Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές για castration- και ανθεκτικούς στη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη περιορίζεται και νέες προσεγγίσεις χρειάζονται απεγνωσμένα. πρόσφατα αποτελέσματα μας από μια συστηματική οθόνη ευαισθησία χημική βιολογία καλύπτει πλέον γνωστά φάρμακα και τα μόρια όμοια με φάρμακο έδειξε ότι αλδεΰδη δεϋδρογενάση αναστολέας δισουλφιράμη είναι ένα από τα πιο ισχυρά καρκίνος ειδικών αναστολέων της ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων TMPRSS2-ERG σύντηξης θετικών καρκίνων. Ωστόσο, τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η δισουλφιράμη και μόνο δεν εμποδίζουν την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

ούτε επάγει απόπτωση

in vitro

, υποδεικνύοντας ότι συνδυαστικές προσεγγίσεις μπορεί να απαιτούνται για την ενίσχυση της αντι-νεοπλασματικής επιδράσεις.

Μέθοδοι και Ευρήματα

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια χημική βιολογία οθόνη ευαισθησία των ναρκωτικών για να εξερευνήσετε δισουλφιράμη μηχανιστική λεπτομέρειες και για την ταυτοποίηση ενώσεων ενεργοποίηση του αποτελέσματος της δισουλφιράμης στον TMPRSS2-ERG σύντηξης καρκινικά κύτταρα θετικά του προστάτη. Συνολικά, 3357 ενώσεις συμπεριλαμβανομένων και των υφιστάμενων χημειοθεραπευτικών παραγόντων, καθώς και τα ναρκωτικά όπως τα μικρά μοριακές ενώσεις υποβλήθηκαν σε διαλογή μόνα τους και σε συνδυασμό με δισουλφιράμη. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ανδρογονική και αντιοξειδωτική ενώσεις ανταγωνίστηκε επίδραση disulfiram ενώ οι αναστολείς του υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης, πρωτεασώματος, τοποϊσομεράση II, γλυκοζυλοκεραμίδης συνθετάση ή κυτταρικού κύκλου ήταν μεταξύ των ενώσεων ερεθιστική κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε δισουλφιράμη. Ο συνδυασμός της δισουλφιράμης και ενός αντιαγγειογόνο sunitinib παράγοντα μελετήθηκε με περισσότερες λεπτομέρειες, αφού και οι δύο βρίσκονται ήδη σε κλινική χρήση σε ανθρώπους. Disulfiram-sunitinib επάγεται συνδυασμός απόπτωση και μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης υποδοχέα ανδρογόνου περισσότερο από μία από τις ενώσεις μόνη της. Επιπλέον, συνδυαστική έκθεση μειώνεται μεταστατικό χαρακτηριστικά όπως η μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή 3D κυττάρων καθώς και επαγόμενη από επιθηλιακή διαφοροποίηση εμφανίζεται ως αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης.

Συμπεράσματα

Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας προτείνουν νέες συνδυαστικές προσεγγίσεις για την αναστολή της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων του προστάτη. συνδυασμός δισουλφιράμη-sunitinib προσδιορίστηκε ως ένα από τα ισχυρά συνεργιστική προσεγγίσεις. Από sunitinib μόνος έχει αναφερθεί ότι έχουν έλλειψη αποτελεσματικότητας σε καρκίνο του προστάτη κλινικές δοκιμές, τα αποτελέσματα μας παρέχουν ένα σκεπτικό για νέα συνδυαστική προσέγγιση για τη στόχευση του καρκίνου του προστάτη πιο αποτελεσματικά

Παράθεση:. Ketola K, Kallioniemi O, ILJIN Κ (2012) χημική Βιολογία ναρκωτικά ευαισθησία της οθόνης Προσδιορίζει το sunitinib ως Synergistic Agent με Δισουλφιράμη σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (12): e51470. doi: 10.1371 /journal.pone.0051470

Επιμέλεια: Jun Liu, Johns Hopkins School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 29, 2012? Αποδεκτές: 6 Νοεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 12, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Ketola et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχονται από σχέδιο ΕΕ-PRIMA (σύμβαση # LSHC-CT-204-504587), ο καρκίνος Οργανώσεις της Φινλανδίας, Sigrid Ίδρυμα Juselius και η Ακαδημία της Φινλανδίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η συχνότερη μορφή καρκίνου και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις ανδρικού πληθυσμού στο δυτικό κόσμο [1]. Δεδομένου ότι οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη τελικά καθίστανται ανθεκτικά σε επί του παρόντος υφιστάμενα φάρμακα όπως αντι-ανδρογόνα και αργότερα επίσης σε κυτταροτοξικούς παράγοντες, οι νέες ουσίες και συνδυαστικές προσεγγίσεις χρειάζονται. Έχουμε εκτελέσει πρόσφατα μια βιολογίας ένωση οθόνη χημικά για να ελέγξετε συστηματικά τις ευαισθησίες του 4910 γνωστών φαρμάκων και ναρκωτικών, όπως μικρών μορίων σε μη-κακοήθη και κακοήθη καρκινικά κύτταρα του προστάτη [2]. Αλδεΰδη αφυδρογονάση (ALDH) αναστολέα δισουλφιράμη ήταν μεταξύ τεσσάρων εκλεκτικοί αναστολείς καρκίνου που έχουν αναγνωριστεί αναστολής της ανάπτυξης των καλλιεργημένων TMPRSS2-ERG σύντηξης θετικά κύτταρα VCAP σε συγκέντρωση νανομοριακή καθώς και στη μείωση της ανάπτυξης ξενομοσχευμάτων VCAP

in vivo

[2]. Πρόσφατα, η δυνατότητα αναστολής της αναπτύξεως της δισουλφιράμης στον καρκίνο του προστάτη έχει επιβεβαιωθεί σε ανεξάρτητο υψηλής απόδοσης ένωση οθόνης

in vitro

και ξενομοσχεύματος μελέτες

in vivo

[3], [4].

