K-Ras εξαρτώνται από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) οι «εθισμένοι» στο βασικό αυτοφαγία που επαναπρογραμματίζει τον κυτταρικό μεταβολισμό σε λυσοσωμική ευαίσθητο τρόπο. Εδώ δείχνουμε ότι το xenophagy σχετιζόμενη TBK1 κινάσης οδηγεί βασικής αυτοφαγία, συνεπής με γνωστή απαίτηση του στον πολλαπλασιασμό K-Ras-εξαρτώμενη NSCLC. Επιπλέον, βασική αυτοφαγία στο πλαίσιο αυτό χαρακτηρίζεται από την παγίδευση του xenophagy υποδοχέα φορτίου Ndp52 και paralogue της Tax1bp1, που δείχνουμε εδώ για να είναι ένα

καλόπιστους

υποδοχέα φορτίου. Autophagy αυτών των υποδοχέων φορτίων προωθεί τη μη κανονική σηματοδότηση ΝΡ-κΒ. Προτείνουμε ότι αυτό TBK1-εξαρτώμενο μηχανισμό για NF-κΒ σηματοδότηση συμβάλλει στον εθισμό αυτοφαγία στο K-Ras οδηγείται NSCLC

Παράθεση:. Newman AC, Scholefield CL, Kemp AJ, Newman Μ, McIver EG, Kamal Α, et al. (2012) TBK1 κινάσης εθισμός σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα προκαλείται μέσω Autophagy της Tax1bp1 /Ndp52 και μη Canonical NF-κΒ σηματοδότηση. PLoS ONE 7 (11): e50672. doi: 10.1371 /journal.pone.0050672

Επιμέλεια: Edward Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Ιουλίου 2012? Αποδεκτές: 23η Οκτωβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Newman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο στο εργαστήριο ΝΔ χρηματοδοτήθηκε από μια Cancer Research UK Career Development Fellowship (C20685 /A12825) που κατέχονται από ΝΔ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Ahmad Kamal, Ed McIver και Michelle Newman είναι υπάλληλοι της Τεχνολογίας Ιατρικό Συμβούλιο Έρευνας, Λίντον Σπίτι, 7-12 πλατεία Tavistock, Λονδίνο WC1H 9lt, Ηνωμένο Βασίλειο. Ιατρικής Έρευνας Τεχνολογίας Συμβούλιο κατέχει μια αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας (PCT δεν WO2010100431) σε αναστολείς TBK1 συμπεριλαμβανομένων MRT68601. Οι συγγραφείς αυτοί μπορούν επομένως να λαμβάνετε οικονομικά οφέλη από τυχόν μελλοντική εκμετάλλευση αυτού του διπλώματος ευρεσιτεχνίας. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Μια στρατηγική που θα στοχεύει την εξέλιξη του όγκου είναι να εντοπιστούν συγκεκριμένες μοριακές τα τρωτά σημεία που απορρέουν από το γενετικό υπόβαθρο. Η ενεργοποίηση του K-Ras με μετάλλαξη, ή με άλλα μέσα, καθιστά μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυττάρων εθισμένος »στην παρουσία TBK1 (κινάση ΔΕΞΑΜΕΝΗ δεσμεύσεως 1) πρωτεΐνη για τη συνεχή πολλαπλασιασμό και /ή την επιβίωση [1], ενδεχομένως μέσω άμεσης διέγερσης της δραστηριότητας TBK1 [2]. TBK1 και paralogue της, IKKε, παράλληλα με τα καλά χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες ΙΚΚα και ΙΚΚβ, αποτελούν μια υπο-οικογένεια σερίνης-θρεονίνης κινάσες πρωτεΐνης [3]. TBK1 και IKKε είχαν αρχικά περιγραφεί ως μεσολαβούν την ενεργοποίηση του παράγοντα μεταγραφής ΝΡ-κΒ [4], [5], [6]. Έχει επίσης προταθεί ότι συστατική προαγωγή του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα NSCLC, κατάντη του K-Ras, θα μπορούσαν να αποτελούν τη βάση TBK1 «εθισμός» [1]. Πράγματι, προφίλ γονιδιακής έκφρασης έχει δείξει ότι μια K-Ras γνώμονα, NF-κΒ-σαν υπογραφή εξαρτάται από το γονίδιο TBK1 [1]. Ωστόσο, μηχανιστική απόδειξη για TBK1 μεσολάβηση εμπλοκή ΝΡ-κΒ στον καρκίνο έχει αραιή. Εναλλακτικές ερμηνείες του εθισμού TBK1 έχουν προταθεί, όπως η άμεση ενεργοποίηση της προ-επιβίωσης σηματοδότηση Akt κινάσης [7], [8]. Ωστόσο, καμία ατομική συνεισφορά της TBK1 είναι απαραίτητα αλληλοαποκλειόμενες με τους άλλους.

Ένα δεύτερο μονοπάτι που ασχολούνται στα κατάντη της ενεργοποίησης K-Ras είναι μακροαυτοφαγία (εφεξής αυτοφαγία) [9], [10], [11]. Autophagy είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων λυσοσωμική αποικοδόμηση [12]. Στα αρχικά στάδια, ανάλογα με τη δράση του πυρήνα γονιδίων αυτοφαγία, όπως

ATG5

και

ULK1

, διπλά membraned κυστίδια διακοσμημένα με ουμπικουϊτίνης-όπως πρωτεΐνες της οικογένειας /GABARAP LC3, που ονομάζεται αυτοφαγοσώματα, αρχίζουν να διαμορφώνουν. Αυτά εκκολαπτόμενη αυτοφαγοσώματα περικλείουν όλο και μεσεγγύηση, κυτταρόπλασμα καθώς ωριμάζουν. Ανάλογα με το πλαίσιο, αυτό μπορεί να είναι ένα μη-επιλεκτική ή επιλεκτική διαδικασία, στην οποία συμμετέχουν παγίδευση διακριτών πληθυσμών, ή «φορτία», οργανιδίων, πρωτεΐνες ή άλλες δομές, όπως τα βακτήρια και στην περίπτωση του «xenophagy». Επιλεκτικότητα διαμεσολαβείται μέσω υποδοχέων φορτίου που συνδέουν τις πρωτεΐνες LC3 /GABARAP στο φορτίο, στην υποτιθέμενη πολυ-μοριακών συμπλόκων [12]. επιπτώσεις Autophagy στην κυτταρική μοίρα τόσο από αυτή την επιλεκτική παγίδευση των συμπλοκών φορτίου από το κυτοσόλιο και μέσω μετέπειτα λυσοσωμική αποικοδόμηση του περιεχομένου του autophagosome, η οποία απελευθερώνει μεταβολιτών στο κυτταρόπλασμα. Αυτό το τελευταίο βήμα αναστέλλεται από lysosomotrophic φάρμακα όπως η χλωροκίνη. Τέτοιες ενώσεις είναι μια πιθανή κατηγορία παραγόντων για θεραπευτική χειραγώγηση της αυτοφαγία [11], [13].

