Αφηρημένο

IL-10 συνδέεται με κακοήθεια του όγκου μέσω του ανοσοποιητικού διαφυγής. Υποθέσαμε ότι η IL-10 απλότυποι κατηγοριοποιούνται από πολυμορφισμούς προαγωγέα IL-10 σε -1082A & gt? G, -819C & gt? Τ, και -592C & gt? Α θα μπορούσαν να επηρεάσουν την IL-10 έκφραση και οδηγούν σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), οι ασθενείς με άσχημα αποτελέσματα και υποτροπής. Συλλέξαμε παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από 385 ασθενείς με NSCLC για τον προσδιορισμό IL-10 απλότυποι με άμεση αλληλούχιση και αλύσου πολυμεράσης περιορισμός αντίδραση μήκους θραύσματος πολυμορφισμού (PCR-RFLP). Από τους 385 όγκους, 241 ήταν διαθέσιμα για να αξιολογήσει τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IL-10 με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Η επίδραση της IL-10 απλοτύπων στη συνολική επιβίωση (OS) και υποτροπής επιβίωση χωρίς (RFS) καθορίστηκαν με Kaplan-Meier και πολυπαραγοντική ανάλυση Cox παλινδρόμησης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα IL-10 mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα σε όγκους με τον απλότυπο μη-ATA ό, τι με τον απλότυπο ΑΤΑ (Ρ = 0,004). Οι ασθενείς με την απλότυπος μη-ATA είχαν μικρότερο λειτουργικό σύστημα και τις περιόδους RFS από ό, τι οι ασθενείς με τον απλότυπο ΑΤΑ. Αυτό μπορεί να σχετίζεται με την παρατήρηση ότι ο αριθμός των λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο μειώθηκε στους όγκους με υψηλότερα επίπεδα IL-10. Σταθερά, τα Τ κύτταρα από το περιφερικό αίμα των ασθενών με μη-ATA απλότυπος ήταν περισσότερο επιρρεπή σε απόπτωση και λιγότερο κυτταροτοξική σε καρκινικά κύτταρα, σε σύγκριση με εκείνους από τους ασθενείς με ΑΤΑ απλότυπο. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η IL-10 μπορεί να προάγει την κακοήθεια όγκων μέσω προαγωγή απόπτωσης των Τ κυττάρων και την επιβίωση των κυττάρων του όγκου, και IL-10 απλότυπο αξιολογήθηκε με PCR-RFLP ή άμεση αλληλούχιση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλεφθεί η επιβίωση και η υποτροπή σε εκτομή NSCLC, βοηθώντας τους κλινικούς ιατρούς να κάνουν κατάλληλες αποφάσεις σχετικά με τη θεραπεία των ασθενών

Παράθεση:. Wang YC, Sung WW, Wu TC, Wang L, Chien WP, Cheng YW, et al. (2012) Η ιντερλευκίνη-10 Απλότυπου μπορεί να προβλέψει την επιβίωση και Υποτροπή σε χειρουργικά μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (7): e39525. doi: 10.1371 /journal.pone.0039525

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν

Ελήφθη: 6 Γενάρη του 2012? Αποδεκτές: 22 Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 27, Ιουλίου 2012

Copyright: © Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (NSC-96-2628-Β-040-002-my3), και το Υπουργείο Υγείας (DOH101-TD-C-111-005) της Ταϊβάν, ROC κοινού. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ιντερλευκίνη-10 (IL-10), μια σημαντική ανοσοανασταλτική κυτοκίνης, είναι μέρος ενός ισορροπημένου δικτύου κυτοκινών [1] – [5]. Η IL-10 κυτοκίνης παράγεται από διάφορα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των φυσιολογικών και νεοπλασματικών Β κυττάρων, διεγερμένα μονοκύτταρα, μακροφάγα, και ένα υποσύνολο των Τ κυττάρων [1] – [4]. Πολλές μελέτες ασθενών-μαρτύρων έχουν δείξει τη σύνδεση της IL-10 πολυμορφισμοί υποκινητή (SNPs) με την ανθρώπινη κινδύνους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του κινδύνου καρκίνου του πνεύμονα [6] – [9]. Της IL-10 υποκινητή SNPs, αυτά που σε -1082A & gt? G, -819C & gt? T, και -592G & gt? Ένα ήταν το επίκεντρο των πρόσφατων μελετών, και οι φαινότυποι αυτών των ενιαίων SNPs νουκλεοτιδίων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από λειτουργικές δοκιμασίες στο κελί μοντέλα [10], [11].