Δισουλφιράμη είναι ένας αναστολέας ΑΙ_ϋΗ που έχει μακροχρόνια χρησιμοποιηθεί ως αποτρεπτικός παράγοντας αλκοόλ στις κλινικές. Εκτός από τον καρκίνο του προστάτη, δισουλφιράμη έχει επίσης αποδειχθεί ότι έχει αντικαρκινική δράση στο μαστό, μυέλωμα, λευχαιμία, καρκίνο πνεύμονα, του τραχήλου της μήτρας αδενοκαρκίνωμα, μελάνωμα, νευροβλάστωμα και του παχέος εντέρου [5] – [11]. Επί του παρόντος, δισουλφιράμη είναι σε κλινικές δοκιμές σε μεταστατικό μελάνωμα φάσης, σε ορμονοάντοχο καρκίνους του πνεύμονα και με ηπατικές μεταστάσεις (www.clinicaltrials.gov, αναγνωριστικά NCT00256230 και NCT00742911), καθώς και στον καρκίνο του προστάτη (αναγνωριστικό: NCT01118741). Σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα προστάτη, δισουλφιράμη επάγει οξειδωτικό στρες, μειώνει DNA μεθυλοτρανσφεράση (DNMT) δραστηριότητες ALDH και καθώς αναστέλλει την αντιγραφή του DNA [2], [4], [12]. Στον καρκίνο του μαστού, δισουλφιράμη και χαλκού από κοινού έκθεση αναστέλλει δραστικότητα ΝΡ-κΒ, αυξάνει δραστικά είδη οξυγόνου και τον αριθμό των καρκινικών βλαστοκυττάρων (CSC) [13]. Επιπλέον, η αναστολή της δραστικότητας ALDH έχει προταθεί ως ένας πιθανός σημαίνει τον περιορισμό του καρκίνου βλαστικών κυττάρων και να ξεπεράσει την αντίσταση του φαρμάκου [14]. προηγούμενα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι αν και δισουλφιράμη μειωμένη vcap ανάπτυξη των κυττάρων ξενομοσχεύματος περίπου κατά 40%, δεν ήταν σε θέση να εμποδίσει [2]. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν ληφθεί στο ανθρώπινο μεταστατικό καρκίνο στα οστά LNCaP ξενομοσχεύματα C4-2B [4]. Επιπλέον, η έκθεση δισουλφιράμη από μόνη της δεν ήταν αρκετή για να επάγει απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. [2] Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια συνδυαστική οθόνη ευαισθησία σε ERG θετικό καρκίνο του προστάτη κύτταρα για να διερευνήσουν μηχανισμός disulfiram δράσης με περισσότερες λεπτομέρειες. Επιπλέον, ο στόχος ήταν να εντοπίσει πιθανούς παράγοντες συνεργούσα με δισουλφιράμη στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Συνολικά, 3357 ενώσεις που περιλαμβάνουν τις τρέχουσες χημειοθεραπευτικών παραγόντων και φάρμακο σαν μικρές μοριακές ενώσεις μελετήθηκαν μόνα τους και σε συνδυασμό με δισουλφιράμη. Τα μοριακά και φαινοτυπικά αλλαγές διερευνήθηκαν με ένα από τα πιο ισχυρά δισουλφιράμη ευαισθητοποιητής, sunitinib.

Υλικά και Μέθοδοι

Cells

Το

TMPRSS2-ERG

γονιδιακή σύντηξη και AR θετικών καρκινικών κυττάρων του προστάτη γραμμή vcap ελήφθη από τους Drs. Adrie van Bokhoven (Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Κέντρο Επιστημών Υγείας, Denver, Colorado) και Kenneth Pienta (Πανεπιστήμιο του Michigan, Michigan) και αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο ϋυΐββοοο Eagle [15]. καρκίνωμα του προστάτη PC-3 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (LGC Promochem ΑΒ, Borås, Σουηδία) και αναπτύχθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή.

Loess-κανονικοποιημένη CellTiter-Glo καταλήγει με 3.357 ενώσεις σε διαλογή με την απουσία ( άξονας-γ) και παρουσία (χ-άξονας) του δισουλφιράμη (ΕΚ

50 90 ηΜ) σε VCAP κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Κάθε τελεία αντιπροσωπεύει αποτέλεσμα που λαμβάνεται με μία ένωση. Τα σημεία δεδομένων που χαρακτηρίζονται ως δισουλφιράμη ευαισθητοποίηση (τετράγωνα κάτω από τη γραμμή τάσης) και διάσωση (τρίγωνα πάνω από την γραμμή τάσης) Οι ενώσεις αναφέρεται. Αποτέλεσμα με sunitinib υποδεικνύεται με ένα βέλος.

Η

Ενώσεις

Δισουλφιράμη αγοράστηκε από την Fluka (Μόναχο, Γερμανία) και αραιώνονται σε DMSO. Sunitinib αγοράστηκε από LC Laboratories (Woburn, USA) και αραιώνονται σε DMSO.