Ο ρόλος της αυτοφαγία στην οξεία απόκριση σε μετάλλαξη Ras είναι ασαφής. Έχει αποδειχθεί ότι δρα ως τελεστής της επιβίωσης, κυτταρικού θανάτου ή γήρανση [9], [14], [15]. Ωστόσο, η συνεχής βασική αυτοφαγία είναι σαφώς απαιτείται για τον πολλαπλασιασμό ή /και την επιβίωση των καθιερωμένων K-Ras οδηγείται καρκινικών κυττάρων [10], [11], [13]. Ένας ρόλος της αυτοφαγία εδώ είναι η άμεση ρύθμιση του κυτταρικού μεταβολισμού, μέσω των μιτοχονδρίων ομοιόστασης, τον έλεγχο ποιότητας πρωτεΐνες και /ή την αναδιαμόρφωση της πισίνας κυτταρικής μεταβολίτη. Αθροιστικά, οι μηχανισμοί αυτοί ρυθμίζουν την ισορροπία μεταξύ οξειδωτική φωσφορυλίωση και αερόβια γλυκόλυση [10], [11], [13]. Μερικοί από αυτούς τους μηχανισμούς εξαρτώνται από λυσοσωμική αποικοδόμηση, όπως φαίνεται από την ευαισθησία του για μεταβολικές επιδράσεις lysosomotrophic παράγοντες όπως χλωροκίνη. Ωστόσο, δεν έχει αντιμετωπιστεί το πώς αυτοφαγία ασχολείται κατάντη του K-Ras. Επιπλέον, δεν είναι σαφές αν η αυτοφαγία «εθισμός» μπορεί να εξηγηθεί μόνο από την άμεση μεταβολικές επιδράσεις ή αν παγίδευση των συγκεκριμένων πρωτεϊνών ρυθμίζει κυτταρική μοίρα, μέσω της τροποποίησης της μεταγωγής σήματος μέσα στο κύτταρο.

Είναι ενδιαφέρον, TBK1 έχει ενοχοποιηθεί στην autophagy του κυτοσολίου

Salmonella spp.

βακτήρια από το εσωτερικό των κυττάρων [16]. Η νέα πρωτεΐνη TBK1 δέσμευσης και xenophagy υποδοχέα φορτίου, Ndp52, αναγνωρίζει ουβικιτινιωμένες πρωτεΐνες, στην επιφάνεια των βακτηρίων, και οι πρωτεΐνες σύνδεσης υδατάνθρακα επί ρήξη κυστίδια ξενιστή [17], [18]. Ένα μη-πλεονάζοντα βήμα σε αυτό το μονοπάτι έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι ο TBK1 μεσολάβηση φωσφορυλίωση ενός περαιτέρω νέου υποδοχέα φορτίου, Optineurin [16]. Η σημασία της TBK1 έξω από xenophagy σηματοδότησης είναι ασαφής. Ωστόσο, δείχνουμε εδώ ότι η βασική αυτοφαγία, με κάποιες ομοιότητες με xenophagy και με αποτέλεσμα ο κύκλος εργασιών των υποδοχέων φορτίου, όπως Ndp52 και παράλογων πρωτεΐνη Tax1bp1, είναι συστατικά που ασχολούνται με κύτταρα NSCLC TBK1-εθιστεί από τη δραστηριότητα κινάσης της TBK1. Έχουμε αποδείξει έναν κεντρικό ρόλο για αυτή την αυτοφαγία στην οδήγηση μη κανονικών NF-κΒ σηματοδότηση διαμεσολαβείται μέσω του μεταγραφικού παράγοντα RelB. Προτείνουμε ότι αυτή η οδός συμπληρώνει άμεση μεταβολικούς μηχανισμούς της συμβολής της βασικής αυτοφαγία στην υποστήριξη του πολλαπλασιασμού ή /και την επιβίωση των κυττάρων NSCLC. Τα ευρήματά μας επεκτείνουν έτσι το ρόλο του εθισμού αυτοφαγία στο K-Ras με γνώμονα τον καρκίνο και δείχνουν μηχανιστική αλληλεπίδραση με την οδό TBK1-NF-κΒ.

Αποτελέσματα

Autophagy στο K-Ras κύτταρα που εξαρτώνται από τον καρκίνο του πνεύμονα είναι μεταγενέστεροι της TBK1 κινάσης

Για να διερευνήσουν το ρόλο της TBK1 στο K-Ras με γνώμονα τη βασική αυτοφαγία έχουμε αναπτύξει ένα μοντέλο πολιτισμού NSCLC στο «εθισμένος» Α549 κύτταρα K-Ras [1]. Βρήκαμε ότι η κυτοσόλιο από αυτά που περιέχονται άφθονα δομές στικτή που επισημαίνονται με πρωτεΐνη σύντηξης GFP-LC3B, αλλά όχι με λιπίδιο-unconjugatable GFP-LC3BΔG- & gt? Α (Εικ. 1 a). Η αφθονία των GFP-LC3B puncta δραματικά αυξημένα κατά τη θεραπεία με χλωροκίνη (Εικ. 1α). Σύμφωνα με τη μεθοδολογία του τομέα [19], που στη συνέχεια πήρε αυτά LC3B puncta να αντιπροσωπεύουν μια βασική, σταθερή κατάσταση επίπεδο αυτοφαγοσώματα. Αυτά αυτοφαγοσώματα ήταν απόντες όταν RNAi χρησιμοποιήθηκε για να νοκ ντάουν την αυτοφαγία γονίδια