μελέτες ανοσολογικής επιτήρησης Tumor έχουν αποκαλύψει τη σύνδεση μεταξύ IL-10 και την ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκίνων όπως μεγάλα Β-κύτταρα λέμφωμα Τ-κυττάρων μη-Hodgkin λέμφωμα, και καρκίνων του παχέος εντέρου, του προστάτη, του μαστού, του στομάχου, του μυελώματος, και των πνευμόνων [4], [6] – [9], [12] – [22]. Σε περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα, μερικές αναφορές έχουν δείξει ότι η απώλεια της IL-10 σε όγκους του πνεύμονα μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου και να οδηγήσουν σε κακή κλινική έκβαση σε ασθενείς? Ωστόσο, μια αντίθετο αποτέλεσμα έχει αναφερθεί σε άλλες μελέτες [23] – [29]. Είναι ενδιαφέρον ότι η απουσία του IL-10 έκφραση έχει συσχετιστεί με φτωχή έκβαση στο στάδιο Ι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [24], [25], ενώ στο τελευταίο στάδιο NSCLC, η παρουσία της IL-10-θετικά μακροφάγα που βρίσκονται στο περιθώριο του όγκου μπορεί να είναι ένας δείκτης της κακής πρόγνωσης αποτέλεσμα [23]. Επιπλέον, έχουν μικρότερους χρόνους επιβίωσης έχουν αναφερθεί σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα που είχε IL-10 υψηλά επίπεδα στον ορό, όταν συγκρίνονται με παρόμοια ασθενείς που είχαν χαμηλή ορού IL-10 επίπεδα [26]. Ως εκ τούτου, ένα σαφή ρόλο για την IL-10 στην πνευμονική ογκογένεση μένει να προσδιοριστεί.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων που γειτνιάζουν με χειρουργικά όγκοι NSCLC σε 385 ασθενείς, προκειμένου να προσδιοριστούν IL-10 υποκινητή SNPs στο -1082A & gt? G, -819C & gt? Τ, και -592C & gt? Α με άμεση αλληλούχιση και αλύσου πολυμεράσης περιορισμός αντίδραση μήκους θραύσματος πολυμορφισμού (PCR-RFLP). Αυτές οι τρεις SNPs IL-10 προαγωγός έχει αναφερθεί ότι παράγουν, κυρίως, τρεις απλοτύπων: GCC, ACC, ΑΤΑ [30] – [33]. Στην παρούσα μελέτη, οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε δύο απλότυπους, ΑΤΑ και μη-ATA (Εικ. 1), το οποίο είχε χρησιμοποιηθεί με δύο προηγούμενες εκθέσεις [34], [35]. Εμείς αμφισβήτηση: 1) το κατά πόσον οι όγκοι από μη-ATA μεταφορείς έχουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IL-10 από τους όγκους από ΑΤΑ φορείς, 2) εάν οι ασθενείς με απλότυπο μη-ATA ή υψηλότερα επίπεδα IL-10 mRNA σε όγκους του πνεύμονα έχουν μεγαλύτερη ογκοάνοση επιτήρησης, και 3) αν η IL-10 απλότυπος ή την έκφραση του mRNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει τη συνολική επιβίωση (OS) και υποτροπής επιβίωση χωρίς (RFS) σε εκτομή ασθενείς με NSCLC.

SNP στις θέσεις -819 και -592 σε η IL-10 υποκινητής ήταν σε πλήρη ανισορροπία σύνδεσης. Τρεις IL-10 απλοτύπων παρατηρήθηκαν και η εμφάνιση του κάθε συνδυασμού απλότυπος ή απλότυπος είναι εισηγμένη στα σκιασμένα κουτιά.

Η

Η

(Α) Εκπρόσωπος του CD3 ανοσοχρώση των TILs σε όγκους του πνεύμονα με χαμηλή πυκνότητα ΤΙΤ (& lt? 25 CD3

+ /HPF) (αριστερά: 100x? δεξιά: 400x)? (Β) TILs παρουσιάζονται σε όγκους του πνεύμονα παρουσιάζουν υψηλή πυκνότητα ΤΙΤ (≥25 CD3

+ /HPF) (αριστερά: 100x? Δεξιά: 400x).

Η

απόπτωση των κυττάρων Τ ορίστηκε όπως αννεξίνη V

+ /CD3 καρκινικών κυττάρων

+ και απόπτωση ορίστηκε ως αννεξίνης V

+ /ΡΚΗ26

+. (Α) Εκπρόσωπος κυτταρομετρία ροής κλίμακας SSC-FSC για gating πληθυσμό λεμφοκυττάρων, και ΡΚΗ26 δηλώνοντας για τη σήμανση καρκινικά κύτταρα. (Β) Εκπρόσωπος κυτταρομετρίας ροής της απόπτωσης αποτέλεσμα των CD3