Η

υψηλής απόδοσης Ένωση Ευαισθησία

οθόνης

Ένα υψηλής απόδοσης οθόνη ένωση ευαισθησία με τη βιβλιοθήκη του 3357 ενώσεων μόνο και σε συνδυασμό με δισουλφιράμη διεξήχθη σε κύτταρα VCAP. Η βιβλιοθήκη περιλαμβάνονται τρέχουσα χημειοθεραπευτικά και μικρές μοριακές ενώσεις της ένωσης βιβλιοθηκών εμπορικών LOPAC (1.280 υφιστάμενες Food and Drug Administration-εγκεκριμένα φάρμακα και άλλες ενώσεις με φαρμακολογικά σχετικές δομές? 1 και 0,1 mmol /L), Microsource Spectrum (2.000 ενώσεις συμπεριλαμβανομένων των περισσότερων της γνωστής φαρμάκων και άλλων βιοδραστικών ενώσεων και φυσικών προϊόντων? 1 και 0,1 mmol /L), και ένα inhouse βιβλιοθήκη (77 πειραματικές ενώσεις? 10, 1 και 0,1 μmol /L). Στην οθόνη, χρησιμοποιήθηκε ΕΚ

50 τιμή του δισουλφιράμη (90 ηΜ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από επώαση 3 ημερών με χρήση CellTiter-Glo (CTG) δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας φθορισμού (Promega, Inc.). Τα αποτελέσματα κυτταρικής βιωσιμότητας ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα loess μέθοδο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [2]. Οι ενώσεις που χαρακτηρίζονται ως χτυπά ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων κατά τουλάχιστον τρεις τυπικές αποκλίσεις από τη μέση τιμή των ελέγχων DMSO.

Η

Κυττάρων Η βιωσιμότητα και η απόπτωση Αναλύσεις

δοκιμασίες

Η βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση πραγματοποιήθηκαν επί 384 φρεατίων (Falcon). 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο απλώθηκαν σε 35 μΐ των αντίστοιχων μέσων ανάπτυξης τους και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. Ενωση αραιώσεων προστέθηκαν στα κύτταρα σε 15 μΐ και επωάστηκαν για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας CTG (Promega, Inc.). Επαγωγή της κασπάσης-3 και 7 δραστηριότητες ανιχνεύθηκε με ομοιογενή Αρο-ΕΝΑ δοκιμασία (Promega, Madison, WI). δοκιμασίες βιωσιμότητας κυττάρου και απόπτωση Στη συνέχεια διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, στη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας, 25 μΐ αντιδραστηρίου ενεργοποιημένης CTG προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, το τρυβλίο επωάστηκε για 30 λεπτά σε RT /150 rpm και το σήμα φωταύγειας (700 nm) μετρήθηκε ποσοτικά με τη χρήση Envision Multilabel Plate Reader (Perkin- Elmer, Massachusetts, ΜΑ). Για τη δοκιμασία απόπτωσης, 25 μΐ μέσου λήφθηκε από από κάθε φρεάτιο και 25 μΐ αντιδραστηρίου ApoONE προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα επωάστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και το φθορισμομετρική σήμα (διέγερση FITC 499 nm, εκπομπή 521 FITC nm) μετρήθηκε ποσοτικά με τη χρήση Envision Multilabel Plate Reader. Η μέση φωταύγεια ή φθορισμομετρική σήμα από τα φρεάτια έξι πανομοιότυπα ένωση αντιμετωπίζονται χωρίστηκαν από το μέσο όρο του σήματος ελέγχου του οχήματος έξι DMSO αντιμετωπίζονται πηγάδια για να καθορίσει φορές αλλαγές.

Σχετική κυτταρική βιωσιμότητα αποτελέσματα Α) vcap και Β) PC- 3 κύτταρα καρκίνου προστάτη, καθώς και σε μη-κακοήθη C) κύτταρα RWPE-1 και D) EP156T. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν την στατιστική σημαντικότητα: *, Ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? και ***, Ρ & lt?. 0.005

Η

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα κριτήρια χτύπημα στην ένωση οθόνη (σκορ κάτω από -3 SD από τη μέση) αντιστοιχεί σε μία τιμή Ρ & lt ? 0,01. Οι στατιστικές αναλύσεις όλων των αποτελεσμάτων έγιναν με τη χρήση t-test του Student. Αυτά τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Οι ακόλουθες τιμές Ρ χρησιμοποιήθηκαν για να δείξουν στατιστική σημαντικότητα: *, Ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? και ***, Ρ & lt?. 0.005

Προσδιορισμός των Συνδυαστική Drug Effects

Η φύση της αλληλεπίδρασης και ο βαθμός συνέργειας μεταξύ δισουλφιράμη και sunitinib αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του δείκτη συνδυασμού [16]. Η εξάρτηση από την συγκέντρωση του αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα προσδιορίστηκε για τις δύο ενώσεις, είτε μόνες τους ή σε συνδυασμό. Το κλάσμα που επηρεάζεται (Fa) ορίστηκε ως το κλάσμα των κυττάρων που επηρεάζονται από την δεδομένη συγκέντρωση ενώσεις μόνες ή σε συνδυασμό. Fa = 0 προσδιορίστηκε με βάση τον έλεγχο DMSO και Fa = 1 για σταυροσπορίνη (1 μΜ) απάντηση (δεν υπάρχουν βιώσιμα κύτταρα αριστερά). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK), και ο δείκτης συνδυασμού (CI) υπολογίστηκε από τις γραφικές παραστάσεις διάμεσο αποτέλεσμα σύμφωνα με την εξίσωση CI = (D) 1 /(DX) 1+ (D) 2 /( DX) 2, όπου (DX) 1 και (DX) 2 είναι οι συγκεντρώσεις των ενώσεων D1 και D2 που απαιτούνται για την παραγωγή ενός δεδομένου επιπέδου αντιπολλαπλασιαστική επίδραση όταν χρησιμοποιείται μόνο του, ενώ (D) 1 και (Δ) 2 είναι οι συγκεντρώσεις τους που παράγουν το ίδιο αποτέλεσμα όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό. Ένας δείκτης συνδυασμός 0.9-1.1 δείχνει προσθετική αλληλεπίδραση, τιμές κάτω του 0,9 δείχνουν συνέργεια, και τις αξίες πάνω από 1.1 δείχνουν ανταγωνισμό.