ATG5

και

ULK1

(Εικ. 1b-δ). RNAi του

TBK1

έδωσαν παρόμοια αποτελέσματα, τοποθετώντας αυτό το κινάσης ανάντη της βασικής autophagosome αφθονίας (Σχ. 1 b-d). Έχουμε επεκταθεί αυτά τα ευρήματα χρησιμοποιώντας αναλύσεις αυτοφαγία ροής σε συνδυασμό με ένα μέλος μιας περιγράφηκε πρόσφατα οικογένεια ενζυματική αναστολείς της TBK1 (MRT68601, εφεξής TBKi, Εικ. S1) [20]. αγωγής με αναστολέα του Α549 κυττάρων LC3B tandem φθορίζουσα [21] είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση τόσο της πρόωρης αυτοφαγικά ( «πράσινο + κόκκινο ‘) LC3B puncta και όξινα αργά αυτοφαγοσώματα (« κόκκινος »puncta) (Σχ. 1ε, f). Αντίστοιχα, η χλωροκίνη μεσολάβηση συσσώρευση λιπιδιωμένης LC3B-ΙΙ ή GABARAP-ΙΙ, με τη μορφή αυτών των πρωτεϊνών συσχετίζονται με σχηματισμό αυτοφαγοσώματα, αποτράπηκε με επεξεργασία αναστολέα (εικ. 1 g). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι TBK1 κινάσης προωθεί πράγματι αυτοφαγία, ενεργώντας στο πρώιμο στάδιο του σχηματισμού autophagosome, παρά την καταστολή ωρίμανση autophagosome στο λυσοσωμικό όξινο διαμέρισμα [19].

Α549 GFP-LC3B ή GFP-LC3BΔG – & gt? Α κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PBS ή 5 μΜ χλωροκίνη (CQ) για 8 ώρες και τα κύτταρα απεικονίζεται για GFP. β, γ) κύτταρα Α549 GFP-LC3B επιμολύνθηκαν με υποδεικνύεται siRNA για 72 h (

NTC

= μη στόχευση έλεγχος) και β) κυτταρικά εκχυλίσματα στυπώθηκαν για υποδεικνύεται πρωτεΐνες (α-μπανιέρα = α-τουμπουλίνης) ή κύτταρα γ) απεικονίζεται για GFP-LC3B puncta. δ) κύτταρα Α549 FLAG-HA-LC3B επιμολύνθηκαν με υποδεικνύεται siRNA και ΗΑ-θετικών puncta ανοσοχρωματίστηκε, απεικονίζεται και μετρήθηκαν σε 72 h (n = 3, ± S.E.M., * = ρ & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0,01). e, f) Α549 tandem φθορίζουσα-LC3B (κύτταρα tfLC3B) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 1 μΜ MRT68601 (TBKi) για 24 ώρες και ε) απεικόνιση και στ) ποσοτικοποιηθεί για συνολικό αριθμό των αυτοφαγικά puncta (πράσινο + κόκκινο) και το υποσύνολο αυτών puncta με μη ανιχνεύσιμο σήμα GFP (κόκκινο), όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο Υλικά και Μέθοδοι. ζ) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 10 μΜ MRT68601 (TBKi) για 24 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία PBS ή 5 μΜ (CQ) χλωροκίνη και κυτταρικά εκχυλίσματα στυπώθηκαν για υποδεικνύεται πρωτεΐνες. Ράβδοι κλίμακας = 50 μm σε όλες τις ομάδες.

Η

Βασική Autophagy Πολεμά τον Cargo Υποδοχείς Ndp52 και Tax1bp1

Η βακτηριακή αυτοφαγία (xenophagy) διαμεσολαβείται μέσω TBK1 και τους συνεργάτες συνδέσεώς της, η xenophagy φορτίου υποδοχείς Ndp52 και Optineurin [16], [18]. Σε ένα παράλληλο προς αυτό, βρήκαμε πρόσληψη Ndp52, και ο Ndp52 paralogue Tax1bp1, σε βασικά αυτοφαγοσώματα σε κύτταρα Α549 (Σχ. 2α, c). Δείξαμε επίσης μια συστατική Ndp52-TBK1 συγκρότημα και επιβεβαίωσε την προηγούμενη έκθεση ότι Tax1bp1 θα μπορούσε να δεσμεύσει TBK1 [22] (Εικ. S2a, β). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι Ndp52 και Tax1bp1 μπορεί να γίνει στόχος για την παγίδευση από τα βασικά αυτοφαγία. Κατά συνέπεια, η θεραπεία με χλωροκίνη σταθεροποιημένο Tax1bp1 παρόμοια με έναν θετικό έλεγχο, ο υποδοχέας ρ62 φορτίο (Σχ. 2β), και ταυτόχρονα με αυξημένο εντοπισμός Tax1bp1 να LC3B θετικά κυστίδια (Εικ. 2γ). Ουβικουϊτίνη όπως πρωτεΐνες των υποοικογενειών LC3 και GABARAP είναι ικανά σύνδεσης Tax1bp1, με ποικίλες συγγένειες (Εικ. 2d). Αυτό υποδηλώνει ότι Tax1bp1 είναι, όπως, Ndp52, ένα

καλόπιστους

πρωτεΐνη υποδοχέα φορτίου. Περαιτέρω υποστήριξη για το εύρημα αυτό προέρχεται από την παρατήρηση ότι η διαγραφή των μοτίβων δέσμευσης υποθετικού LC3 /GABARAP οικογένεια στην Tax1bp1 αφαιρεί εντοπισμού για να αυτοφαγοσώματα (Εικ. 2ε). Αυτά τα μοτίβα περιλαμβάνουν τόσο ένα «κανονικό» LIR (περιοχή LC3-αλληλεπιδρώντας) μοτίβο (W49, V50, G51, I52) και ένα «μη κανονικών LIR» μοτίβο, η τελευταία συνήγαγε από αυτό που περιγράφεται πρόσφατα για τη σύνδεση Ndp52 να LC3C (L141, V142, V143) [23] (Εικ. 2ε, βλέπε επίσης ευθυγραμμίσεις στο Σχ. S2C). Συνεπής με τον ρόλο των TBK1 στις ανωτέρω μεθόδους, πρωτεΐνη TBK1 επίσης δείχθηκε να εντοπίζεται στα βασικά αυτοφαγοσώματα (Εικ. 2στ).