+ Τ κύτταρα και ΡΚΗ26 περιφραγμένη καρκινικά κύτταρα. (Γ) Υψηλότερο επίπεδο απόπτωσης των Τ κυττάρων μετά από συν-καλλιέργεια με κύτταρα όγκου από 22 υγιείς άνδρες εθελοντές που έφεραν την IL-10 μη-ATA απλότυπος έναντι των IL-10 ΑΤΑ απλότυπος ποσοστά κυτταρικής απόπτωσης (Τ κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργειας με Α549: 10,49 ± 3,04 έναντι 8,34 ± 2,37, Ρ = 0,011? κατά τη διάρκεια της συν-καλλιεργήθηκαν με TL-1: 18,30 ± 3,82 έναντι 12,97 ± 2,94, Ρ & lt? 0,01). Προσθέσαμε IL-10 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη στο μέσο συν-καλλιέργειας των PBMCs που φιλοξενεί το IL-10 ΑΤΑ απλότυπο, και ο ρυθμός Τ απόπτωση αυξήθηκε (αυξήθηκε 7,63% κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργειας με Α549, Ρ & lt? 0,001? Αυξήθηκε 2,73% κατά τη διάρκεια της συν ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ με TL-1, P = 0,008). Προσθέσαμε επίσης IL-10 εξουδετερώθηκε αντισώματος στο μέσο συν-καλλιέργειας των PBMCs που φιλοξενεί το μη-ATA IL-10 απλότυπο, και το ποσοστό Τ απόπτωση μειώθηκε (κατά 1,78% κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργειας με Α549, Ρ = 0,017? Με 7,75 % κατά τη διάρκεια της συν-καλλιέργεια με TL-1, P & lt? 0.001). (D) Υψηλότερο επίπεδο απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων μετά από συν-καλλιέργεια με PBMCs από 22 υγιείς άνδρες εθελοντές που έφεραν την IL-10 ATA απλότυπος έναντι του απλότυπο μη-ATA (απόπτωση των Α549: 16,80 ± 3,38 έναντι 14,45 ± 3,78, Ρ = 0.035? απόπτωση TL-1: 12.95 ± 3.05 έναντι 8.68 ± 2.57, P & lt? 0,01). Προσθέσαμε IL-10 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη στο μέσο συν-καλλιέργειας των PBMCs που φιλοξενεί το IL-10 ΑΤΑ απλότυπο, και ο ρυθμός της απόπτωσης όγκου μειώθηκε (μείωση 4,29% του Α549, Ρ & lt? 0,001? Μειώθηκε 1,94% του TL-1, P = 0,043). Προσθέσαμε επίσης IL-10 εξουδετερώθηκε αντισώματος στο μέσο συν-καλλιέργειας των PBMCs που φιλοξενεί το IL-10 μη-ATA απλότυπο, και ο ρυθμός της απόπτωσης όγκου αυξήθηκε (αυξημένη 2,46% του Α549, Ρ = 0,037? Αυξήθηκε 6,67% του TL- 1, Ρ & lt?. 0.001)

Η

(20 μg ανά 3 ημέρες). Τα ποντίκια θυσιάστηκαν στο 14

ου ημέρες. Lung μετάσταση βρέθηκε σε ποντίκια που ενέθηκαν με αντίσωμα IgG (Α) και δεν βρέθηκε σε αυτούς με IL-10 αντίσωμα και εξουδετέρωσή (Β).

Η

Σύμφωνα με IL-10 απλότυπος (Α), IL- 10 mRNA (Β), και ο συνδυασμός της IL-10 απλότυπος και mRNA (C).

η

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Αυτή η μελέτη περιλαμβάνονται 385 ασθενείς με NSCLC. Όλοι οι ασθενείς είχαν σχέση κινεζικής καταγωγής και οι κάτοικοι της κεντρικής Ταϊβάν. Οι ασθενείς που είχαν διαγνωστεί με αδενοκαρκίνωμα (194? 50,4%) ή ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (191? 49,6%) και υποβλήθηκε σε χειρουργική εκτομή στον Τομέα Χειρουργικής Θώρακος, Taichung Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων, μεταξύ των ετών 1993 και 2004. Τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως στους χειρουργική επέμβαση και διατηρήθηκε στους -80 ° C μέχρι να μεταποιηθούν. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review (Διοικητικό κριτική Θεσμικά, Chung Shan Medical University Hospital CSMUH No:. CS11177). δεδομένων για τον καρκίνο υποτροπή ελήφθησαν από την ανασκόπηση διαγραμμάτων και επιβεβαιώθηκε από Χειρουργοί Θώρακα. Κλινικές παραμέτρους και τα δεδομένα OS και RFS συλλέχθηκαν από τις αξιολογήσεις διάγραμμα (32 ασθενείς είχαν κανένα στοιχείο της υποτροπής) και το Αρχείο Καρκίνου της Ταϊβάν, Υπουργείο Υγείας, Εκτελεστικό Yuan, ROC.

εξόρυξη Το γονιδιακό DNA, RNA εκχύλιση και cDNA σύνθεση

Γονιδιωματικό DNA εκχυλίζεται με συμβατικές μεθόδους. Χειρουργικά κανονικούς ιστούς πλησίον του όγκου πνεύμονα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας πέψη πρωτεϊνάσης Κ και το DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας φαινόλη-χλωροφόρμιο, που ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης.

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από 241 διαθέσιμες ιστούς όγκου πνεύμονα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ ( Invitrogen). Πρώτου κλώνου σύνθεση cDNA παρουσία τυχαίων εκκινητών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας cDNA αντίστροφη μεταγραφή kit (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ανάλυση PCR-RFLP για IL-10 -592C /A γενετική SNP

γονότυποι IL-10 -592C /Α προσδιορίσθηκαν με PCR-RFLP όπως περιγράφεται από Rad et al. [36]. προϊόντα ενίσχυσης PCR από 50 δείγματα επιλέχθηκαν τυχαία για άμεση αλληλούχιση για να επιβεβαιωθεί η γονότυπο υποδεικνύεται με PCR-RFLP.