Α) η μορφολογία των κυττάρων ως απάντηση σε δισουλφιράμη (1 μΜ) και sunitinib (5 μΜ) ανοίγματα μόνη της και σε συνδυασμό. Β) Παρουσίαση του δείκτη συνδυασμού (CI) και το κλάσμα των κυττάρων επηρεάζεται (Fa) από την ένωση των ανοιγμάτων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (500 nM, 1 μΜ, 5 μΜ και 10 μΜ) σε vcap κύτταρα καρκίνου του προστάτη. τιμές CI για κάθε συγκέντρωση: 500 μΜ: 0,92, 1 μΜ: 0.19, 5 μΜ: 0.21, 10 μΜ: 0.40. Γ) κασπάσης 3/7 δραστηριότητες σε απάντηση ένωση ανοίγματα. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν την στατιστική σημαντικότητα:. ***, P & lt? 0.005

Η

RNA Εξόρυξη και Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφάσης

Το συνολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αντίστροφη μεταγραφή με τη χρήση 500 ng ολικού RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κιτ σύνθεσης Applied Biosystems cDNA. TaqMan διερευνητές γονιδιακή έκφραση και εκκινητές από τον ανιχνευτή Βιβλιοθήκη καθολική (Roche Diagnostics, Espoo, Finland) χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη του υποδοχέα ανδρογόνων (AR), ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA), ERG, MYC και mRNA έκφραση β-ακτίνης. Οι αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ Prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ο ποσοτικός προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του

μέθοδο ΔΔCT με RQ μάνατζερ 1.2 λογισμικό (Applied Biosystems). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Μέσος όρος έκφραση των δειγμάτων ελέγχου DMSO εκτεθεί θεωρήθηκε για τον υπολογισμό της πτυχής αλλαγές. Δύο έως τέσσερα πανομοιότυπα δείγματα μελετήθηκαν για ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA.

Ανάλυση και Western Blot Υποκυτταρική Proteome Εκχύλιση

Για εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση κηλίδος Western, τα κύτταρα Vcap απλώθηκαν σε 70% συρροή και αριστερά για να συνδέσετε τη διάρκεια της νύχτας πριν από θεραπείες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (62,5 mM Tris, 1% SDS, 5%, β-μερκαπτοαιθανόλη, 10% γλυκερόλη και μπλε βρωμοφαινόλης). Τρία αντιγραφόμενη δείγματα μελετήθηκαν για ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών. Χρησιμοποιήθηκαν ειδικά αντισώματα αναγνωρίζουν AR (1:1000 αραίωση, μονοκλωνικό ποντικού, Labvision, Fremont, CA) ή PSA (1:1000, κουνελιού πολυκλωνικό, DakoCytomation, Δανία). β-ακτίνης (1:4000, μονοκλωνικό ποντικού, Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Σήματα ανιχνεύθηκαν με 1:4000 αραιώσεις των κατάλληλων δευτερογενή αντισώματα συζευγμένο με HRP (όλα από την Invitrogen Molecular Probes, Carlsbad, CA) ακολουθούμενο από οπτικοποίηση με την ενισχυμένη αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). Τα λαμβανόμενα σήματα πυκνομετρικώς αναλύθηκαν με GeneTools λογισμικού (SynGene, Συνοπτικοί Ltd, Cambridge, UK).

Η έκφραση του Α) AR, Β) PSA, Γ) ERG, D) MYC mRNA σε απάντηση δισουλφιράμη ( DSF) και sunitinib (Su) ανοίγματα μόνη της και σε συνδυασμό. Ε) AR και PSA έκφραση πρωτεΐνης σε απόκριση προς την ένωση ανοίγματα μόνα και σε συνδυασμό. ΣΤ) Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης πρωτεϊνών AR σε απάντηση των 6 και 24 ώρες ένωση ανοίγματα. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν την στατιστική σημαντικότητα: *, Ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? και ***, Ρ & lt?. 0.005

Η

E-cadherin (κόκκινο) και F-ακτίνη (κίτρινο) εκφράσεις ως απάντηση στην ένωση θεραπείες. DNA χρωματίσθηκε με DAPI (μπλε).

Η

ανοσοφθορισμού

χρώση ανοσοφθορισμού των κυττάρων VCAP διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εικόνες ελήφθησαν με 63 × μεγέθυνση χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Γερμανία).

Επούλωση Δοκιμασία

Η επίδραση της δισουλφιράμης (1 μΜ) και sunitinib (5 μΜ) μόνο και σε συνδυασμό για τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη μελετήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία επούλωση της πληγής. κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων (Έσσεν ImageLock, Έσσεν Όργανα, Birmingham, UK) και μια πληγή ήταν γδαρμένο με μασητικό τραύμα (Έσσεν Instruments). Ενώσεις και οι κατάλληλοι έλεγχοι προστέθηκαν αμέσως μετά το τραύμα ξύσιμο και συμβολή του τραύματος παρακολουθείται με σύστημα Incucyte Ζωντανή-Cell απεικόνισης και λογισμικού (Έσσεν Instruments). Το κλείσιμο της πληγής μετρήθηκε κάθε ώρα για 24 ώρες, συγκρίνοντας τη μέση πυκνότητα σχετική πληγή τριών βιολογικών επαναλήψεις σε κάθε πείραμα.