Α549 κύτταρα GFP-LC3B χρωματίστηκαν για Ndp52 και απεικονίζεται. β, γ) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS ή 5 μΜ χλωροκίνη (CQ) όλη τη νύχτα και β) κυτταρικά εκχυλίσματα στυπώθηκαν για υποδεικνύεται πρωτεΐνες (α-μπανιέρα = άλφα τουμπουλίνης) ή γ) κύτταρα συν-χρώση για Tax1bp1 και LC3B, και απεικονίζεται με ομοεστιακό μικροσκόπιο. δ) 293FT κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης myc-TAX1BP1, ή κενό φορέα ελέγχου, και προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε pull-down με ενδεικνυόμενη πρωτεΐνη σύντηξης, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι (- = GST μόνο, Β = GST-LC3B, C = GST-LC3C, G = GST-GABARAP). ε) κυτταρικές γραμμές Α549 FLAG-HA-TAX1BP1 εκφράζουν σταθερά τις υποδεικνυόμενες παραλλαγές της Tax1bp1 πρωτεΐνης (βλέπε κείμενο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ χλωροκίνη τη διάρκεια της νύχτας και χρωματίστηκαν για ΗΑ puncta. στ) κύτταρα Α549 GFP-TBK1 mCherry-LC3C απεικονίστηκαν (βέλη δείχνουν colocalisation). Ράβδοι κλίμακας = 25 μm σε όλες τις ομάδες.

Η

TBK1 Δίσκοι μη κανονικές NF-κΒ σηματοδότηση από αυτοφαγικά απομόνωση του Ndp52 και Tax1bp1

επόμενο Υποθέσαμε μια σύνδεση μεταξύ TBK1 με γνώμονα την αυτοφαγία και βασική σηματοδότηση ΝΡ-κΒ. Πυρηνικός εντοπισμός των κανονικών ΝΡ-κΒ υπομονάδες μονοπάτι c-Rel ή ΚεΙΑ δεν ήταν ανιχνεύσιμη στην Α549 κυτταρική γραμμή (ρ53 άγριου τύπου), αλλά βασικά πυρηνικό εντοπισμό της μη κανονικής υπομονάδα μονοπάτι RelB ήταν ανιχνεύσιμη (Εικ. S3). RelB πυρηνικού εντοπισμού εξαρτιόταν από δραστικότητα κινάσης TBK1 όπως φαίνεται από την απώλεια της πυρηνικής χρώσης RelB (Εικ. 3α, β) ή απώλεια της παραμονής στο πυρηνικό κλάσμα (Εικ. 3c) κατά την αγωγή με αναστολέα TBK1. Tax1bp1 έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι αναστέλλουν κανονική σηματοδότηση ΝΡ-κΒ από πυρήνωση μιας ουμπικουϊτίνης συγκρότημα επεξεργασίας για τα κανονικά ρυθμιστές ΝΡ-κΒ TRAF6 και RIP1 [24]. Ωστόσο, αντικρουόμενες αναφορές έχουν επιδείξει δράση ενισχύσεως του ΝΡ-κΒ, αν και κατάντη της απορρύθμισης της λειτουργίας Tax1bp1 από την ιική ογκοπρωτεΐνη Tax [25]. Βρήκαμε ότι η RNAi του

ATG5

,

ULK1

,

TBK1, TAX1BP1

ή

NDP52

αναστέλλεται RelB πυρηνικού εντοπισμού (Σχ. 3d-f), πράγμα που σημαίνει ότι ένας μεταγενέστερος συνέπεια της Tax1bp1 και Ndp52 παγίδευση από αυτοφαγία είναι εμπλοκή των μη κανονικών NF-κΒ. Η θεραπεία με την αυτοφαγία ανασταλτική ένωση 3-ΜΑ (3-μεθυλ αδενίνη) αποκόπτεται επίσης RelB πυρηνικού εντοπισμού, υποστηρίζοντας περαιτέρω αυτά τα ευρήματα (Σχ. 3G). Δεν είναι σαφές εάν αυτοφαγικά υποβάθμιση του φορτίου σε λυσοσώματα, ή απλώς αυτοφαγικά συντηρητική κατάσχεση του φορτίου, απαιτείται για RelB σηματοδότησης. Ενώ Ε64ϋ /πεπστατίνη Α αγωγή δεν είχε καμία ανασταλτική επίδραση επί RelB πυρηνικού εντοπισμού, μια μικρή αλλά σημαντική επίδραση παρατηρήθηκε με υψηλές δόσεις χλωροκίνη και μια έντονη ανασταλτική επίδραση παρατηρήθηκε με βαφιλομυκίνη Α1 (Εικ. S4). Για να επιβεβαιώσετε την παρατήρηση ότι αυτοφαγία προωθεί δραστηριότητα RelB, θα αξιολογούνται οι αλλαγές στη γονιδιακή μεταγραφή. Οι αναλύσεις των πιθανών γονιδίων στόχων RelB έδειξε ότι

BIRC3

επίπεδα mRNA ήταν γερά μειωτικά από την αναστολή RelB (Εικ. 3 η, θ). Είναι σημαντικό, RNAi του

ATG5

,

ULK1

,

TAX1BP1

και

TBK1

παρόμοια μειωτικά

BIRC3

mRNA (Εικ. 3ι) .

Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με DMSO ή 10 μΜ MRT68601 (TBKi) και α) βάφτηκαν για RelB (γραμμή κλίμακας = 50 μm), πυρηνικό εντοπισμό ποσοτικά στο β) (n = 3, ± SEM, * * = ρ & lt? 0,01) ή γ) πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και κηλιδώθηκαν για υποδεικνύεται πρωτεΐνες. d-f) κύτταρα Α549 επιμολύνονται με υποδεικνύεται siRNA (

NTC

= μη-στόχευσης ελέγχου) για 72 ώρες και ε) κυτταρικά εκχυλίσματα στυπώθηκαν για υποδεικνύεται πρωτεΐνες ή d, f) κύτταρα κηλιδώθηκαν και ποσοτικά για την πυρηνική RelB (n = 3, ± SEM, * = ρ & lt? 0,05). ζ) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με PBS ή 10 mM 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) για 24 ώρες και στη συνέχεια χρωματίζονται και να ποσοτικοποιηθούν για την πυρηνική RelB (n = 3, ± S.E.M., *** = ρ & lt? 0.005). h, i) κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με ενδεικνυόμενο φακοϊό και, στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση, η) κυτταρικά εκχυλίσματα στυπώθηκαν για υποδεικνύεται πρωτεΐνες ή i) ολικό RNA ποσοτικοποιείται για