Άμεση ανάλυση αλληλουχίας για IL-10 -1082A /G και -819C /T γενετική SNPs

SNP της IL-10 -1082G /A και -819C /T προσδιορίστηκαν με άμεση αλληλούχιση των προϊόντων PCR που έχουν ενισχυθεί από το DNA των φυσιολογικών ιστών δίπλα στους όγκους. Τα δείγματα DNA παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας πέψη με πρωτεϊνάση Κ και εκχύλιση με φαινόλη-χλωροφόρμιο, που ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση του DNA και την άμεση αλληλούχιση ήταν: 5′-CTCGCCGCAACCCAACTGGC-3 ‘(F) και 5′-TGGGGGAAGTGGGTAAGAGT-3’ (R). Οι συνθήκες του κύκλου PCR συνίστατο από ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 94 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους των 30s στους 94 ° C? 45s στους 56 ° C? 45s στους 72 ° C? και μια τελική επιμήκυνση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας ένα Applied Biosystems 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR ενίσχυση των δειγμάτων cDNA διεξήχθη με ένα ΑΒΙ 7500 πραγματικού χρόνου PCR System (Applied Biosystems) και SYBR Green χρωστική να ποσοτικοποιηθεί μεταγραφές IL-10 mRNA. Real-time RT-PCR εκκινητές ήταν ως ακολούθως: για IL-10 μετάγραφα, 5′-GGCGCTGTCATCGATTTCTT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-TGGAGCTTATTAAAGGCATTCTTCAC-3′ (αντίστροφο)? για 18S μεταγραφές γονίδιο, 5’-TCGGAACTGAGGCCATGA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CCGGTCGGCATCGTTTA-3’ (αντίστροφο). Τα προϊόντα ενισχύθηκαν με IL-10 εκκινητές ελέγχθηκαν με άμεση αλληλούχιση. Οι ποσότητες των IL-10 μεταγραφών mRNA ποσοτικοποιήθηκαν σε σχέση με το 18S εσωτερικού ελέγχου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems).

Πειράματα

απομόνωση Περιφερικό αίμα μονοκυττάρων και συν-καλλιέργειας

μονοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) από υγιείς δότες απομονώθηκαν με Ficoll-Paque (GE Healthcare) φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Τα PBMCs χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από απόπτωση των κυττάρων Τ από συν-καλλιέργεια με κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα σε αναλογία 40:1 επί 36 ώρες με IL-10 αντίσωμα και εξουδετέρωσή (MAB2171, R &? D Systems) ή IL- 10 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη (CYT-500, Prospec). Τα PBMCs συνέχεια συλλέχθηκαν για ανάλυση απόπτωσης των κυττάρων Τ με κυτταρομετρία ροής

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

κυτταρόμετρο ροής. (FACSCalibur? BD Biosciences) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το μέγεθος του πληθυσμού των κυττάρων και το ποσοστό απόπτωσης . PBMCs χρωματίστηκαν με ΡΕ-Cy

ΤΜ7 ποντικού αντι-ανθρώπινου CD3 (BD ​​Pharmingen) και τα θετικά κύτταρα CD3 στην λεμφοκυτταρική πύλη ταυτοποιήθηκαν ως κύτταρα Τ. Annexin V-FITC (Βϋ Pharmingen) χρησιμοποιήθηκε για να σηματοδοτήσει την απόπτωση των κυττάρων. Μετά από χρώση των κυττάρων, ανάλογα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο, τα δείγματα αναλύθηκαν μέσα σε 1 ώρα. Για την απόπτωση των κυττάρων Τ, μπορούμε περιφραγμένο την πύλη λεμφοκυττάρων σε FSC-SSC, και τον πληθυσμό με CD3

+ και αννεξίνης V

+ υπολογίστηκε [37].

Η ανοσοϊστοχημική χρώση

η ανοσοϊστοχημική χρώση για να αξιολογηθεί η έκφραση CD3 σε λεμφοκύτταρα διεξήχθη σε ολόκληρο-mount τομές παραφίνης των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα. Αντι-CD3 (1/100) πολυκλωνικό πρωτογενές αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε. Ένα κιτ ανίχνευσης ανοσοϊστοχημεία για

vitro

διαγνωστική χρήση (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. ΤΙΤ μετρήθηκε με τυχαία συστηματική επιλογή των πεδίων. Τουλάχιστον πέντε διαφορετικές HPFS μετρήθηκαν σε κάθε δείγμα το οποίο εξαρτάται από το μέγεθος της περιοχής του όγκου.

Ζωικό μοντέλο

C57BL /6 ποντίκια διατηρήθηκαν σε πρότυπες εγκαταστάσεις ποντικού (ελεύθερα ειδικού παθογόνου) σε Chung Shan Medical University. TC-1 κυτταρική γραμμή ευγενώς από το Δρ TC Wu (John Hopkins, Βαλτιμόρη, MD) [38]. TC-1 κύτταρα αιωρήθηκαν σε PBS σε μια συγκέντρωση 10

5 κύτταρα ανά 100 μλ. Κάθε ποντικός εγχύθηκε με 10

5 TC-1 κύτταρα με ουρά μάταια ένεση. Οι ποντικοί έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή δόσεις των 200 μg αντι-IL-10 αντίσωμα (mAb417 R &? D Systems) κατά την πρώτη ημέρα της ένεσης? εναλλάσσονται με ενδοπεριτοναϊκή δόσεις των 20 μg αντι-IL-10 αντίσωμα (mAb417 R &? D Systems) σε απόσταση ενσωμάτωση3Η ημέρα. Οι ποντικοί θυσιάστηκαν στις 14

ου ημέρες μετά την ένεση του όγκου. HE λεκέ διεξήχθη για να ελέγξει τον σχηματισμό όγκων μεταξύ των οργάνων των ποντικιών.