Τα κύτταρα απεικονίστηκαν αυτόματα μία φορά κάθε ώρα μετά το ξύσιμο του τραύματος. Τραύματος αποτέλεσμα κλείσιμο υπολογίστηκε ως συρροή τραυμάτων σε απόκριση 6-, 12- και 24 h ανοιγμάτων των ενώσεων Α) Επούλωση πληγών σε απόκριση προς την ένωση ανοιγμάτων για 24 ώρες. Μαύρο περιοχή αντιπροσωπεύει τις άκρες της πληγής στην αρχή της δοκιμασίας. Β) Ποσοτικοποίηση των κυττάρων που εισέρχονται στην περιοχή της πληγής. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν την στατιστική σημαντικότητα: *, Ρ & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? και ***, Ρ & lt?. 0.005

Η

Α) η μορφολογία των κυττάρων σε δοκιμασία σφαιροειδές 3D σε απάντηση ένωση ανοίγματα. Β) Η περιοχή των κυττάρων στις εικόνες Incucyte (% της συνολικής έκτασης) ως απάντηση στην ένωση θεραπείες. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν την στατιστική σημαντικότητα:. *, Ρ & lt? 0,05

Η

3D Δοκιμασία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 3D στο Matrigel σε μη επικαλυμμένα αγγειογένεση μ-slides (Ibidi Gmbh, Γερμανία). Τα κάτω φρεάτια πληρώθηκαν με 10 μΙ Matrigel (50%) σε μέσο καλλιέργειας και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε 37 ° C. Τα κύτταρα (1000 κύτταρα /φρεάτιο) στη συνέχεια επιστρώθηκαν και αφήστε να προσκολληθούν για 1-2 ώρες σε 37 ° C. Το δεύτερο στρώμα του Matrigel σε μέσο καλλιέργειας (25%) προστέθηκε και οι πλάκες επωάστηκαν σε 37 ° C. Δισουλφιράμη (1 μΜ), sunitinib (5 μΜ) ή δισουλφιράμης-sunitinib συνδυασμό προστέθηκε μετά από 4 ημέρες επώασης και διατηρείται για έως και 7 ημέρες. Σφαιροειδή παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο από την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων (Incucyte, Έσσεν Όργανα? 10 × στόχος), αποκτώντας 1 εικόνα /h. Η περιοχή των 3D δομών στις εικόνες συγκρίθηκε με τη συνολική έκταση της εικόνας (σε ποσοστά) για την ποσοτικοποίηση πιθανές επιδράσεις των ενώσεων στην κυτταρική ανάπτυξη.

Αποτελέσματα

ένωση Chemical Biology ευαισθησία της οθόνης Προσδιορίζει Synergistic παράγοντες με δισουλφιράμη

προσέγγισης ένωση οθόνη Chemical Biology χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη του μηχανισμού της δισουλφιράμης μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη και να διερευνήσει τις δυνατότητες συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις των δισουλφιράμη και διαλογή ενώσεων. Βιβλιοθήκη 3357 ενώσεων που περιλαμβάνουν τα περισσότερα από τα γνωστά φάρμακα και φάρμακα όπως τα μικρά μοριακές ενώσεις σαρώθηκε μόνο και σε συνδυασμό με δισουλφιράμη σε VCAP κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματα κυτταρικής βιωσιμότητας σε απουσία (μάρτυρας DMSO) ή παρουσία δισουλφιράμης (ΕΚ

50, 90 ηΜ) συγκρίθηκαν. Όπως ήταν αναμενόμενο, αρκετές ενώσεις ανέστειλαν την ανάπτυξη των κυττάρων VCAP (Εικ. 1). Ωστόσο, μόνο 15 ενώσεις έδειξαν αποτέλεσμα συνδυασμού με δισουλφιράμη. Συνολικά, έξι ενώσεις ευαισθητοποιημένα κύτταρα Vcap να δισουλφιράμη: θρεο-1-φαινυλ-2-δεκανοϋλαμίνο-3-μορφολινο-1-προπανόλη, bortezomib, υδροχλωρική CGP-74514A, υδροχλωρική επιρουβικίνη, φορβόλη 12-μυριστική 13-οξική και sunitinib ( Τραπέζι 1). Σε αντίθεση, 9 ενώσεις διασώθηκε επάγεται δισουλφιράμη αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα (Πίνακας 2). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι ενώσεις αυτές περιλαμβάνονται ανδρογόνες ενώσεις 4-ανδροστενο-3,17-διόνη, 5-άλφα-ανδροστανο-3-άλφα, 17-βήτα-διόλης και ανδροστερόνη, καθώς και αντιοξειδωτικό ασταξανθίνη. Έτσι, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δισουλφιράμη μειωμένος πολλαπλασιασμός των κυττάρων μπορεί να ανταγωνίζεται με την ενεργοποίηση των ανδρογόνων ή αντιοξειδωτικά. Επιπλέον, PKC ενεργοποιητής φορβόλη 12-μυριστική 13-οξική ήταν μεταξύ φάρμακα ευαισθητοποιήσεως επίδραση δισουλφιράμη και PKC αναλογικό απενεργοποιητή δεκαλίνιο, C-14 συνδετήρα, ήταν μεταξύ των ναρκωτικών διάσωση επίδραση δισουλφιράμη, υποδεικνύοντας ότι PKC μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην απόκριση δισουλφιράμη. Επιπλέον, το αποτέλεσμα δισουλφιράμη μπορεί να ενισχυθεί μέσω της αναστολής των κινασών τυροσίνης υποδοχέα, πρωτεασώματος, τοποϊσομεράση II, γλυκοζυλοκεραμίδης συνθετάση ή του κυτταρικού κύκλου (Πίνακας 1) ενώ η αναστολή του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα δεν φαίνεται να είναι ένας ισχυρός στρατηγική για την ενίσχυση της επίδρασης του δισουλφιράμη (Πίνακας 2).