BIRC3

mRNA (η = 3? ± SD) . ι) Α549 κύτταρα επιμολυσμένα με υποδεικνύεται siRNA για 72 ώρες και ολικά εκχυλίσματα RNA υποβλήθηκαν σε qRT-PCR για

BIRC3

mRNA (η = 3? ± S.D.). ια) κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με ενδεικνυόμενο φακοϊό και στους 120 h αριθμός μετά τη μόλυνση των κυττάρων μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι (n = 3, ± SEM, * = ρ & lt?. 0.05)

Η

RelB Δραστηριότητα συμβάλλει στην TBK1 και Autophagy «εθισμός»

Εμείς επιβεβαίωσε προηγούμενες παρατηρήσεις [1], [11], ότι η χρόνια αποσιώπηση του

ATG5

ή

TBK1

, από λεντοϊού στόχευση shRNA, οδήγησε σε μείωση του αριθμού των κυττάρων σε κύτταρα Α549, όπως έκανε και RNAi του

KRAS

(Σχ. S5A-ί). Είναι σημαντικό, λεντοϊού RNAi του

RELB

επίσης οδηγήσει σε σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων (Εικ. 3k). Αυτό υποδηλώνει TBK1- και αυτοφαγία μεσολάβηση ρύθμιση των RelB μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, αποτελούν τη βάση TBK1- και αυτοφαγία-εθισμό.

Autophagy και Ndp52 /Tax1bp1 μεσολάβηση RelB σηματοδότηση μπορεί να είναι ανεξάρτητη από Optineurin και Tax1bp1 δεν προάγει η Canonical NF-κΒ σηματοδότηση

σε κύτταρα Α549, το άλλο υποδοχέα αυτοφαγία φορτίου στο παρελθόν εμπλακεί σε λειτουργία TBK1, Optineurin [16], φαίνεται να έχει περιορισμένη συμμετοχή στην RelB σηματοδότησης. Υπάρχει μόνο μια μικρή, αν και σημαντική, μείωση RelB πυρηνικό εντοπισμό κατόπιν

OPTN

RNAi (Σχ. 4α, b). Ωστόσο, αυτά τα ευρήματα δεν αποκλείουν ένα ρόλο για Optineurin σε διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο ή υπό συνθήκες στρες, και οι δυνατότητες αυτές θα πρέπει να αντιμετωπιστούν στις μελλοντικές εργασίες. Σε κύτταρα Α549, ο ρόλος της στην προώθηση Tax1bp1 ΝΡ-κΒ σηματοδότηση είναι επίσης ειδικά για το νέο μονοπάτι autophagy-RelB που περιγράφονται εδώ. Η διέγερση του κανονικού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ με επεξεργασία TNFa, όπως αξιολογείται με πυρηνικό εντοπισμό του ΚεΙΑ, δεν διαταράσσεται από

TAX1BP1

RNAi, τουλάχιστον στο βαθμό που δεν παρατηρείται μείωση του ΤΝΡα επαγόμενη πυρηνικής μετατόπισης (Σχ. 4c , d). Έτσι, η διεγερτική ρόλος του Tax1bp1 επί ΝΡ κΒ φαίνεται να είναι ειδικό για μη κανονικά σηματοδότηση RelB. Ωστόσο, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι αυτή η δοκιμασία δεν αντιμετωπίζει το ήδη περιγραφεί καλά ανασταλτικό ρόλο του Tax1bp1 σχετικά με τη διάρκεια και το μέγεθος των κανονικών σηματοδότησης ΝΡ-κΒ [24].

Α549 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με υποδεικνυόμενη siRNA (

NTC

= μη-στόχευσης ελέγχου) για 72 ώρες και α) κυτταρικά εκχυλίσματα στυπώθηκαν για υποδεικνύεται πρωτεΐνες ή β) κύτταρα βάφονται και να ποσοτικοποιηθούν για την πυρηνική RelB (n = 3, ± SEM, * = ρ & lt? 0,05) . c, d) Α549 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με υποδεικνύεται siRNA (

NTC

= μη στόχευση ελέγχου) και διεγέρθηκαν με 5 ng /ml ΤΝΡ-α επί 3 ώρες και γ) χρωματίστηκαν και δ) ποσοτικοποιούνται για την πυρηνική ΚεΙΑ ( n = 3, ± SEM). μπαρ κλίμακας = 25 μm.

Η

RelB ενεργοποίηση από Autophagy και Ndp52 /Tax1bp1 παρατηρείται επίσης και σε p53-μεταλλαγμένο, K-Ras-εξαρτώμενη NSCLC κύτταρα

Έχει προταθεί ότι σε p53-μεταλλαγμένο NSCLC γραμμές, όπως ΝΟΙ-Η23, βασική κανονική σηματοδότηση ΝΡ-κΒ είναι πολύ υψηλότερο από ό, τι στις γραμμές άγριου τύπου ρ53, όπως Α549. Ωστόσο, τουλάχιστον σε ΝΟΙ-Η23, έχουμε ακόμα βρει συστατική εμπλοκή RelB σηματοδότησης, εξαρτάται από τη βασική λειτουργία αυτοφαγία, υποδηλώνοντας ότι η βασική μη κανονικά και κανονική σηματοδότηση ΝΡ-κΒ μπορεί να είναι συν-περιστατικό (Σχ. 5a-e). Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι τα κύτταρα ΝΟΙ-Η23 είχε συστατική αυτοφαγία, όπως αξιολογήθηκε με πρωτεΐνη δείκτη LC3 tandem-φθορισμού, η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω από το

TBK1

RNAi (Σχ. 5a-c), και ότι συστατική πυρηνικό εντοπισμό του RelB σε αυτή την κυτταρική γραμμή ήταν ευαίσθητη σε μεσολάβηση RNAi αναστολή της

TBK1

,

ATG5

,

NDP52

ή

TAX1BP1

(Εικ. 5d, ε) .

