριου τύπου Flag-PKD1 ήταν 26,50 ± 2,23 μΜ, ενώ το IC

50 για το αναλογικό ευαίσθητη Flag-PKD1

M659G ήταν 2,13 ± 0,61 μΜ, αντικατοπτρίζοντας μια αύξηση 12 φορές σε ευαισθησία σε 1-NA-ΡΡ1. Σε αντίθεση, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην αναστολή της Flag-ΡΚϋ1

M659A από 1-NA-ΡΡ1 σε σύγκριση με την άγριου τύπου Flag-PKD1 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι η μετάλλαξη M659A ήταν σε θέση να ευαισθητοποιήσει ΡΚϋ1 στην αναστολή της 1-NA-ΡΡ1. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ανασταλτική δράση της 1-NA-ΡΡ1 για ΡΚϋ1 θα μπορούσε να ενισχυθεί περαιτέρω με την εισαγωγή της μετάλλαξης φύλακα, πράγμα που σημαίνει ότι 1-NA-ΡΡ1 θα μπορούσε να συνδεθεί με την αναλογική-ευαίσθητο PKD1

M659G για να καθορίσει PKD-συγκεκριμένες λειτουργίες και τα μονοπάτια σηματοδότησης σε ακέραια κύτταρα.

A.Alignment των πρωτογενών αλληλουχίες που περιέχουν το φύλακα αμινοξύ στο PKD. Βέλος δείχνει τη συναίνεση φύλακα αμινοξύ «Μεθειονίνη» (Μ) σε ένα σκιασμένο ορθογώνιο. B. Η έκφραση του άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων PKDs. κύτταρα ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με άγριου τύπου και δύο μεταλλάξεις φύλακα της Σημαίας-PKD1 (Flag-PKD1

M659G και Flag-PKD1

M659A). Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για ΡΚϋ1 και τουμπουλίνης (έλεγχος φόρτωσης). Γ 1-NA-ΡΡ1 εξάρτηση από τη συγκέντρωση ανέστειλε PMA-επαγόμενη ενεργοποίηση της σημαίας-PKD1 και Flag-PKD1

M659G. ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολυσμένα με Flag-ΡΚϋ1 και Flag-ΡΚϋ1

M659G είχαν τον ορό επί 24 ώρες και προ-κατεργάστηκε με 1-NA-ΡΡ1 σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σε μέσο ελεύθερο ορού για 45 λεπτά, ακολουθούμενο από διέγερση με ΡΜΑ στο 10 ηΜ επί 20 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση για ρ-S

916-ΡΚϋ1, ΡΚϋ1, και τουμπουλίνης. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και αντιπροσωπευτικές εικόνες από ένα πείραμα που φαίνεται.

Η

Συζήτηση

PKDs παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές βασικές βιολογικές διεργασίες και αντιπροσωπεύουν μια αναδυόμενη θεραπευτικό στόχο για πολλές παθολογικές καταστάσεις και ασθενειών. Ωστόσο, η ακριβής βιολογική λειτουργία της PKD δεν έχει σαφώς καθορισμένες.