το sunitinib και δισουλφιράμη της ταυτόχρονης θεραπείας Εμφάνιση συνεργία

Είναι ενδιαφέρον, το sunitinib, ένα αντι-αγγειογενετική παράγοντα, ενίσχυσε την επαγόμενη δισουλφιράμη ανάπτυξη-ανασταλτική δράση. Το sunitinib αναστέλλει τη δράση των πολλαπλών κινασών τυροσίνης όπως VEGFR-1, -2 και -3, ΡϋΟΡΡ-α και -β, c-Kit, Ret και Flt-3 [17]. Έχει αποδειχθεί ότι έχει αντι-νεοπλασματικές ιδιότητες σε μία ποικιλία κακοηθειών όπως ηπατοκυτταρικό καρκίνο, νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος, και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Sunitinib έχει την άδεια να μεταστατικό νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και όγκων του γαστρεντερικού [18] – [20]. Στον καρκίνο του προστάτη, το sunitinib μειώνει σημαντικά την ανάπτυξη του ευνουχισμού ανθεκτικών καρκίνο του προστάτη, τόσο σε προκλινικές και κλινικές ρυθμίσεις [21], [22]. Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη φάσης ΙΙΙ του sunitinib σε καρκίνο του προστάτη απέτυχε λόγω έλλειψης αποτελεσματικότητας σε ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (αναγνωριστικό: NCT00676650). Από το sunitinib έχει ήδη μελετηθεί σε κλινικές δοκιμές σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, επιλέχθηκε ο συνδυασμός sunitinib-δισουλφιράμη για περαιτέρω

in vitro

μελέτες.

Για την επικύρωση της συνδυαστικής αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του sunitinib σε προστάτη καρκινικά κύτταρα, η επίδραση της δισουλφιράμης και μόνο και σε συνδυασμό sunitinib μελετήθηκε σε VCAP και PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δισουλφιράμη και sunitinib κοινού έκθεση μειώνεται κυτταρικής βιωσιμότητας VCAP περισσότερο από είτε από τις ενώσεις μόνη της (σχ. 2Α). Σε κύτταρα PC-3, το αντι-πολλαπλασιαστική δράση παρατηρήθηκε μόνο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις σε απόκριση sunitinib ή δισουλφιράμης-sunitinib συν-έκθεσης (Σχ. 2Β). Για να προσδιοριστεί εάν η συνέργεια σε κύτταρα VCAP προκαλείται απλώς λόγω της αυξημένης κυτταροτοξικότητας, η επίδραση της δισουλφιράμης, sunitinib ή δισουλφιράμης-sunitinib κοινού έκθεση μελετήθηκε σε μη κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα RWPE-1 και EP156T προστάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε μόνο συγκέντρωση στο υψηλότερο (10 μΜ) σε RWPE-1 και κύτταρα EP156T (Σχ. 2C και D), υποδεικνύοντας ότι η αύξηση του συνολικού κυτταρική τοξικότητα δεν εξηγεί την συνδυαστική απόκριση σε κύτταρα VCAP.

για να συγκριθούν τα αποτελέσματα της δισουλφιράμης (1 μΜ) και sunitinib (5 μΜ) μόνο και σε συνδυασμό επί κυτταρική μορφολογία VCAP, διεξήχθη ανάλυση Incucyte ζωντανό κύτταρο. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ενώσεις για 48 ώρες. Σαφείς μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν σε απάντηση σε όλες τις σύνθετες ανοίγματα (Εικ. 3Α). Ειδικότερα, το sunitinib προκαλούνται στα κύτταρα να επισυνάπτει σε κάθε άλλο αφού δεν μεμονωμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν σε sunitinib κύτταρα έκθεσης. Σε απάντηση της δισουλφιράμης sunitinib συν-θεραπεία, τα κύτταρα συνδυάζονται επίσης με το άλλο, αλλά δεν υπήρχε σαφώς λιγότερο βιώσιμα κύτταρα τα αριστερά (Σχ. 3Α). δείκτη συνδυασμού (CI) προσδιορίστηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις φαρμάκου (500 ηΜ, 1 μΜ, 5 μΜ και 10 μΜ) με βάση κυτταρικής βιωσιμότητας αποτελέσματα σε κύτταρα VCAP. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δισουλφιράμη και sunitinib έδειξε συνέργεια σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (CI & lt? 1) (Εικ. 3Β). Οι χαμηλότερες τιμές CI-παρατηρήθηκαν σε συγκεντρώσεις 1 μΜ και 5 μΜ (CI 0,19 και 0,21). συγκέντρωση του sunitinib 5 μΜ επιλέχθηκε για περαιτέρω πειράματα συνδυασμό με βάση CI και η κυτταρική βιωσιμότητα αποτελέσματα καθώς και τα προηγούμενα sunitinib

in vitro

μελέτες σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [23] – [25].

sunitinib και δισουλφιράμη της ταυτόχρονης θεραπείας προκαλεί απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη

Για να προσδιορίσετε αν δισουλφιράμη και sunitinib έκθεση επάγει την απόπτωση, κασπάσης 3 και 7 δραστηριότητες προσδιορίστηκαν με ποσοτική φθορομετρική δοκιμασία. δραστικότητα κασπάσης μετρήθηκε σε απόκριση σε δισουλφιράμη (1 μΜ) και sunitinib (5 μΜ) έκθεση για 48 ώρες μόνα τους και σε συνδυασμό σε κύτταρα VCAP. Είναι ενδιαφέρον, ούτε δισουλφιράμη ούτε sunitinib και μόνο ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση. Ωστόσο, μια σημαντική επαγωγή απόπτωσης παρατηρήθηκε σε απόκριση θεραπείας συνδυασμού δισουλφιράμη-sunitinib (Σχ. 3C). Στο σύνολό τους, sunitinib δείχνει συνεργιστική ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης με δισουλφιράμη και ο συνδυασμός αυτών των δύο ενώσεων να διεγείρει απόπτωση πάνω από μία από τις ενώσεις μόνη της.