κύτταρα NCI-H23 επιμολύνονται με υποδεικνύεται siRNA (NTC = έλεγχος μη-στόχευση) για 72 ώρες και α) τα κυτταρικά εκχυλίσματα καθάρισε για υποδεικνύεται πρωτεΐνες. β, γ) ΝΟΙ-Η23 κύτταρα LC3B tandem φθορίζουσα επιμολύνθηκαν με υποδεικνύεται siRNA και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. d, e) τα κύτταρα NCI-Η23 επιμολύνθηκαν με υποδεικνύεται siRNA για 72 ώρες και τα κύτταρα δ) χρωματίστηκαν και ε) ποσοτικοποιούνται για την πυρηνική RelB (n = 3, ± SEM, * = ρ & lt? 0,05, ** = ρ & lt? 0,01) . μπαρ κλίμακας = 50 μm σε όλες τις ομάδες.

Η

Ένα μοντέλο για την εμπλοκή του βασικοκυτταρικό RelB σηματοδότηση στο K-Ras-εξαρτώμενα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται σε αυτό το χειρόγραφο οδηγήσει στην διατύπωση του κατωτέρω μοντέλου (Εικ. 6). Ενώ η δραστηριότητα των TBK1 δέσμευσης υποδοχέων φορτίου Optineurin, Ndp52 και, ενδεχομένως, Tax1bp1, οδηγεί αυτοφαγία των βακτηριακών κυττάρων κατά τη διάρκεια της xenophagy, μια παρόμοια TBK1 μεσολάβηση αυτοφαγικά παγίδευση των Tax1bp1 και Ndp52 οδηγείται από τα βασικά αυτοφαγία στα κύτταρα K-Ras-εξαρτώμενη NSCLC . Αυτό οδηγεί σε εμπλοκή των μη κανονικών σηματοδότηση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ΝΡ-κΒ και /ή την επιβίωση. Είτε TBK1 ρυθμίζει επίσης την άμεση, λυσοσωμική λειτουργία της αυτοφαγία στον κυτταρικό μεταβολισμό είναι άγνωστη? παραμένει, επίσης, να εξεταστεί αν ο ρόλος της αυτοφαγία είναι πειραματικά διαχωριστούν από την επιλεκτική απομόνωση του Tax1bp1 και Ndp52. Μηχανιστικά, επίσης δεν είναι σαφές πώς TBK1 οδηγεί αυτοφαγία. Ωστόσο, δεδομένου ότι αυτό το χειρόγραφο ήταν στο τελικό στάδιο της αναθεώρησης, η ομάδα των Deretic δημοσίευσε ότι η φωσφορυλίωση του γενικού υποδοχέα λειτουργία αυτοφαγία και διευκόλυνσης της autophagosome βιογένεση, Ρ62 /SQSTM1, στον τομέα ουμπικουϊτίνης-δέσμευσης (UBA), μπορούν να συμμετέχουν σε ένα μυθιστόρημα ρόλο για TBK1 στην πείνα που προκαλείται από αυτοφαγία [26], [27]. Πράγματι, τα πρώτα αποτελέσματα από αυτό το εργαστήριο δείχνουν ότι τα κύτταρα Α549 έχουν basally φωσφορυλιωμένη ρ62 που μειώνεται σε αφθονία με επεξεργασία TBKi (Εικ. S6).

Δείτε το κείμενο για λεπτομερή συζήτηση. Ub = ουβικιτίνης.

Η

Συζήτηση

Η αυτοφαγία είναι μια πολύπλευρη διαδικασία, θεσπίζουν αλλαγές στην κυτταρική μοίρα από τους δύο μη εκλεκτικών και εκλεκτικών μηχανισμών [12]. Είναι πιθανό ότι η δέσμευση του αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα δρα άμεσα τόσο τον μεταβολισμό [10], [11], [13] και κυτταρική σηματοδότηση, σε μια ολοκληρωμένη απάντηση. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι xenophagy είναι συζευγμένη με μια έμφυτη ανοσοαπόκριση σηματοδότηση μέσω μη κανονικά ΝΡ-κΒ, και ο μηχανισμός αυτός απλά με παρεκκλίνοντα εμπλέκεται με ογκογονίδιο με γνώμονα αυτοφαγία σε κύτταρα NSCLC. Ο ρόλος της TBK1 στην οδήγηση αυτοφαγία μπορεί επίσης να εξηγήσει πώς αυτοφαγία ασχολείται, παρά την προβλεπόμενη υψηλή βασική δραστηριότητα του mTOR, σε κύτταρα NSCLC. Μηχανιστικά, η φωσφορυλίωση ρ62 μπορεί να παίζει ρόλο σε αυτή τη διαδικασία [26]. Ωστόσο, εικάζουν ότι TBK1 είναι ένα επιπόλαιο κινάσης με πολλά υποστρώματα, και να προβλέψει ότι η ρ62, και μάλιστα Optineurin (δίπλα στο LIR μοτίβο) φωσφορυλίωση [16], αποτελούν απλώς ένα υποσύνολο των λειτουργικά σχετικών στόχων της TBK1 στην αυτοφαγία. Είναι έτσι πιθανό ότι διαφορετικά υποστρώματα της πράξης TBK1 σε διαφορετικά στάδια της αυτοφαγία, είτε στα πρώτα βήματα, όπως τα στοιχεία μας θα πρότεινα, ή σε μεταγενέστερα στάδια ωρίμανσης, όπως έχει προταθεί πρόσφατα [26].