Η στατιστική ανάλυση

t-test του Student και Chi-square test εφαρμόστηκαν για συνεχή ή διακριτή ανάλυση δεδομένων. Οι συσχετίσεις μεταξύ της IL-10 πολυμορφισμοί υποκινητή και την επιβίωση των ασθενών εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Πιθανούς συγχυτικούς παράγοντες προσαρμόστηκαν με μοντέλα παλινδρόμησης κατά Cox, με πολυμορφισμούς IL-10 προαγωγός τοποθετηθεί ως μεταβλητές δείκτη. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του προγράμματος SPSS στατιστικού λογισμικού (έκδοση 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL). Όλα στατιστική δοκιμή έγινε χρησιμοποιώντας δύο όψεων δοκιμές και τις αξίες P & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Μη-ATA απλότυπος είναι πιο συχνή σε ασθενείς με κομβικά μετάσταση

IL-10 απλοτύπων-ΑΤΑ /ΑΤΑ (ΑΤΑ απλότυπος) και μη-ΑΤΑ /ΑΤΑ (μη-ATA απλότυπος) -υποβλήθκαν κατηγοριοποιούνται από την IL-10 SNPs υποκινητή σε -1082A /G, -819C /T και -592C /Α (Εικ. 1). Οι σχέσεις μεταξύ της IL-10 απλοτύπων και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων σε 365 ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα αναλύθηκαν στατιστικά με Chi-square test. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, η μη-ATA απλότυπος εμφανίσθηκαν συχνότερα σε ασθενείς με κομβικά μετάσταση (Ν1 και Ν2) σε σχέση με μη-κομβικά μετάσταση (N0) (62,5% έναντι 50,3%, p = 0,016). Επιπλέον, μια σχετικά υψηλότερη επικράτηση των μη καπνιστών παρατηρήθηκε μεταξύ των ασθενών με τον απλότυπο μη-ATA ό, τι με τον απλότυπο ΑΤΑ (61,7% έναντι 51,8%, Ρ = 0,049). Ως εκ τούτου, οι ασθενείς με μη-ATA απλότυπος μπορεί να έχουν πιο επιθετικούς όγκους με μεγαλύτερη τάση προς υποτροπή.

Τα υψηλότερα επίπεδα IL-10 mRNA σε όγκους του πνεύμονα από μη-ATA ασθενείς απλότυπος σε σύγκριση με τους ασθενείς απλότυπος ΑΤΑ οδήγησε σε φτωχότερες όγκου ανοσολογική επιτήρηση μερικώς μέσω μειωμένους αριθμούς διηθητικών λεμφοκυττάρων όγκου

από τους όγκους των 385 ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα, 241 ήταν διαθέσιμα για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA της IL-10. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IL-10 mRNA βρέθηκαν σε όγκους από ασθενείς μη-ATA απλότυπου από από ασθενείς απλότυπος ΑΤΑ (μέση ± SE, 68.51 ± 16.31 έναντι 12.85 ± 4.54, Ρ = 0.004). Η κατανομή των λεμφοκυττάρων που διηθούν όγκο (TILs) σε όγκους των πνευμόνων αξιολογήθηκε με IHC σε 87 διαθέσιμες τομές παραφίνης όγκου πνεύμονα. Στο συνολικό πληθυσμό της μελέτης, δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά σε αριθμό TILs σε όγκους του πνεύμονα του ΑΤΑ και μη-ATA ασθενείς (Πίνακας 2, Σχήμα 3?. 50.0 έναντι 37.5, Ρ = 0,236). Ωστόσο, μία διαφορά στους αριθμούς TIL μεταξύ ΑΤΑ και μη-ATA μεταφορείς παρατηρήθηκε σε ασθενείς τελικού σταδίου (Ρ = 0,032, Πίνακας 2), αλλά όχι σε ασθενείς πρώιμου σταδίου (Ρ = 0,988, Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι μη-ATA ασθενείς που έχουν χαμηλότερους αριθμούς ΤΙΤ σε σύγκριση με το ΑΤΑ ασθενείς μπορεί να έχουν φτωχότερη όγκου ανοσοποιητικό επιτήρησης.

IL-10 μειώνει την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων μέσω της αύξησης των κυττάρων Τ απόπτωση

Για να επαληθεύσετε η δυνατότητα των αλλαγών στον όγκο ανοσοποιητικό επιτήρησης, PBMCs συλλέχθηκαν από 22 υγιείς δότες με την απλότυπος ΑΤΑ και 22 υγιείς δότες με την απλότυπος μη-ATA. Τα επίπεδα IL-10 mRNA σε ΜΚΠΑ από μη-ATA απλότυπος υγιείς δότες ήταν υψηλότερες από ό, τι από ΑΤΑ απλότυπος υγιείς δότες (μέσος όρος ± SE, 78.54 ± 13.18 έναντι 46.37 ± 3.91, Ρ = 0,028). Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια συν-καλλιεργήθηκαν με Α549 και TL-1 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Η κυτταροτοξικότητα καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής με Annexin V