Sunitinib Μειώνει την έκφραση του υποδοχέα ανδρογόνου (AR), ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA ), ERG και MYC στην ERG καρκινικά κύτταρα θετικά του προστάτη

για να προσδιορίσει τα πρώτα μοριακές αλλαγές σε απάντηση δισουλφιράμη και sunitinib, η έκφραση του mRNA του καρκίνου του προστάτη ογκογονιδίων AR, PSA, ERG και MYC μελετήθηκε σε δισουλφιράμη (1 μΜ ), το sunitinib (5 μΜ) ή δισουλφιράμης-sunitinib συν-εκτεθειμένα κύτταρα vcap σε 3-σημείο μίας ώρας. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το sunitinib μειωθεί σημαντικά AR, PSA, ERG και τα επίπεδα MYC (περίπου κατά 40%), ενώ η δισουλφιράμη μόνο του δεν είχε σημαντική επίδραση (Σχ. 4Α, Β, Γ και Δ). Τα αποτελέσματα με δισουλφιράμη είναι σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας [2]. Ωστόσο, δεν υπήρχαν ενδείξεις για μια συνδυαστική επίδραση της δισουλφιράμης και sunitinib στη μείωση του έκφραση αυτών των ογκογονιδίων σε επίπεδο mRNA.

Για να διαπιστώσετε εάν οι αλλαγές μπορούν να ανιχνευθούν σε επίπεδο πρωτεΐνης, AR μελετήθηκε ως απάντηση στην πλέον ανοίγματα (6 και 24 ώρες) της δισουλφιράμης και sunitinib μόνο και σε συνδυασμό. Είναι ενδιαφέρον, μόνο μία ελαφρά μείωση του AR παρατηρήθηκε σε απάντηση sunitinib και μόνο, και όχι μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης AR παρατηρήθηκε σε απάντηση μόνος δισουλφιράμη. Ωστόσο, μια σαφής μείωση της πρωτεϊνικής έκφρασης AR (20 και 50%) παρατηρήθηκε σε απάντηση στην έκθεση συνδυασμός της δισουλφιράμης και sunitinib σε 6- και 24-ωρη χρονικά σημεία (Σχ. 4Ε και F). Επιπλέον, παρατηρήθηκε παρόμοια μείωση στο AR επίπεδα πρωτεΐνης ρυθμιζόμενης PSA (Εικ. 4Ε). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το sunitinib μειώνει σηματοδότηση των ανδρογόνων στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη ειδικά όταν συνδυάζεται με δισουλφιράμη. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω ανάλυση προκειμένου να διαπιστωθεί αν δισουλφιράμη και δρουν συνεργικά sunitinib μέσω σηματοδότησης ανδρογόνων.

Δισουλφιράμη και του sunitinib της ταυτόχρονης θεραπείας Προκαλεί E-cadherin Έκφραση

Τα αποτελέσματα από μικροσκοπική ανάλυση των κυττάρων μορφολογία πρότεινε ότι τα κύτταρα vcap ήταν περισσότερο συνδέονται μεταξύ τους σε απόκριση είτε sunitinib ή δισουλφιράμης και sunitinib συν-έκθεση σε σύγκριση με την έκθεση δισουλφιράμη μόνο (Σχ. 3Α). Για να προσδιοριστεί κατά πόσο αυτές οι φαινότυποι ήταν λόγω της επαγωγής του μορίου κυτταρικής προσκόλλησης Ε-καδερίνης, ανοσοχημική χρώση διεξήχθη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δισουλφιράμη και sunitinib ταυτόχρονης θεραπείας έκφραση επάγεται Ε-καδερίνης περισσότερο από είτε από τις ενώσεις μόνο (Εικ. 5). E-cadherin είναι κοινώς γνωστός δείκτης για τη διαφοροποίηση των καρκινικών κυττάρων και είναι προς τα κάτω ρυθμισμένη σε διηθητικό καρκίνωμα του προστάτη [26]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η επαγωγή της έκφρασης Ε-καδερίνης σχετίζεται με μειωμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ERG θετικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη VCAP [27], [28]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μορφολογικά φαινότυπο δει σε απάντηση sunitinib-δισουλφιράμη της ταυτόχρονης θεραπείας συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση Ε-καντερίνης vcap καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Δισουλφιράμη και του sunitinib της ταυτόχρονης θεραπείας μειώνει τον καρκίνο του προστάτη κυττάρων Μετανάστευση

Για να μελετήσουμε αν δισουλφιράμη και sunitinib της ταυτόχρονης θεραπείας επηρεάζει προστάτη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, δοκιμασία ζωντανή κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων έγινε. Στον προσδιορισμό, PC-3 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μοντέλο καρκίνου του προστάτη, εφόσον τα κύτταρα Vcap δεν μεταναστεύουν σε αυτή τη δοκιμασία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δισουλφιράμη-sunitinib κοινού έκθεση μειωμένη κυτταρική μετανάστευση περισσότερα από είτε μία από τις ενώσεις μόνο (Εικ. 6). Η μετανάστευση μειώθηκε σημαντικά σε δισουλφιράμη και sunitinib συν-εκτεθειμένες προστάτη καρκινικών κυττάρων σε 12- και 24-ωρη χρονικά σημεία (κατά 20 και 30% σε σύγκριση με τον έλεγχο DMSO). Σημαντική μείωση στη μετανάστευση των κυττάρων παρατηρήθηκε επίσης σε δισουλφιράμη και sunitinib εκτίθενται τα κύτταρα σε 24-ωρη χρονικό σημείο (Εικ. 6Β). PC-3 συρροή κυττάρων δεν μειώθηκε σημαντικά σε αυτά τα χρονικά σημεία, υποδεικνύοντας ότι η μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης δεν έχει ως αποτέλεσμα, λόγω μειωμένης κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Σχήμα S1). Έτσι, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δισουλφιράμη-sunitinib συν-έκθεσης μειώνει τον καρκίνο του προστάτη κυτταρική μετανάστευση περισσότερο από μία από τις ενώσεις μόνη της.