Σε γενικές γραμμές, ΝΡ-κΒ σηματοδότηση έχει σκεφτεί να βρίσκονται ανάντη της autophagy [28], [29], [30]. Ωστόσο, πρόσφατα έχει προταθεί άμεση ρύθμιση των κανονικών σηματοδότησης NF-κΒ από αυτοφαγία. Υποθέσαμε μηχανισμοί έχουν συμπεριλάβει δέσμευση του ρ62, ΙκΒα, NEMO ή BCL10 [31], [32], [33], [34], [35]. Η ποικιλομορφία των μηχανισμών δράσης αυτοφαγία απεικονίζει τις διάφορες λειτουργίες αυτής της διαδικασίας? Εδώ προσθέτουμε έναν άλλον μηχανισμό ρύθμισης NF-κΒ, αυτή τη φορά στη ρύθμιση της μη κανονικής οδού RelB. Πρόσφατα, παρεκκλίνουσα δραστηριότητα RelB έχει εντοπιστεί σε όγκους του πνεύμονα, τοποθέτηση με το μοντέλο μας [36]. Ωστόσο, ρ53 άγριου τύπου NSCLC μπορεί επίσης να εξαρτάται, σε κάποιο βαθμό, κατόπιν κανονικής ΝΡ-κΒ σηματοδότηση [37], [38]. Πράγματι, κύτταρα Α549 (ρ53 άγριου τύπου) εξαρτώνται από δραστικότητα c-Rel για πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [1]. Αυτό δεν είναι αμοιβαία αποκλειόμενες με τα αποτελέσματά μας? ανιχνεύσιμα ποσότητα των πυρηνικών c-Rel μπορούσε να είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό /επιβίωσης, μαζί με RelB. Πράγματι, το πλαίσιο της p53-μεταλλαγμένο NSCLC, εάν η πρόσληψη των κανονικών σηματοδότησης NF-κΒ είναι πολύ πιο εμφανής [39], θα είναι μια καλή αρένα για να τεμαχίσει τέτοια αλληλεπίδραση. Είναι ενδιαφέρον, έχουμε δείξει σε αυτό το χειρόγραφο ότι σε τουλάχιστον ορισμένα κυτταρικές γραμμές με μετάλλαξη ρ53, και ανέφεραν εξέχοντα βασική κανονικά ΝΡ-κΒ σηματοδότηση (π.χ. ΝΟΙ-Η23), ότι η βασική, autophagy γνώμονα RelB πυρηνικού εντοπισμού μπορεί να παρ ‘όλα αυτά ανιχνευθεί. Μελλοντική διερεύνηση των φορτίων αυτοφαγία έφερε στο autophagosomal μεμβράνες από Tax1bp1 και Ndp52, ουβικουιτινωμένης ή άλλως, θα ρίξει επίσης φως από τον μηχανισμό με τον οποίο αυτοί οι υποδοχείς του φορτίου που αφορούσε τη μεσολάβηση των μη κανονικών σηματοδότησης NF-κΒ. Πρωτεομική πειράματα για να προσδιοριστεί η ταυτότητα των εν λόγω εμπορευμάτων βρίσκονται σε εξέλιξη στο εργαστήριό μας.

Με δεδομένο το ενδιαφέρον για την ανάπτυξη αναστολέων TBK1 για τη θεραπεία του καρκίνου, πρέπει να κατανοήσουμε λεπτομερώς τις συνέπειες της απώλειας του μονοπατιού που περιγράφεται εδώ. Στο

in vivo

ρύθμιση, τα αποτελέσματα του κανονισμού RelB από αυτοφαγία και TBK1 είναι απίθανο να είναι εξ ολοκλήρου κυττάρων αυτόνομα, με δεδομένη την καθιερωμένη ρόλο του NF-κΒ σηματοδότηση για τον έλεγχο της επικοινωνίας κυττάρου-κυττάρου και φλεγμονή. Είναι ενδιαφέρον,

TAX1BP1

μπορούν να ρυθμίζουν την εντερική ογκογένεση σε μοντέλα ποντικών του καρκίνου [40]. Επίσης, βλαστική

TAX1BP1

knockout ποντίκια εμφανίζουν ένα όργανο-ειδική φλεγμονώδη φαινότυπο [41]. Είναι πιθανό ότι αυτές οι παρατηρήσεις μπορεί να σχετίζονται με τον ρόλο για Tax1bp1 περιγράφεται εδώ ή, εναλλακτικά, προς την καλύτερη περιγράφεται ρόλο στην καταστολή κανονική ΝΡ-κΒ σηματοδότηση [24]. Τέλος, η στόχευση του autophagy προτείνεται επίσης ως μέσο θεραπείας του καρκίνου, τουλάχιστον σε ορισμένα γενετικά υπόβαθρα. Τα δεδομένα εδώ δείχνουν προσοχή σε παρέκταση των αποτελεσμάτων των γενετικών αναστολή της αυτοφαγία στοχεύοντας σχηματισμό autophagosome και απομόνωσης, με τη δράση των φαρμάκων που στοχεύουν λειτουργία λυσοσωμικής, όπως η χλωροκίνη, αναστολείς πρωτεάσης ή βαφιλομυκίνης Α1. Δεν είναι σαφές ότι παράγοντες όπως αυτά θα επηρεάσουν όλες τις αλλαγές, όπως η δραστηριότητα NF-κΒ, ότι η στόχευση τα πρώτα στάδια της αυτοφαγία θα, και