+ /ΡΚΗ26

απόπτωση των κυττάρων Τ + και προσδιορίστηκε με Annexin

+ /CD3

+. Η απόπτωση των κυττάρων Τ μετά από συν-καλλιέργεια με Α549 και TL-1 κύτταρα ήταν χαμηλότερη σε ΜΚΠΑ από τις ΑΤΑ απλότυπος υγιείς δότες σε σχέση με PBMCs από μη-ATA απλότυπος υγιείς δότες (8,34 ± 2,37 έναντι 10,49 ± 3,04, Ρ = 0,012 για Α549? 12,97 ± 2,94 έναντι 18,30 ± 3,82, P & lt? 0.001? Σχ. 4Α). Κατά συνέπεια, ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων όγκου (Α549 και TL-1) ήταν σημαντικά υψηλότερη μετά από συν-καλλιέργεια με PBMCs από τις ΑΤΑ απλότυπος υγιείς δότες, παρά από τα μη-ATA υγιείς δότες (16,80 ± 3,38 έναντι 14,45 ± 3,78, Ρ = 0,035 για Α549? 12,95 ± 3,05 έναντι 8,68 ± 2,57, P & lt? 0.001? Εικ. 4Β). Για να επαληθευθεί αν το IL-10 ήταν υπεύθυνη για αυτή την απόπτωση των Τ κυττάρων και καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα, τους αριθμούς αποπτωτικών κυττάρων Τ του PBMCs από τις ΑΤΑ απλότυπος υγιείς δότες αυξήθηκε με επεξεργασία με 100 ng /ml IL-10 (8,34 ± 2,37 vs . 15.97 ± 3.03, Ρ & lt? 0,001 για Α549? 12,97 ± 2,94 έναντι 15,70 ± 3,54, Ρ = 0,008 για TL-1? Εικ. 4Α). Αντιστρόφως, η απόπτωση των κυττάρων Τ σε PBMCs από μη-ATA υγιείς δότες ήταν σημαντικά μειωμένη σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο από την IL-10 εξουδετερώθηκε αντίσωμα (Σχ. 4Α). Κατά συνέπεια, η απόπτωση και των δύο τύπων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μειώθηκε κατόπιν θεραπείας με IL-10 και αυξήθηκε κατά IL-10 εξουδετερώθηκε αντίσωμα (Σχ. 4Β). Συλλογικά, PBMCs από μη-ATA φορείς είχαν χαμηλότερα αποπτωτικά αποτελέσματα επί κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα από ό, τι PBMCs από ΑΤΑ φορείς, και IL-10 ήταν υπεύθυνη για κύτταρο όγκου απόπτωση μετά από συν-καλλιέργεια με PBMCs. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι η IL-10 μείωσε την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων μέσω της αύξησης των κυττάρων Τ απόπτωση.

Στο πείραμα σε ζώα μας, τα κύτταρα TC-1 που δεν εκφράζουν την IL-10 (ευγενική προσφορά του Dr. TC Wu, John Hopkins, Βαλτιμόρη, MD, USA) ενέθηκαν σε ποντικούς C57BL6 μέσω της φλέβας της ουράς. Μετά από 14 ημέρες, οι όγκοι σχηματίστηκαν σε ολόκληρη πνεύμονα (Εικ. 5). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν όγκοι παρατηρήθηκαν μετά τα κύτταρα TC-1 αγωγή ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-10 εξουδετερώθηκε αντισώματος. Τα αποτελέσματα αυτά φαίνεται να υποστηρίζει προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι η IL-10 εκκρίνεται από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού μπορεί να προάγει την εξέλιξη των όγκων του πνεύμονα [39].

Ασθενείς με μη-ATA απλότυπο ή υψηλά επίπεδα IL-10 mRNA είχε φτωχότερα αποτελέσματα σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΑΤΑ απλότυπος ή χαμηλά επίπεδα IL-10 mRNA

Kaplan-Meier και πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox διεξήχθησαν για να ελέγξει αν φτωχότερες επιβίωσης και μεγαλύτερη υποτροπής θα φανεί σε ασθενείς με τον απλότυπο μη-ATA ή υψηλής IL-10 mRNA επίπεδα σε όγκους του πνεύμονα σε σύγκριση με τους ασθενείς με τον απλότυπο ΑΤΑ ή χαμηλά επίπεδα IL-10 mRNA. Οι καμπύλες επιβίωσης προβλέψει με ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με τον απλότυπο μη-ATA είχαν μικρότερο λειτουργικό σύστημα και τις περιόδους RFS από ό, τι οι ασθενείς με τον απλότυπο ΑΤΑ (P = 0,001 για το OS, αριστερό πίνακα του σχήματος 6Α?. Ρ & lt? 0,001 για την RFS, δεξιό τμήμα της Εικ. 6Α). Σύμφωνα με την προγνωστική αξία της IL-10 απλότυπου, αυξημένα επίπεδα IL-10 mRNA παρατηρήθηκαν επίσης σε ένα υποσύνολο αυτού του πληθυσμού της μελέτης (n = 241), που δείχνουν ότι οι όγκοι με υψηλά επίπεδα IL-10 mRNA συσχετίστηκαν με χειρότερη OS και RFS από ότι σε ασθενείς των οποίων οι όγκοι είχαν χαμηλά επίπεδα IL-10 mRNA (P = 0,001 για το OS, αριστερό πάνελ του σχήματος 6Β?. Ρ & lt? 0,001 για RFS, δεξί πάνελ του Σχήματος 6Β.). Όπως ήταν αναμενόμενο, η χειρότερη OS και RFS παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με απλότυπο μη-ATA και υψηλά επίπεδα IL-10 mRNA (σχ. 6C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η IL-10 απλότυπο ή έκφραση IL-10 mRNA σε όγκους του πνεύμονα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει τα αποτελέσματα των ασθενών.