Δισουλφιράμη και του sunitinib συνδυασμός μειώνει τον καρκίνο του προστάτη κυττάρων Εισβολή σε 3D Πολιτισμού

Η επίδραση της δισουλφιράμης και sunitinib της ταυτόχρονης θεραπείας μελετήθηκε σε PC-3 μοντέλο σφαιροειδές 3D [29]. Τα σφαιροειδή αναπτύχθηκαν σε Matrigel για 4 ημέρες και δισουλφιράμη (1 μΜ) και sunitinib (5 μΜ) μόνο και σε συνδυασμό προστέθηκαν στα κύτταρα και η κυτταρική μορφολογία παρακολουθήθηκε επί 7 ημέρες χρησιμοποιώντας απεικόνιση ζωντανών κυττάρων. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 7. Disulfiram μόνη της ήταν σε θέση να μειώσει τα κύτταρα από την εισβολή 3D δομή, αλλά δεν ήταν σε θέση να μειώσει την ανάπτυξη των κυττάρων μέσα στον αυλό (Εικ. 7Α). Σε αντίθεση, τα σφαιροειδή αντιμετωπίζονται sunitinib ήταν μικρότερα, ενώ κυττάρων εισβολής δεν έχει αποκλειστεί. Είναι ενδιαφέρον ότι η θεραπεία συνδυασμού μείωσε το ύψος των προεξοχών επεμβατική, καθώς και το μέγεθος των σφαιροειδών. Η περιοχή των κυττάρων στις εικόνες (% της συνολικής έκτασης) σε απόκριση προς την ένωση θεραπείες για 7 ημέρες σε 3D παρουσιάζεται στο Σχήμα 7Β. Στο σύνολό τους, δισουλφιράμη-sunitinib της ταυτόχρονης θεραπείας μειώνεται προστάτη εισβολή των καρκινικών κυττάρων και την ανάπτυξη στο μοντέλο σφαιροειδές 3D.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια χημική βιολογία οθόνη ένωση ευαισθητοποίηση για τη μελέτη αφυδρογονάση αλδεΰδη (ALDH ) μηχανισμό αναστολέας δισουλφιράμη της δράσης και για τον εντοπισμό δυνητικών συνεργιστική παράγοντες για δισουλφιράμη σε TMPRSS2-ERG καρκινικά κύτταρα θετικά του προστάτη. Σύνολο 3.357 ενώσεων συμπεριλαμβανομένης της τρέχουσας χημειοθεραπευτικών και μικρές μοριακές ενώσεις υποβλήθηκαν σε διαλογή μόνα τους και σε συνδυασμό με δισουλφιράμη και τη συνεργιστική μηχανισμό δισουλφιράμη ευαισθητοποιητή sunitinib μελετήθηκε με περισσότερες λεπτομέρειες.

Τα αποτελέσματα από την υψηλής απόδοσης συνδυαστική οθόνη έδειξε ότι αρκετές ανδρογόνο ενώσεις, καθώς και ένα αντιοξειδωτικό ασταξανθίνη ήταν μεταξύ των ενώσεων διάσωση δισουλφιράμης επάγεται αντι-πολλαπλασιαστική δράση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. προηγούμενα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι προκαλούμενη δισουλφιράμη οξειδωτικό στρες σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. [2] Disulfiram αυξάνει τα επίπεδα ROS επίσης σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [13]. Έτσι, η επίδραση των αντιοξειδωτικών διάσωση ασταξανθίνης σε δισουλφιράμη εκτεθειμένα κύτταρα υποστηρίζει τα προηγούμενα αποτελέσματα που δείχνουν ότι η δισουλφιράμη μειωμένος πολλαπλασιασμός των κυττάρων διαμεσολαβείται μέσω επαγωγή του οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα διαλογής πρότειναν επίσης ότι PKC παίζει ένα ρόλο στην απόκριση δισουλφιράμη αφού PKC ενεργοποιητής φορβόλη 12-μυριστική 13-οξική ήταν μεταξύ φάρμακα ευαισθητοποιήσεως στην επίδραση δισουλφιράμη ενώ αναλογικό PKC απενεργοποιητή δεκαλίνιο, C-14 συνδετήρα διασώζονται επίδραση δισουλφιράμη στην οθόνη. Επιπλέον, η αναστολή των κινασών τυροσίνης υποδοχέα, πρωτεασώματος, τοποϊσομεράση II, γλυκοζυλοκεραμίδης συνθετάση μπορεί να είναι εναλλακτικούς τρόπους για την ενίσχυση της επίδρασης disulfiram ενώ η αναστολή του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα έχει αντίθετο αποτέλεσμα. Μία από τις έξι ενώσεις ευαισθητοποίηση κυττάρων Vcap να disulfiram επάγεται αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση ήταν αντιαγγειογόνο παράγοντα, τυροσίνη-πρωτεΐνη υποδοχέα κινάσης αναστολέα sunitinib. Το sunitinib είναι ένα αντικαρκινικό φάρμακο που είναι κλινικά χρησιμοποιείται για τη θεραπεία μεταστατικού καρκινώματος νεφρικών κυττάρων και ασθενείς με καρκίνο του γαστρεντερικού. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι έχουν αντι-νεοπλασματική δραστικότητα σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο, νευροενδοκρινείς όγκους του παγκρέατος, και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [18] – [20].