αντίστροφα

.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και πλασμίδια

Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM (Sigma) + 10% FCS (Sigma) κάτω από 5% CO2 στους 37 ° C. κύτταρα HEK293FT ήταν από την Invitrogen. Α549 κύτταρα που χρησιμοποιούνται ελήφθησαν από Institute of Cancer Research (London, UK) και η ταυτότητα επιβεβαιώθηκε με μικροδορυφόρων προσδιορισμού του γονότυπου (Υπηρεσίας Προστασίας της Υγείας, UK). κύτταρα NCI-H23 αγοράστηκαν απευθείας από την ATCC. Α549 και ΝΟΙ-Η23 κύτταρα παραγωγοποιείται για να εκφράσουν Οο οικοτρόποι υποδοχέα χρησιμοποιώντας pEcoR-neo και επιλογή σε G418. Ρετροϊών για να κάνει σταθερό μολυσματικοί δημιουργήθηκε στο Phoenix-Eco κυττάρων με πρότυπες τεχνικές. Οι ιοί αυτοί ήταν: pBabe GFP-LC3B puro [42]: LC3B cDNA αρουραίου συγχωνευμένο Ν-τερματικά προς GFP. pBabe GFP-LC3BΔG- & gt? A puro: πάνω πρωτεΐνη πλασμίδιο που κωδικοποιεί κομμένο έτσι, C-ter Gly εκτίθενται από την επεξεργασία του C-άκρου από Atg4 είναι μόνιμα εκτεθειμένη. Αυτό το C-ter Gly μεταλλάσσεται σε Ala pBabe tfLC3B Puro:. PBabe puro με συνδυασμό φθορισμού LC3B [21] κλωνοποιημένο σε NheI (αμβλύ) /SalI σε SnaBI /SalI ιστοσελίδα. pWZL GFP-TBK1 HYGRO: pWZL GFP DEST IRES HYGRO φορέα (αδημοσίευτο) με πλήρους μήκους TBK1 συγχωνευμένο με C-τελικό άκρο της GFP με ανασυνδυασμό με pDONR 223 TBK1 (αδημοσίευτη) με τεχνολογία πύλης (Invitrogen). pBabe mCherry LC3C BLAST: διάνυσμα BLAST pBabe Cherry DEST (ανέκδοτο) με πλήρες μήκος LC3C συγχωνευμένο με C-τελικό άκρο της mCherry από ανασυνδυασμό με pDONR 223 LC3C [43] από την τεχνολογία πύλη (Invitrogen). MSCV FLAG-HA-LC3B: Όπως περιγράφεται στη βιβλιογραφία {Behrends 2010 # 4}. MSCV FLAG-ΗΑ- TAX1BP1 (WT και LIR μεταλλάξεις): TAX1BP1 cDNA κλωνοποιήθηκε σε pDONR 223 με πρότυπες τεχνικές κλωνοποίησης πύλη χρησιμοποιώντας pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1 (κάτω) ως πρότυπο. TAX1BP1 cDNA ήταν τότε Πύλη κλωνοποιήθηκε σε MSCV NTAP IRES PURO [43]. Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση διεξήχθη σε pDONR πριν από ανασυνδυασμό εντός MSCV NTAP IRES PURO για να παραχθεί cDNA που κωδικοποιεί TAX1BP1 με μεταλλάξεις στο υποθετικό κανονική ή μη κανονική μοτίβο LIR (μεταλλάξεις, όπως περιγράφεται στο κείμενο). Όλα μεταλλαχθούν cDNAs ήταν πλήρως αλληλουχήθηκε

Άλλα πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν:. PcDNA 3.1 myc-His: Invitrogen, pcDNA 3.1 myc-TAX1BP1: myc-TAX1BP1 πλήρους μήκους cDNA (NCBI ισομορφή 1) ενισχύθηκε με PCR με τους ακόλουθους εκκινητές από έναν κλώνο IMAGE και κλωνοποιήθηκε BamHI-XhoI σε pCDNA 3.1 myc-His: GGA TCC GCC ACC ATG GAG CAG AAG CTG ΑΤΤ TCC GAG GAG GAC CTG ACA TCC ΤΤΤ CAA GAA GTC CCA TTG CAG ACT TC και CTC GAG CTA GTC ΑΑΑ ΑΤΤ TAG AAC ΑΤΤ CTG ATC ΑΑΑ ATG GGT C. Η προκύπτουσα cDNA κωδικοποιεί την παραλλαγή 307I αυτής της πρωτεΐνης (κοινή πολυμορφισμός). pDEST15-κενό φορέα (για την έκφραση της πρωτεΐνης ελέγχου GST): δημιουργείται από την εισαγωγή ενός τερματισμού εντός πλαισίου κωδικόνιο που περιέχει κασέτα σε pDEST15 με πύλη κλωνοποίηση από ένα ειδικά κατασκευασμένο πλασμίδιο pDONR223. pDEST15-LC3B, pDEST15-LC3C και pDEST15-GABARAP (για την έκφραση των πρωτεϊνών σύντηξης GST) δημιουργήθηκαν από τον ανασυνδυασμό με pDONR 223 LC3B, pDONR 223 LC3C ή pDONR 223 GABARAP [43] με την τεχνολογία πύλης (Invitrogen).

Χημικά

p> χλωροκίνη

Αντισώματα

Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είναι τα εξής:. TBK1 (Rabbit AOW9 μονοκλωνικά, Millipore), φωσφο-Ser172 -TBK1 (BD Pharmingen), ATG5 (για ATG5-12, κουνέλι πολυκλωνικά, Cell σηματοδότηση Technology), ULK1 (κουνέλι πολυκλωνικό A705, Cell σηματοδότηση Technology), LC3B (Ανοσοστύπωμα, Κουνέλι μονοκλωνικά D11, Cell σηματοδότηση Technology), LC3B (ανοσοφθορισμός, ποντίκι μονοκλωνικό 2G6, Nanotools), GABARAP (κουνέλι πολυκλωνικό Ap1821a, Abgent), ERK (κουνέλι πολυκλωνικό 9102, Cell σηματοδότηση Technology), RelB (Rabbit μονοκλωνικό C1E4, Cell σηματοδότηση Technology), της ιστόνης Η3 (Η3, ποντίκι μονοκλωνικό 6-6-2 , Millipore), Tax1bp1 (Rabbit πολυ HPA024432, Sigma HPA), Ndp52 (Rabbit πολυ ab68588, Abcam), Ρ62 (ποντίκι 3 /ρ62 μονοκλωνικό, BD Pharmingen), myc tag (Rat JAC6 μονοκλωνικά, Abd Serotec [πειράματα TBK1 coIP] ή Mouse 4Α6 μονοκλωνικά, Millipore [πειράματα pulldown GST]), c-Rel (Rabbit πολυκλωνικά, 4727, Cell σηματοδότηση Τεχνολογίας), ΚεΙΑ (Rabbit μονοκλωνικό C22B4, Cell σηματοδότηση Τεχνολογίας), α-τουμπουλίνης (Mouse μονοκλωνικό DM1A, Sigma), ΗΑ ( αρουραίο μονοκλωνικό 3F10, Roche), GST (GST-2 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, Sigma), Optineurin (πολυκλωνικός Item no. 100000, Cayman Chemical), K-Ras (Mouse μονοκλωνικό 3B10-2F2, Sigma). Αντι-φωσφο-S403-Ρ62 ήταν ένα είδος δώρο του Nobuyuki Nukina (RIKEN, Ιαπωνία). Φωσφο-ειδικά αντισώματα για να IRF3, ΚεΙΑ και JNK ελήφθησαν από την Cell Technology σηματοδότηση.

siRNA Η επιμόλυνση

Στην πιάτα 35 mm, 0.8 × 10

5 Α549 ή 1,2 × 10

5 ΝΟΙ-Η23 απλώθηκαν επί μία νύκτα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν για 8 ώρες με Oligofectamine (Invitrogen) και 10 ηΜ siRNA (Α549) ή 20 ηΜ siRNA (ΝΟΙ-Η23), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.