Η πολυπαραγοντική Cox παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει κατά πόσον η IL-10 απλότυπο ή επίπεδα mRNA μπορεί ανεξαρτήτως προβλέπουν έκβαση του ασθενούς, μετά από προσαρμογή για διάφορες παραμέτρους όπως η ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα, η ιστολογία του όγκου, και το στάδιο του καρκίνου. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, οι ασθενείς με μη-ATA απλότυπος είχε ώρας 1,431 και 1,556 για μικρότερες OS και RFS, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΑΤΑ απλότυπο (95% CI, 1,104 – 1,856, P = 0,007 για το OS? 1.200- 2.018, P & lt? 0,001 για RFS). Η μέση διάρκεια για το OS και RFS σε ασθενείς με μη-ATA απλότυπος ήταν 24,1 και 16,8 μήνες αντίστοιχα, σε σύγκριση με 40,9 και 30,9 μήνες αντίστοιχα, για τον απλότυπο ΑΤΑ. Τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών για ασθενείς με μη-ΑΤΑ και ΑΤΑ απλότυπους ήταν 28,2% έναντι 43,3% για το OS και το 22,2% έναντι 36,2% για την RFS. Η ανεξάρτητη προγνωστική αξία των επιπέδων IL-10 mRNA αποδείχθηκε επίσης σε ένα υποσύνολο αυτού του πληθυσμού της μελέτης. Οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα IL-10 mRNA είχε μικρότερη διάμεση επιβίωση και 5-ετή ποσοστό επιβίωσης για το OS και RFS σχέση με τους ασθενείς με χαμηλά επίπεδα της IL-10 mRNA (Πίνακας 3? 30,2 μήνες έναντι 52,1 μηνών, 30,7% έναντι 48,7%, P = 0,017 για το OS? 17,2 μήνες έναντι 35,9 μηνών, 19,2% έναντι 45,1%, p = 0,001 για RFS). Οι ώρες από την IL-10 mRNA για το OS και RFS αυξημένη σε σχέση με HRs της IL-10 απλότυπος (1.553 έναντι 1.431 για το OS? 1.755 έναντι 1.556 για το RFS). Πιο ενδιαφέρον, HRs των ασθενών με μη-ATA απλότυπος συν υψηλό επίπεδο IL-10 mRNA αυξήθηκε 1,431 – 1,892 για το OS και 1,556 – 2,344 για την RFS σε σύγκριση με τους ασθενείς με ΑΤΑ απλότυπος συν χαμηλά επίπεδα IL-10 mRNA. Η αύξηση HRs δεν παρατηρήθηκε σε ασθενείς με τον απλότυπο ΑΤΑ συν υψηλή IL-10 mRNA ή σε ασθενείς με μη-ATA απλότυπο και το χαμηλό επίπεδο της IL-10 mRNA. Τα αποτελέσματα αυτά φαίνεται να δείχνουν ότι η IL-10 απλότυπος ή το επίπεδο της IL-10 mRNA μπορεί ανεξάρτητα να προβλέψει την επιβίωση και την υποτροπή σε εκτομή ασθενείς με NSCLC.

Συζήτηση

Η SNPs της IL-10 σε -1082 G & gt ? Α, -819 C & gt? T και -592 C & gt? Ένα είναι GCC, ACC, και απλοτύπων ΑΤΑ, αντίστοιχα [36], [40]. Η έκφραση του IL-10 mRNA σε κύτταρα περιφερικού αίματος είναι υψηλότερη σε άτομα με ένα ή δύο GCC απλότυπους, που ακολουθείται από ACC /ACC φορείς, και, στη συνέχεια, ΑΤΑ /ACC και φορείς ΑΤΑ /ΑΤΑ [36], [40], [41] . Στην παρούσα μελέτη, μη ΑΤΑ και ΑΤΑ απλοτύπων σε κατηγορίες ανάλογα με τα τρία ΣΣΚ, ΑΤΑ και ACC απλοτύπων της IL-10 υποκινητή (Εικ. 1). Μια φτωχή προγνωστική αξία για το OS και RFS βρέθηκε για το ΣΣΚ, ACC, και οι μεταφορείς μη-ATA (Πίνακας S1). Ωστόσο, η προγνωστική σημασία των τριών φορέων αποκαλύφθηκε μόνο σε ασθενείς τελικού σταδίου, όχι σε ασθενείς σε πρώιμα στάδια αυτού του πληθυσμού της μελέτης (Πίνακας S1). Από την άλλη πλευρά, IL-10 mRNA επίπεδα έκφρασης ήταν σημαντικά υψηλότερα σε φορείς με ≥1 αριθμού αντιγράφων του ΣΣΚ σε σχέση με μεταφορείς χωρίς GCC (IL-10 mRNA για GCC έναντι μη-GCC: 147.90 ± 56.80 έναντι 31.72 ± 7.91, P & lt? 0.001). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην έκφραση IL-10 mRNA παρατηρήθηκε για τους μεταφορείς ACC (IL-10 mRNA για ACC έναντι μη-ACC: 57,69 ± 15,43 έναντι 31,15 ± 11,36, Ρ = 0,166). Αυτό ήταν συνεπές με μια προηγούμενη έκθεση στην οποία αναφέρεται ότι οι φορείς απλότυπος ΣΣΚ είχαν υψηλότερο κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα σε σχέση με άλλους φορείς [6]. Επιπλέον, η IL-10 mRNA επίπεδο ήταν υψηλότερο σε μη-ATA απλότυπου από ό, τι ATA απλότυπο (Εικ. 2). Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, IL-10 απλότυποι αξιολογήθηκαν για προγνωστική σημασία τους σε ασθενείς με NSCLC.

Η συσχέτιση μεταξύ της IL-10 και την εξέλιξη του όγκου συχνά έχει εξηγηθεί από αλλαγές στην ανοσοκαταστολή και ογκοάνοση επιτήρησης [ ,,,0],1] – [4], [42]. Στην παρούσα μελέτη, συνεπή ευρήματα παρατηρήθηκαν σε

in vitro πειράματα με

PBMCs συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα και σε ποσοστό

in vivo

παρατηρήσεις TILs σε καρκινικούς ιστούς (Εικ. 4). Προηγούμενες μελέτες χρησιμοποιώντας διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν IL-10 έδειξαν ότι αυτοί οι ποντικοί ανέπτυξαν μεγαλύτερους όγκους απ ‘ότι τα ποντίκια ελέγχου. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η IL-10 εμποδίζει την αποτελεσματική ανοσοαποκρίσεις έναντι της προόδου όγκου [43]

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η IL-10 έχει διαφορετικά προγνωστική σημασία σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα πρώιμου και όψιμου σταδίου [23]. – [25]. Στην παρούσα μελέτη πληθυσμού, φτωχότερες OS και RFS παρατηρήθηκαν στα τέλη του σταδίου (III) σε ασθενείς με μη-ATA απλότυπος από ό, τι σε ασθενείς με τον απλότυπο ΑΤΑ (HR, 1.785, P & lt? 0.001 για το OS? ΥΕ, 2.071, P & lt? 0,001 για RFS? Πίνακας S1)? Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε καμία προγνωστική αξία για πρώιμου σταδίου (Ι + II) ασθενείς (Πίνακας S1). Σε σύγκριση με το συνολικό πληθυσμό της μελέτης, οι ασθενείς τελικού σταδίου είχαν υψηλότερο HR για OS και RFS (1.785 έναντι 1.431 για το OS? 2.071 έναντι 1.556 για την RFS? Πίνακας S1). Αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IL-10 mRNA σε ασθενείς με όψιμη φάση με τον απλότυπο μη-ATA ό, τι με τον απλότυπο ΑΤΑ (87.26 ± 28.83 έναντι 10.87 ± 4.53, p = 0,011)? Ωστόσο, η διαφορά μεταξύ της μη-ATA και ΑΤΑ απλότυποι ήταν οριακά παρατηρήθηκε σε ασθενείς σε πρώιμα στάδια (54.13 ± 18.49 έναντι 14.52 ± 7.47, Ρ = 0.050). Επιπλέον, η προγνωστική σημασία των TILs σε OS και RFS αποδείχθηκε επίσης σε ασθενείς τελικού σταδίου, όχι σε ασθενείς πρώιμου σταδίου (Ρ = 0,012 για το OS, Ρ = 0,003 για την RFS? Πίνακας S2). Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι η μη-ATA απλότυπος, με ένα υψηλότερο επίπεδο έκφρασης της IL-10 mRNA, μπορεί να είναι πιο σημαντικό για την προώθηση της επιθετικότητας του όγκου σε ασθενείς με τελικό στάδιο από ό, τι σε ασθενείς με πρώιμου σταδίου.

Εν ολίγοις, IL-10 απλότυποι μπορούν να προσδιορισθούν εύκολα από δείγματα αίματος ασθενών και μπορεί να είναι χρήσιμη στην πρόβλεψη της επιβίωσης και υποτροπής σε ασθενείς χειρουργήσιμη NSCLC. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που δείχνει ότι η IL-10 απλότυποι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει OS και RFS σε ασθενείς με NSCLC. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι οι απλοτύπων της IL-10 προαγωγός SNPs μπορεί να αποτελούν πιθανές βιοδείκτες για την πρόβλεψη της επιβίωσης και υποτροπής σε ασθενείς χειρουργήσιμο ΜΜΚΠ.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

πολυπαραγοντική ανάλυση της επίδρασης της IL-10 απλότυπους στη συνολική επιβίωση και επιβίωση χωρίς υποτροπή σε μη μικροκυτταρικό ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, σύμφωνα με το στάδιο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039525.s001

(DOC)

Πίνακας S2.

πολυπαραγοντική ανάλυση της επίδρασης της διηθούν όγκο αριθμών λεμφοκυττάρων στη συνολική επιβίωση και επιβίωση χωρίς υποτροπή σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ασθενών κυττάρων.

doi: 10.1371 /journal.pone.0039525.s002

(DOC)

Ευχαριστίες

FASCs Calibur διεξήχθη στο Μέσο Κέντρο Chung Shan Medical University, το οποίο υποστηρίζεται από το Εθνικό Συμβούλιο Επιστήμης, Υπουργείο Παιδείας και Chung Shan Medical University.